CN101701213B

CN101701213B - 一种双功能木聚糖酶xynbe18及其基因和应用

Info

Publication number: CN101701213B
Application number: CN2009102359412A
Authority: CN
Inventors: 姚斌; 石鹏君; 刘欣; 罗会颖; 柏映国; 黄火清; 杨培龙; 孟昆; 赵珩; 王亚茹; 史秀云; 袁铁铮
Original assignee: Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Wuhan Sunhy Biology Co., Ltd.
Priority date: 2009-10-30
Filing date: 2009-10-30
Publication date: 2012-06-06
Anticipated expiration: 2029-10-30
Also published as: CN101701213A

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种双功能木聚糖酶XYNBE18及其基因和应用。本发明提供了一种来源于类芽孢菌属Paenibacillus sp.E18 CGMCC3327的双功能木聚糖酶XYNBE18，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本发明提供了编码上述木聚糖酶的基因组编码基因xynBE18。本发明的木聚糖酶的具有以下性质：最适pH7.0，最适温度50℃，较好的pH稳定性，同时具有木聚糖酶和葡聚糖酶活性。做为一种新型的酶制剂，可广泛用于动物饲料、食品、能源工业等。

Description

一种双功能木聚糖酶XYNBE18及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种双功能木聚糖酶XYNBE18及其基因和应用。

背景技术

半纤维素作为植物细胞壁的主要组分，是陆生植物中继纤维素之后含量最丰富的碳水化合物，约占植物干重的35％。其中木聚糖是半纤维素中的代表性组分，是自然界中含量仅次于纤维素的第二丰富的多聚糖，几乎占地球可更新有机碳含量的三分之一(Collins et al.FEMS Microbiology Reviews.2005，29：3-23.)。

对植物细胞壁的降解是微生物获取营养的第一步，需要多种纤维素酶和半纤维素酶的共同作用。为了更有效地完成这一过程。微生物则在自然选择的压力下，进化产生出能够同时降解多种底物的多功能酶。多功能木聚糖酶作为其中的重要成员，近年来也得到了更为深入和广泛的研究。Chen等从一株Aspergillus niger A-25中分离得到一个木聚糖酶XynIII，具有β-1，3-1，4-葡聚糖酶活性，可以水解桦木木聚糖、燕麦木聚糖、地衣多糖和大麦葡聚糖等，研究还证实该酶的木聚糖酶和葡聚糖酶活性来自于同一活性位点(Chen et al.Journal of Microbiology and Biotechnology.2006，16：1132-1138.)。Flint等报导，一个分离自菌株Ruminococcus flavefaciens 17的木聚糖酶XynD同一条多肽链上有两个独立的结构域，分别具有木聚糖酶和β-1，3-1，4-葡聚糖酶活性(Flint et al.Journal of Bacteriology.1993，175：2943-2951.)。

饲料中添加多功能木聚糖酶，可显著降低消化道中的食糜粘度，提高动物内源性消化酶活性地发挥，其酶解产物还具有调节动物肠道微生态环境、降低动物结肠炎的发生率和减少抗生素等兽药用量的功效。同时，相对于添加木聚糖酶和纤维素酶混合物，多功能木聚糖酶在降低生产成本，提高酶学反应效率方面都有着不可比拟的优势。

发明内容

本发明的目的是提供一种能高效应用的双功能木聚糖酶。

本发明的再一目的是提供编码上述双功能木聚糖酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述双功能木聚糖酶的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述双功能木聚糖酶的应用。

本发明的另一目的是提供一种类芽孢菌。

本发明提供了一种双功能木聚糖酶XYNBE18，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了编码上述双功能木聚糖酶的基因xynBE18。具体地，该基因的基因组序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了包含上述双功能木聚糖酶基因xynBE18的重组载体，优选为pET22b-xynBE18。

本发明还提供了包含上述双功能木聚糖酶基因xynBE18的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。

本发明还提供了一种制备双功能木聚糖酶XYNBE18的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶表达；以及

3)回收并纯化所表达的木聚糖酶XYNBE18。

本发明还提供了上述双功能木聚糖酶XYNBE18的应用。

本发明还提供了能够从中克隆双功能木聚糖酶基因xynBE18的类芽孢菌。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、食品、工业中应用新的木聚糖酶。本发明获得的双功能木聚糖酶XYNBE18，最适pH7.0，同时具有木聚糖酶和葡聚糖酶活性。这些性质符合动物消化生理特点，提高饲料消化能和代谢能，降低配方成本，减少环境污染。

根据本发明的双功能木聚糖酶XYNBE18，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

MRLREAFKKHFLVGAAVDPVTLDTQRDLLIEHFNSVTVESDMKFERLHPSEDQYTFEAADRLVSLAKANGMGVRGHTLVWHNQTPKWVFEHQDGSPVDRETLLALMKSHIDTVLSRYRGDIYAWDVVNEAVSDSGSELLRPSKWLDIIGDDFIAKAFEYAHEADPGALLFYNDYNEAVPEKREKIYALVKSLLEQGVPIHGLGIQSHWSLHHPSVDDIRQATEQYASLGLKLHITELDVSMFAFDDRRIDLAAPTEEMLALQAERYGQFFRLFQEYSEYITSVTFWGAADDYTWLDHFPVRGRKNWPFLFDIKHQPKPSYWKVLETI

其中，该酶具有327个氨基酸，无信号肽序列。

因此，成熟的双功能木聚糖酶XYNBE18的理论分子量为37.8kDa。

该木聚糖酶XYNBE18在中性pH范围内具有较高活性。本发明筛选到类芽孢菌Paenibacillus sp.E18 CGMCC No.3327所产生的木聚糖酶，其最适pH值为7.0，在pH 6.0～10.5的范围内维持80％以上的酶活性；最适温度为50℃，在40℃-60℃间均具有50％以上的酶活力；该酶只有一个催化结构域，除可作用于木聚糖外，对于大麦β-葡聚糖、地衣多糖、昆布多糖也有较好的降解作用。其对大麦β-葡聚糖的降解能力相对于最适底物桦木木聚糖可以达到40％以上，其次为地衣多糖和昆布多糖，其比例分别为33.2％和20.5％。但不能水解羧甲基纤维素和微晶纤维素。这种性质的木聚糖酶还未曾有过报道。

本发明还提供了编码上述双功能木聚糖酶XYNBE18的基因xynBE18。

该酶的全基因序列如SEQ ID NO.2所示：

ATGAGGTTGCGTGAAGCGTTTAAAAAGCATTTCTTGGTGGGGGCCGCCGTGGATCCGGTCACATTGGACACGCAGAGGGATTTGCTTATCGAGCATTTCAACAGCGTGACTGTCGAAAGTGATATGAAGTTCGAAAGGCTGCATCCGTCGGAAGATCAATATACGTTTGAAGCGGCGGATCGCCTGGTGTCTCTGGCCAAAGCCAATGGCATGGGGGTCAGGGGCCACACGCTGGTCTGGCACAATCAGACGCCGAAATGGGTGTTTGAACATCAGGACGGCAGCCCGGTTGACCGGGAGACGCTGCTGGCCCTCATGAAATCTCACATCGACACGGTTTTGTCCCGTTACAGGGGAGATATCTATGCCTGGGACGTGGTGAACGAAGCGGTGTCCGACAGCGGCAGCGAACTGCTGCGGCCTTCAAAGTGGCTGGACATCATCGGCGACGATTTCATCGCCAAAGCGTTTGAGTATGCCCATGAGGCGGACCCGGGGGCGCTGCTCTTTTATAACGATTACAACGAAGCCGTACCGGAGAAAAGGGAGAAAATTTATGCGCTCGTCAAATCGTTGCTCGAGCAGGGAGTGCCCATTCATGGTCTCGGCATCCAGAGTCACTGGAGCCTGCATCATCCGTCCGTGGACGATATCCGCCAAGCGACCGAACAGTATGCGAGCCTCGGCTTGAAGCTGCACATTACGGAGCTGGATGTCTCCATGTTTGCGTTCGATGACCGGCGGATCGATCTCGCGGCTCCGACCGAAGAGATGCTTGCCCTTCAAGCGGAACGTTACGGGCAATTTTTCCGGTTGTTTCAGGAATACAGCGAATATATAACGTCCGTCACTTTTTGGGGGGCTGCAGACGATTATACCTGGCTGGACCATTTCCCTGTGCGCGGCCGGAAAAACTGGCCCTTCCTGTTCGACATCAAGCATCAGCCCAAGCCGTCTTATTGGAAGGTGCTTGAAACCATATGA

本发明通过PCR的方法分离克隆了这一木聚糖酶基因xynBE18，DNA全序列分析结果表明，木聚糖酶XYNBE18结构基因xynBE18全长984bp，无信号肽序列。

成熟蛋白理论分子量为37.8kDa。将木聚糖酶基因xynBE18序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对。该基因与来源于Paenibacillus sp.HPL-001的木聚糖酶氨基酸序列一致性为85％。说明XYNBE18是一种新的木聚糖酶。

本发明还提供了包含上述木聚糖酶基因的重组载体，优选为pET22b-xynBE18。将本发明的木聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将木聚糖酶基因插入到质粒pET22b(+)上的NcoI和HindIII限制性酶切位点之间，得到重组表达质粒pET22b-xynBE18。

本发明还提供了包含上述木聚糖酶基因的重组菌株，优选为重组菌株BL21/xynBE18。

本发明还提供了一种制备双功能木聚糖酶的方法，包括以下步骤：

1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶的表达；以及

3)回收并纯化所表达的木聚糖酶。

其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21(DE3)，得到重组菌株BL21/xynBE18。

本发明还提供了上述双功能木聚糖酶的应用。

本发明分离得到了一种类芽孢菌Paenibacillus sp.E18，其保藏编号为CGMCCNo.3327。

本发明的木聚糖酶最适pH为7.0，在pH6.0～10.5都有较高的酶活性；pH稳定性好；比活力为51.7U/mg。其双功能酶活性，可降低木聚糖酶在工业生产上应用成本。pH适应范围提高饲料消化能和代谢能，降低配方成本，减少环境污染；提高谷物加工副产品的营养价值，提升饲料产品品质。本发明的木聚糖酶可应用于酿酒工业，降低物料粘度，可以有利于淀粉酶作用于淀粉层，提高淀粉利用率，增加酒精的产率。因此，本发明的木聚糖酶在能源工业中的应用也显示出其巨大的潜力。水解产物(木糖和低聚木糖)可应用在食品行业，作为增稠剂、脂肪代替物和抗冻食品添加剂；在制药工业中木聚糖与其它物质结合使用，可以延缓药物成分的释放。木聚糖的水解产物还可以进一步转化为液体燃料、单细胞蛋白、溶剂和低热量甜味剂。

附图说明

图1：在大肠杆菌中表达的重组木聚糖酶的SDS-PAGE分析，其中，1：低分子量蛋白质Marker；2：含有空载体的大肠杆菌培养上清液3：含有木聚糖酶基因的大肠杆菌培养上清液浓缩液；4：纯化的重组木聚糖酶。

图2重组木聚糖酶的最适pH。

图3重组木聚糖酶的pH稳定性。

图4重组木聚糖酶的最适温度。

图5重组木聚糖酶的热稳定性。

类芽孢杆菌Paenibacillus sp.E18(CGMCC No.3327)，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.3327，保藏日期2009年10月12号。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：类芽孢杆菌Paenibacillus sp.E18(CGMCC No.3327)，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.3327。大肠杆菌表达载体pET22b(+)及菌株Escherichia coli BL21(DE3)购自于Novagen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。燕麦木聚糖购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)富集培养基(g/l)：NaCl 5.5，K₂HPO₄ 5.3，KH₂PO₄ 3.0，(NH₄)₂SO₄ 2.5，CaCl₂ 0.5，MgSO₄·7H₂O 0.1，FeSO₄ 0.0075，CoCl₂ 0.003，MnSO₄·H₂O 0.0025，ZnSO₄ 0.002，and corn stover 8.0，pH 7.0。

(2)平板筛选培养基(g/l)：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.0，琼脂15.0，pH7.0。

(3)LB培养基(g/l)：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.0，pH7.0。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1类芽孢杆菌Paenibacillus sp.E18(CGMCC No.3327)分离纯化，及其产酶特性

将玉米青贮饲料按1％(w/v)接种于富集培养基中，37℃培养3d，离心收集菌体，然后稀释涂布于产酶培养基((NH₄)₂SO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，CaCl₂ 0.2g/L，木聚糖1％，1.5％琼脂糖，pH7.0)平板上，37℃培养1d，在产酶培养基平板可见透明圈产生。产透明圈最大的菌株经划线分离纯化后定名为E18，其菌落为灰白色，小而扁平。16S rDNA鉴定该菌株为类芽孢杆菌，命名为Paenibacillus sp.E18。

实施例2类芽孢菌属Paenibacillus sp.E18(CGMCC No.3327)木聚糖酶编码基因xynBE18的克隆

提取类芽孢菌属Paenibacillus sp.E18(CGMCC No.3327)基因组DNA：

将液体培养1d的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入2mL提取液，研磨5min，然后将研磨液置于50mL离心管中，65℃水浴锅裂解20min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。

根据第十家族木聚糖酶基因的保守(YAWDVVNE和DGIGMQSH)序列设计合成了简并引物P1，P2

P1：5′-TACGACTGGGAYGTNGDIAAYGA-3′；

P2：5′-GTGACTCTGGAWICCNAYICCRT-3′)。

以Paenibacillus sp.E18(CGMCC No.3327)总DNA为模板进行PCR扩增。降落PCR反应参数为：94℃变性5min；94℃变性30sec，60-50℃退火30sec，72℃延伸1min，10个循环(每个循环降落1℃)，然后94℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环，72℃保温10min。得到一约258bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送三博生物技术有限公司测序。

根据测序得到的核甘酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22～30nt，退火温度在60～65℃。并将它们分别命名为usp1，usp2，usp3(上游特异性引物)，dsp1，dsp2，dsp3(下游特异性引物)见表1。

表1.木聚糖酶XYNBE18 TAIL-PCR特异性引物

通过反向TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。通过两步Tail-PCR获得该片段的上下游侧翼序列，全序列共长3.8kb，包括三个完整的开放阅读框(ORF)。木聚糖酶基因xynBE18(GenBankaccession no.FJ899683)由984个碱基组成，编码327个氨基酸和一个终止密码子，在GenBank中的比对结果表明它与来源于Paenibacillus sp.HPL-001的木聚糖酶基因全序列相似性为85％，其次是来源于Geobacillus stearothermophilus的木聚糖酶基因，相似性为65％。xynBE18编码蛋白预计分子量为37.8kDa，等电点为5.43。

它的上游是一个GH43家族基因abf43AE18(GenBank accession no.FJ899684)，全长1536bp，编码511个氨基酸和一个终止密码子。与Clostridium phytofermentans来源的GH43基因具有56％的最高相似性，与一个来源于Bifidobacteriumadolescentis DSM20083的阿拉伯呋喃糖苷酶基因相似性为47％。它所编码的蛋白预计分子量为57.5kDa，等电点为5.29。

基因下游为一个乙酰酯酶基因axeE18(GenBank accession no.FJ899685)，包含789个碱基，编码263个氨基酸。与其相似性较高的假设酯酶基因分别来源于Geobacillus sp.Y412MC10(相似性70％)。

实施例3重组木聚糖酶的制备。

将表达载体pET22b(+)进行双酶切(NcoRI+HindIII)，同时将编码木聚糖酶的基因xynBE18双酶切(NcoRI+HindIII)，切出编码成熟木聚糖酶的基因片段与表达载体pET22b(+)连接，获得含有Paenibacillus sp.E18(CGMCC No.3327)木聚糖酶基因xynBE18的重组质粒pET22b-xynBE18并转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌菌株BL21/xynBE18。

取含有重组质粒的BL21菌株，接种于3mL LB(100μg/mL的氨苄青霉素)培养液中，37℃培养过夜。1％接菌于20mL LB(加有100μg/mL的氨苄青霉素)，37℃振荡培养约2～3h(OD₆₀₀达到0.6～0.8)后加入终浓度0.6mmol/L的诱导剂IPTG，20℃180rpm震荡培养12h。12000rpm离心5min，收集培养基上清。DNS法测定木聚糖酶的活力。重组木聚糖酶的表达量为4.4U/mL。SDS-PAGE结果(图1)表明，重组木聚糖酶在大肠杆菌中得到了表达。所表达的木聚糖酶经过纯化之后，其蛋白质的含量达到总蛋白的90％以上。

实施例4重组木聚糖酶的活性分析

DNS法：具体方法如下：在pH6.5，60℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mLDNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。

实施例5重组木聚糖酶XYNBE18的性质测定

1、重组木聚糖酶XYNBE18的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

将实施例3纯化的重组木聚糖酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物木聚糖用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中50℃下进行木聚糖酶活力测定。结果(图2)表明，XYNBE18的最适pH为7.0，在pH6.0～10.5的范围内，酶活性均维持在最大酶活性的80％以上。木聚糖酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH7.0缓冲液体系中50℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果(图3)表明，木聚糖酶在pH 6.0-10.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在50％以上，这说明此酶具有较好的pH稳定性。

2、木聚糖酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：

木聚糖酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH7.0)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为木聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在50℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图4)表明，其最适温度为50℃。酶的热稳定性性试验表明(图5)，重组酶在40℃时稳定性非常好。50℃下保温30min，剩余酶活性为20％。

3、木聚糖酶的K_m值测定方法如下：

用不同浓度的桦木木聚糖为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH7.0)缓冲液体系中，50℃下测定酶活性，计算出其在50℃下的k_m值。经测定，此木聚糖酶在50℃下以木聚糖为底物的k_m值为0.16mg/mL，最大反应速度V_max为44.25μmol/min·mg。

4、不同金属离子化学试剂对XYNBE18酶活的影响测定如下：

在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为1，5和10mmol/L。在40℃、pH4.5条件下测定酶活性。结果(表2)表明，K⁺、Na⁺、Li⁺在高浓度和低浓度时对酶活都有轻微的促进作用，浓度高时促进作用稍有降低；Co²⁺、Cr³⁺、Pb⁺在低浓度时对酶活有不同程度的促进，但随着浓度的升高，其作用转变为大幅度的抑制；Mn²⁺、Ca²⁺的促进和抑制作用间的转换较前者稍显温和；Ni²⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、SDS等对酶活的抑制随浓度增加而加强；EDTA在不同浓度下都会轻微的抑制酶活；而β-Met的促进作用在高浓度时得到更好的体现；重金属离子Ag⁺、Hg²⁺在低浓度时即可强烈抑制酶活，高浓度时甚至会出现沉淀现象。其他离子对酶活的抑制作用由强到弱排序为Zn²⁺＞Fe³⁺＞Ni²⁺＞SDS＞Cu²。

表2.各种化学试剂对木聚糖酶XYNBE18活力的影响

注：“-”代表无法检测。

5、重组木聚糖酶的底物特异性

该酶除可作用于木聚糖外，对于大麦β-葡聚糖、地衣多糖、昆布多糖也有较好的降解作用(表3)。其对大麦β-葡聚糖的降解能力相对于最适底物桦木木聚糖可以达到40％以上，其次为地衣多糖和昆布多糖，其比例分别为33.2％和20.5％。但不能水解羧甲基纤维素和微晶纤维素。

表3.木聚糖酶XYNBE18底物特异性分析

6、木聚糖酶降解燕麦木聚糖产物的分析如下：

在500μL 1％的木聚糖中加入100μL纯化的酶液，最适温度下保温3～4h。用无水乙醇将酶蛋白沉淀，上清液用2500色谱仪，利用高效阴离子交换色谱-脉冲安培(HPAEC-PAD)检测方法，进行产物中糖种类的分析。分析结果表明：木聚糖酶XYNBE18降解桦木木聚糖的产物主要是木糖，木二糖，和木三糖。产物中木糖含量为47.1％，木二糖含量为34.4％，木三糖的含量为18.5％；木聚糖酶XYNBE18降解燕麦木聚糖的产物中木糖含量为57.7％，木二糖含量为32.8％，木三糖的含量为9.5％。

序列表

<110>中国农业科学院饲料研究所

<120>一种双功能木聚糖酶XYNBE18及其基因和应用

<160>2

<210>1

<211>327

<212>PRT

<213>种类芽孢菌(Paenibacillus sp.E18)

<400>1

MRLREAFKKH FLVGAAVDPV TLDTQRDLLI EHFNSVTVES DMKFERLHPS

EDQYTFEAAD 60

RLVSLAKANG MGVRGHTLVW HNQTPKWVFE HQDGSPVDRE TLLALMKSHI

DTVLSRYRGD 120

IYAWDVVNEA VSDSGSELLR PSKWLDIIGD DFIAKAFEYA HEADPGALLF

YNDYNEAVPE 180

KREKIYALVK SLLEQGVPIH GLGIQSHWSL HHPSVDDIRQ ATEQYASLGL

KLHITELDVS 240

MFAFDDRRID LAAPTEEMLA LQAERYGQFF RLFQEYSEYI TSVTFWGAAD

DYTWLDHFPV 300

RGRKNWPFLF DIKHQPKPSY WKVLETI 327

<210>2

<211>984

<212>DNA

<213>种类芽孢菌(Paenibacillus sp.E18)

<400>2

atgaggttgc gtgaagcgtt taaaaagcat ttcttggtgg gggccgccgt ggatccggtc 60

acattggaca cgcagaggga tttgcttatc gagcatttca acagcgtgac tgtcgaaagt 120

gatatgaagt tcgaaaggct gcatccgtcg gaagatcaat atacgtttga agcggcggat 180

cgcctggtgt ctctggccaa agccaatggc atgggggtca ggggccacac gctggtctgg 240

cacaatcaga cgccgaaatg ggtgtttgaa catcaggacg gcagcccggt tgaccgggag 300

acgctgctgg ccctcatgaa atctcacatc gacacggttt tgtcccgtta caggggagat 360

atctatgcct gggacgtggt gaacgaagcg gtgtccgaca gcggcagcga actgctgcgg 420

ccttcaaagt ggctggacat catcggcgac gatttcatcg ccaaagcgtt tgagtatgcc 480

catgaggcgg acccgggggc gctgctcttt tataacgatt acaacgaagc cgtaccggag 540

aaaagggaga aaatttatgc gctcgtcaaa tcgttgctcg agcagggagt gcccattcat 600

ggtctcggca tccagagtca ctggagcctg catcatccgt ccgtggacga tatccgccaa 660

gcgaccgaac agtatgcgag cctcggcttg aagctgcaca ttacggagct ggatgtctcc 720

atgtttgcgt tcgatgaccg gcggatcgat ctcgcggctc cgaccgaaga gatgcttgcc 780

cttcaagcgg aacgttacgg gcaatttttc cggttgtttc aggaatacag cgaatatata 840

acgtccgtca ctttttgggg ggctgcagac gattatacct ggctggacca tttccctgtg 900

cgcggccgga aaaactggcc cttcctgttc gacatcaagc atcagcccaa gccgtcttat 960

tggaaggtgc ttgaaaccat atga 984

Claims

1.一种双功能木聚糖酶XYNBE18，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种双功能木聚糖酶基因xynBE18，其特征在于，编码权利要求1所述的双功能木聚糖酶XYNBE18。

3.如权利要求2所述的双功能木聚糖酶基因xynBE18，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

4.包含权利要求2或3所述双功能木聚糖酶基因xynBE18的重组载体。

5.包含权利要求2或3所述双功能木聚糖酶基因xynBE18的重组载体，所述重组载体通过将基因xynBE18经NcoRI+HindIII双酶切后插入载体pET22b的NcoRI和HindIII酶切位点之间而构建得到。

6.包含权利要求2或3所述双功能木聚糖酶基因xynBE18的重组菌株。

7.如权利要求6的重组菌株，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。

8.一种制备双功能木聚糖酶XYNBE18的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶表达；以及

3)回收并纯化所表达的木聚糖酶XYNBE18。

9.权利要求1所述双功能木聚糖酶XYNBE18作为饲料添加剂的应用。

10.一种类芽孢菌Paenibacillus sp.E18，其保藏编号为CGMCC No.3327。