CN102154244B - 一种高温酸性纤维素酶EgG5及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高温酸性纤维素酶EgG5及其基因。本发明提供了一种来源于瓶霉属Phialophora sp.的纤维素酶EgG5，其氨基酸序列如SEQ lD NO.1所示，且本发明提供了编码上述酸性纤维素酶的编码基因egG5。本发明的纤维素酶具有以下性质：最适pH3.5～5.0，最适温度70℃，比活为60.3 U/mg；良好的稳定性，在极端酸性范围内依然保持较高酶活。做为一种新型的酶制剂，可广泛用于饲料、能源工业等。

Description

一种高温酸性纤维素酶EgG5及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高温酸性纤维素酶EgG5及其基因和应用。

背景技术

纤维素是由D-葡萄糖为基本组成单元，通过1，4-糖苷键连接而成的多糖。纤维素是自然界中含量最多的，可以再生的多糖，它是植物细胞壁的主要组成成分，通常它与半纤维素和木质素交联在一起。纤维素的降解需要纤维素酶(从纤维素分子内部随机进行断裂形成寡糖)，纤维二糖水解酶(从还原端或者非还原端逐次降解二糖)，葡萄糖苷酶将纤维寡糖，二糖水解得到葡萄糖。纤维素酶有着广泛的应用，例如：造纸，酿造，纺织，饲料，生物能源等领域。而同时，由于能源短缺和环境的问题，生物能源作为一种新的替代品而备受人们的关注。目前研究最多的主要为微生物来源的纤维素酶，其中真菌由于其分泌量大，且分泌到胞外而成为研究的热点。但是，不同的工业应用，对纤维素酶的性质的需求是不同的，如：饲料工业需要嗜酸的纤维素酶，纺织工业需要嗜碱的纤维素酶，而在生物质转化过程中需要嗜酸、有良好的pH和热稳定性的酶。目前工业应用的纤维素酶，主要来自木霉属Trichoderma reesei和Penicillium spp.，这些酶的最适pH在5.0左右，最适温度在50-60度之间，而嗜热和热稳定性好的酶则有更好的优势：高温可以提高反应速率，降低底物的粘度，同时还可以抑制其他微生物的生长。因此，有着优良性质的纤维素酶，包括其基因的获得、表达、纯化、性质、结构特征及其如何在不同领域的应用正在广泛开展着。

由于不同工业对纤维素酶需求的不同，因此，获得新型具有优良特性纤维素酶的研究仍具有重大意义。克隆和分离具有嗜酸、嗜热稳定性好的纤维素酶可以更好的应用于生物能源、饲料、酿酒等领域。

发明内容

本发明的目的是提供一种能高效应用的高温、酸性稳定性好的纤维素酶。

本发明的再一目的是提供编码上述高温酸性纤维素酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述高温酸性纤维素酶的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述高温酸性纤维素酶的应用。

本发明从瓶霉(Phialophora sp.)中分离得到一种新的高温酸性纤维素酶EgG5。

本发明提供了一种纤维素酶EgG5，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。SEQ ID NO.1：

MMRSLLLSLTVLGAGAVAQQSAWGQCGGIGWSGSTSCEAGSCCVSQNAYYSQCVPGTACSGTATTTATPTPTSGGGSGRTRFAGVNIAGFDFGCATDGACNTTAVYPPVKDMPPYYNNPDGAGQMDHFSKDDNLNIFRLPVGWQYLVNSNLGGTLDSTNLGYYDQLVQSCLSTGAYCIVDIHNYARWNGSIIGQGGPTNEQFVSVWTQLATKYASQARVWFGIMNEPHDVPSITTWAATVQAVVTAIRNAGATSQFISLPGNDWQSAAAVISDDSAAALSTVTNPDGTTTNLIFDVHKYLDSDNSGTHTECVTNNIDDAFAPLATWLRQNGRQAILTETGGGNTASCETYLCQQIAYLKISANADAYLGYVVWGAGSFDSTYALDETPTGSGSSWTDTPLVKACI

其中，该酶包括405个氨基酸和一个终止密码子，不包含信号肽，因此，成熟的纤维素酶EgG5的理论分子量为42.8kDa

本发明的EgG5同时具有好的热稳定性，常温下，在酸性和中性的范围内均具有高活性、抗蛋白酶降解等特性。本发明的纤维素酶，其最适pH值为4.0，在pH2.0～6.0的范围内维持50％以上的酶活性；最适温度为70℃，在80℃仍具有75％左右的酶活力。

本发明提供了编码上述高温酸性纤维素酶的基因egG5。具体地，该基因的序列如SEQ ID NO.2所示：

atgatgcgctcactgttactttctctcacagtcttgggtgctggcgccgtcgctcagcagagcgcctggggccagtgtggtggcatagggtggtctggctcgactagctgcgaggcaggaagctgctgcgtttcgcagaacgcctattattcgcagtgtgttcccggtactgcatgttctggcacggccacgacaacagcgacaccaaccccgacaagcggtggcggatccggccggacgagatttgccggtgtcaatattgcagggttcgacttcggatgcgccactgacggcacctgcaacactaccgcagtctacccgcctgtcaaggacatgcccccatactacaacaaccctgacggcgccgggcagatggaccacttctctaaggatgacaacctcaacatattccgtctgcctgtgggttggcagtaccttgtcaacagcaacctcggcggaacgctggactcgacaaacctcggctactacgaccagctagtccagagctgcctttctaccggcgcatattgcatcgtcgacattcataactatgcgcgatggaacggtgccatcatcggccagggtggtccgacaaacgaacaattcgtgagcgtctggacgcagcttgcaaccaaatacgccagccaggctcgcgtctggtttggcatcatgaacgaaccgcacgacgtccccagcatcactacgtgggcagccaccgtccaggccgtggtcactgcgatccggaacgccggcgctaccagccagttcatatcgctacccggcaacgactggcagtcggcagcggctgttatcagcgatggcagtgccgccgcgctctccacggttaccaatccggatggcaccaccacaaacctcatcttcgacgtccacaagtacctggactccgacaactccgggacgcacaccgagtgtgtgacgaataacatcgacgacgccttcgcaccgcttgccacgtggctgaggcagaatggccgacaagcgatcttgacagagacgggaggaggcaacaccgcttcgtgcgagacatacctgtgccagcagatcgcatatctgaacgccaacgcggatgtctacctcggttatgttggatggggtgctggttctttcgacagcacctacgcactagatgagactccaactggaagcggttcttcttggaccgacaccccgcttgtcaaggcatgcatcgcccggtcctcgtaa

本发明通过PCR的方法分离克隆了高温酸性纤维素酶基因egG5，DNA全序列分析结果表明，酸性纤维素酶EgG5的结构基因egG5全长1224bp。

成熟蛋白理论分子量为42.8kDa，将纤维素酶基因egG5序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，该基因与来源于Trichoderma sp.C-4的纤维素酶氨基酸序列一致性为73％。说明EgG5是一种新的纤维素酶。

本发明还提供了包含上述高温酸性纤维素酶基因egG5的重组载体，命名为pPIC-egG5。将本发明的纤维素酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的纤维素酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-egG5。

本发明还提供了包含上述高温酸性纤维素酶基因egG5的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株GS115/egG5。

本发明还提供了一种制备高温酸性纤维素酶EgG5的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组纤维素酶表达；

3)回收并纯化所表达的纤维素酶EgG5。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/egG5。

本发明还提供了上述高温酸性纤维素酶EgG5的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、能源工业中应用新的纤维素酶。本发明的纤维素酶最适pH为4.0，在pH2.0～6.0都有较高的酶活性；pH稳定性好。其耐高温特性，可使其在需求高温环境的工业生产上应用。本纤维素酶可应用于饲料、能源工业，纤维物质转化为可发酵糖的过程。

附图说明

图1重组纤维素酶的最适pH。

图2重组纤维素酶的pH稳定性。

图3重组纤维素酶的最适温度。

图4重组纤维素酶的热稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：本发明从瓶霉(Phialophora sp.)中分离得到一种新的高温酸性纤维素酶EgG5。毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)Phialophora sp.培养基为马铃薯培养基：1000mL 200g土豆煮汁，10g葡萄糖，25g琼脂，pH3.0。

(2)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。

(3)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(V/V)。

(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1瓶霉Phialophora sp.纤维素酶编码基因egG5的克隆

提取瓶霉Phialophora sp.基因组DNA：

将PDB(200g/L土豆煮汁，葡萄糖20g/L)液体培养5天的培养物离心收集菌体放入研钵中研磨5min，加入10mLCTAB提取液，置于50mL离心管中，65℃水浴锅裂解2h以上，每隔20min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于-20℃静置30min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。

根据第五家族纤维素酶基因的保守(AGFDFG和MNEPHD)序列设计合成了简并引物P1，P2

P1：5′-GCCGGNTTYGAYTTYGG-3′；

P2：5′-GTCGTGNGGYTCRTTCAT-3′)。

以Phialophora sp.G5CGMCC 3328总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，40℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环后72℃保温10min。得到一约426bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送博迈德公司测序。

根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22～30nt，退火温度在60～65℃。并将它们分别命名为usp1、usp2、usp3(上游特异性引物)、dsp1、dsp2、dsp3(下游特异性引物)见表1。

表1.纤维素酶EgG5TAIL-PCR特异性引物

通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送博迈德公司测序。拼接后EgG5纤维素酶基因全长1224bp，编码407个氨基酸和一个终止密码子。预测该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为42.8kDa。

实施例2重组纤维素酶的制备

将表达载体pPIC9进行双酶切(EcoR I+Not I)，同时将编码纤维素酶的基因egG5双酶切(EcoR I+Not I)，切出编码成熟纤维素酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有Phialophora sp.纤维素酶基因egG5的重组质粒pPIC-egG5并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/egG5。

取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于150mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。测定纤维素酶的活力。重组纤维素酶的表达量为0.75U/mL。SDS-PAGE结果表明，重组纤维素酶在毕赤酵母中得到了表达。重组木聚糖的比活为60.3U/mg。

实施例3重组纤维素酶的活性分析

DNS法：具体方法如下：在pH4.0，70℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mLDNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。

实施例4重组纤维素酶EgG5的性质测定

1、重组纤维素酶EgG5的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

将实施例3纯化的重组纤维素酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物CMC-Na用不同pH的0.2mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中50℃下进行纤维素酶活力测定。结果(图1)表明，重组酶EgG5的最适pH为4.0，在pH2.0～6.0有50％以上的相对酶活性。纤维素酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃，50℃，60℃，70℃处理120min，再在pH4.0缓冲液体系中70℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果(图2)表明纤维素酶在37℃处理时，pH 2.0-10.0之间均很稳定，在此pH范围内处理120min后剩余酶活性在85％以上。而在50和60℃高温度条件下，在最适pH附近，处理120min，酶活保持基本不变，有很好的稳定性。

2、纤维素酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：

纤维素酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH4.0)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为纤维素酶在不同温度下处理不同时间，再在70℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图3)表明其最适温度为70℃。酶的热稳定性性试验表明(图4)，EgG5有良好的热稳定性，在60℃下温育24h，能保持80％左右的酶活，65℃和70℃时其半衰期分别为12h和1h。

3、纤维素酶的K_m值测定方法如下：

用不同浓度的木聚糖为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH4.0)缓冲液体系中，70℃下测定酶活性，计算出其在70℃下的K_m值。经测定，以CMC-Na和大麦葡聚糖为底物时的K_m值分别为1.677和0.597mg/mL，最大反应速度V_max分别为145.5和355.3μmol/min·mg。

4、不同金属离子化学试剂对EgG5酶活的影响测定如下：

在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为10mmol/L。在70℃、pH4.0条件下测定酶活性。结果表明，大多数离子和化学试剂在浓度为10mmol时重组纤维素酶的活力没有明显变化。但是Ag⁺、Hg²⁺几乎可以完全抑制其活力，而SDS也强烈抑制其活力。

5、重组纤维素酶的底物特异性

该酶对β-葡聚糖、CMC-Na有活性外，对Avicel和滤纸也有一定的降解作用(表2)。

表2.纤维素酶EgG5底物特异性分析

Claims (9)

1.一种高温酸性纤维素酶EgG5，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种高温酸性纤维素酶基因egG5，其特征在于，编码权利要求1所述的高温酸性纤维素酶EgG5。

3.如权利要求2所述的高温酸性纤维素酶基因egG5，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

4.包含权利要求2所述高温酸性纤维素酶基因egG5的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为载体pPIC9-egG5，其中，将表达载体pPIC9进行EcoR I和Not I双酶切，同时将编码权利要求1所述纤维素酶EgG5的基因进行EcoR I和Not I双酶切，切出编码成熟纤维素酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得重组载体pPIC9-egG5。

6.包含权利要求2所述高温酸性纤维素酶基因egG5的重组菌株。

7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。

8.一种制备权利要求1所述高温酸性纤维素酶EgG5的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组纤维素酶表达；

3)回收并纯化所表达的纤维素酶EgG5。

9.权利要求1所述高温酸性纤维素酶EgG5用于水解纤维素的应用。

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