CN102220304B

CN102220304B - 一种低温木聚糖酶XynAHJ2及其基因

Info

Publication number: CN102220304B
Application number: CN2011101425560A
Authority: CN
Inventors: 黄遵锡; 周峻沛; 董岩岩; 李俊俊; 唐湘华; 许波; 潘璐; 高雅洁
Original assignee: Yunnan Normal University
Current assignee: Yunnan Normal University
Priority date: 2011-05-30
Filing date: 2011-05-30
Publication date: 2012-07-11
Anticipated expiration: 2031-05-30
Also published as: CN102220304A

Abstract

本发明涉及一种低温木聚糖酶XynAHJ2及其基因。本发明提供了一种来源于芽孢杆菌（Bacillussp.）的木聚糖酶XynAHJ2，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，且本发明提供了上述木聚糖酶的编码基因xynAHJ2，低温木聚糖酶基因xynAHJ2的重组载体和低温木聚糖酶基因xynAHJ2的重组菌株。本发明的木聚糖酶具有以下性质：最适pH6.5；最适温度35℃，在10℃和20℃分别具有约40%和60%的酶活；良好的pH稳定性；较好的在低温下水解各种底物的能力；可作为一种饲料或食品添加剂应用于饲料与食品行业。

Description

一种低温木聚糖酶 XynAHJ2 及其基因

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说是一种低温木聚糖酶XynAHJ2及其基因。

背景技术

半纤维素是自然界中的第二丰富多聚糖。木聚糖是半纤维素的重要组分，其主要存在于蕨类、裸子植物和被子植物中，如农业副产物中的玉米芯、麦麸、米糠、秸秆和甘蔗渣等。木聚糖酶可将木聚糖降解成低聚糖、木糖和木糖衍生物，包括内切-1,4-β-D-木聚糖酶（endo-1,4-β-D-xylanase，EC 3.2.1.8）和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-arabinofuranosidase，EC 3.2.1.55）等（Collins et al. FEMS Microbiol Rev, 2005, 29: 3–23.）。根据氨基酸序列同源性，木聚糖酶主要归类于糖苷水解酶第10、11、39、43、52、62和67家族（Finn et al. Nucleic Acids Res, 2008, 36: D281–D288.）。

内切-1,4-β-D-木聚糖酶被认为是木聚糖酶中最重要的酶，主要归类于糖苷水解酶第10和11家族，具有广泛的应用性，如内切-1,4-β-D-木聚糖酶在饲料行业中可改善饲料性能并消除或降低抗营养作用、在造纸和纸浆工业中可作为生物漂白剂、在酿酒行业中可提高发酵效率并增加酒精的产率、在食品行业中可改善食品性能等。低温木聚糖酶可用于低温到中温的生境或加工过程，如水产生境常常为10–25℃、食品行业中的醒面和杆面过程需要在35℃以下进行等。将中温或者高温加工的过程转为低温加工过程还可起到降低能耗的作用（Beg et al. Appl Microbiol Biotechnol, 2001, 56: 326–338.）。但是，目前所获得的木聚糖酶，多为中温或高温酶（Wang et al. Bioresour Technol, 2011, 102: 3330–3336.），这些木聚糖酶在低温下（0–20℃）几乎都没有酶活。

发明内容

本发明的目的是提供一种低温木聚糖酶XynAHJ2。

本发明的再一目的是提供编码上述低温木聚糖酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明所述低温木聚糖酶XynAHJ2可得自芽孢杆菌（Bacillus sp.），如Bacillus sp. ATCC 31195。XynAHJ2的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

本发明的木聚糖酶XynAHJ2的最适pH值为6.5，在pH5.5–10.0的范围内维持50%以上的酶活性；经pH6.0–10.0的缓冲液处理1h，酶活剩余50%以上；最适温度为35℃，在10℃和20℃分别具有约40%和60%的酶活，具有低温酶的低温催化特性；37℃时半衰期>60min，45℃时半衰期约为4min，属于低温酶的温度不稳定特性；能有效地水解燕麦木聚糖、桦木木聚糖、山毛榉木聚糖、麸皮、玉米粉、豆粕和棉粕。

本发明提供了编码上述低温木聚糖酶的基因xynAHJ2，该基因序列如 SEQ ID NO. 2所示。

本发明通过PCR的方法分离克隆了低温木聚糖酶基因xynAHJ2，其全长990bp，起始密码为ATG，终止密码为TAG，编码329个氨基酸。经BLAST比对，该木聚糖酶基因xynAHJ2编码的氨基酸序列与GenBank中Geobacillus sp. Y412MC10来源的潜在木聚糖酶（ACX65537）具有最高的一致性，为66.5%；与确证活性的Paenibacillus sp. HPL-001来源内切-1,4-β-D-木聚糖酶（ACJ06666）的一致性为65.3%。说明木聚糖酶XynAHJ2是一种新的内切-1,4-β-D-木聚糖酶。

本发明还提供了包含上述低温木聚糖酶基因xynAHJ2的重组载体，优选为pET-xynAHJ2。将本发明的木聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，将本发明的木聚糖酶基因插入到质粒pET-28a（+）上的EcoRI和XhoI限制性酶切位点之间，得到重组大肠杆菌表达质粒pET-xynAHJ2。

本发明还提供了包含上述低温木聚糖酶基因xynAHJ2的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21(DE3)/xynAHJ2。

本发明的制备低温木聚糖酶XynAHJ2的方法按以下步骤进行：

1）用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶表达；

3）回收并纯化所表达的木聚糖酶XynAHJ2。

其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21（DE3），得到重组菌株BL21(DE3)/xynAHJ2。

本发明的木聚糖酶XynAHJ2最适pH在中性范围（pH6.5），pH稳定性在中性pH内最佳，最适温度较低（35℃）且在较低温度（10℃）具有较高活性（剩余约40%酶活），有效地水解燕麦木聚糖、桦木木聚糖、山毛榉木聚糖、麸皮、玉米粉、豆粕和棉粕，表明XynAHJ2在食品和水产饲料添加剂方面具一定的应用前景。

附图说明

图1：在大肠杆菌中表达的重组木聚糖酶的SDS-PAGE分析，其中，M：低分子量蛋白质Marker；1：纯化的重组木聚糖酶；2：含有重组木聚糖酶基因的大肠杆菌培养上清液。

图2：重组木聚糖酶的最适pH。

图3：重组木聚糖酶的pH稳定性。

图4：重组木聚糖酶的最适温度。

图5：重组木聚糖酶的热稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：芽孢杆菌（Bacillus sp.）同文献报道菌种性质，如Bacillus sp. ATCC 31195；大肠杆菌表达载体pET-28a（+）及菌株Escherichia coli BL21（DE3）可购于Novagen公司。

2、酶类及其它生化试剂：限制性内切酶、DNA聚合酶、连接酶和dNTP购自TaKaRa公司；燕麦木聚糖、桦木木聚糖和山毛榉木聚糖购自Sigma公司；其它都为国产试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。

3、培养基：

LB培养基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000ml，pH自然（约为7）。固体培养基在此基础上加2.0%（w/v）琼脂。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1：木聚糖酶基因xynAHJ2的克隆

提取芽孢杆菌基因组DNA：将液体培养2d的菌液离心取菌体，加入1mL溶菌酶，37℃处理60min，再加入裂解液，70℃水浴裂解60min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70%的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。

根据糖苷水解酶第10家族的保守序列（G-H-T-L-[V/I/L]-W-H和W-D-V-V-N-E）设计合成了简并引物GH10F和GH10R（表1）。

以芽孢杆菌总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，44℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环后72℃保温10min。得到一约150bp片段，将该片段回收后与pMD 18-T载体相连，然后送北京六合华大基因科技股份有限公司广州分公司测序。

根据测序得到的核甘酸序列，分别设计上游和下游TAIL-PCR特异性引物各二条：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般20–30nt，退火温度在50–60℃。并将它们分别命名为usp1和usp2（上游特异性引物）及dsp1和dsp2（下游特异性引物；表1）。

通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增产物送北京六合华大基因科技股份有限公司广州分公司测序。测序结果与已知基因序列片段相拼接，得到木聚糖酶基因xynAHJ2，该基因序列如 SEQ ID NO. 2所示。

实施例2：重组木聚糖酶XynAHJ2的制备

将表达载体pET-28a（+）进行双酶切（EcoRI和XhoI），同时将编码木聚糖酶的基因xynAHJ2进行双酶切（EcoRI和XhoI），将上述酶切的木聚糖酶基因xynAHJ2与表达载体pET-28a（+）相连接，获得含有木聚糖酶的基因xynAHJ2的重组质粒pET-xynAHJ2并转化大肠杆菌BL21（DE3），获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/xynAHJ2。

取含有重组质粒pET-xynAHJ2的E. coli BL21（DE3）菌株和只含有pET-28a（+）空质粒的E. coli BL21（DE3）菌株，以0.1%的接种量接种于LB（含50µg/mL Kan）培养液中，37℃快速振荡16h。然后将此活化的菌液以1%接种量接种到新鲜的LB（含50µg/mL Kan）培养液中，快速振荡培养约2–3h（OD₆₀₀达到0.6–1.0）后，加入终浓度0.7mM的IPTG诱导，于20℃继续振荡培养约20h或26℃振荡培养约8h。12000rpm离心5min，收集菌体。用适量的pH7.0 Tris-Hcl缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的初酶液经13,000rpm离心10min后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose纯化目的蛋白。SDS-PAGE结果（图1）表明，重组木聚糖酶在大肠杆菌中得到了表达，经Nickel-NTA Agarose纯化后为单一条带。

实施例3：重组木聚糖酶XynAHJ2的活性分析

酶活性测定方法采用3,5－二硝基水杨酸（DNS）法：将底物溶于0.1M缓冲液中，使其终浓度为0.5%（w/v）；反应体系含100μL适量酶液，900μL底物；底物在反应温度下预热5min后，加入酶液后再反应10min，然后加1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min，冷却至室温后在540nm波长下测定OD值。1个酶活单位（U）定义为在给定的条件下每分钟分解底物产生1μmol木糖所需的酶量。

实施例4：重组木聚糖酶XynAHJ2的性质测定

1、重组木聚糖酶XynAHJ2的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

酶的最适pH测定：将实施例2纯化的木聚糖酶XynAHJ2在37℃和pH4.0–11.0的缓冲液下进行酶促反应。酶的pH稳定性测定：将纯化的酶液置于pH5.0–11.0的0.1M缓冲液中，在25℃下处理1h以上，然后在pH6.0及37℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。缓冲液为：0.1M McIlvaine buffer（pH4.0–8.0），0.1M Tris-HCl（pH8.0–9.0）和0.1M glycine-NaOH（pH9.0–11.0）。以桦木木聚糖为底物，反应10min，测定纯化的XynAHJ2的酶学性质。结果表明：XynAHJ2的最适pH为6.5，在pH5.5–10.0的范围内维持50%以上的酶活性（图2）；经pH6.0–10.0的缓冲液处理1h，酶活剩余50%以上（图3）。

2、重组木聚糖酶XynAHJ2的最适温度及热稳定性测定方法如下：

酶的最适温度测定：在pH6.0的缓冲液中，于0–50℃下进行酶促反应。酶的热稳定性测定：将同样酶量的酶液置于设定的温度中（37℃，45℃或50℃）处理0–60min后，在pH6.0及37℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以桦木木聚糖为底物，反应10min，测定纯化的XynAHJ2的酶学性质。结果表明：XynAHJ2的最适温度为35℃，在10℃和20℃分别具有约40%和60%的酶活（图4）；37℃时XynAHJ2的半衰期>60min，45℃时半衰期约为4min（图5）。

3、重组木聚糖酶XynAHJ2的动力学参数测定方法如下：

酶的动力学参数一级反应时间测定：在pH6.5及35℃下，以0.5%（m/v）的桦木木聚糖作为底物，依次在酶促反应的1–30min内终止反应并测定酶活性，计算出酶活性与反应时间的比值，若在一定时间内该比值保持稳定，则此时间为一级反应时间。用0.05–1%（m/v）桦木木聚糖为底物，在pH6.5、35℃和一级反应时间下，根据Lineweaver-Burk方法测定Km、Vmax和kcat。经测定，在35℃ pH6.5条件下，XynAHJ2对桦木木聚糖的K _m、V _max和k _cat分别为0.51 mg⁻¹ ml⁻¹、16.05 mmol min⁻¹ mg⁻¹和11.88 s⁻¹。

4、不同金属离子及化学试剂对XynAHJ2酶活的影响测定方法如下：

在酶促反应体系中加入10mM的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。在37℃、pH6.0条件下测定酶活性。结果（表2）表明，10mM的Hg²⁺和SDS可完全抑制XynAHJ2；Pb²⁺和Cu²⁺对XynAHJ2的抑制较强（剩余酶活分别为~36%和~43%）；Fe²⁺、Co²⁺和Zn²⁺对XynAHJ2的抑制较弱（剩余酶活>60%）；β-mercaptoethanol可使XynAHJ2的酶活提高约0.3倍；其余金属离子和化学试剂对XynAHJ2的影响很小。

表2. 金属离子及化学试剂对重组木聚糖酶XynAHJ2活力的影响

5、木聚糖酶XynAHJ2的底物特异性

在35℃ pH6.5条件下，XynAHJ2对0.5%（w/v）的山毛榉木聚糖、燕麦木聚糖和桦木木聚糖的比活分别为19.56、14.94和13.47 U mg⁻¹；在20℃ pH6.0条件下，XynAHJ2对1%（w/v）的麸皮、玉米粉、豆粕和棉粕的比活分别为0.016、0.012、0.008和0.005 U mg⁻¹。

序列表

<110> 云南师范大学

<120> 一种低温木聚糖酶XynAHJ2及其基因

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 329

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌（Bacillus sp.）

<400> 1

Met Val Lys Thr Lys Val Glu Val Pro Ser Leu Ser Lys Val Tyr Glu

1 5 10 15

Glu Tyr Phe Asn Ile Gly Ala Ala Val Asn Leu Asn Thr Ile Lys Ser

20 25 30

Gln Lys Asp Leu Leu Arg Lys His Phe Asn Ser Ile Thr Ala Glu Asn

35 40 45

Asp Met Lys Phe Ile Glu Ile Gln Pro Ser Glu Gly Gly Val Thr Phe

50 55 60

Glu Lys Ala Asp Gln Leu Ala Ala Phe Ala Lys Glu Asn Gly Met Lys

65 70 75 80

Met Arg Gly His Thr Leu Val Trp His Asn Gln Thr Pro Glu Trp Val

85 90 95

Phe Glu Gly Ala Asp Arg Glu Thr Leu Leu Gln Arg Met Lys Glu His

100 105 110

Ile Thr Ala Val Met Asn Arg Tyr Lys Gly Thr Ile Phe Cys Trp Asp

115 120 125

Val Val Asn Glu Ala Val Thr Asp Glu Gly Pro Val Leu Leu Arg Pro

130 135 140

Thr Lys Trp Leu Glu Ile Ile Gly Glu Asp Tyr Ile Glu Lys Ala Phe

145 150 155 160

Glu Tyr Ala His Glu Ala Asp Pro Asp Ala Leu Leu Phe Tyr Asn Asp

165 170 175

Tyr Asn Glu Ser Asn Pro Glu Lys Arg Glu Lys Ile Tyr Lys Leu Val

180 185 190

Lys Ser Leu Val Asp Lys Gly Val Pro Ile His Gly Val Gly Leu Gln

195 200 205

Ala His Trp Asn Leu Val Asn Pro Gly Leu Glu Asp Ile Arg Thr Ala

210 215 220

Ile Glu Arg Tyr Ala Ser Leu Gly Leu Lys Leu His Leu Thr Glu Leu

225 230 235 240

Asp Val Ser Val Phe Asn Phe Glu Asp Lys Arg Thr Asp Leu Thr Glu

245 250 255

Pro Thr His Glu Val Leu Glu Leu Gln Ala Glu Arg Tyr Cys Gln Val

260 265 270

Phe Gln Leu Leu Arg Gln Tyr Arg Asn His Ile Thr Ser Val Thr Phe

275 280 285

Trp Gly Ala Ala Asp Asp Tyr Thr Trp Leu Ser Asp Phe Pro Val Arg

290 295 300

Gly Arg Lys Asn Trp Pro Phe Leu Phe Asp Glu Asn His Gln Pro Lys

305 310 315 320

Glu Ser Phe Trp Lys Val Val Gln Phe

325

<210> 2

<211> 990

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌（Bacillus sp.）

<400> 2

atggtaaaaa cgaaagtaga agttccttct ttatctaaag tgtatgaaga atattttaat 60

attggtgccg cagttaacct aaatacgata aagtcacaaa aggatttatt aagaaaacat 120

tttaatagta ttacagctga aaatgatatg aaattcatcg aaatccagcc ttctgagggg 180

ggggttacgt ttgaaaaggc cgatcaatta gctgcttttg caaaggaaaa tggaatgaag 240

atgcgcgggc atacattggt ctggcataat caaacgccag aatgggtatt tgaaggcgca 300

gatagagaaa cacttttaca acgaatgaag gaacatatta ctgcggtaat gaacagatat 360

aaagggacga ttttctgctg ggatgtggta aacgaagcgg taacggatga gggtccagtt 420

ttattacgac ctacaaaatg gctagaaata atcggagaag attatatcga aaaagcattt 480

gaatatgcac atgaggctga ccctgacgcc ctgctttttt acaatgacta taatgaatcc 540

aacccggaaa aacgcgaaaa aatttataaa cttgttaaat ctctagtgga taagggtgtt 600

ccgattcacg gagttggcct ccaggcgcat tggaatctag taaatcccgg tcttgaagat 660

attcgtacag cgattgaacg atatgcttcc cttggattaa agctccatct tacagaatta 720

gatgtatccg tcttcaactt tgaagataag aggacggacc ttacagaacc aacccatgaa 780

gtgctagaat tgcaggctga aagatactgc caagtgtttc aattgcttcg acaatatcga 840

aatcatatta cttctgtaac cttttggggc gcagccgatg attatacatg gttaagcgat 900

tttcctgtta gaggaagaaa aaattggccg tttctttttg atgaaaatca tcaaccaaaa 960

gaatcttttt ggaaggttgt ccaattttag 990

Claims

1.一种低温木聚糖酶XynAHJ2，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

2.一种编码权利要求1所述的低温木聚糖酶基因xynAHJ2，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

3.一种包含权利要求2所述低温木聚糖酶基因xynAHJ2的重组载体。

4.一种包含权利要求2所述低温木聚糖酶基因xynAHJ2的重组菌株。