CN104726434B - 一种木聚糖酶XynRBM26及其编码基因 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种木聚糖酶XynRBM26及其编码基因、重组载体和重组菌。本发明提供了一种木聚糖酶XynRBM26，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明以山毛榉木聚糖为底物的木聚糖酶XynRBM26最适pH为5.5，最适温度为45℃，在反应体系中加入5M的NaCl仍然具有86％的酶活，酶经2M NaCl在37℃下处理1h，活性高达120％；该酶能有效地水解燕麦木聚糖、山毛榉木聚糖，而不能水解羧甲基纤维素钠、昆布多糖和β‑葡聚糖、微晶纤维素、p‑nitrophenyl‑β‑D‑xylopyranoside，可广泛应用于饲料、食品和生物燃料等行业。

Description

一种木聚糖酶XynRBM26及其编码基因

技术领域

本发明涉及微生物和基因工程技术领域，尤其涉及的是一种木聚糖酶XynRBM26及其编码基因。

背景技术

木聚糖是植物细胞壁中半纤维素的主要组成成分，其完全水解需要木聚糖酶和木糖苷酶等多种酶的协同作用，木聚糖酶包括内切-1，4-β-D-木聚糖酶(endo-1，4-β-D-xylanase，EC 3.2.1.8)和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-arabinofuranosidase，EC3.2.1.55)等(Collins et al.FEMS Microbiol Rev，2005，29:3-23)。内切-1，4-β-D-木聚糖酶能水解木聚糖主链的β-1，4糖苷键，是木聚糖降解过程中发挥最主要作用的酶。由于木聚糖酶具有降解植物木聚糖的作用，被广泛应用于食品、饲料、酿酒、造纸、麻类脱胶和燃料生产等工业领域。

植食性动物胃肠道中存在丰富的与木质纤维素降解有关的多种酶类，但不同动物之间存在差异(Hess et al.Science，2011，331:463-467；Dai et al.PLoS One，2012，7:e40430)。近年来，研究者通过微生物分离培养和宏基因组学等方法从天牛胃肠道、奶牛瘤胃、山羊瘤胃等动物中获取了多种木聚糖酶(Zhou et al.J Ind Microbiol Biotechnol，2011，38:523-530；Cheng et al.J Agric Food Chem，2012，60:12516-12524；Wang etal.Bioresour Technol，2011，102:3330-3336)。滇金丝猴(Rhinopithecus bieti)是典型的植食性灵长类动物，由于摄食种类和物种的差异，其胃肠道中可能蕴含有不同于其它动物的新的微生物木聚糖酶基因资源，但到目前为止，还未见滇金丝猴胃肠道微生物来源相关酶基因的报道。

木聚糖酶来源比较广泛，在细菌、真菌、陆地植物组织中都存在(Collins etal.FEMS Microbiol Rev，2005，29:3-23)，其中微生物主要来源于芽孢杆菌属(Bacillus)、曲霉属(Aspergillus)、里氏木霉属(Trichoderma)等，然而来自Massilia的木聚糖酶尚未见报道。不同菌属来源的木聚糖酶酶学性质差异较大(Kimura et al.Biosci BiotechnolBiochem，2000，64:1230-1237；Gessesse et al.Appl Environ Microbiol，1998，64:3533-3535)，因此研究鉴定不同来源的木聚糖酶对其在不同领域的应用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种木聚糖酶。

本发明的再一目的是提供编码上述木聚糖酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组表达载体。

本发明的另一目的是提供用所述的重组表达载体转化宿主细胞所得的重组菌株。

本发明从滇金丝猴粪便中分离到Massilia sp.RBM26，通过基因组测序，获得第10家族的木聚糖酶编码基因，并将其转入大肠杆菌进行异源表达和重组酶的酶学特性分析，发现获得的木聚糖酶XynRBM26在高浓度NaCl下仍然具有催化活性，可应用于高盐食品和海产品加工及其它高盐环境生物技术领域，且本发明中的木聚糖酶来源于动物胃肠道，因此其性质具有进一步应用于饲料等领域的潜力。

本发明所述木聚糖酶XynRBM26可得自Massilia sp.RBM26，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述木聚糖酶XynRBM26的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，共383个氨基酸，其理论分子量为43.17kDa。

本发明的木聚糖酶XynRBM26的最适pH值为5.5，在pH5.0-7.0之间可以保持90％以上的酶活性；在pH5.0-10.0的缓冲液处理1h，酶活力剩余82％以上；最适反应温度为45℃，在37℃、45℃和50℃下处理1h，剩余酶活分别为95.6％、81.2％和59.7％；反应体系中0.5-1.5M的NaCl对酶活影响较小，在5M时仍可以保持86％的活性；经0.5-5M的NaCl在37℃下处理1h，发现0.5-3.5M的NaCl可提高酶活；在反应体系中加入10％(v/v)的乙醇进行酶促反应，可保持50％的酶活性，酶经3.0-15.0％(v/v)的乙醇在37℃下处理1h，该酶仍能保持80％左右的酶活性；在pH5.5及45℃下该酶对0.5％(w/v)的燕麦木聚糖、山毛榉木聚糖能有效地水解，而不能水解羧甲基纤维素钠、昆布多糖和β-葡聚糖、微晶纤维素、p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside。

本发明通过基因组测序的方法克隆了木聚糖酶的编码基因XynRBM26，其全长为1152bp，起始密码为ATG，终止密码为TGA。

本发明还提供了包含上述木聚糖酶基因XynRBM26的重组载体，优选为pEasy-E2-XynRBM26。将本发明的木聚糖酶基因插入到表达载体中，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，将本发明木聚糖酶基因和表达载体pEasy-E2通过T-A方式相连接，得到重组大肠杆菌表达质粒pEasy-E2-XynRBM26。

本发明还提供了包含上述木聚糖酶基因XynRBM26的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21(DE3)/XynRBM26。

本发明制备木聚糖酶XynRBM26的方法按以下步骤进行：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶基因XynRBM26表达；

3)回收并纯化所表达的木聚糖酶XynRBM26。

其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21(DE3)，得到重组菌株BL21(DE3)/XynRBM26。

本发明提供了一个新的木聚糖酶基因，其编码的木聚糖酶最适pH为5.5，最适温度为45℃，在反应体系中加入5M的NaCl仍然具有86％的酶活，酶经2M NaCl在37℃下处理1h，活性高达120％；该酶能有效地水解燕麦木聚糖、山毛榉木聚糖，而不能水解羧甲基纤维素钠、昆布多糖和β-葡聚糖、微晶纤维素、p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside。以上性质表明本发明的木聚糖酶作为一种新型的酶制剂，可广泛应用于饲料、食品和生物燃料等行业。

附图说明

图1：在大肠杆菌中表达的重组木聚糖酶XynRBM26的SDS-PAGE分析，其中，1：500mM咪唑洗脱亲和于Nickel-NTA Agarose中的重组XynRBM26；M：蛋白质Marker。

图2：纯化的重组木聚糖酶XynRBM26的pH活性。

图3：纯化的重组木聚糖酶XynRBM26的pH稳定性。

图4：纯化的重组木聚糖酶XynRBM26的热活性。

图5：纯化的重组木聚糖酶XynRBM26的热稳定性。

图6：纯化的重组木聚糖酶XynRBM26的NaCl抗性。

图7：纯化的重组木聚糖酶XynRBM26的NaCl稳定性。

图8：纯化的重组木聚糖酶XynRBM26的乙醇抗性。

图9：纯化的重组木聚糖酶XynRBM26的乙醇稳定性。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

试验材料和试剂

1、菌株及载体：Massilia sp.RBM26是本研究室2013年从我国云南省维西县白马雪山国家级自然保护区的滇金丝猴粪便微生物中分离得到，其16s rRNA基因序列比对结果与Massilia aurea shain AP13(NR_042502)的相似性为99％。大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3)和表达载体pEasy-E2购于北京全式金生物技术有限公司。

2、酶类及其他生化试剂：DNA聚合酶和dNTP购自TaKaRa公司；山毛榉木聚糖(Beechwood xylan)、p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside购自Sigma公司；燕麦木聚糖(Xylan from oat spelts)购自SERVA公司；Genomic DNA Clean&Concentration试剂盒购自Zymo Research公司，TureseqTM DNA Sample Preparation Kit购自Illumima公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

LB培养基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000ml，pH自然(约为7)。固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1：木聚糖酶基因XynRBM26的克隆

提取Massilia sp.RBM26基因组DNA:将液体培养2d的菌液离心取菌体，加入1mL溶菌酶，37℃处理1h，再加入裂解液，裂解液组成为：50mM Tris，20mM EDTA，NaCl 500mM，2％SDS(w/v)，pH8.0，70℃水浴裂解1h，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。

用超声打断仪Biorupter将5μg的Massilia sp.RBM26的基因组打断为400-600bp的片段，用Genomic DNA Clean&Concentration试剂盒对打断的DNA片段进行纯化，纯化后用TureseqTM DNA Sample Preparation Kit进行DNA片段的末端补平、3’端加A碱基和加接头、及DNA片段的PCR扩增(操作按试剂盒说明书进行)。用MiSeq基因组测序仪(Illumima公司)对上述制备好的文库进行基因组测序。

基因组测序得到的数据经读码框预测和本地BLAST比对，得到木聚糖酶基因XynRBM26，该基因序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2:重组木聚糖酶XynRBM26的制备

以5’ATGACATCTCGACGCGATAC3’和5’GGCTTTACGCATCGGCATCG3’为引物对，Massiliasp.RBM26基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性30S，72℃退火30S，72℃延伸1min30S，共20个循环；94℃变性30S，52℃退火30S，72℃延伸1min30S，共10个循环；72℃扩增后延伸7min；其中从72℃到52℃每个循环温度下降1℃。PCR结果得到木聚糖酶基因XynRBM26，并在该基因3’端引入突出的A碱基。将木聚糖酶基因XynRBM26和表达载体pEasy-E2通过T-A方式相连接，获得含有XynRBM26的重组表达质粒pEasy-E2-XynRBM26，将pEasy-E2-XynRBM26转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/XynRBM26。

取含有重组质粒pEasy-E2-XynRBM26的重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/XynRBM26和只含有pEasy-E2(+)空质粒的BL21(DE3)菌株，以0.1％的接种量接种于LB(含100μg mL^{- 1}Amp)培养液中，37℃快速振荡16h。然后将此活化的菌液以1％接种量接种到新鲜的LB(含100μg mL^-1Amp)培养液中，快速振荡培养约2-3h(OD600达到0.6-1.0)后，加入终浓度0.7mM的IPTG进行诱导，于20℃继续振荡培养约20h或26℃振荡培养约8h。12000rpm离心5min，收集菌体。用适量的pH7.0McIlvaine缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体，破碎后经13，000rpm离心10min，吸取上清进行SDS-PAGE分析。SDS-PAGE结果(图1)表明，在大约45kDa的位置，经500mM的咪唑洗脱后，产物为单一条带。同时，含有载体pEasy-E2(+)的大肠杆菌菌体破碎上清液无木聚糖酶酶活，而含有重组载体pEasy-E2-XynRBM26的大肠杆菌菌体破碎上清液有木聚糖酶酶活。以上结果说明重组木聚糖酶XynRBM26在大肠杆菌中得到了表达。

实施例3：纯化的重组木聚糖酶XynRBM26的性质测定

1、纯化的重组木聚糖酶XynRBM26的活性分析

活性测定方法采用3，5－二硝基水杨酸(DNS)法：将底物溶于0.1M缓冲液中，使其终浓度为0.5％(w/v)；反应体系含100μL适量酶液，900μL底物；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液后再反应10min，然后加1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min，冷却至室温后在540nm波长下测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在一定的条件下每分钟分解底物产生1μmol还原糖(以木糖计)所需的酶量。

2、纯化的重组木聚糖酶XynRBM26的pH活性和pH稳定性测定：

酶的最适pH测定：将木聚糖酶XynRBM26在37℃下和0.1M pH3.0-12.0的缓冲液中进行酶促反应。酶的pH稳定性测定：将酶液置于0.1M pH3.0-12.0的缓冲液中，在37℃下处理1h，然后在pH5.5及37℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。缓冲液为：0.1MMcIlvaine(pH3.0-8.0)，0.1M Tris/HCl(pH8.0-9.0)和0.1M glycine/NaOH(pH9.0-12.0)。以山毛榉木聚糖为底物，反应10min，测定纯化的XynRBM26的酶学性质。结果表明：XynRBM26的最适pH为5.5，在pH5.0-9.0的范围内维持50％以上的酶活性(图2)；经pH5.0-10.0的缓冲液处理1h，该酶酶活力剩余82％以上(图3)。

3、纯化的重组木聚糖酶XynRBM26的热活性及热稳定性测定：

酶的最适温度测定：在pH5.5的缓冲液中，于0-70℃下进行酶促反应。酶的热稳定性测定：将同样酶量的酶液置于37℃、45℃、50℃和55℃中，处理0-1h后，在pH5.5及45℃进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以山毛榉木聚糖为底物，反应10min，测定纯化的XynRBM26的酶学性质。结果表明：XynRBM26的最适温度为45℃，在30-50℃的范围内可以保持62％以上的酶活，在50℃以后酶活随温度升高迅速下降(图4)；该酶在37℃、45℃、50℃下处理1h，剩余酶活分别为95.6％、81.2％和59.7％；在55℃条件下耐受20min，酶活迅速损失约至11％(图5)。

4、纯化的重组木聚糖酶XynRBM26的动力学参数测定：

酶的动力学参数一级反应时间测定：在pH5.5及45℃下，以0.5％(w/v)的山毛榉木聚糖为底物，依次在酶促反应的1-10min内终止反应并测定酶活性，计算出酶活性与反应时间的比值，若在一定时间内该比值保持稳定，则此时间为一级反应时间。用0.05-2.0％(w/v)的山毛榉木聚糖为底物，在pH5.5、45℃和一级反应时间下，根据Lineweaver-Burk方法测定Km、Vmax和kcat。经测定，在45℃及pH5.5条件下，XynRBM26对山毛榉木聚糖的Km、Vmax和kcat分别为9.5mg mL^-1、65.8μmol min^-1mg^-1和47.3S^-1。

5、不同金属离子及化学试剂对纯化的重组木聚糖XynRBM26活力的影响：

在酶促反应体系中分别加入19种不同的金属离子及化学试剂(终浓度为1mM和10mM)，研究其对酶活性的影响。在45℃及pH5.5条件下，以山毛榉木聚糖为底物测定酶活性(同样条件下以未加金属离子及化学试剂的酶促反应作为对照)。表1显示所测定的19种不同金属离子及化学试剂在两种浓度下对重组木聚糖酶XynRBM26的影响，即使在1mM的浓度下，Ag⁺、SDS、Hg²⁺也完全抑制XynRBM26的酶活性。在10mM的浓度下，Pb²⁺完全抑制XynRBM26的酶活性，Mn²⁺、Fe²⁺对该酶的抑制较强，Co²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺对该酶的抑制较弱；而其余金属离子及化学试剂及对该酶活性无影响或影响微弱。

表1 19种不同金属离子及化学试剂在两种浓度下对重组木聚糖酶XynRBM26的影响

6、纯化的重组木聚糖酶XynRBM26的NaCl抗性及NaCl稳定性测定：

酶的NaCl抗性测定：在酶促反应体系中加入0.5-5M NaCl，在pH5.5及45℃下进行酶促反应。酶的NaCl稳定性测定：将纯化的酶液置于0.5-5M NaCl溶液中，在37℃下处理1h，然后在pH5.5及45℃下进行酶促反应，以在37℃下保温1h但未加NaCl的酶液作为对照。以山毛榉木聚糖为底物，反应10min，测定纯化的XynRBM26酶学性质。结果表明：在反应体系中加入5M的NaCl仍然具有86％的酶活(图6)；重组酶经0.5-3.5M的NaCl在37℃下处理1h，该酶仍能保持100％以上的活性(图7)。

7、纯化的重组木聚糖酶XynRBM26的乙醇抗性及乙醇稳定性测定：

酶的乙醇抗性测定：在酶促反应体系中加入5.0-30.0％(v/v)乙醇，在pH5.5及45℃下进行酶促反应。酶的乙醇稳定性测定：将纯化的酶液置于3.0-25.0％(v/v)的乙醇中，在37℃下处理1h，然后在pH5.5及45℃下进行酶促反应，以在37℃下保温1h但未加乙醇的酶液作为对照。以山毛榉木聚糖为底物，反应10min，测定纯化的重组木聚糖酶XynRBM26的酶学性质。结果表明：随着乙醇含量的增加，木聚糖酶XynRBM26的活性逐渐降低，但在5.0-10.0％(v/v)的乙醇范围内可维持50％以上酶活性(图8)；经3.0-15.0％(v/v)乙醇在37℃下处理1h，该酶仍能保持80％左右的活性(图9)。

Claims (5)

1.一种木聚糖酶的编码基因XynRBM26，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种包含权利要求1所述的木聚糖酶基因XynRBM26的重组载体。

3.权利要求2所述重组载体转化宿主细胞所得的重组菌株。

4.一种木聚糖酶XynRBM26，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.一种木聚糖酶XynRBM26的制备方法，包括：

1)用权利要求2所述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶基因XynRBM26表达；

3)回收并纯化所表达的木聚糖酶XynRBM26。