发明内容
本发明的目的是提供一种能高效应用的高温酸性木聚糖酶木聚糖酶。
本发明的再一目的是提供编码上述高温酸性木聚糖酶的基因。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
本发明的另一目的是提供一种制备上述高温酸性木聚糖酶的基因工程方法。
本发明的另一目的提供上述高温酸性木聚糖酶的应用。
本发明从瓶霉(Phialophora sp.J88CGMCC 3873)(保藏日期:2010年5月25号,保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所100101),其保藏号为:CGMCC No.3873。)中分离得到一种新的高温酸性木聚糖酶XYN10J88。
本发明提供了一种高温酸性木聚糖酶XYN10J88,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1:
MRGLKASLFAYLGTASIVSADGLNVRAQAAGKKYFGTAISTTVLNDATADAIAKN
YQDFGQYTCENEMKFDATEPSRNSFSYGSADMIVAQAQADGQIMRCHNLVWHN
QVPSWVTDGNFDNATLISIMKNHIANVVGHYKGKCYAWDVGNEALNEDGSYMT
SGSVWGSTIGPAYIPIAFAAAAEADPAAKLyYNDYNCEKAGAKSTGAQNLIKMVK
SYGAPIHGIQGHFTTGQVGGSSALVSNMQAFTALGVEVAYTELDMATPSSDPDLTQ
QATDYATVVTSCKQVPDCVGITIWEFSDRYTWLTNSAPLPWDVNFQKKPAYTSILD
AWGGSATGSATSTPTTMATSTTTAGPAPSGGGGGCTAAHWAQCGGTGYTGCTTC
ASPYTCQVSNPYYSQCL
其中,该酶基因编码399个氨基酸,N端20个氨基酸为其预测的信号肽序列“mrglkaslfaylgtasivsa”(SEQ ID NO.3)。
因此,成熟的高温酸性木聚糖酶XYN10J88的理论分子量为40.0kDa,其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示:
DGLNVRAQAAGKKYFGTAISTTVLNDATADAIAKNYQDFGQYTCENEMKFDATE
PSRNSFSYGSADMIVAQAQADGQIMRCHNLVWHNQVPSWVTDGNFDNATLISIM
KNHIANVVGHYKGKCYAWDVGNEALNEDGSYMTSGSVWGSTIGPAYIPIAFAAA
AEADPAAKLyYNDYNCEKAGAKSTGAQNLIKMVKSYGAPIHGIQGHFTTGQVGG
SSALVSNMQAFTALGVEVAYTELDMATPSSDPDLTQQATDYATVVTSCKQVPDCV
GITIWEFSDRYTWLTNSAPLPWDVNFQKKPAYTSILDAWGGSATGSATSTPTTMAT
STTTAGPAPSGGGGGCTAAHWAQCGGTGYTGCTTCASPYTCQVSNPYYSQCL
本发明的木聚糖酶XYN10J88具有好的热稳定性,同时在常温下、酸性和中性的范围内均具有高活性、抗蛋白酶降解等特性。本发明筛选到Phialophora sp.J88CGMCC 3873所产生的木聚糖酶,其最适pH值为4.0,在pH4.0~7.0的范围内维持50%以上的酶活性;最适温度为70℃,在40℃仍具有50%左右的酶活力;用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理120分钟,酶活性维持在50%以上。
本发明提供了编码上述高温酸性木聚糖酶xyn10J88。具体地,该基因的基因组序列如SEQ ID NO.4所示:
atgcgtggtctcaaagccagcttgttcgcctaccttggcacggcgagcatcgtctcggccgatggcctcaatgttcgcgcgcagg
ccgcgggaaagaagtactttggcaccgccatcagcaccaccgtcctcaacgacgcgactgcggacgcgatagccaagaactac
caggacttcggacagtacacctgtgagaacgagatgaagttcgacgccaccgagccatccaggaatagcttcagctatggcagc
gccgacatgatcgtagcgcaggcgcaagccgacggccagatcatgaggtgccacaaccttgtctggcataaccaggtgccctc
gtgggttaccgacggcaacttcgacaacgcgaccctgatcagcatcatgaagaaccacatcgccaacgtggtcgggcactacaa
gggcaagtgctatgcgtgggatgtgggaaacgaggccctgaacgaggacggctcgtacatgacgtctggttccgtgtgggggt
cgaccatcgggccggcctacatccccatagccttcgcggcggcagcggaggcagacccggcggccaagctgtactacaacga
ctacaactgtgagaaggcgggggcaaaatccacgggcgcgcagaacctgatcaagatggtcaagtcgtacggagccccgatc
catggcatccaggggcatttcacgaccggccaggtcgggggctcttccgcgctggtgagcaacatgcaggccttcactgccctg
ggcgtcgaggtggcctataccgagctcgacatggcgacgccgtcatccgacccggatctcacccaacaggctaccgactatgc
caccgtggtgacgtcgtgcaagcaggtgccggactgcgtgggcatcacgatctgggaattctcggaccggtatacgtggctcac
caactcggcgccgctgccgtgggacgtcaatttccagaagaaaccggcgtacaccagcatcctggatgcttgggggggctcgg
ccacaggcagtgcgacaagcacgccgaccaccatggctaccagcaccaccacggcaggtccggctccctcgggcggaggg
ggcggctgcacggcggcccactgggcgcagtgcggcgggactggatacacgggatgcaccacctgtgcgtccccgtatacct
gtcaagtctctaatccctactacagtcagtgtctgtaa
本发明通过PCR的方法分离克隆了木聚糖酶基因xyn10J88,DNA全序列分析结果表明,木聚糖酶XYN10J88结构基因xyn10J88全长1200bp。其中,信号肽的碱基序列为:
ATGCGTGGTCTCAAAGCCAGCTTGTTCGCCTACCTTGGCACGGCGAGCATCGT
CTCGGCC(SEQ ID NO.6)。
成熟的木聚糖酶XYN10J88的基因序列如SEQ ID NO.5所示。
SEQ ID NO.5
gatggcctcaatgttcgcgcgcaggccgcgggaaagaagtactttggcaccgccatcagcaccaccgtcctcaacgacgcgac
tgcggacgcgatagccaagaactaccaggacttcggacagtacacctgtgagaacgagatgaagttcgacgccaccgagccat
ccaggaatagcttcagctatggcagcgccgacatgatcgtagcgcaggcgcaagccgacggccagatcatgaggtgccacaa
ccttgtctggcataaccaggtgccctcgtgggttaccgacggcaacttcgacaacgcgaccctgatcagcatcatgaagaaccac
atcgccaacgtggtcgggcactacaagggcaagtgctatgcgtgggatgtgggaaacgaggccctgaacgaggacggctcgt
acatgacgtctggttccgtgtgggggtcgaccatcgggccggcctacatccccatagccttcgcggcggcagcggaggcagac
ccggcggccaagctgtactacaacgactacaactgtgagaaggcgggggcaaaatccacgggcgcgcagaacctgatcaaga
tggtcaagtcgtacggagccccgatccatggcatccaggggcatttcacgaccggccaggtcgggggctcttccgcgctggtga
gcaacatgcaggccttcactgccctgggcgtcgaggtggcctataccgagctcgacatggcgacgccgtcatccgacccggatc
tcacccaacaggctaccgactatgccaccgtggtgacgtcgtgcaagcaggtgccggactgcgtgggcatcacgatctgggaat
tctcggaccggtatacgtggctcaccaactcggcgccgctgccgtgggacgtcaatttccagaagaaaccggcgtacaccagca
tcctggatgcttgggggggctcggccacaggcagtgcgacaagcacgccgaccaccatggctaccagcaccaccacggcag
gtccggctccctcgggcggagggggcggctgcacggcggcccactgggcgcagtgcggcgggactggatacacgggatgc
accacctgtgcgtccccgtatacctgtcaagtctctaatccctactacagtcagtgtctgtaa
成熟蛋白理论分子量为40.0kDa,将木聚糖酶基因xyn10J88序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对,该基因与来源于Penicillium funiculosum的木聚糖酶氨基酸序列一致性为49.5%。说明XYN10J88是一种新的木聚糖酶。
本发明还提供了包含上述高温酸性木聚糖酶基因xyn10J88的重组载体,优选为pPIC-xyn10J88。将本发明的木聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间,使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案,优选为将本发明的木聚糖酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间,使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控,得到重组酵母表达质粒pPIC9-xyn10J88。
本发明还提供了包含上述高温酸性木聚糖酶基因xyn10J88的重组菌株,优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌,优选为重组菌株GS115/xyn10J88。
本发明还提供了一种制备高温酸性木聚糖酶XYN10J88的方法,包括以下步骤:
1)用上述的重组载体转化宿主细胞,得重组菌株;
2)培养重组菌株,诱导重组木聚糖酶表达;以及
3)回收并纯化所表达的木聚糖酶XYN10J88。
其中,优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型汉逊酵母细胞,优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)GS115,得到重组菌株GS115/xyn10J88。
本发明还提供了上述高温酸性木聚糖酶XYN10J88的应用。
本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足,提供一种性质优良的、适合于在饲料、酿酒、食品工业中应用新的木聚糖酶。本发明的木聚糖酶最适pH为4.0,在pH4.0~7.0都有较高的酶活性;pH稳定性好;具有良好的抗蛋白酶的能力。其耐高温特性,可使其在需求高温环境的工业生产上应用。本木聚糖酶可应用于饲料工业,有效降低粘度,消除或降低因粘度增加而引起的抗营养作用。在酿酒工业中,可有效降解可溶性何不可溶性的阿拉伯木聚糖,有效降低麦芽汁的粘度提高过滤效率澄清啤酒。另外,在白酒、清酒的酿造中有助于提高发酵效率,提高淀粉利用率,增加酒精的产率。还可以将造纸工业废料及农业废弃物中的木聚糖可被转化为D-木糖单体,而D-木糖又可被细菌、酵母及真菌转化成有价值的燃料。因此,本木聚糖酶在能源工业中的应用也显示出其巨大的潜力。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株及载体:本发明从瓶霉(Phialophora sp.J88CGMCC 3873)(保藏日期:2010年5月25号,保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,100101),其保藏号为:CGMCC No.3873。)中分离得到一种新的高温酸性木聚糖酶XYN10J88。毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。
2、酶类及其它生化试剂:内切酶购自TaKaRa公司,连接酶购自Invitrogen公司。燕麦木聚糖购自Sigma公司,其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基:
(1)Phialophora sp.J88CGMCC 3873培养基为马铃薯汁培养基:1000mL马铃薯汁,10g葡萄糖,25g琼脂,pH2.5。
(2)大肠杆菌培养基LB(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl,pH7.0)。
(3)BMGY培养基:1%酵母提取物,2%蛋白胨,1.34%YNB,0.00004%Biotin,1%甘油(V/V)。
(4)BMMY培养基:除以0.5%甲醇代替甘油,其余成份均与BMGY相同,pH4.0。
说明:以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法,均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行,或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1瓶霉Phialophora sp.J88CGMCC 3873产酶特性
将来源于云南铀矿废水样品经富集培养后(富集培养基:(NH4)2SO4 5g/L,KH2PO4 1g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,FeSO4·7H2O 0.01g/L,CaCl2 0.2g/L,玉米芯粉0.5%,麸皮0.5%,pH2.5),按常规稀释后涂布于产酶培养基((NH4)2SO4 5g/L,KH2PO4 1g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,FeSO4·7H2O 0.01g/L,CaCl2 0.2g/L,木聚糖1%,1.5%琼脂糖,pH 2.5)平板上,30℃培养5~6d,挑取产生透明圈菌落在产酶培养基平板划线分离,重复划线分离过程3轮,使菌株纯化。通过此方法筛选到该分泌木聚糖酶的菌株。产透明圈最大的菌株经划线分离纯化后定名为J88,经18SrDNA鉴定该菌株为瓶霉,命名为Phialophora sp.J88。
实施例2瓶霉Phialophora sp.J88CGMCC 3873木聚糖酶编码基因xyn10J88的克隆
提取瓶霉Phialophora sp.J88CGMCC 3873基因组DNA:
将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中,加入2mL提取液,研磨5min,然后将研磨液置于50mL离心管中,65℃水浴锅裂解20min,每隔10min混匀一次,在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白,再取上清加入等体积异丙醇,于室温静置5min后,4℃下10000rpm离心10min。弃上清,沉淀用70%的乙醇洗涤两次,真空干燥,加入适量TE溶解,置于-20℃备用。
根据第十家族木聚糖酶基因的保守(WDVVNE和I(L)TELDI)序列设计合成了简并引物P1,P2
P1:5′-TGGGACGTSGTSAACGAG-3′;
P2:5′-GGATGTCSAGYTCSGTGA-3′)。
以Phialophora sp.J88CGMCC 3873总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为:94℃变性5min;然后94℃变性30sec,45℃退火30sec,72℃延伸1min,30个循环后72℃保温10min。得到一约348bp片段,将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送三博生物技术有限公司测序。
根据测序得到的核苷酸序列,设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物:设计方向为需要扩增的未知区域方向,sp2的位置设计在sp1的内侧,sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定,引物长度一般22~30nt,退火温度在60~65℃。并将它们分别命名为usp1,usp2,usp3(上游特异性引物),dsp1,dsp2,dsp3(下游特异性引物)见表1。
表1.木聚糖酶XYN10J88TAIL-PCR特异性引物
通过反向TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列,扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。拼接后XYN10J88木聚糖酶基因全长1200bp,编码399个氨基酸和一个终止密码子。用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)进行分析表明N端20个氨基酸为预测的信号肽。预测该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为40.0kDa。
实施例3重组木聚糖酶的制备
将表达载体pPIC9进行双酶切(EcoR I+Not I),同时将编码木聚糖酶的基因xyn10J88双酶切(EcoR I+Not I),切出编码成熟木聚糖酶的基因片段与表达载体pPIC9连接,获得含有Phialophora sp.J88CGMCC 3873木聚糖酶基因xyn10J88的重组质粒pPIC-xyn10J88并转化毕赤酵母GS115,获得重组毕赤酵母菌株GS115/xyn10J88。
取含有重组质粒的GS115菌株,接种于300mL BMGY培养液中,30℃250rpm振荡培养48h后,离心收集菌体。然后于150mLBMMY培养基重悬,30℃250rpm振荡培养。诱导72h后,离心收集上清。测定木聚糖酶的活力。重组木聚糖酶的表达量为43.6U/mL。SDS-PAGE结果表明,重组木聚糖酶在毕赤酵母中得到了表达。重组木聚糖的比活为350.6U/mg。
实施例4重组木聚糖酶的活性分析
DNS法:具体方法如下:在pH4.0,70℃条件下,1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液,900μL底物,反应10min,加入1.5mL DNS终止反应,沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。
实施例5重组木聚糖酶XYN10J88的性质测定
1、重组木聚糖酶XYN10J88的最适pH和pH稳定性的测定方法如下:
将实施例4纯化的重组木聚糖酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物木聚糖用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中70℃下进行木聚糖酶活力测定。结果(图1)表明,重组酶XYN10J88的最适pH为4.0,在pH4.0~7.0有50%以上的相对酶活性。木聚糖酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min,再在pH4.0缓冲液体系中70℃下测定酶活性,以研究酶的pH耐性。结果(图2)表明木聚糖酶在pH 3.0-9.0之间均很稳定,在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在70%以上,这说明此酶在酸性和中性范围内具有较好的pH稳定性。
2、木聚糖酶的最适温度及热稳定性测定方法如下:
木聚糖酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH4.0)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为木聚糖酶在不同温度下处理不同时间,再在70℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图3)表明其最适温度为70℃。酶的热稳定性性试验表明(图4),XYN10J88有良好的热稳定性,在70℃下温育1h,能保持90%以上的酶活。
3、木聚糖酶的Km值测定方法如下:
用不同浓度的木聚糖为底物,在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH4.0)缓冲液体系中,70℃下测定酶活性,计算出其在70℃下的Km值。经测定,以可溶性小麦阿拉伯木聚糖和燕麦木聚糖为底物时的Km值分别为2.05和2.31mg/mL,最大反应速度Vmax分别为443.26和361.04μmol/min·mg。
4、不同金属离子化学试剂对XYN10J88酶活的影响测定如下:
在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂,研究其对酶活性的影响,各种物质终浓度为1和5mmol/L。在70℃、pH4.0条件下测定酶活性。结果表明,大多数离子和化学试剂在浓度为1mmol时重组木聚糖酶的活力没有明显变化。但是Ag+、Hg2+几乎可以完全抑制其活力,而SDS也强烈抑制其活力。当Cu2+,Cr3+,Zn2+,Pb2+,和β-巯基乙醇浓度为5mmol时可以部分抑制XYN10J88酶活力。
5、木聚糖酶抗胃蛋白酶及胰蛋白酶能力测定如下:
用pH2.0KCl-HCl缓冲液配制0.1mg/mL胃蛋白酶,pH7.0Tris-HCl缓冲液配制0.1mg/mL胰蛋白酶。取pH2.0KCl-HCl缓冲液稀释后的0.5mL纯化的酶液加入0.5mL胃蛋白酶,pH7.0Tris-HCl缓冲液稀释后的0.5mL纯化的酶液加入0.5mL胰蛋白酶混合,蛋白酶/木聚糖酶(w/w)≈0.1,37℃保温60和120min取样,在pH4.0及70℃条件下测定酶活性。实验结果表明木聚糖酶XYN10J88用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理120min后,胰蛋白酶处理后的XYN10J88的酶活比处理前提高了27%,胃蛋白酶处理后的XYN10J88的木聚糖酶活性比处理前降低了49%。
6、重组木聚糖酶的底物特异性
该酶除可作用于木聚糖外,对于大麦Avicel、β-葡聚糖、CMC、Insoluble wheatarabinoxylan也有一定的降解作用(表2)。其对可溶性的小麦阿拉伯木聚糖的降解能力相对于燕麦木聚糖可以达到169.2%以上。
表2.木聚糖酶XYN10J88底物特异性分析
序列表
<110>温州海螺挑战生物工程有限公司
<120>一种高温酸性木聚糖酶XYN10J88及其基因和应用
<160>6
<210>1
<211>399
<212>PRT
<213>瓶霉(Phialophora sp.J88)
<400>1
MRGLKASLFA YLGTASIVSA DGLNVRAQAA GKKYFGTAIS TTVLNDATAD
AIAKNYQDFG 60
QYTCENEMKF DATEPSRNSF SYGSADMIVA QAQADGQIMR CHNLVWHNQV
PSWVTDGNFD 120
NATLISIMKN HIANVVGHYK GKCYAWDVGN EALNEDGSYM TSGSVWGSTI
GPAYIPIAFA 180
AAAEADPAAK LYYNDYNCEK AGAKSTGAQN LIKMVKSYGA PIHGIQGHFT
TGQVGGS SAL 240
VSNMQAFTAL GVEVAYTELD MATPSSDPDL TQQATDYATV VTSCKQVPDC
VGITIWEFSD 300
RYTWLTNSAP LPWDVNFQKK PAYTSILDAW GGSATGSATS TPTTMATSTT
TAGPAPSGGG 360
GGCTAAHWAQ CGGTGYTGCT TCASPYTCQV SNPYYSQCL 399
<210>2
<211>379
<212>PRT
<213>瓶霉(Phialophora sp.J88)
<400>2
DGLNVRAQAA GKKYFGTAIS TTVLNDATAD AIAKNYQDFG QYTCENEMKF
DATEPSRNSF 60
SYGSADMIVA QAQADGQIMR CHNLVWHNQV PSWVTDGNFD NATLISIMKN
HIANVVGHYK 120
GKCYAWDVGN EALNEDGSYM TSGSVWGSTI GPAYIPIAFA AAAEADPAAK
LYYNDYNCEK 180
AGAKSTGAQN LIKMVKSYGA PIHGIQGHFT TGQVGGSSAL VSNMQAFTAL
GVEVAYTELD 240
MATPSSDPDL TQQATDYATV VTSCKQVPDC VGITIWEFSD RYTWLTNSAP
LPWDVNFQKK 300
PAYTSILDAW GGSATGSATS TPTTMATSTT TAGPAPSGGG GGCTAAHWAQ
CGGTGYTGCT 360
TCASPYTCQV SNPYYSQCL 379
<210>3
<211>20
<212>PRT
<213>瓶霉(Phialophora sp.J88)
<400>3
MRGLKASLFA YLGTASIVSA 20
<210>4
<211>1200
<212>DNA
<213>瓶霉(Phialophora sp.J88)
<400>4
atgcgtggtc tcaaagccag cttgttcgcc taccttggca cggcgagcat cgtctcggcc 60
gatggcctca atgttcgcgc gcaggccgcg ggaaagaagt actttggcac cgccatcagc 120
accaccgtcc tcaacgacgc gactgcggac gcgatagcca agaactacca ggacttcgga 180
cagtacacct gtgagaacga gatgaagttc gacgccaccg agccatccag gaatagcttc 240
agctatggca gcgccgacat gatcgtagcg caggcgcaag ccgacggcca gatcatgagg 300
tgccacaacc ttgtctggca taaccaggtg ccctcgtggg ttaccgacgg caacttcgac 360
aacgcgaccc tgatcagcat catgaagaac cacatcgcca acgtggtcgg gcactacaag 420
ggcaagtgct atgcgtggga tgtgggaaac gaggccctga acgaggacgg ctcgtacatg 480
acgtctggtt ccgtgtgggg gtcgaccatc gggccggcct acatccccat agccttcgcg 540
gcggcagcgg aggcagaccc ggcggccaag ctgtactaca acgactacaa ctgtgagaag 600
gcgggggcaa aatccacggg cgcgcagaac ctgatcaaga tggtcaagtc gtacggagcc 660
ccgatccatg gcatccaggg gcatttcacg accggccagg tcgggggctc ttccgcgctg 720
gtgagcaaca tgcaggcctt cactgccctg ggcgtcgagg tggcctatac cgagctcgac 780
atggcgacgc cgtcatccga cccggatctc acccaacagg ctaccgacta tgccaccgtg 840
gtgacgtcgt gcaagcaggt gccggactgc gtgggcatca cgatctggga attctcggac 900
cggtatacgt ggctcaccaa ctcggcgccg ctgccgtggg acgtcaattt ccagaagaaa 960
ccggcgtaca ccagcatcct ggatgcttgg gggggctcgg ccacaggcag tgcgacaagc 1020
acgccgacca ccatggctac cagcaccacc acggcaggtc cggctccctc gggcggaggg 1080
ggcggctgca cggcggccca ctgggcgcag tgcggcggga ctggatacac gggatgcacc 1140
acctgtgcgt ccccgtatac ctgtcaagtc tctaatccct actacagtca gtgtctgtaa 1200
<210>5
<211>1140
<212>DNA
<213>瓶霉(Phialophora sp.J88)
<400>5
gatggcctca atgttcgcgc gcaggccgcg ggaaagaagt actttggcac cgccatcagc 60
accaccgtcc tcaacgacgc gactgcggac gcgatagcca agaactacca ggacttcgga 120
cagtacacct gtgagaacga gatgaagttc gacgccaccg agccatccag gaatagcttc 180
agctatggca gcgccgacat gatcgtagcg caggcgcaag ccgacggcca gatcatgagg 240
tgccacaacc ttgtctggca taaccaggtg ccctcgtggg ttaccgacgg caacttcgac 300
aacgcgaccc tgatcagcat catgaagaac cacatcgcca acgtggtcgg gcactacaag 360
ggcaagtgct atgcgtggga tgtgggaaac gaggccctga acgaggacgg ctcgtacatg 420
acgtctggtt ccgtgtgggg gtcgaccatc gggccggcct acatccccat agccttcgcg 480
gcggcagcgg aggcagaccc ggcggccaag ctgtactaca acgactacaa ctgtgagaag 540
gcgggggcaa aatccacggg cgcgcagaac ctgatcaaga tggtcaagtc gtacggagcc 600
ccgatccatg gcatccaggg gcatttcacg accggccagg tcgggggctc ttccgcgctg 660
gtgagcaaca tgcaggcctt cactgccctg ggcgtcgagg tggcctatac cgagctcgac 720
atggcgacgc cgtcatccga cccggatctc acccaacagg ctaccgacta tgccaccgtg 780
gtgacgtcgt gcaagcaggt gccggactgc gtgggcatca cgatctggga attctcggac 840
cggtatacgt ggctcaccaa ctcggcgccg ctgccgtggg acgtcaattt ccagaagaaa 900
ccggcgtaca ccagcatcct ggatgcttgg gggggctcgg ccacaggcag tgcgacaagc 960
acgccgacca ccatggctac cagcaccacc acggcaggtc cggctccctc gggcggaggg 1020
ggcggctgca cggcggccca ctgggcgcag tgcggcggga ctggatacac gggatgcacc 1080
acctgtgcgt ccccgtatac ctgtcaagtc tctaatccct actacagtca gtgtctgtaa 1140
<210>6
<211>60
<212>DNA
<213>瓶霉(Phialophora sp.J88)
<400>6
atgcgtggtc tcaaagccag cttgttcgcc taccttggca cggcgagcat cgtctcggcc 60