CN102329785B - 一种中温耐碱性甘露聚糖酶Man5XH9及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种中温耐碱性甘露聚糖酶Man5XH9及其基因和应用。本发明提供了一种新的中温耐碱性甘露聚糖酶Man5XH9，其具有如SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列，且本发明还提供了编码上述中温耐碱性甘露聚糖酶Man5XH9的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4或5所示，以及包含该基因的重组载体和重组菌株及其应用。本发明提供的甘露聚糖酶Man5XH9最适pH为4.5，在pH 4.0～7.0都有较高的酶活性，pH稳定性好，适合于在造纸、纺织工业中应用。

Description

一种中温耐碱性甘露聚糖酶Man5XH9及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种中温耐碱性甘露聚糖酶Man5XH9及其基因和应用。

背景技术

植物细胞壁多糖主要是由纤维素，半纤维素以及木质素这三大主要类多糖组成，其中，半纤维素为不能被水或是螯合试剂所溶解，但能被碱性物质所水解的植物细胞壁多糖(Saha BC(2003)Hemicellulose bioconversion.J Ind Microbiol Biotechnolz30：279-291.)。半纤维素主要包括甘露聚糖、木聚糖、阿拉伯半乳聚糖、葡聚糖等多种多糖，甘露聚糖也是一种重要的混合多糖型半纤维素，由半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖组成(Moreira LR，Filho EX(2008)An overview of mannan structure andmannan-degrading enzyme systems.Appl Microbiol Biotechnol 79：165-178.)。

甘露聚糖的降解首先由甘露聚糖酶降解其主链生成寡糖，然后由甘露糖苷酶将其降解成甘露糖，其侧链则由α-半乳糖苷酶来降解。目前报道的甘露聚糖酶主要来源于GH 5和GH 26家族(http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/)，在GH 113家族中也发现有甘露聚糖酶，并且它们采用的都是双取代机制(Henrissat B，Bairoch A(1993)New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequencesimilarities.Biochem J 293：781-788.)。GH 5家族的酶包括内切葡聚糖酶和甘露聚糖酶，形成典型的(β/α)8桶状结构，并主要来源于细菌和真菌，如Bacillus circulans，Clostridium cellulolytic，Trichoderma reesei，Aspergillus aculeatus和Agaricus bisporus(Dhawan S，Kaur J(2007)Microbial mannanases：an overview of production andapplications.Crit Rev Biotechnol 27：197-216.)。

在饲料工业中，酸性甘露聚糖酶是一种饲料添加剂，其功能可减轻环境污染，消除抗营养因子的作用，提高饲料利用率。在造纸工业中，耐碱甘露聚糖酶可运用于纸浆的漂白工艺(Montiel MD，Rodríguez J，Pérez-Leblic MI，Hernández M，AriasME，Copa-

JL(1999)Screening of mannanases in actinomycetes and their potentialapplication in the biobleaching of pine kraft pulps.Appl Microbiol Biotechnol52：240-245.)。在纺织工业中，甘露聚糖酶被用于降解天然纤维中的半纤维素成分，能有效地去除纺织印染产品上残余的染料，利用酶法取代常规的化学处理工艺，降低了工业能耗和对环境的污染。在食品工业中，甘露聚糖酶可用于降解植物胶，生产功能性低聚甘露糖，可用于食品的加工、贮藏以及果汁澄清(赵月菊，薛燕芬，马延和(2009)β-甘露聚糖酶的结构生物学研究现状和展望.微生物学报，49(9)：1131-1137.)。

β-甘露聚糖酶作为一种新型的工业酶，具有很大的潜在应用价值，在工业中有着广阔的应用前景。国内外早期的研究主要集中在产酶菌株的筛选和发酵条件的优化、酶的分离纯化和性质的研究等方面。近几年，研究发现天然来源的甘露聚糖酶往往难以同时满足工业实际需求，不能直接应用于生产实践中，因此天然酶的异源表达成为获得工业用酶一种有效途径。另外，已报到的甘露聚糖酶多数在酸性pH条件下稳定，而在超过pH 8.0后几乎丧失其活力，其不能适应造纸、纺织工业中的碱性反应条件，因此，造纸、纺织工业需要耐碱的甘露聚糖酶。本发明中来源于青霉属Penicillium sp.XH9的甘露聚糖酶Man5XH9具有以下性质：最适pH 4.5，并在pH4.0～7.0范围内具有75％以上的酶活力，具有很好的pH稳定性，37℃下作用1h后，在pH 4.0～10.0之间，剩余酶活性均在60％以上，并且在pH 12.0仍具有40％以上的酶活力；最适温度60℃，在20℃都保持30％以上的酶活力，其低温和中温条件以及pH中性范围内具有较高酶活力，优良的pH稳定性等特性使其在造纸、纺织工业应用上具有很大的潜力。

发明内容

本发明的目的是提供一种中温耐碱性甘露聚糖酶Man5XH9。

本发明的再一目的是提供编码上述中温耐碱性甘露聚糖酶的基因Man5XH9。

本发明的另一目的是提供包含上述中温耐碱性甘露聚糖酶基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述中温耐碱性甘露聚糖酶基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述中温耐碱性甘露聚糖酶方法。

本发明的另一目的提供上述中温耐碱性甘露聚糖酶的应用。

本发明分离筛选出一种生产上述中温耐碱性甘露聚糖酶Man5XH9的青霉XH9(Penicillium sp.)，于2011年10月21日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.5369。

本发明提供了一种中温耐碱性甘露聚糖酶Man5XH9，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示：

MRSLSSLAIL SAVEAASAQL APSSSSASSS LALTSSAAGS TFSTAVSSTR

QPTSTVSPSS       60

SAVSSTPLGN ARPSGSSSFA KVDGRKFNID GVAKYFAGTN AYWLPFQTNN

ADVDSIFKNL      120

KESGLKVLRV WGFNDVNTVP AAGTVYFQLH DKATGTTTIN TGADGPKRLD

YVVSAAEKNG      180

IKLIIPIVNS WDDYGGMDAY VNAYGGSKTE WYTNTKIQSV YQAYIKAVVS

RYKTSSAVFA      240

WELANEPRCS GCNTDIIAKW VAKTSAYIKS LDSNHMVTTG EEGMGLTVGS

DGSYPYTTTE      300

GNDFAKNLAA PDIDFGVYHL YVADWGIKDN SWGNGWIETH

AKICDAAGKP CVFEEYGIKN     360

DHCSASLKWQ KTALATNAGD LIWQYGQKLS SGPSPNDDYT

VYYGTDDWKC AVGDHVSQI      419

其中，该酶基因编码419个氨基酸，N端18个氨基酸为其预测的信号肽序列“MRSLSSLAILSAVEAASA”(SEQ ID NO.3)。

因此，成熟的中温耐碱性甘露聚糖酶Man5XH9的理论分子量为43.0kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

QLAPSSSSAS SSLALTSSAA GSTFSTAVSS TRQPTSTVSP SSSAVSSTPL

GNARPSGSSS       60

FAKVDGRKFN IDGVAKYFAG TNAYWLPFQT NNADVDSIFK NLKESGLKVL

RVWGFNDVNT      120

VPAAGTVYFQ LHDKATGTTT INTGADGPKR LDYVVSAAEK NGIKLIIPIV

NSWDDYGGMD      180

AYVNAYGGSK TEWYTNTKIQ SVYQAYIKAV VSRYKTSSAV FAWELANEPR

CSGCNTDIIA      240

KWVAKTSAYI KSLDSNHMVT TGEEGMGLTV GSDGSYPYTT TEGNDFAKNL

AAPDIDFGVY      300

HLYVADWGIK DNSWGNGWIE THAKICDAAG KPCVFEEYGI KNDHCSASLK

WQKTALATNA      360

GDLIWQYGQK LSSGPSPNDD YTVYYGTDDW KCAVGDHVSQ

I               401

本发明的甘露聚糖酶Man5XH9同时具有好的pH稳定性而低温和中温范围内均具有高活性等特性。本发明筛选到Penicillium sp.XH9所产生的甘露聚糖酶，其最适pH值为4.5，在pH4.0～6.0的范围内维持90％以上的酶活性；最适温度为60℃，在20℃仍具有30％左右的酶活力。

本发明提供了编码上述中温耐碱性甘露聚糖酶基因Man5XH9。具体地，该基因的基因组序列如SEQ ID NO.4所示：

atgcgttcct tgtcttccct tgctattcta tctgcggtag aagcagcttc cgcgcaactt      60

gccccttcaa gtagctcggc ttcgtctagc ttggctttaa ctagctcggc cgcgggatca     120

actttctcga ctgctgtttc ttcaaccaga cagcctacat ctaccgtgtc tccatcttcg     180

tctgcagttt cgtccacccc actgggcaat gctcgcccct ctggcagcag ctcttttgct     240

aaggtggatg gtcgcaagtt caacattgac ggcgtggcta agtacttcgc tggaacgaac     300

gcgtactggc taccattcca gaccaacaat gcggatgttg actccatctt caaaaacctg     360

aaggagtccg gtcttaaagt tctccgagtt tggggtttca acgatgtgaa caccgtcccg     420

gcggctggca ctgtctactt ccagctccat gacaaggcca ccggtactac taccatcaac     480

actggtgctg atggtccgaa gcgtcttgat tacgttgtct ctgctgccga gaagaacggc     540

atcaagctta tcattcccat tgtgaattcc tgggatgatt acggtggtat ggatgcctac     600

gtcaatgcct atggtggcag caagaccgaa tggtacacca acacgaagat ccagagcgtg     660

taccaggcgt atatcaaggc tgtcgtctct cgctacaaga cttcctctgc tgtctttgcg     720

tgggagttgg ctaatgagcc tcgctgctct ggctgcaaca ccgacatcat cgccaaatgg     780

gtagccaaga catctgccta catcaagtcc ctcgattcta accacatggt tactaccggt     840

gaagagggca tgggcctaac tgtcggatcg gatggctctt acccttacac taccaccgaa     900

ggcaacgact tcgccaagaa ccttgcggcc cctgatattg actttggagt gtaccacctc     960

tacgtcgccg actggggtat caaggataac tcctggggca atgggtggat cgagacccat    1020

gccaagatct gcgacgctgc tggaaagcct tgcgtgttcg aggagtatgg catcaagaac    1080

gaccactgct ccgcctcgct gaagtggcag aagaccgccc tggctaccaa cgctggtgat    1140

ctcatctggc aatatggcca gaagctgtcc tccggtccct ctcccaatga cgactacacc    1200

gtctactatg gcactgacga ctggaagtgc gctgtcggtg accatgtcag ccagatttaa    1260

本发明通过RT-PCR的方法分离克隆了甘露聚糖酶基因Man5XH9，cDNA全序列分析结果表明，甘露聚糖酶Man5XH9基因Man5XH9全长1260bp。其中，信号肽的碱基序列为：atgcgttcct tgtcttccct tgctattcta tctgcggtag aagcagcttc cgcg(SEQ ID NO.6)。

因此，成熟的甘露聚糖酶Man5XH9的基因序列如SEQ ID NO.5所示：

caacttgccc cttcaagtag ctcggcttcg tctagcttgg ctttaactag ctcggccgcg      60

ggatcaactt tctcgactgc tgtttcttca accagacagc ctacatctac cgtgtctcca     120

tcttcgtctg cagtttcgtc caccccactg ggcaatgctc gcccctctgg cagcagctct     180

tttgctaagg tggatggtcg caagttcaac attgacggcg tggctaagta cttcgctgga     240

acgaacgcgt actggctacc attccagacc aacaatgcgg atgttgactc catcttcaaa     300

aacctgaagg agtccggtct taaagttctc cgagtttggg gtttcaacga tgtgaacacc     360

gtcccggcgg ctggcactgt ctacttccag ctccatgaca aggccaccgg tactactacc     420

atcaacactg gtgctgatgg tccgaagcgt cttgattacg ttgtctctgc tgccgagaag     480

aacggcatca agcttatcat tcccattgtg aattcctggg atgattacgg tggtatggat     540

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agcgtgtacc aggcgtatat caaggctgtc gtctctcgct acaagacttc ctctgctgtc     660

tttgcgtggg agttggctaa tgagcctcgc tgctctggct gcaacaccga catcatcgcc     720

aaatgggtag ccaagacatc tgcctacatc aagtccctcg attctaacca catggttact     780

accggtgaag agggcatggg cctaactgtc ggatcggatg gctcttaccc ttacactacc     840

accgaaggca acgacttcgc caagaacctt gcggcccctg atattgactt tggagtgtac     900

cacctctacg tcgccgactg gggtatcaag gataactcct ggggcaatgg gtggatcgag     960

acccatgcca agatctgcga cgctgctgga aagccttgcg tgttcgagga gtatggcatc    1020

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tacaccgtct actatggcac tgacgactgg aagtgcgctg tcggtgacca tgtcagccag    1200

atttaa                                                               1206

成熟蛋白理论分子量为43.0kDa，将甘露聚糖酶基因Man5XH9序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，该基因与性质验证的来源于Aspergillusfumigatus的甘露聚糖酶氨基酸序列一致性为76％。说明Man5XH9是一种新的甘露聚糖酶。

本发明还提供了包含上述中温耐碱性甘露聚糖酶基因Man5XH9的重组载体，优选为pPIC-Man5XH9。将本发明的甘露聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的甘露聚糖酶基因插入到质粒pPIC9上的SpeI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-Man5XH9。

本发明还提供了包含上述中温耐碱甘露聚糖酶基因Man5XH9的重组菌株，所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组毕赤酵母菌株GS115/Man5XH9。

本发明还提供了一种制备上述中温耐碱性甘露聚糖酶Man5XH9的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组甘露聚糖酶Man5XH9表达；以及

3)回收并纯化所表达的甘露聚糖酶Man5XH9。

其中，所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/Man5XH9。

本发明还提供了上述中温耐碱甘露聚糖酶Man5XH9的应用，优选其在水解甘露聚糖酶及在造纸、纺织工业中的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在造纸、纺织工业中应用新的甘露聚糖酶。本发明的甘露聚糖酶最适pH为4.5，在pH 4.0～7.0都有较高的酶活性；pH稳定性好。此外，Man5XH9可有效降解半乳甘露聚糖与葡萄甘露聚糖，而不降解木聚糖与微晶纤维素钠，可以有效降解漂白纸浆中的甘露聚糖部分而不影响纤维素。因此，本甘露聚糖酶在工业中的应用显示出其巨大的潜力。

附图说明

图1重组甘露聚糖酶的最适pH。

图2重组甘露聚糖酶的pH稳定性。

图3重组甘露聚糖酶的最适温度。

图4重组甘露聚糖酶的热稳定性。

青霉XH9(Penicillium sp.)，于2011年10月21日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.5369。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：青霉Penicillium sp.XH9由发明人分离获得，毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。底物购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)Penicillium sp.XH9 CGMCC5369培养基为马铃薯汁培养基：1000mL马铃薯汁，10g葡萄糖，25g琼脂，pH3.0。

(2)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。

(3)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(V/V)。

(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1 青霉Penicillium sp.XH9分离及产酶特性

青霉Penicillium sp.XH9分离自发酵棉粕中，pH5.0。分离培养基为PDA培养基，pH3.0，通过多次稀释涂板获得单菌。在PDA培养基28℃14天菌落灰绿色，直径2.0～3.0cm。营养菌丝体无色。菌丝有横隔，分生孢子梗亦有横隔，光滑或粗糙。基部无足细胞，顶端不形成膨大的顶囊，其分生孢子梗经过多次分枝，产生几轮对称或不对称的小梗，形如扫帚，称为帚状体。分生孢子球形、椭圆形或短柱形，光滑或粗糙，大部分生长时呈蓝绿色。该菌为Penicillium属，命名为XH9(Penicillium sp.)。该菌株于2011年10月21日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.5369。

将青霉Penicillium sp.XH9接种于产酶培养基((NH₄)₂SO₄ 5g/L，KH₂PO₄1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，CaCl₂ 0.2g/L，角豆胶0.5％，pH6.0)，30℃培养3～6d，观察其是否产甘露聚糖酶。诱导6天后，测定到培养基上清具有甘露聚糖酶酶活，达到1.0U/ml.

实施例2 青霉Penicillium sp.XH9甘露聚糖酶编码基因Man5XH9的克隆

提取青霉Penicillium sp.XH9基因组DNA：

将液体培养3天的菌丝体用离心后取入研钵中，加入2mLCTAB提取液，液氮冻制研磨5min，然后将研磨液置于50mL离心管中，70℃水浴锅裂解20min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。

根据第五家族甘露聚糖酶基因的保守(NWSDYGG和AWELGNE)序列设计合成了简并引物P1，P2：

P1：5′-AAYTGGGAYGAYTWYGGNGG-3′；

P2：5′-TCRYYNSCNARYTCCCANGC-3′。

以Penicillium sp.XH9总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，50℃降落45℃(每个循环降落0.5℃)退火30sec，72℃延伸30s，接着94℃变性30s，45℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃保温7min。得到一约170bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送三博生物技术有限公司测序。

根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各二条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，第二条引物的位置设计在第一条引物的内侧。每两个引物之间的距离为80bp左右，引物长度一般22～30nt，退火温度在60℃。并将它们分别命名为usp1，usp2(上游特异性引物)，dsp1，dsp2(下游特异性引物)见表1。

表1.甘露聚糖酶Man5XH9 TAIL-PCR特异性引物

通过反向TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。拼接后再通过RT-PCR方法获得Man5XH9甘露聚糖酶基因全长1260bp(SEQ ID NO.2)，编码419个氨基酸(SEQ ID NO.4)和一个终止密码子。用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)进行分析表明N端18个氨基酸为预测的信号肽(SEQ ID NO.3)。预测该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为43.0kDa。

实施例3 重组甘露聚糖酶的制备

将表达载体pPIC9进行双酶切(Spe I+Not I)，同时将扩增到编码甘露聚糖酶的基因Man5XH9(不含信号肽)双酶切(Spe I+Not I)，切出编码甘露聚糖酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有Penicillium sp.XH9 CGMCC5369甘露聚糖酶基因Man5XH9的重组质粒pPIC-Man5XH9并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/Man5XH9；同样，将包含有信号肽序列的甘露聚糖酶Man5XH9的cDNA通过酶切、连接方法插入已去除α-因子信号肽序列的表达载体pPIC9中，获得含信号肽序列的编码甘露聚糖酶的基因Man5XH9的重组质粒pPIC-Man5XH9-1并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/Man5XH9-1。

分别取含有两种重组质粒的GS115菌株，分别接种于300mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于100mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。测定甘露聚糖酶的活力。重组菌株GS115/Man5XH9的重组甘露聚糖酶的表达量为43.5U/mL，相比之下，重组菌株GS115/Man5XH9-1的重组甘露聚糖酶的表达量低于前者。SDS-PAGE结果表明，重组甘露聚糖酶在毕赤酵母中得到了表达。重组甘露聚糖酶的比活为47.5U/mg。

实施例4 重组甘露聚糖酶的活性分析

纯化重组菌株GS115/MAn5XH9和GS115/Man5XH9-1所产重组甘露聚糖酶，使用DNS法进行活性分析。

DNS法：具体方法如下：在pH4.5，60℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mLDNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。

实施例5 重组甘露聚糖酶Man5XH9的性质测定

1、重组甘露聚糖酶Man5XH9的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

将实施例4纯化的重组甘露聚糖酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物角豆胶用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中37℃下进行甘露聚糖酶活力测定。结果(图1)表明，重组酶Man5XH9的最适pH为4.5，在pH 4.0～7.0有75％以上的相对酶活性。甘露聚糖酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH 4.5缓冲液体系中60℃下测定酶活性，以研究酶的pH稳定性。结果(图2)表明甘露聚糖酶在pH 4.0-10.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在60％以上，这说明此酶在中性和碱性范围内具有良好的pH稳定性。

2、甘露聚糖酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：

甘露聚糖酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH4.5)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为甘露聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在60℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图3)表明其最适温度为60℃。酶的热稳定性性试验表明(图4)，Man5XH9在50℃下温育1h，能保持原有的酶活性的70％。

3、甘露聚糖酶的K_m值测定方法如下：

分别以不同浓度的角豆胶或魔芋粉为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 4.5)缓冲液体系中，60℃下测定酶活性，计算出其在60℃下的K_m值。经测定，以角豆胶与魔芋粉为底物时的K_m值分别为7.8mg/mL和2.3mg/mL，最大反应速度V_max分别为70.4μmol/min·mg和61.7μmol/min·mg。

4、不同金属离子化学试剂对Man5XH9酶活的影响测定如下：

在酶促反应体系中加入1mmol/L的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。在60℃、pH 4.5条件下测定酶活性。结果表明(表2)，Li⁺、Fe³⁺、Mg²⁺、Cr³⁺对酶活有部分抑制作用，SDS强烈抑制其活性，而Cu²⁺、Co²⁺和巯基乙醇对酶活都有一定的促进作用，其它金属离子和化学试剂对酶活的影响不大。

表2.各种化学试剂及离子的对Cel6的影响如表所示

5、重组甘露聚糖酶的底物特异性

该酶除可作用于角豆胶外，对于魔芋粉也有较高的降解作用(表3)。其角豆胶降解产物主要为甘露二糖、甘露三糖和其他寡糖。魔芋粉降解产物为少量甘露糖，甘露二糖，以及未鉴定的寡糖。

表3.甘露聚糖酶Man5XH9底物特异性分析

Claims (10)

1.一种中温耐碱性甘露聚糖酶Man5XH9，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2所示。

2.一种中温耐碱性甘露聚糖酶基因man5XH9，其特征在于，编码权利要求1所述的中温耐碱性甘露聚糖酶Man5XH9。

3.根据权利要求2所述的中温耐碱性甘露聚糖酶基因man5XH9，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4或5所示。

4.包含权利要求2或3所述中温耐碱性甘露聚糖酶基因man5XH9的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为通过将所述甘露聚糖酶基因man5XH9插入到质粒pPIC9上的Spe I和Not I限制性酶切位点之间而获得的载体pPIC9-man5XH9。

6.包含权利要求2或3所述中温耐碱性甘露聚糖酶基因man5XH9的重组菌株。

7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为毕赤酵母菌。

8.一种制备中温耐碱性甘露聚糖酶Man5XH9的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组甘露聚糖酶Man5XH9的表达；以及

3）回收并纯化所表达的甘露聚糖酶Man5XH9。

9.权利要求1所述中温耐碱性甘露聚糖酶Man5XH9用于降解甘露聚糖的应用。

10.一株青霉（Penicillium sp.）XH9，其特征在于，其保藏编号为：CGMCC No.5369。

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