CN102533698B - 一种高温酸性甘露聚糖酶Man5C1及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高温酸性甘露聚糖酶Man5C1及其基因和应用。本发明提供了一种来源于青霉属Penicillium sp.C1CGMCC 4432的甘露聚糖酶Man5C1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本发明提供了编码上述甘露聚糖酶的编码基因man5C1。本发明的木聚糖酶的具有以下性质：最适pH4.0，最适温度70℃，比活为1035U/mg；良好的蛋白酶抗性，有效的降解角豆胶半乳甘露聚糖以及易于工业化发酵生产。做为一种新型的酶制剂，可广泛用于饲料，食品等。

Description

一种高温酸性甘露聚糖酶Man5C1及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高温酸性甘露聚糖酶Man5C1及其基因和应用。

背景技术

β-甘露聚糖酶(β-mannanase endo-1，4-β-D-mannanmannohydroase EC3.2.1.78)是一类能水解甘露聚糖的半纤维素酶，广泛存在于微生物、动物和植物中。

甘露聚糖是植物半纤维素的主要成份，是以1，4-β-D-吡喃甘露糖苷键连接而成的线性多糖。在β-甘露聚糖外切酶和甘露糖苷内切酶的作用下，甘露聚糖可被分解为甘露糖。甘露聚糖的结构比较复杂，如主链上某些残基被葡萄糖取代或半乳糖通过α-1，6-糖苷键与甘露糖残基相连形成分枝则称为异甘露聚糖。主要有半乳甘露聚糖(galactomannan)，葡萄甘露聚糖(glucomannan)，半乳葡萄甘露聚糖(galactoglucomannan)。因此消化甘露聚糖主要是依靠β-甘露聚糖酶，此外还需要几种酶的协同作用，包括：β-甘露糖苷酶(β-mannosidase)，外-β-D-甘露聚糖酶(Exo-β-mannanase)，甘露糖苷酶(galactosidase)，葡萄糖苷酶(glucosidase)和脱乙酰酯化酶(deacytle esterase)等支链酶。

蛋白结构分析表明，β-甘露聚糖酶多属于糖基水解酶家族(glycoside hydrolasefamilies GHs)5和26。糖基水解家族5中包含多种不同来源的糖基水解酶。主要包含细菌、真菌、植物中的β-甘露聚糖酶和内源性的葡聚糖酶。对糖基水解家族5中甘露聚糖酶的氨基酸序列进行比较表明，序列同源性很低(＜20％)，因此在糖基水解家族5中又划分出8个亚家族A1-A8。其中A7为真核生物β-甘露聚糖酶，A8为细菌β-甘露聚糖酶，该亚家族氨基酸序列同源性多超过43％(Hilge et al.，1998；Beguinet al，1990)。

随着对β-甘露聚糖酶的深入研究，该酶在饲料、造纸、保健食品及生物技术研究等方面均得到了广泛的应用。近年来，随着甘露寡糖生理功能的发现，绿色饲料的兴起以及人们环保意识的增强，对β-甘露聚糖酶的研究和利用已进入了一个新的阶段。β-甘露聚糖酶已被广泛应用于食品、洗涤、医药、饲料、造纸、纺织印染、石油开采、精细化工及生物技术等诸多领域，是一种新型的工业酶，具有很大的潜在应用价值，在工业中有着广阔的应用前景。目前，对于酸性甘露聚糖酶的报道较少。而在饲料中应用的甘露聚糖酶，需要在酸性条件下具有高活性。酸性β-甘露聚糖酶主要来源于真菌。它们作用的最适pH值在2.4～5.0，但天然菌株所产的甘露聚糖酶产量低，不能满足工业化生产的需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种能高效应用的高温酸性甘露聚糖酶。

本发明的再一目的是提供编码上述高温酸性甘露聚糖酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述高温酸性甘露聚糖酶的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述高温酸性甘露聚糖酶的应用。

本发明从青霉C1(Penicillium.C1 CGMCC 4432)(2010年12月7日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC 4432)中分离得到一种新的高温酸性甘露聚糖酶Man5C1。

本发明提供了一种高温酸性甘露聚糖酶Man5C1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

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其中，该酶基因编码407个氨基酸，N端18个氨基酸为其预测的信号肽序列“mrttillastllghsvsa”(SEQ ID NO.3)。

因此，成熟的高温酸性甘露聚糖酶Man5C1的理论分子量为41.2kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

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本发明的甘露聚糖酶Man5C1同时具有好的热稳定性而在常温下在酸性和中性的范围内均具有高活性、抗蛋白酶降解等特性。本发明筛选到Penicillium sp.C1CGMCC 4432所产生的甘露聚糖酶，其最适pH值为4.0，在pH3.0～7.0的范围内维持60％以上的酶活性；最适温度为70℃，在40℃仍具有38％左右的酶活力；用胃蛋白酶和胰蛋白酶分别处理60分钟，酶活性分别维持85％与95％。

本发明提供了编码上述高温酸性甘露聚糖酶Man5C1。具体地，该基因的基因组序列如SEQ ID NO.4所示：

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本发明通过PCR的方法分离克隆了甘露聚糖酶基因Man5C1，DNA全序列分析结果表明，甘露聚糖酶Man5C1基因man5C1全长1473bp。其中，信号肽的碱基序列为：

ATGAGGACGACGATCCTTCTTGCCAGTACCCTTCTGGGTCACTCCGTTTCGGCT(SEQ ID NO.6)。

成熟的甘露聚糖酶Man5C1的基因序列如SEQ ID NO.5所示。

SEQ ID NO.5

Cagaccacttccggtctaagaagtacaggtaccgccacaactacgacctcttctacgttgacaacgacaacctccaagacaacat

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成熟蛋白理论分子量为41.2kDa，将甘露聚糖酶基因man5C1序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，该基因与来源于Aspergillus aculeatus的甘露聚糖酶氨基酸序列一致性为57.8％。说明Man5C1是一种新的甘露聚糖酶。

本发明还提供了包含上述高温酸性甘露聚糖酶基因man5C1的重组载体，优选为pPIC-Man5C1。将本发明的甘露聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的甘露聚糖酶基因插入到质粒pPIC9上的5naB I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-man5C1。

本发明还提供了包含上述高温酸性甘露聚糖酶基因man5C1的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株GS115/man5C1。

本发明还提供了一种制备高温酸性甘露聚糖酶Man5C1的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组甘露聚糖酶表达；

3)回收并纯化所表达的甘露聚糖酶Man5C1。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/man5C1。

本发明还提供了上述高温酸性甘露聚糖酶Man5C1的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、食品工业中应用新的甘露聚糖酶。本发明的甘露聚糖酶最适pH为4.0，在pH3.0～7.0都有较高的酶活性；pH稳定性好；具有良好的抗蛋白酶的能力。本甘露聚糖酶在人工瘤胃模拟试验中稳定，可应用到饲料添加剂当中，对畜牧业的发展有着重要的意义。此外，Man5C1可有效降解半乳甘露聚糖与葡萄甘露聚糖，而不降解木聚糖与微晶纤维素钠，可以有效降解漂白纸浆中的甘露聚糖部分而不影响纤维素。因此，本甘露聚糖酶在工业中的应用也显示出其巨大的潜力。

附图说明

图1重组甘露聚糖酶的最适pH。

图2重组甘露聚糖酶的pH稳定性。

图3重组甘露聚糖酶的最适温度。

图4重组甘露聚糖酶的热稳定性。

青霉C1(Penicillium sp.C1)于2010年12月7日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCCNo.4432。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：本发明从青霉(Penicillium sp.C1 CGMCC 4432)。毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。角豆胶购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)Penicillium sp.C1 CGMCC 4432培养基为马铃薯汁培养基：1000mL马铃薯汁，10g葡萄糖，25g琼脂，pH3.0。

(2)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。

(3)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(V/V)。

(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1青霉Penicillium sp.C1CGMCC 4432产酶特性

将来源于云南某矿的铀矿废水样品经富集培养后(富集培养基：(NH₄)₂SO₄5g/L，KH₂PO₄1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，CaCl₂0.2g/L，玉米芯粉0.5％，麸皮0.5％，pH2.5)，按常规稀释后涂布于产酶培养基((NH₄)₂SO₄5g/L，KH₂PO₄1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，CaCl₂0.2g/L，角豆胶0.5％，1.5％琼脂糖，pH 2.5)平板上，30℃培养5～6d，挑取产生透明圈菌落在产酶培养基平板划线分离，重复划线分离过程3轮，使菌株纯化。通过此方法筛选到该分泌木聚糖酶的菌株。产透明圈最大的菌株经划线分离纯化后定名为C1，经18SrDNA鉴定该菌株为瓶霉，命名为Penicillium sp.C1。

实施例2青霉Penicillium sp.C1CGMCC4432甘露聚糖酶编码基因man5C1的克隆

提取青霉Penicillium sp.C1CGMCC 4432基因组DNA：

将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入2mL提取液，研磨5min，然后将研磨液置于50mL离心管中，65℃水浴锅裂解20min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。

根据第五家族甘露聚糖酶基因的保守(NNWSDYGG和AWELGNEP)序列设计合成了简并引物P1，P2

P1：5′-AAYAAYTGGGAYGAYTWYGGNGG-3′；

P2：5′-GGYTCRYYNSCNARYTCCCANGC-3′。

以Penicillum sp.C1 CGMCC 4432总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，50℃降落45℃(每个循环降落0.5℃)退火30sec，72℃延伸30s，10个循环后接着94℃变性30s，45℃退火30s，72℃延伸30s，一共30个循环，72℃保温10min。得到一约176bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送三博生物技术有限公司测序。

根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22～30nt，退火温度在60～65℃。并将它们分别命名为usp1，usp2，usp3(上游特异性引物)，dsp1，dsp2，dsp3(下游特异性引物)见表1。

表1.甘露聚糖酶Man5C1TAIL-PCR特异性引物

通过反向TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。拼接后Man5C1甘露聚糖酶基因全长1221bp，编码407个氨基酸和一个终止密码子。用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)进行分析表明N端18个氨基酸为预测的信号肽。预测该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为41.2kDa。

实施例3重组木聚糖酶的制备

将表达载体pPIC9进行双酶切(SnaB I+Not I)，同时将编码甘露聚糖酶的基因Man5C1双酶切(SaB I+Not I)，切出编码成熟甘露聚糖酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有Penicillium sp.C1CGMCC 4432甘露聚糖酶基因Man5C1的重组质粒pPIC-man5C1并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/man5C1。

取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于100mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。测定甘露聚糖酶的活力。重组甘露聚糖酶的表达量为58U/mL。SDS-PAGE结果表明，重组甘露聚糖酶在毕赤酵母中得到了表达。重组甘露聚糖的比活为1035U/mg。

实施例4重组甘露聚糖酶的活性分析

DNS法：具体方法如下：在pH4.0，70℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。

实施例5重组甘露聚糖酶Man5C1的性质测定

1、重组甘露聚糖酶Man5C1的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

将实施例4纯化的重组甘露聚糖酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物角豆胶用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中37℃下进行木聚糖酶活力测定。结果(图1)表明，重组酶Man5C1的最适pH为4.0，在pH3.0～7.0有60％以上的相对酶活性。甘露聚糖酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH4.0缓冲液体系中70℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果(图2)表明甘露聚糖酶在pH 3.0-7.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在60％以上，这说明此酶在酸性和中性范围内具有较好的pH稳定性。

2、甘露聚糖酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：

甘露聚糖酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH4.0)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为甘露聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在70℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图3)表明其最适温度为70℃。酶的热稳定性性试验表明(图4)，Man5C1有良好的热稳定性，在50℃下温育1h，能保持原有的酶活性。

3、甘露聚糖酶的K_m值测定方法如下：

分别以不同浓度的角豆胶为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH4.0)缓冲液体系中，70℃下测定酶活性，计算出其在70℃下的K_m值。经测定，以角豆胶与魔芋粉为底物时的K_m值分别为5.6和4.8mg/mL，最大反应速度V_max分别为2785和1608μmol/min·mg。

4、不同金属离子化学试剂对Man5C1酶活的影响测定如下：

在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为1和5mmol/L。在70℃、pH4.0条件下测定酶活性。结果表明，1mM Co²⁺(112.5％)，Pb²⁺(117.2％)，Cu²⁺(117.6％)，Zn²⁺(118.1％)，and Mn²⁺(126.4％)能促进Man5C1的活性，但SDS(6.3％)强烈抑制其活性。当Cr³⁺(55.6％)，Fe³⁺(6.8％)浓度为5mmol时可以部分抑制Man5C1酶活力，而相反β-巯基乙醇能够提高它1.4倍的酶活力。其它的金属离子如K⁺，Na⁺，Mg²⁺，EDTA几乎对酶活性没有影响。

5、甘露聚糖酶抗胃蛋白酶及胰蛋白酶能力测定如下：

用pH2.0KCl-HCl缓冲液配制0.1mg/mL胃蛋白酶，pH7.0Tris-HCl缓冲液配制0.1mg/mL胰蛋白酶。取pH2.0KCl-HCl缓冲液稀释后的0.5mL纯化的酶液加入0.5mL胃蛋白酶，pH7.0Tris-HCl缓冲液稀释后的0.5mL纯化的酶液加入0.5mL胰蛋白酶混合，蛋白酶/甘露聚糖酶(w/w)≈0.1，37℃保温60min取样，在pH4.0及70℃条件下测定酶活性。实验结果表明甘露聚糖酶Man5C1用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理60min后，胰蛋白酶处理后的Man5C1的酶活比处理前降低了5％，胃蛋白酶处理后的Man5C1的甘露聚糖酶活性比处理前降低了15％。

6、重组甘露聚糖酶的底物特异性

该酶除可作用于角豆胶外，对于瓜尔豆胶，魔芋粉也有一定的降解作用(表2)。

表2.甘露聚糖酶Man5C1底物特异性分析

Claims (10)

1.一种高温酸性甘露聚糖酶Man5C1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的高温酸性甘露聚糖酶Man5C1，其特征在于，SEQ ID NO.1的N端为氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的信号肽。

3.一种高温酸性甘露聚糖酶基因man5C1，其特征在于，编码权利要求1所述的高温酸性甘露聚糖酶Man5C1。

4.如权利要求3所述的高温酸性甘露聚糖酶基因man5C1，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。

5.如权利要求3所述的高温酸性甘露聚糖酶基因man5C1，其特征在于，所述高温酸性甘露聚糖酶基因man5C1的信号肽编码序列如SEQ ID NO.6所示。

6.包含权利要求3所述高温酸性甘露聚糖酶基因man5C1的重组载体。

7.包含权利要求3所述高温酸性甘露聚糖酶基因man5C1的重组载体pPIC-man5C1，其特征在于，将所述甘露聚糖酶基因插入到质粒pPIC9上的SnaB I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-man5C1。

8.包含权利要求3所述高温酸性甘露聚糖酶基因man5C1的重组菌株。

9.一种制备高温酸性甘露聚糖酶Man5C1的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求6的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组甘露聚糖酶表达；

3)回收并纯化所表达的甘露聚糖酶Man5C1。

10.权利要求1所述高温酸性甘露聚糖酶Man5C1用于水解甘露聚糖的应用。