CN100491533C - 改良的高比活木聚糖酶及其基因、包括该基因的表达载体和重组酵母细胞以及表达方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种经改良的高比活木聚糖酶及其编码基因、高效表达方法。改良后的木聚糖酶较原木聚糖酶具有更好的热稳定性，在80℃处理1分钟，改良的木聚糖酶XYNB’剩余酶活性为98%以上。本发明还提供了含有本发明的木聚糖酶基因的重组酵母细胞。本发明的重组酵母中木聚糖酶的表达量可达到10000IU/mL发酵液。本发明的木聚糖酶可广泛应用于饲料和食品工业中。

Description

改良的高比活木聚糖酶及其基因、包括该基因的表达载体和重组酵母细胞以及表达方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域。具体地，本发明涉及一种经分子改良的木聚糖酶及其基因，本发明还涉及含有该木聚糖酶基因的表达载体、重组酵母细胞，以及该基因的高效表达方法。

背景技术

木聚糖(xylan)是一种杂合多聚五碳糖，主链由多个吡喃木糖基通过木糖苷键相连。侧链上连着多种不同大小的短的取代基。木聚糖主要存在于植物细胞的次生壁中，处于木质素及其它多聚糖之间，起着连接作用。木聚糖是植物半纤维素的重要组分，它占植物碳水化合物总量的三分之一，在自然界中是继纤维素之后含量第二丰富的再生物质资源。不同植物所含木聚糖的多少也有所差别，一般硬材中所含木聚糖比软材中多，硬材中能占到干重的15％～30％，软材中一般占干重的7％～10％。而在一些一年生植物如小麦、甘蔗、棉子壳中，木聚糖含量非常高，一般都能达到30％以上。(Gregory A C E et al.Biotech.and Gentic Engi.Rev.，15：439～455，1998)

我国的畜禽饲料主要原料来源于植物，如玉米、小麦、大麦等，它们都含有一定数量的木聚糖，如小麦种皮中阿拉伯木聚糖占其非淀粉多糖(NSPs)总量的66％，糊粉层中阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖分别占其NSPs总量的65％和31％，胚乳细胞中88％的NSPs是阿拉伯木聚糖，其中1/3是可溶的。而这些NSPs是饲料中的重要抗营养因子。会阻碍畜禽的消化吸收，降低饲料利用率，同时给卫生和疾病控制带来困难。

现在普遍认为，木聚糖可能通过多种方式影响饲料的营养价值和动物对饲料的消化利用。其中最直观的原因是可溶性木聚糖能结合大量的水，使采食动物消化道中食糜的体积增大、粘度升高，影响胃肠道运动对食糜的混合效率，从而影响消化酶与底物接触和消化产物向小肠上皮绒毛渗透，进一步影响了动物对饲料的消化和养分吸收。木聚糖还可能与消化酶或消化酶活性必需的其它成分(如胆汁酸或无机离子等)结合而影响消化酶的活性。另外由于木聚糖是细胞壁的主要成分，不能被消化酶水解，大分子消化酶也不能通过细胞壁进入细胞内，因而对细胞内容物形成了一种包被结构，木聚糖的这种包被作用也会干扰有些谷物细胞内其它养分的消化吸收。另外，木聚糖使采食动物对养分吸收减少，而在肠道的蓄积增加，这为肠道微生物的繁殖提供了良好的环境，大量有害微生物的增殖，会产生许多酸性物质，改变肠道pH环境，从而影响消化酶发挥最佳效应，同时微生物会竞争性地消耗大量营养物质，降低物质的利用率。

由于木聚糖具有上述抗营养活性，在实际生产中，饲粮中木聚糖不能有效降解，会显著降低营养物质的消化率，降低采食量，影响畜禽的生产性能。粘性粪便的排泄，给卫生控制带来困难，畜禽发病率增加；同时，还能影响禽蛋色素的沉积，使肉禽胴体色质偏白，降低胴体等级。(Morgan A J et al.Proc Aust Poult Sym，，7：109～115，1995)

木聚糖酶是能够降解木聚糖的一类水解酶。研究结果表明，饲料中如果添加木聚糖酶，就可显著降低或消除木聚糖的抗营养作用。其具体作用及机理包括：

(1)添加木聚糖酶和β-葡聚糖酶后，将大分子的多聚糖降解成分子量较小的多糖片段，从而降低食糜的粘稠性。加拿大Sasktoon大学的研究证实，雏鸡活体增重和料重比与前肠食糜粘度的对数之间存在一种线性关系；美国商业联合体的试验证明，大麦饲粮中添加酶制剂使肉鸡肠道内容物粘度由37.0CPS下降到6.4CPS；Badford和Classen(1991)证实，70％-80％的雏鸡增重与饲料转化率的提高是由食糜粘度下降引起的。肠内容物粘度的降低有利于消化酶和营养物质的充分混合，降低不动水层的厚度，减少胆汁酸的排出，利于肠道的消化吸收，从而提高营养物质的消化率；

(2)提高内源性消化酶活性，促进营养物质尤其是脂肪和蛋白质的消化和吸收。王振来(1997)在仔猪上的试验证实，添加外源木聚糖酶提高了肠内容物中的总蛋白水解酶、淀粉酶和脂肪酶活力。但它如何提高内源酶活的机理还不清楚；

(3)添加木聚糖酶和β-葡聚糖酶后，可以降低因粘度过高而引起的营养物质在肠道的蓄积，从而减少肠道细菌群落，这种变化可以使肠壁变薄，改善营养吸收，同时肠道中沙门氏杆菌的减少，可以降低胆汁盐的早期解离，有助脂肪的消化。细菌群落的削弱可以降低动物的腹泻率，有利于畜禽的健康生长；

(4)木聚糖是植物细胞壁的成分之一，畜禽内源性消化酶不能分解木聚糖，细胞壁内的营养物质难以释放出来，木聚糖酶可以分解木聚糖而破坏细胞壁结构，使消化酶能与营养物质充分接触，另一方面，木聚糖的降解，可以使与之相结的蛋白质、淀粉和脂肪游离出来，有利于营养的消化，提高动物采食量、增重和饲料转化率。

对木聚糖酶的研究早在六十年代就已开始，主要研究集中在适合于食品工业、制浆造纸工业、能源工业等方面的木聚糖酶，已经从不同来源的微生物中分离到大量的不同类型不同功能的木聚糖酶。研究得较为清楚的有Trichoderma reesei(里氏木霉)、Aspergillus niger(黑曲霉)、Streptomyces lividans(浅青紫链霉菌)、Cellulomonas fimi(粪肥杆菌)、Clostridium thermocellum(热纤维梭菌)、Penicilliumsimplicissimum(简青霉)等所产生的木聚糖酶。最近十几年，随着生物技术的不断发展和进步，特别是基因工程技术和蛋白质工程技术的广泛应用，人们对木聚糖酶的了解更加深入，已经分离出多种木聚糖酶基因，并已工业化生产多种木聚糖酶产品。

在木聚糖酶基因的表达方面，近年来已有了许多有益的尝试。1990年Luthi等用大肠杆菌(Escherichia coli)为受体菌尝试表达来源于Caldocellum sacharolyticum的耐热木聚糖酶基因xynA，控制xynA的启动子采用表达载体P^JLA602上的温度诱导的pR和pL启动子。xynA的表达量可达到细胞总蛋白的20％以上。并且表达的XYNA具有正常的生物学活性，与原始天然酶无显著差异(L ü thi E et al.Appli.and EnviroMicrobio，56：2677～2683，1990)。1993年Sung等根据大肠杆菌的密码子偏向人工合成环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)木聚糖酶编码基因，并采用lac启动子，结果重组木聚糖酶在细胞周质中的表达量高达300mg/L发酵液(Sung W L et al.Protein Expr.Purif.，4：200～206，1993)。1993年Shendye、1996年Lapidotd等也同样利用大肠杆菌做为受体菌分别表达了来源于Bacillus的耐热木聚糖酶，后者用T7启动子驱动木聚糖酶基因，表达量达到细胞总蛋白的70％。(Shendye A et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.，，195：776～784，1993；Shendye A，et al.FEMS Microbiol.Lett.，108：297～302，1993；Lapidot A et al.J.Biotechnol.51：259～264，1996)。1994年Wakarchuk等在木聚糖酶中引入Ser，形成不影响其活性的二硫键，使其耐热性提高了15℃。(Wakarchuk W W et al.Protein Engineering，7：1379～1386，1994)。1999年Sung等对来源于Trichoderma reesei的XYNII和Bacillus circulans的木聚糖酶进行了改良，通过点突变、取不同木聚糖酶的片断组成杂合酶、在酶N端加不超过10个氨基酸等方法，将酶的耐热性提高了28℃之多。(Sung et al.United States patent，5866408，1999)。同年，Moreau等通过不同点突变将来源于Streptomyces lividans的XYLA的特异性酶活性提高了10％到25％不等，酶的半衰期最高提高了47％，而突变酶酶反应的pH性质与天然酶相同。(Moreau A et al.EnzymeMicrob.Technol，16：420～424.，1994)。

木聚糖酶的热稳定性是其能在饲料中广泛应用的关键因素之一。在饲料生产上，饲料加工都需经过一个制粒工艺，在制粒过程中有一个持续时间为数分钟的高温，温度一般在75～93℃，饲料用酶制剂在此高温下活性大幅度地不可逆丧失。但另一方面，饲料用酶又必须在常温下具有较高的酶活性，因为饲料用酶最终的作用场所又是动物正常体温(37℃左右)的肠胃道中，这与工业上所使用的一些高温酶不同。大多数木聚糖酶的最适温度在50℃～60℃之间。迄今为止，只发现20余种细菌和不足10种真菌能产耐热木聚糖酶。嗜热真菌比嗜热细菌产生的木聚糖酶耐热性差，只有Gloephyllumtrabeum产生的木聚糖酶最适温度为80℃。而嗜热细菌产生的木聚糖酶的最适温度有的(栖热袍菌属)高达100℃以上。值得注意的是现已发现的耐热木聚糖酶中只有Thermomonospora fussa的XynA属于G/11族糖苷水解酶，其它都属于F/10族(江正强等，中国生物工程杂志，8：47-51，2003)。L.Lo leggio等人(Lo Leggio L等，PROTEINS：Structure，Function，andGeneties，36：295-306，1999)总结了影响第10组木聚糖酶热稳定性的几种因素：①酶的疏水中心的有效包埋。②酶的螺旋结构N端存在脯氨酸。③酶的带电侧链与螺旋偶极子的互作。④耐热酶没有太长的环状结构。⑤氢键和盐桥对第10组木聚糖酶的热稳定性并不起太大作用。以上结论对运用点突变技术提高第10组木聚糖酶的热稳定性有重要的参考价值。在第11组木聚糖酶中，盐桥相对于芳香族氨基酸的相互作用而言，对提高酶的热稳定性影响较弱。同源性比较结果也显示，二硫键的形成对提高第11组木聚糖酶的热稳定性没有太大影响(Sapag等.J Biotechnol，95：109-131，2002，)。但特定位点的突变，如：Gly→X；X→Pro对提高的11组木聚糖酶的热稳定性却十分有效。在多种蛋白的保守区以Val代替Leu或Ile，在α-螺旋区以Ala代替Leu或Ile对木聚糖酶的热稳定性也有影响(Georis J，Protein Science，9：466-475，2000)。研究表明，虽然第10组木聚糖酶的热稳定性要高一些，但在造纸工业中，由于酶的分子量较小，第11组木聚糖酶更有应用前景。

来自Streptomyces olivaceoviridis的木聚糖酶XYNB具有较优良的酶学性质(Zhang H L，Yao B，Chinese Science Bulletin，48：761-765，2003；何永志，姚斌等.微生物学报，44：340-344，2004)。它是目前分离到的比活性最高的木聚糖酶，具有抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的能力，而且金属离子和表面活性剂对XYNB的酶促反应均无明显影响，也有较好的pH稳定性。但其耐热性一般。通过分子改良提高其热稳定性可使其更适合于在饲料中的实际应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种热稳定性改良的木聚糖酶，即通过基因工程手段克隆得到突变木聚糖酶基因、构建其表达载体、并在高效的生物反应器中表达该基因，从而能够方便、快捷、大量的制备热稳定性改良的木聚糖酶。

本发明通过基因工程诱变技术提供了一种木聚糖酶基因(XYNB’)。在http://www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html网站上完成对XYNB的同源建模。推测的木聚糖酶XYNB高级结构由两个反向的β折叠片和一个短的α螺旋组成，整个酶分子成右手型结构。图1中标出Thr¹¹和Tyr¹⁶。它们分别位于氮端的β折叠股B1和B2上。从同为第11族的4种嗜热木聚糖酶的结构分析中发现，在其氮端β折叠股B1和B2上存在芳香族氨基酸的疏水相互作用(表1)，而这种相互作用可能对稳定酶的结构、提高酶的热稳定性起作用。在XYNB结构中的相似位点是T11-Y16，因此如将Thr¹¹突变为Tyr¹¹，则有可能形成相似的疏水相互作用。

表1 四个嗜热木聚糖酶的最适温度和氮端芳香族氨基酸的疏水相互作用的分析

可以通过本领域公知的基因突变技术完成木聚糖酶基因的突变。可采用的基因突变方法有定点突变、PCR致错突变和DNA shuffling等。本发明应用定点突变技术对木聚糖酶基因进行突变。通过设计突变引物，用PCR的方法扩增后得到突变分子。为了实现T11Y突变，设计的PCR引物Z9、Z10如下：

Z9：

5’-TA

CCACGGTCATCACCACCAACCAGACCGGCTACA

ACAACGGGTTC-3’(含EcoR I及Nco I的酶切位点)

Z10：

5’-TATCAGCCGCTGACCGTGATGTT-3’(含Kpn I的酶切位点)

其中Z9是突变引物，带有下划线的部分为突变的核苷酸。以基因xynB为模板，进行PCR扩增，通过PCR的方法进行定点突变，获得突变基因xynB’，该基因具有如图2所示的核苷酸序列。

基因克隆按常规方法克隆(Maniatis T.，et al.Molecular cloning.New York：Cold Spring harbor laboratory，1982)将上述得到的木聚糖酶突变分子克隆到大肠杆菌载体pPUC19上，同样的方法也可克隆到大肠杆菌克隆载体或表达载体上，如pPUC18、pPGEM等，获得包含该突变的木聚糖酶基因的表达载体。

可以使用上述构建的表达载体转化高效表达的生物反应器。所述生物反应器可以是真核表达系统如杆状病毒的昆虫表达系统、霉菌表达系统、植物表达系统或酵母表达系统等，优选使用高效的毕赤酵母表达系统(P.pastoris)作为表达木聚糖酶基因的生物反应器。通过体内重组使木聚糖酶基因整合到酵母的基因组上，筛选出阳性重组子，从而大量表达具有改良的热稳定性的木聚糖酶，该酶具有如图3所示的氨基酸序列。

综上，本发明提供了一种改良的，木聚糖酶基因的高效表达方法，该方法包括以下步骤：通过PCR定点突变技术获得改良的木聚糖酶基因，构建包含改良的木聚糖酶基因的表达载体；在生物反应器中表达所述改良的木聚糖酶基因。

本发明对木聚糖酶XYNB进行分子改良，使它在具有更好的热稳定性。改良的木聚糖酶与原木聚糖酶相比，有1个氨基酸的差异，由原来的+11的T定点突变Y，在XYNB结构中形成Y11-Y16的疏水相互作用。本发明中的木聚糖酶XYNB’具有更好的热稳定性。在80℃和90℃分别处理1min，XYNB’剩余酶活性分别为98.07％和34.39％；而XYNB剩余酶活性只有56.99％和6.91％。本发明提供的改良的木聚糖酶基因的高效表达方法，为利用重组酵母工业化大规模、低成本发酵生产木聚糖酶奠定了基础。

附图说明

本发明从Streptomyces olivaceoviridis中克隆克隆得到木聚糖酶基因，Streptomyces olivaceoviridis，分类命名为橄榄绿链霉菌，(Streptomyces olivaceoviridis)，已于2005年4月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址，北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所100080)，保藏号为CGMCC No.1348。

图1XYNB的分子模型。

图2突变基因xynB’的核苷酸序列。

图3突变酶XYNB’的氨基酸序列。

图4重组表达载体pPIC9a-xynB’的物理图谱。

图5发酵罐中酵母表达的木聚糖酶XYNB’的SDS-PAGE分析，1～9分别为诱导12、24、36、48、60、72、84、96和108小时。

图6突变酶XYNB’和原酶XYNB在不同温度下的热稳定性比较，a)60℃；b)70℃；c)80℃；d)90℃。

具体实施方式

实施例

实验条件

1.菌株、载体和基因大肠杆菌菌株E.coli DH_5a、质粒pET-22b(+)等购自Promega公司，酵母菌株Pichia pastoris GS115(His^-Mut⁺)、质粒pPIC9为Invitrogen公司产品。木聚糖酶基因xynB(EMBL收录号为：AJ292317)由本实验室从Streptomycesolivaceoviridis(保藏号：CGMCC No.1348，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称：CGMCC，保藏单位地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所100080，保藏日期：2005年4月11日)中克隆。

2.酶与试剂盒限制性内切酶、连接酶、Taq酶、DNAaseI为Boehringer公司产品。PCR Kit均购于Promega公司。

3.生化试剂DNA合成试剂为Milipore公司产品。引物合成用ABI公司Cyclone DNA合成仪。IPTG、X-Gal、SDS及植酸钠为Sigma公司产品。TEMED、过硫酸铵、丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺为Promega公司产品。

4.培养基大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％ NaCl，pH7.0)。酵母完全培养基为YPD(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)；酵母转化培养基为RDB[18.6％山梨醇、2％葡萄糖、1.34％Yeast Nitrogen Base W/O amino acids(YNB)、0.00004％ Biotin、0.005％谷氨酸、0.005％甲硫氨酸、0.005％赖氨酸、0.005％亮氨酸、0.005％异亮氨酸、2％琼脂糖]；酵母选择培养基为MM(1.34％YNB、0.00004％Biotin、0.5％甲醇、1.5％琼脂糖)和MD(1.34％YNB、0.00004％Biotin、2％葡萄糖、1.5％琼脂糖)；酵母诱导培养基BMGY[1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％ Biotin、1％甘油(V/V)]和BMMY(除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同)。重组酵母发酵培养基为10×Basal Salts(2.67％磷酸、0.093％硫酸钙、1.82％硫酸钾、1.49％硫酸镁、0.413％氢氧化钾、4％甘油或葡萄糖)；发酵中所用的微量盐溶液PTM1(0.6％硫酸铜、0.008％碘化钠、0.3％硫酸锰、0.02％钼酸钠、0.002％硼酸、0.05％氯化钴、2％氯化锌、6.5％硫酸亚铁、0.025％生物素、0.5％硫酸)。

实验1 突变基因的获得

设计PCR引物Z9、Z10如下：

Z9：’-TAGAATTCGCCATGGCCACGGTCATCACCACCAACCAGACCGGCTACAACAACGGGTTC-3’(含EcoR I及Nco I的酶切位点)

Z10：5’-TAGGTACCTCAGCCGCTGACCGTGATGTT-3’(含Kpn I的酶切位点)

其中Z9是突变引物，带有下划线的部分为突变的核苷酸。以基因xynB为模板，进行PCR扩增，通过PCR的方法进行定点突变，获得突变基因xynB’。通过Kpn I和EcoR I双酶切位点将xynB’克隆进了pUC19载体，电转化大肠杆菌JM109以蓝白斑筛选出重组菌落，提取重组质粒pUC19-xynB’进行序列测定。证实设计的位点得到了正确突变，其核苷酸序列见图2，氨基酸序列见图3。

实验2 xynB’在酵母表达载体上的构建

用于构建酵母表达载体的质粒是pPIC9(带有α-因子分泌信号)。首先将木聚糖酶基因插入到上述表达载体的信号肽序列的下游，与信号肽形成正确的阅读框架，然后通过载体与酵母P.pastoris染色体基因组之间的同源重组事件使目的基因稳定整合到酵母染色体上。具体的过程是：将重组质粒pUC19-xynB’用EcoR I和Smal I进行双酶切，回收xynB’基因，定向插入到pPIC9 α上的EcoR I和Smal I位点之间，形成重组质粒pPIC9 α-xynB’(图4)从而将目的基因克隆到AOX1启动子下游，而且与信号肽编码序列形成正确的阅读框架。

实验3 酵母转化及筛选重组酵母株系

质粒pPIC9 α-xynB’的DNA经BglI酶切后电击转化酵母细胞后，通过体内重组，目的基因将整合到受体酵母基因组中。在外源诱导物甲醇存在的条件下，AOX1启动子可以启动其下游基因xynB’的表达，并且信号肽可以指导表达产物进入酵母的分泌途径，经过切割，外源蛋白木聚糖酶最终分泌至胞外。

首先用2～3倍过量的内切酶BglI消化质粒pPIC9 α-xynB’的DNA，使之线性化，电泳检测酶切是否完全。用酚抽提，乙醇沉淀，70％乙醇洗两次，冷冻干燥，无菌水溶解，取1～5μg DNA转化毕赤酵母细胞，在RDB固体培养基上涂板，每板涂0.1mL，30℃下将培养皿倒置培养至转化子出现。

转化子可在基本培养基RDB(不含His)上生长，而非转化子不能生长，这是因为受体菌GS115为组氨酸缺陷型，而载体上虽然带有his4基因，但没有酵母复制子，所以载体上的his4基因必须整合进酵母基因组中才能表达。另外，由于重组的酵母细胞中AOX1基因受到破坏，所以它就不能再利用甲醇作为碳源。这样，在以甲醇作为唯一碳源的培养基上转化子就不会生长(或者生长极缓慢)，表现为甲醇利用缺陷型(mut^-)。

用无菌牙签从转化平板RDB上挑取his⁺重组子，首先接种到MM固体培养基上，再接种到MD固体培养基上，如此挑取his⁺重组子，30℃培养2天。筛选在MD平板上生长正常但在MM平板上有一点生长或完全不生长的克隆子(his⁺mut^-)即为阳性克隆子。

为了筛选得到高表达的重组酵母菌株，直接检测诱导培养基中木聚糖酶的表达情况。将his⁺mut^-转化子首先在BMGY培养基中培养，待其生长至饱和状态，离心弃BMGY，换入诱导培养基BMMY，在诱导培养36h后取上清液进行木聚糖酶酶活性分析。酶学测定采用国际通用的Somogyi-Nelson法，将0.25ml 0.5％的可溶性4-O-Me-D-glucurono-D-xylan(Sigma公司，From birchwood)溶液与0.2ml柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液加入试管，放入55℃水浴中预热3min。再将0.05ml已经稀释好的酶液加入到试管中，继续在37℃水浴中反应10min，向试管中加入0.5ml Somogyi试剂(碱性铜试剂)终止反应，将试管在沸水中加热15min，立即用流水冷却到室温，向试管中加入0.5mlNelson试剂(砷钼酸盐试剂)显色，在Voltex mixer上剧烈搅拌，室温下放置10min，加入1ml蒸馏水，10000rpm离心5分钟，去除絮状物。500nm处测吸光值。对照为先将0.05ml酶液加入到0.2ml柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，在100℃沸水中煮20分钟灭活，再加入同体积的底物保温。木聚糖酶活性单位(U)定义为：在一定条件下，每分钟由木聚糖释放出1μmol木糖所需的酶量。通过表达木聚糖酶的酶活性测定，从500株重组酵母中初步筛选到156株表达木聚糖酶的重组子，其中表达量最高的1株重组子，定名为P.pastoris xynB’-07。

实验4 重组酵母在5升发酵罐中高密度发酵生产木聚糖酶的程序

发酵过程分为三个阶段。具体如下：1)菌株培养阶段。发酵培养基10×Basal Salts接种前先加入28％氨水使培养基的pH达到5.0，再按每升培养基加入4.37mL PTM1，5-10％接种种子液，通气搅拌培养18～24h，在培养过程中随着菌株的生长，培养基中的溶氧量由100％逐渐降低，当碳源消耗完后溶氧量将再度升高至80％以上，此时菌体湿重达到90～110g/L。2)碳源饲喂阶段。流加25％葡萄糖(每升中含12mLPTM1)，流加量为28mL/h/L，培养4h。调整通气量使溶氧量始终大于20％。此步结束时菌体湿重达到180～220g/L。3)诱导表达阶段。加入诱导剂甲醇(每升中含12mL PTM1)，使甲醇终浓度维持在0.3％，溶氧量始终大于20％。在诱导过程中每12h取样一次测定表达的木聚糖酶的积累量。

随诱导时间增加发酵液中表达积累的木聚糖酶的SDS-PAGE分析见图5。结果表明，表达的木聚糖酶随诱导时间的增加而积累，在诱导108小时时达到高峰，酶活性达到10000U/mL发酵液。以上结果证明木聚糖酶基因不仅得到了表达、有效分泌，且表达的木聚糖酶具有正常的生物学活性。

实验六 突变酶的酶学性质研究

将纯化后的突变酶与原酶(同样经毕赤酵母表达并纯化，见文献：何永志，姚斌等，微生物学报，44：340-344，2004)进行酶学性质的比较研究。包括酶的最适温度和热稳定性、最适pH和pH稳定性、比活性、金属离子和相关化学试剂对木聚糖酶活性的影响、酶动力学性质、等(测定方法见参考文献Zhang H L，Yao B etal.Chinese Science Bulletin，48：761-765，2003)。

实验结果表明(表2)，XYNB’的热稳定性较XYNB有较大幅度的提高(图6)，在60℃和70℃分别处理60min和10min，XYNB’剩余酶活性在50％以上，而XYNB剩余酶活性只有10.28％和18.65％。在80℃和90℃分别处理1min，XYNB’剩余酶活性分别为98.07％和34.39％；而XYNB剩余酶活性只有56.99％和6.91％。在热稳定性提高的同时，其最适温度并未改变，与原酶一样为60℃。

表2.木聚糖酶XYNB和XYNB’的酶学性质比较

 

酶学性质	XYNB	XYNB’
			最适温度/℃	60	60
最适pH	5.2	5.6
			PH稳定性	5-9	4-9
Km/(g/kg)	20.87	11.89
			Vmax/(μmol/mg·min)	4568	3045
比活性/(IU/mg)	886.89	1179.6
			金属离子和某些化学试剂对酶活性的影响	EDTA，Cr<sup>3+</sup>，Ni<sup>2+</sup>轻微的激活Zn<sup>2+</sup>，Mn<sup>2+</sup>轻微的抑制SDS无影响	EDTA，Cr<sup>3-</sup>，轻微的激活Zn<sup>2+</sup>，Mn<sup>2+</sup>Ni<sup>2+</sup>轻微的抑制SDS无影响
纤维素酶活性	无	无
			抗胃蛋白酶和胰蛋白酶能力	保持95％的活性	保持99％的活性

酶的各种性质见表2。在pH性质上，XYNB’的最适pH为5.6，与原酶XYNB的5.0有所差异，pH稳定性在酸性范围内有所提高。在酶的比活性方面，XYNB’为1179.6IU/mg，较XYNB提高了33％。在酶的动力学方面，突变酶XYNB’在Km值上比原酶低43％，这说明突变酶具有更高的催化效率。金属离子Ni²⁺对原酶有轻微的激活作用，而对突变酶表现为轻微的抑制作用，别的金属离子和化学试剂方面，突变酶和原酶的表现一致。酶经突变后，依然维持了原酶独特的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的特性。

sequence list20050413104014

<110>applicant：中国农业科学院饲料研究所

<120>Title：改良的高比活木聚糖酶及其基因、包括该基因的表达载体和重组酵母细胞以及表达方法

Sequence

--------

<210>1

<211>576

<212>DNA

<213>木聚糖酶基因，橄榄绿链霉菌(Streptomyces olivaceoviridis)

<400>1：

<210>2

<211>191

<212>PRT

<213>木聚糖酶，橄榄绿链霉菌(Streptomyces olivaceoviridis)

<400>2：

Claims (8)

1、一种改良的木聚糖酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如图2所示。

2、一种改良的木聚糖酶，其特征在于，其氨基酸序列如图3所示。

3、包括权利要求1的改良的木聚糖酶基因的表达载体。

4、如权利要求3所述的表达载体，其特征在于该表达载体为包括权利要求1的改良的木聚糖酶基因的酵母表达载体。

5、一种高效表达权利要求1所述改良的木聚糖酶基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)通过PCR定点突变技术获得改良的木聚糖酶基因，其中定点突变中使用的引物对序列如下：

P1:5’TAGAA TTCGC CATGG CCACG GTCAT CACCA CCAAC CAGACCGGCT ACAAC AACGG GTTC3’，

P2:5’TAGGT ACCTC AGCCG CTGAC CGTGA TGTT3’；

2)构建包含步骤1)中获得的改良的木聚糖酶基因的表达载体；

3)在生物反应器中表达所述改良的木聚糖酶基因。

6、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述生物反应器为昆虫表达系统、霉菌表达系统、植物表达系统、酵母表达系统。

7、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述生物反应器为毕赤酵母表达系统。

8、包括权利要求1所述的改良木聚糖酶基因的重组酵母细胞。

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