CN101838636A - 一种高比活木聚糖酶xyn11f63及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高比活木聚糖酶XYN11F63及其基因和应用。本发明提供了一种来源于青霉属Penicillium sp.F63CGMCC1669的木聚糖酶XYN11F63，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本发明提供了编码上述木聚糖酶的基因组和cDNA编码基因xyn11F63。本发明的木聚糖酶的具有以下性质：最适pH4.5，最适温度40℃，比活为7988U/mg；极好的蛋白酶抗性以及易于工业化发酵生产。做为一种新型的酶制剂，可广泛用于动物饲料、食品、造纸、能源工业等。

Description

一种高比活木聚糖酶XYN11F63及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高比活木聚糖酶XYN11F63及其基因、包含该基因的重组载体和应用。

背景技术

木聚糖(xylan)是植物细胞壁半纤维素的主要成分，它是自然界中含量仅次于纤维素的第二丰富的多聚糖，几乎占地球可更新有机碳含量的三分之一(Collins et al.FEMS Microbiology Reviews.2005，29：3-23.)。长期以来富含木聚糖的农业副产物如玉米芯、秸秆、甘蔗渣等难以得到有效的利用。与此同时在造纸制浆过程中富含木聚糖和氯化物的工业废料往往直接排入水体，导致水质富营养化等水体污染从而严重破坏生态环境(Polizeli et al.Applied Microbiology and Biotechnology.2005，67：577-591.)。木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的一类酶的总称，在造纸、饲料、食品、纺织、能源科学和环境保护等领域上都有着广泛的应用前景。

据报道各种微生物如细菌和真菌等都能产生木聚糖酶。丝状真菌因其易于培养、分泌表达以及具有高木聚糖酶生产能力而成为木聚糖酶的理想来源(Tanaka et al.Journal of Bioscience and Bioengineering，2005，100：623-630.)。目前已有一些青霉来源的木聚糖酶基因已经得到克隆并实现了异源表达。包括来源于Penicillium citrium XynA(Tanaka et al.Journal of Bioscience and Bioengineering，2005，100：623-630.)，Penicillium funiculosum XYNC(Fumiss et al.BBA-Proteins and Proteomics.2002，1598：24-29.)，Penicillium sp.strain 40 XynA(Kimura et al.Bioscience，Biotechnology and Biochemistry.2000，64：1230-1237.)，Penicillium purpurogenum XynB (Diaz et al.Gene.1997，187：247-251.)，and Penicillium janthinellum NCIM(Milagres and Prade，Enzyme and Microbial Technology.199416：627-632.)。

尽管如此，真菌来源的木聚糖酶因生产成本较高使其应用受到限制。因此，获得新型具有优良特性木聚糖酶的研究仍具有重大意义。克隆和分离具有高比活的木聚糖酶可以更好的应用于饲料、食品和造纸工业，而且可以降低生产成本，都是木聚糖酶应用于工业化生产所必需的。

发明内容

本发明的目的是提供一种能高效应用的高比活木聚糖酶。

本发明的再一目的是提供编码上述高比活木聚糖酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述高比活木聚糖酶的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述高比活木聚糖酶的应用。

本发明从青霉(Penicillium sp.F63)中分离得到一种新的高比活木聚糖酶XYN11F63，该菌种保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.1669，保藏日期：2006年4月5号，并且在申请号为200610080455.4、申请日为2006年5月16日的专利申请文件中。

本发明提供了一种高比活木聚糖酶XYN11F63，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MVSFSNLFMAACAAVTAFALPNELDKRALTTSKQGTSDGYFYSFWTNGGGSVSY

ENGAAGQYSVTWKNCDSFTSGKGWATGSARNIKFSGSFKPSGNAYLAVYGWTTS

PLVEYYIMESYGEYNPGSSMTFKGTVTSDGSVYDIYTHKQVNQPSIVADSSTFDQY

WSIRRNKRSSGTVTTANHFNAWSKLGMGMGSHGYQIVSTEGYKSSGSSSITVS

其中，该酶基因编码217个氨基酸，N端19个氨基酸为其预测的信号肽序列“mvsfsnlfmaacaavtafa”(SEQ ID NO.3)。

因此，成熟的高比活木聚糖酶XYN11F63的理论分子量为21.5kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

LPNELDKRALTTSKQGTSDGYFYSFWTNGGGSVSYENGAAGQYSVTWKNCDSFT

SGKGWATGSARNIKFSGSFKPSGNAYLAVYGWTTSPLVEYYIMESYGEYNPGSSM

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本发明的木聚糖酶XYN11F63在酸性范围内均具有高活性、抗蛋白酶降解等特性。本发明筛选到Penicillium sp.F63 CGMCC1669所产生的木聚糖酶，其最适pH值为4.5，在Ph4.5～9.0的范围内维持90％以上的酶活性；最适温度为40℃，在30℃-50℃间均具有60％以上的酶活力维持在60％以上；用胰蛋白、α-糜蛋白酶、蛋白酶K和枯草杆菌溶素A处理60分钟，酶活性维持在80％。这种性质的木聚糖酶还未曾有过报道。

本发明提供了编码上述高比活木聚糖酶xyn11F63。具体地，该基因的基因组序列如SEQ ID NO.4所示：

atggtctctttttcaaacctctttatggctgcctgtgcagcggtgactgcctttgcgctccccaatgagttggataagcgggctctcaccacaagcaagcaaggaactagcgacggctacttctattccttctggaccaacggtggtggtagtgtctcctacgagaacggtgctgcaggtcaatacagcgtcacctggaaaaactgcgactccttcacctccggcaagggctgggctactggtagcgccgtaagtcgagcgtacgagttaatcttcggtaaatatacttattagtattcttactagcgaaacatcaaattctccggctctttcaagccctccggaaatgcttaccttgccgtttacggttggaccactagccctcttgttgaatattatatcatggagagctacggcgaatacaaccccggcagcagcatgaccttcaagggaaccgtgacttctgatggatccgtctacgatatctacacccacaagcaggtgaaccagccttctatcgtcgcagattcctccaccttcgatcagtactggtccatccgccgcaacaagcgcagcagcggaactgtcaccactgctaaccacttcaacgcttggtctaagcttggaatgggtatgggctcccacggctaccagatcgtcagcactgagggatacaagagcagtggctcttcgtccatcactgtttcctaa

本发明通过PCR的方法分离克隆了木聚糖酶基因xyn11F63，DNA全序列分析结果表明，木聚糖酶XYN11F63结构基因xyn11F63全长711bp，含有一个内含子，cDNA长654bp，+250～+306bp为57bp的内含子序列，其cDNA序列如SEQ ID NO.5所示：

Atggtctctttttcaaacctctttatggctgcctgtgcagcggtgactgcctttgcgctccccaatgagttggataagcgggctctcaccacaagcaagcaaggaactagcgacggctacttctattccttctggaccaacggtggtggtagtgtctcctacgagaacggtgctgcaggtcaatacagcgtcacctggaaaaactgcgactccttcacctccggcaagggctgggctactggtagcgcccgaaacatcaaattctccggctctttcaagccctccggaaatgcttaccttgccgtttacggttggaccactagccctcttgttgaatattatatcatggagagctacggcgaatacaaccccggcagcagcatgaccttcaagggaaccgtgacttctgatggatccgtctacgatatctacacccacaagcaggtgaaccagccttctatcgtcgcagattcctccaccttcgatcagtactggtccatccgccgcaacaagcgcagcagcggaactgtcaccactgctaaccacttcaacgcttggtctaagcttggaatgggtatgggctcccacggctaccagatcgtcagcactgagggatacaagagcagtggctcttcgtccatcactgtttcctaa

其中，信号肽的碱基序列为：ATGGTCTCTTT TTCAAACCTCT TTATGGCTGCCTGTGCAGCGGT GACTGCCTTTGCG(SEQ ID NO.6)。

成熟蛋白理论分子量为21.5kDa。将木聚糖酶基因xyn11F63 cDNA序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对。该基因与来源于Penicillium chrysogenum的木聚糖酶氨基酸序列一致性为85％。说明XYN11F63是一种新的木聚糖酶。

本发明还提供了包含上述高比活木聚糖酶基因xyn11F63的重组载体，优选为pPIC-xyn11F63。将本发明的木聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的木聚糖酶基因插入到质粒pPIC9上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-xyn11F63。

本发明还提供了包含上述高比活木聚糖酶基因xyn11F63的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株GS115/xyn11F63。

本发明还提供了一种制备高比活木聚糖酶XYN11F63的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶表达；以及

3)回收并纯化所表达的木聚糖酶XYN11F63。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/xyn11F63。

本发明还提供了上述高比活木聚糖酶XYN11F63的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、食品、工业中应用新的木聚糖酶。本发明的木聚糖酶最适pH为4.5，在Ph3.5～5.5都有较高的酶活性；pH稳定性好；比活力为7988U/mg；具有极好的抗蛋白酶的能力。其高比活性，可降低木聚糖酶在工业生产上应用成本。pH适应范围提高饲料消化能和代谢能，降低配方成本，减少环境污染；提高谷物加工副产品的营养价值，提升饲料产品品质。本木聚糖酶可应用于酿酒工业，降低物料粘度，可以有利于淀粉酶作用于淀粉层，提高淀粉利用率，增加酒精的产率。还可以将造纸工业废料及农业废弃物中的木聚糖可被转化为D-木糖单体，而D-木糖又可被细菌、酵母及真菌转化成有价值的燃料。因此，本木聚糖酶在能源工业中的应用也显示出其巨大的潜力。水解产物(木糖和低聚木糖)可应用在食品行业，作为增稠剂、脂肪代替物和抗冻食品添加剂；在制药工业中木聚糖与其它物质结合使用，可以延缓药物成分的释放。木聚糖的水解产物还可以进一步转化为液体燃料、单细胞蛋白、溶剂和低热量甜味剂。

附图说明

图1在毕赤酵母菌中表达的重组木聚糖酶的SDS-PAGE分析，其中，1：低分子量蛋白质Marker；2：含有木聚糖酶基因的毕赤酵母菌培养上清液浓缩液；3：纯化的重组木聚糖酶。

图2重组木聚糖酶的最适pH。

图3重组木聚糖酶的pH稳定性。

图4重组木聚糖酶的最适温度。

图5重组木聚糖酶的热稳定性。

图6重组木聚糖酶的蛋白酶抗性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：青霉Penicillium sp.F63 CGMCC1669，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.1669。毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。燕麦木聚糖购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)青霉Penicillium sp.F63 CGMCC1669培养基为马铃薯汁培养基：1000mL马铃薯汁，10g葡萄糖，25g琼脂，pH5.0。

(2)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。

(3)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(V/V)。

(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1青霉Penicillium sp.F63 CGMCC1669产酶特性

将青霉Penicillium sp.F63 CGMCC1669经马铃薯汁培养基培养后，涂布于产酶培养基((NH₄)₂SO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O0.01g/L，CaCl₂ 0.2g/L，木聚糖1％，1.5％琼脂糖，pH5.0)平板上，30℃培养5～6d，在产酶培养基平板可见透明圈产生。证明其具有木聚糖酶活性。

实施例2青霉Penicillium sp.F63(CGMCC1669)木聚糖酶编码基因xyn11F63的克隆

提取青霉Penicillium sp.F63(CGMCC1669)基因组DNA：

将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入2mL提取液，研磨5min，然后将研磨液置于50mL离心管中，65℃水浴锅裂解20min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。

根据第十一家族木聚糖酶基因的保守(CYLG(A)VYGW和TFNQYWS)序列设计合成了简并引物P1，P2

P1：5′-TGCTACCTGG(C/G)CTT(A/C/G/T)TA(C/T)GG(A/C/G/T)TGG-3′；

P2：5′-ACCAGTA(C/T)TG(A/C/G/T)T(A/C/G/T)(A/G)AA(A/C/G/T)GT-3′)。

以青霉Penicillium sp.F63 CGMCC1669总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，48℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环后72℃保温10min。得到一约213bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送三博生物技术有限公司测序。

根据测序得到的核甘酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22～30nt，退火温度在60～65℃。并将它们分别命名为usp1，usp2，usp3(上游特异性引物)，dsp1，dsp2，dsp3(下游特异性引物)见表1。

表1.木聚糖酶XYN11F63 TAIL-PCR特异性引物

通过反向TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。

实施例3木聚糖酶基因的RT-PCR分析

提取Penicillium sp.F63(CGMCC166)的总RNA，利用反转录酶得到cDNA的一条链，然后设计恰当的引物(Xy110A F：5′-ATGGTCTCTTTTTCAAACCTCTTTATGGCTGCCTG-3′，Xy110A R：5′-TTAGGAAACAGTGATGGACGAAGAGCCACT-3′)扩增该单链cDNA，获得木聚糖酶的cDNA序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。

通过比较木聚糖酶的基因组序列和cDNA序列后发现该基因有1个内含子，cDNA长654bp，编码217个氨基酸和一个终止密码子，N端19个氨基酸为其预测的信号肽序列。所测出的基因xyn11F63的成熟蛋白部分核甘酸序列与GeneBank上的木聚糖酶基因序列进行同源比较，最高一致性为86％，氨基酸序列最高一致性为85％，证明从Penicillium sp.F63(CGMCC1669)中分离克隆得到的编码木聚糖酶的基因为新基因。

实施例4重组木聚糖酶的制备。

将表达载体pPIC9进行双酶切(EcoRI+NotI)，同时将编码木聚糖酶的基因xyn11F63双酶切(EcoRI+NotI)，切出编码成熟木聚糖酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有Penicillium sp.F63 CGMCC1669木聚糖酶基因xyn11F63的重组质粒pPIC-xyn11F63并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/xyn11F63。

取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于150mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。测定木聚糖酶的活力。重组木聚糖酶的表达量为516U/mL。SDS-PAGE结果(图1)表明，重组木聚糖酶在毕赤酵母中得到了表达。所表达的木聚糖酶经过纯化之后，其蛋白质的含量达到总蛋白的90％以上。

实施例5重组木聚糖酶的活性分析

DNS法：具体方法如下：在pH4.5，40℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。

实施例6重组木聚糖酶XYN11F63的性质测定

1、重组木聚糖酶XYN11F63的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

将实施例4纯化的重组木聚糖酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物木聚糖用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中55℃下进行木聚糖酶活力测定。结果(图2)表明，XYN11F63的最适pH为4.5，在Ph3.5～5.5的范围内，酶活性均维持在最大酶活性的60％以上。木聚糖酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH4.5缓冲液体系中40℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果(图3)表明木聚糖酶在pH 4.5-9.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在90％以上，这说明此酶具有较好的pH稳定性。

2、木聚糖酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：

木聚糖酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH4.5)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为木聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在55℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图4)表明其最适温度为40℃。酶的热稳定性性试验表明(图5)，重组酶在40℃时稳定性非常好。45℃下保温60min，剩余酶活性为44.6％。

3、木聚糖酶的K_m值测定方法如下：

用不同浓度的木聚糖(4-O-Me-D-glucurono-D-xylan，Sigma From birchwood)为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH4.5)缓冲液体系中，40℃下测定酶活性，计算出其在40℃下的k_m值。经测定，此木聚糖酶在40℃下以木聚糖为底物的k_m值为11.3mg/mL，最大反应速度V_max为10570.8μmol/min·mg。

4、不同金属离子化学试剂对XYL10A酶活的影响测定如下：

在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为1，5和10mmol/L。在40℃、pH4.5条件下测定酶活性。结果(表2)表明，大多数离子和化学试剂在浓度为1mmol时重组木聚糖酶的活力没有明显变化。但是Hg²⁺几乎可以完全抑制其活力，而SDS也强烈抑制其活力。当Co²⁺，Cu²⁺，pb²⁺，Fe³⁺浓度为10mmo时可以部分抑制rXYN11F63活力。β-巯基乙醇在5mmol和10mmol时能分别使重组酶活力增加到原来的1.29和1.35倍。

表2.各种化学试剂对木聚糖酶XYN11F63活力的影响

注：“-”代表无法检测。

5、木聚糖酶抗胃蛋白酶及胰蛋白酶能力测定如下：

用pH 7.00.1mol/L Tris-HCl将胰蛋白酶、α-糜蛋白酶配成1mg/mL的溶液；用pH7.50.1mol/L Tris-HCl将蛋白酶K、枯草杆菌蛋白酶A配成1mg/mL的溶液。将纯化的木聚糖酶与蛋白酶按10∶1(w/w)在配制蛋白酶溶液的缓冲液中处理30min和60min后，按标准方法在最适温度和最适pH下检测已处理酶的剩余酶活。对照酶液用配制蛋白酶液的相应缓冲液处理相同的时间，以其酶活作为对照计算相对酶活。经过各种蛋白酶处理的XYN11F63酶活力变化结果(图6)表明，用不同的酶蛋白37℃处理30min后XYN11F63的剩余酶活力为：92.7％(胰蛋白酶)，93.1％(α-糜蛋白酶)，80.1％(蛋白酶K)和86.8％(枯草杆菌溶素A)；当处理60min时酶活力还可保留80％以上。从以上结果可以看出：XYN11F63对这四种蛋白酶都有较好的抵抗能力。

6、木聚糖酶降解燕麦木聚糖产物的分析如下：

在500μL 1％的木聚糖中加入100μL纯化的酶液，最适温度下保温3～4h。用无水乙醇将酶蛋白沉淀，上清液用2500色谱仪，利用高效阴离子交换色谱-脉冲安培(HPAEC-PAD)检测方法，进行产物中糖种类的分析。分析结果表明：木聚糖酶XYN11F63降解燕麦木聚糖的产物主要是木糖，木二糖，木三糖和木四糖。产物中木糖含量为7.46％，木二糖含量为28.36％，木三糖的含量为25.37％，木四糖含量为38.81％。

序列表

<110>申请人？

<120>一种高比活木聚糖酶XYN11F63及其基因和应用

<160>6

<210>1

<211>217

<212>PRT

<213>青霉(Penicillium sp)

<400>1

MVSFSNLFMA ACAAVTAFAL PNELDKRALT TSKQGTSDGY FYSFWTNGGG

SVSYENGAAG                                         60

QYSVTWKNCD SFTSGKGWAT GSARNIKFSG SFKPSGNAYL AVYGWTTSPL

VEYYIMESYG                                         120

EYNPGSSMTF KGTVTSDGSV YDIYTHKQVN QPSIVADSST FDQYWSIRRN

KRSSGTVTTA                                         180

NHFNAWSKLG MGMGSHGYQI VSTEGYKSSG SSSITVS           217

<210>2

<211>198

<212>PRT

<213>青霉(Penicillium sp)

<400>2

LPNELDKRAL TTSKQGTSDG YFYSFWTNGG GSVSYENGAA GQYSVTWKNC

DSFTSGKGWA             60

TGSARNIKFS GSFKPSGNAY LAVYGWTTSP LVEYYIMESY GEYNPGSSMT

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GMGMGSHGYQ             180

IVSTEGYKSS GSSSITVS    198

<210>3

<211>19

<212>PRT

<213>青霉(Penicillium sp)

<400>3

MVSFSNLFMA ACAAVTAFA    19

<210>4

<211>711

<212>DNA

<213>青霉(Penicillium sp)

<400>4

atggtctctt tttcaaacct ctttatggct gcctgtgcag cggtgactgc ctttgcgctc    60

cccaatgagt tggataagcg ggctctcacc acaagcaagc aaggaactag cgacggctac    120

ttctattcct tctggaccaa cggtggtggt agtgtctcct acgagaacgg tgctgcaggt    180

caatacagcg tcacctggaa aaactgcgac tccttcacct ccggcaaggg ctgggctact    240

ggtagcgccg taagtcgagc gtacgagtta atcttcggta aatatactta ttagtattct    300

tactagcgaa acatcaaatt ctccggctct ttcaagccct ccggaaatgc ttaccttgcc    360

gtttacggtt ggaccactag ccctcttgtt gaatattata tcatggagag ctacggcgaa    420

tacaaccccg gcagcagcat gaccttcaag ggaaccgtga cttctgatgg atccgtctac    480

gatatctaca cccacaagca ggtgaaccag ccttctatcg tcgcagattc ctccaccttc    540

gatcagtact ggtccatccg ccgcaacaag cgcagcagcg gaactgtcac cactgctaac    600

cacttcaacg cttggtctaa gcttggaatg ggtatgggct cccacggcta ccagatcgtc    660

agcactgagg gatacaagag cagtggctct tcgtccatca ctgtttccta a             711

<210>5

<211>654

<212>DNA

<213>青霉(Penicillium sp)

<400>5

atggtctctt tttcaaacct ctttatggct gcctgtgcag cggtgactgc ctttgcgctc    60

cccaatgagt tggataagcg ggctctcacc acaagcaagc aaggaactag cgacggctac    120

ttctattcct tctggaccaa cggtggtggt agtgtctcct acgagaacgg tgctgcaggt    180

caatacagcg tcacctggaa aaactgcgac tccttcacct ccggcaaggg ctgggctact    240

ggtagcgccc gaaacatcaa attctccggc tctttcaagc cctccggaaa tgcttacctt    300

gccgtttacg gttggaccac tagccctctt gttgaatatt atatcatgga gagctacggc    360

gaatacaacc ccggcagcag catgaccttc aagggaaccg tgacttctga tggatccgtc    420

tacgatatct acacccacaa gcaggtgaac cagccttcta tcgtcgcaga ttcctccacc    480

ttcgatcagt actggtccat ccgccgcaac aagcgcagca gcggaactgt caccactgct    540

aaccacttca acgcttggtc taagcttgga atgggtatgg gctcccacgg ctaccagatc    600

gtcagcactg agggatacaa gagcagtggc tcttcgtcca tcactgtttc ctaa          654

<210>6

<211>57

<212>DNA

<213>青霉(Penicillium sp)

<400>6

atggtctctt tttcaaacct ctttatggct gcctgtgcag cggtgactgc ctttgcg    57

Claims (10)

1.一种高比活木聚糖酶XYN11F63，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的高比活木聚糖酶XYN11F63，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种高比活木聚糖酶基因xyn11F63，其特征在于，编码权利要求1或2所述的高比活木聚糖酶XYN11F63。

4.如权利要求3所述的高比活木聚糖酶基因xyn11F63，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.4或5所示。

5.包含权利要求3或4所述高比活木聚糖酶基因xyn11F63的重组载体。

6.包含权利要求3或4所述高比活木聚糖酶基因xyn11F63的重组载体pPIC-xyn11F63。

7.包含权利要求3或4所述高比活木聚糖酶基因xyn11F63的重组菌株。

8.如权利要求7的重组菌株，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。

9.一种制备高比活木聚糖酶XYN11F63的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求5的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组葡聚糖酶表达；以及

3)回收并纯化所表达的木聚糖酶XYN11F63。

10.权利要求1或2所述高比活木聚糖酶XYN11F63的应用。

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