CN107287176A

CN107287176A - 一种耐高温中性植酸酶Physh-A及其基因和应用

Info

Publication number: CN107287176A
Application number: CN201610225440.6A
Authority: CN
Inventors: 吴建军; 周樱; 张成杰; 王禾
Original assignee: WUHAN SUNHY BIOLOGY CO Ltd
Current assignee: WUHAN SUNHY BIOLOGY CO Ltd
Priority date: 2016-04-12
Filing date: 2016-04-12
Publication date: 2017-10-24
Anticipated expiration: 2036-04-12
Also published as: CN107287176B

Abstract

本发明涉及一种耐高温中性植酸酶Physh‑A及其基因和应用。该耐高温中性植酸酶是如下a)或b)的蛋白：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与水解植酸相关的由a)衍生的蛋白质。本发明还公开了该耐高温中性植酸酶的编码基因和应用。该耐高温中性植酸酶Physh‑A具有极强的热稳定性，同时，在pH值5.0‑6.5间的环境中，能保持70％以上的活性，这非常适合在青、草、鲤、鲫、鲂等无胃鱼的消化道(pH值5.0‑7.2)环境中发挥作用。添加该耐高温中性植酸酶能够有效降解饲料中鱼类不能消化的植酸磷，减少粪磷的排放，降低养殖污染。

Description

一种耐高温中性植酸酶Physh-A及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐高温中性植酸酶Physh-A及其基因和应用。

背景技术

饲料中植物性原料的磷约2/3以植酸及其盐形式存在，水产动物对饲料中磷的需要量要高于畜禽，且磷源主要来源于饲料。水产动物消化系统内缺乏植酸酶，无法利用植酸磷，对鱼粉、骨粉等动物性饲料中的磷利用率也很低(15％)，未被利用的植酸磷随粪便排入水体，可造成水体富营养化，污染水环境，进而影响水产动物的生长性能，严重者可引发鱼幽门盲囊损伤等疾病。植酸酶是催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸(盐)的一类酶的总称，可通过催化降解植酸成无机磷，同时可释放与植酸结合的营养物质，提高饲料的潜在营养价值。因此，植酸酶对提高水产饲料中磷利用率、降低饲料成本、减少环境污染都具有重要的意义。

但是，与陆生单胃动物不同的是，水生动物对植酸酶的性质有不同的要求。对单胃畜禽而言，植酸酶的主要作用场所是单胃动物酸性的胃中，因而需要植酸酶在酸性条件下具有较高的酶活性，即酶反应的最适pH值为酸性的植酸酶。而水产动物消化道普遍较短，食物在消化道停留的时间有限，酶的作用不完全。且有胃鱼(通常指肉食性的，包括大口鲶、乌鱼、鲑鱼、虹鳟、鳗鱼等)和无胃鱼(鲤鱼、鲫鱼、四大家鱼等)对植酸的消化率不同，消化道内的酸碱度差别也很大。有胃鱼胃液可分泌盐酸，pH较低，通常在2～4之间，呈酸性环境，肠道短，不经弯曲直接到肛门，成一条线。无胃鱼不能分泌盐酸，消化道pH为6.8～7.3，呈近中性，肠道盘绕弯曲通肛门，长度为有胃鱼的3～4倍。以往的植酸酶研究主要集中在酸性植酸酶上，适用于胃PH呈酸性的单胃动物以及少数有胃鱼类如虹鳟等，对于消化道无胃、肠道呈中性的淡水鲤科鱼类饲料来说，酸性植酸酶的应用效果非常有限。因此，开发既适合有胃又适合无胃鱼消化道环境的水产专用植酸酶具有较强的使用价值和广阔的使用前景。

除了上述因素限制了植酸酶在水产饲料中推广和应用外，水产饲料特殊的加工工艺也是限制植酸酶在水产饲料中使用的一个重要因素。植酸酶是一种特殊的蛋白质，在高温下非常容易失活，而水产饲料的生产过程中存在着一个高温高压的调质和制粒的环节，在这个环节中，一般的植酸酶就会丧失大部分活性，从而影响了它的使用效果。

发明内容

本发明的目的之一是，提供一种适合无胃鱼使用的耐高温中性植酸酶Physh-A及其编码基因，以解决上述存在的问题：

1)适合青、草、鲤、鲫、鲂等淡水经济鱼类消化道环境的中性植酸酶；

2)能够耐受上述养殖品种配合饲料生产加工过程中高温环境的植酸酶。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述耐高温中性植酸酶的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述耐高温中性植酸酶的应用。

本发明的耐高温中性植酸酶来源于烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)。

本发明提供的耐高温中性植酸酶Physh-A的氨基酸序列如下所示:

APSSAGSKSCDTVDLGYQCSPATSHLWGIYSPFFSLEDELSVSSKLPKDCRITLVQVLSRHGARYPTSSKSKKYKKLVTAIQANATDFKGKFAFLKTYNYTLGADDLTPFGEQQLVNSGIKFYQRYKALARSVVPFIRASGSDRVIASGEKFIEGFQQAKLADPGATNRAAPAISVIIPESETFNNTLDHGVCTKFEASQLGDEVAANFTALFAPDIRARAEKHLPGVTLTDEDVVSLMDMCSFDTVARTSDASQLSPFCQLFTHNEWKKYNYLQSLGKYYGYGAGNPLGPAQGIGFTNELIARLTRSPVQDHTSTNSTLVSNPATFPLNATMYVDFSHDNSMVSIFFALGLYNGTEPLSRTSVESAKELDGYSASWVVPFGARAYFETMQCKSEKEPLVRALINDRVVPLHGCDVDKLGRCKLNDFVKGLSWARSGGNWGECFS*

上述氨基酸序列与序列表中序列2一致。

本发明提供了一种编码上述耐高温中性植酸酶基因序列，具体如下所示:GCTCCTTCTTCTGCTGGTTCTAAATCCTGCGATACAGTCGATCTTGGTTATCAGTGTTCTCCTGCTACCTCTCACCTTTGGGGAATCTACTCACCATTTTTCAGTTTGGAAGATGAGCTTTCTGTTTCTTCCAAGTTGCCTAAAGACTGTAGAATTACTTTGGTTCAGGTCCTTTCTAGACATGGTGCTAGATACCCAACATCTAGTAAGTCCAAGAAATACAAGAAATTGGTTACCGCTATCCAAGCCAACGCAACTGATTTCAAGGGTAAATTCGCCTTCTTGAAGACATACAACTATACCTTGGGAGCTGATGACCTTACTCCATTTGGTGAACAACAGTTGGTTAACTCAGGAATTAAGTTCTACCAGAGATACAAGGCTTTGGCCAGAAGTGTTGTCCCTTTCATCAGAGCTTCTGGTTCCGATAGAGTTATTGCCTCTGGAGAAAAGTTTATCGAGGGTTTCCAACAGGCTAAATTGGCCGACCCTGGAGCAACTAACAGAGCTGCCCCAGCTATTTCTGTTATTATCCCTGAATCCGAGACTTTTAACAATACATTGGATCATGGTGTTTGCACCAAGTTCGAAGCTTCCCAATTGGGAGATGAGGTCGCAGCTAATTTTACTGCACTTTTCGCTCCAGACATCAGAGCAAGAGCTGAAAAACACTTGCCTGGTGTTACTCTTACAGATGAGGACGTTGTCTCATTGATGGATATGTGTAGTTTTGACACCGTCGCCAGAACTTCTGATGCATCCCAATTGTCACCATTTTGCCAGCTTTTCACACATAACGAATGGAAGAAATACAACTATTTGCAATCTCTTGGTAAATACTATGGTTATGGAGCCGGTAACCCATTGGGACCTGCACAGGGAATTGGTTTTACAAATGAGTTGATCGCTAGACTTACCAGATCCCCTGTTCAAGATCATACCAGTACTAACTCTACTTTGGTCTCAAATCCAGCTACATTTCCTCTTAACGCCACCATGTACGTTGATTTCTCTCACGACAATTCCATGGTCTCAATTTTCTTTGCTTTGGGACTTTACAACGGTACTGAACCATTGAGTAGAACATCTGTTGAATCCGCAAAAGAGCTTGACGGTTACTCAGCTAGTTGGGTTGTCCCTTTTGGAGCCAGAGCATATTTCGAGACTATGCAGTGTAAGTCTGAAAAAGAGCCATTGGTTAGAGCTCTTATTAACGATAGAGTTGTCCCTTTGCACGGATGTGATGTCGACAAGTTGGGTAGATGCAAACTTAATGACTTTGTCAAGGGTTTGTCCTGGGCAAGAAGTGGTGGTAACTGGGGAGAGTGCTTTTCCTAA

本发明还提供了包含上述编码基因的重组载体。

本发明还提供了包含上述编码基因的重组菌株。

本发明还提供了一种制备耐高温中性植酸酶的方法，包括以下步骤：

1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组植酸酶表达；以及

3)回收并纯化所表达的耐高温中性植酸酶。

本发明还提供了包含上述耐高温中性植酸酶的应用。

本发明所涉及的耐高温中性植酸酶为毕赤酵母发酵生产，具有极强的热稳定性，经100℃水浴锅中分别处理5min、10min，酶活存留率为89.06％、84.87％；经130℃消化炉消化5min、10min，酶活存留率为87.32％、82.14％；经电炉煮沸5min，酶活存留率为82.09％，因此可以有效地耐受水产颗粒饲料生产过程中的高温(85℃-90℃)。同时该耐高温中性植酸酶在pH值5.0-6.5间的环境中，能保持70％以上的活性，这非常适合在青、草、鲤、鲫、鲂等无胃鱼的消化道(pH值5.0-7.2)环境中发挥作用。添加该耐高温中性植酸酶能够有效降解饲料中鱼类不能消化的植酸磷，减少粪磷的排放，降低养殖污染。

实施本发明，具有如下有益效果：1.提高了鱼类对饲料中磷的表观消化率，促进了鱼类的快速生长；2.提高了鱼类对饲料中蛋白质、氨基酸、矿物质的利用率，降低了饲料系数；3.促进了磷在鱼体的沉积，改善了鱼体的体形，提高了养殖鱼类的商品性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。附图中：

图1为pH值对本发明耐高温中性植酸酶酶活的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步详细说明本发明。以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围。

实施例1:烟曲霉菌耐高温中性植酸酶基因的克隆

根据中性植酸酶保守区域设计合成了简并引物：

P1(5’-cccgaggccgagctkbaaywwyac-3’)，

P2(5’-ccaggtrwwrttvma-3’)。

以提取的烟曲霉菌总DNA为模板进行兼并性PCR扩增。PCR反应参数为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环后；72℃10min，得到植酸酶保守性片段，将该片段进行测序分析。

根据已知序列，分别设计了三对同向且退火温度较高的上下游特异性引物，采用TAIL-PCR法扩增获得基因的全部序列，经正确拼接后获得耐高温中性植酸酶基因，该植酸酶基因全长1338bp，如序列表中序列1；编码445个氨基酸，序列表中序列2，命名为Physh-A。

将表达载体pPIC9和耐高温中性植酸酶基因双酶切(EcoR Ⅰ+Not Ⅰ)处理后，用T4DNA连接酶把两段纯化的DNA片段连接起来，转入大肠杆菌DH5α，筛选阳性转化子提取质粒，电转入毕赤酵母GS115中，随后涂布在含有组氨酸缺陷的MD培养基(葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L，生物素4×10-4g/L，YNB13.4g/L)平板上，28℃培养3天，获得重组毕赤酵母菌株。

用灭过菌的牙签从长有转化子的MD板上挑取单菌落，按照编号先点到植酸钙筛选培养基(1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油(V/V))、0.1％植酸钙)平板上，挑选水解圈较大的菌株接种于100mlBMGY(1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油(V/V)))培养液中，28℃200rpm培养48h后离心收集菌体，然后转入50mlBMMY(1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin)培养基中，28℃200rpm甲醇诱导培养，72h后收集上清耐高温中性植酸粗酶液，5min，取上清用于酶活性检测，从中筛选出高中植酸酶酶活力的转化子。

对将上述获得的高植酸酶活性的转化子进行30L发酵罐水平高密度发酵试验。随着甲醇诱导时间的延长，发酵上清液中植酸酶酶活力显著增加，发酵至190h，菌体OD值为399，菌体湿重40.37％，酶活达到3224u/mL。

实施例2：耐高温中性植酸酶的耐热性研究

取5mL经一定稀释的酶液装在10mL玻璃离心管中，于100℃水浴锅(酶液温度为95℃-97℃)中分别处理5min、10min后，测定酶活，每次测定重复3次，取平均值。结果表明，该酶液经上述方式处理后，酶活存留率为89.06％、84.87％。

实施例3：耐高温中性植酸酶的耐热性研究

取8mL经一定稀释的酶液装在消化管中，于130℃消化炉上消化5min、10min后，测定酶活，每次测定重复3次，取平均值。结果表明，该酶液经上述方式处理后，酶活存留率为87.32％、82.14％。

实施例4：耐高温中性植酸酶的耐热性研究

取经一定稀释酶液装到烧杯中，置于电炉加热煮沸，煮沸后溶液温度达到102-104℃，从沸腾时开始计时，处理5分钟后，测定酶活，每次测定重复3次，取平均值。结果表明，该酶液经上述方式处理后，酶活存留率为82.09％。

实施例5：耐高温中性植酸酶的pH适应性研究

以耐高温中性植酸酶为材料，在不同的pH的缓冲体系中进行耐高温中性植酸酶活性的测定。底物植酸钠用一系列不同pH值的缓冲液(pH5.0-6.5，乙酸缓冲液；pH 6.5-7.5，PBS缓冲液；pH 7.5-8.5，Tris-HCl缓冲液；pH8.5-10.0Gly-NaOH)配制，37℃下在这些不同的缓冲体系中进行酶促反应，测定酶活性。结果表明，该耐高温中性植酸酶在pH值5.0-6.5间的环境中，能保持70％以上的活性(如图1)，这非常适合在青、草、鲤、鲫、鲂等无胃鱼的消化道(pH值5.0-7.2)环境中发挥作用。

实施例6：耐高温中性植酸酶的应用效果研究

为了验证本饲料添加剂的效果，按如下方式进行了试验。

将360尾平均体重为(31.45±4.68)g的草鱼平均分成4组，在饲料中分别用本发明植酸酶替代0％(P0)、25％(P₂₅)、50％(P₅₀)和75％(P₇₅)的磷酸二氢钙，每组3个平行，在进行了9周的养殖试验后测定成活率、增重率、特定生长率(SGR)、饲料利用率(FCR)、鱼体组成和鱼体生化指标。具体数据祥见表1、表2、表3。

表1可以看出，P₂₅的增重率最大，与对照组无显著差异(P>0.05)，显著高于P₅₀和P₇₅(P<0.05)，P₅₀与对组照组没有显著性差异(P>0.05)，P₇₅最小，与P₅₀无显著性差异(P>0.05)；特定生长率与增重率的变化趋势相似，但P₇₅与前3组有显著性差异(P<0.05)；成活率P₂₅和P₅₀与对组照组没有显著性差异(P>0.05)，P₂₅达到了100％，P₇₅明显低于对照组和P₂₅(P<0.05)，与P₅₀无显著性差异(P>0.05)；饲料系数对照组最高，其它组依次降低，P₇₅显著性低于其它3组(P<0.05)，而其它3组间无显著性差异，说明在一定范围内，用植酸酶部分替代磷酸二氢钙对生长没有不良影响。

表1生长性状和饲料利用率

注：值用平均数±标准差(n＝3)来表示，表中同行内数据标有不同字母表示有显著性差异(P<0.05)。

表2全鱼组成成分

表2可以看出，与对照组相比，其它3组水分含量有降低趋势；粗蛋白质含量有升高趋势，P₇₅略降；全鱼水分、粗蛋白和粗灰分各组之间都没有显著差异(P>0.05)。P₂₅的脂肪含量显著低于其它各组(P<0.05)，而P₇₅的脂肪含量显著高于其它组(P<0.05)，P₅₀与对照组的脂肪含量没有显著性差异(P>0.05)。磷的含量除P₇₅显著性低于前3组，其它各组之间无显著性差异(P>0.05)。说明用植酸酶部分替代磷酸二氢钙对鱼体组成基本没影响。

表3血液生理指标

表3可以看出。P₂₅、P₅₀和P₇₅的碱性磷酸酶、谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活性都显著性高于对照组(P<0.05)；其中碱性磷酸酶的活性P₅₀和P₇₅显著性高于P₂₅(P<0.05)；谷草/谷丙转氨酶，P₂₅、P₅₀显著性高于对照组(P<0.05)，P₂₅、P₅₀和P₇₅之间及P₇₅与对照组之间无显著性差异(P>0.05)。

与对照组相比，各组血磷和血钙水平都有不同程度的升高，血磷含量各组差异不显著(P>0.05)，P₅₀和P₇₅的血钙含量显著性高于对照组。

显然，上面描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

序列表

<110> 武汉新华扬生物股份有限公司

<120> 一种耐高温中性植酸酶Physh-A及其基因和应用

<130>

<160> 2

<210> 1

<211> 1338

<212> DNA

<213> 烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus）

<400> 1

GCTCCTTCTT CTGCTGGTTC TAAATCCTGC GATACAGTCG ATCTTGGTTA TCAGTGTTCT 60

CCTGCTACCT CTCACCTTTG GGGAATCTAC TCACCATTTT TCAGTTTGGA AGATGAGCTT 120

TCTGTTTCTT CCAAGTTGCC TAAAGACTGT AGAATTACTT TGGTTCAGGT CCTTTCTAGA 180

CATGGTGCTA GATACCCAAC ATCTAGTAAG TCCAAGAAAT ACAAGAAATT GGTTACCGCT 240

ATCCAAGCCA ACGCAACTGA TTTCAAGGGT AAATTCGCCT TCTTGAAGAC ATACAACTAT 300

ACCTTGGGAG CTGATGACCT TACTCCATTT GGTGAACAAC AGTTGGTTAA CTCAGGAATT 360

AAGTTCTACC AGAGATACAA GGCTTTGGCC AGAAGTGTTG TCCCTTTCAT CAGAGCTTCT 420

GGTTCCGATA GAGTTATTGC CTCTGGAGAA AAGTTTATCG AGGGTTTCCA ACAGGCTAAA 480

TTGGCCGACC CTGGAGCAAC TAACAGAGCT GCCCCAGCTA TTTCTGTTAT TATCCCTGAA 540

TCCGAGACTT TTAACAATAC ATTGGATCAT GGTGTTTGCA CCAAGTTCGA AGCTTCCCAA 600

TTGGGAGATG AGGTCGCAGC TAATTTTACT GCACTTTTCG CTCCAGACAT CAGAGCAAGA 660

GCTGAAAAAC ACTTGCCTGG TGTTACTCTT ACAGATGAGG ACGTTGTCTC ATTGATGGAT 720

ATGTGTAGTT TTGACACCGT CGCCAGAACT TCTGATGCAT CCCAATTGTC ACCATTTTGC 780

CAGCTTTTCA CACATAACGA ATGGAAGAAA TACAACTATT TGCAATCTCT TGGTAAATAC 840

TATGGTTATG GAGCCGGTAA CCCATTGGGA CCTGCACAGG GAATTGGTTT TACAAATGAG 900

TTGATCGCTA GACTTACCAG ATCCCCTGTT CAAGATCATA CCAGTACTAA CTCTACTTTG 960

GTCTCAAATC CAGCTACATT TCCTCTTAAC GCCACCATGT ACGTTGATTT CTCTCACGAC 1020

AATTCCATGG TCTCAATTTT CTTTGCTTTG GGACTTTACA ACGGTACTGA ACCATTGAGT 1080

AGAACATCTG TTGAATCCGC AAAAGAGCTT GACGGTTACT CAGCTAGTTG GGTTGTCCCT 1140

TTTGGAGCCA GAGCATATTT CGAGACTATG CAGTGTAAGT CTGAAAAAGA GCCATTGGTT 1200

AGAGCTCTTA TTAACGATAG AGTTGTCCCT TTGCACGGAT GTGATGTCGA CAAGTTGGGT 1260

AGATGCAAAC TTAATGACTT TGTCAAGGGT TTGTCCTGGG CAAGAAGTGG TGGTAACTGG 1320

GGAGAGTGCT TTTCCTAA 1338

<210> 2

<211> 445

<212> PRT

<213> 烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus）

<400> 2

Ala Pro Ser Ser Ala Gly Ser Lys Ser Cys 10

Asp Thr Val Asp Leu Gly Tyr Gln Cys Ser 20

Pro Ala Thr Ser His Leu Trp Gly Ile Tyr 30

Ser Pro Phe Phe Ser Leu Glu Asp Glu Leu 40

Ser Val Ser Ser Lys Leu Pro Lys Asp Cys 50

Arg Ile Thr Leu Val Gln Val Leu Ser Arg 60

His Gly Ala Arg Tyr Pro Thr Ser Ser Lys 70

Ser Lys Lys Tyr Lys Lys Leu Val Thr Ala 80

Ile Gln Ala Asn Ala Thr Asp Phe Lys Gly 90

Lys Phe Ala Phe Leu Lys Thr Tyr Asn Tyr 100

Thr Leu Gly Ala Asp Asp Leu Thr Pro Phe 110

Gly Glu Gln Gln Leu Val Asn Ser Gly Ile 120

Lys Phe Tyr Gln Arg Tyr Lys Ala Leu Ala 130

Arg Ser Val Val Pro Phe Ile Arg Ala Ser 140

Gly Ser Asp Arg Val Ile Ala Ser Gly Glu 150

Lys Phe Ile Glu Gly Phe Gln Gln Ala Lys 160

Leu Ala Asp Pro Gly Ala Thr Asn Arg Ala 170

Ala Pro Ala Ile Ser Val Ile Ile Pro Glu 180

Ser Glu Thr Phe Asn Asn Thr Leu Asp His 190

Gly Val Cys Thr Lys Phe Glu Ala Ser Gln 200

Leu Gly Asp Glu Val Ala Ala Asn Phe Thr 210

Ala Leu Phe Ala Pro Asp Ile Arg Ala Arg 220

Ala Glu Lys His Leu Pro Gly Val Thr Leu 230

Thr Asp Glu Asp Val Val Ser Leu Met Asp 240

Met Cys Ser Phe Asp Thr Val Ala Arg Thr 250

Ser Asp Ala Ser Gln Leu Ser Pro Phe Cys 260

Gln Leu Phe Thr His Asn Glu Trp Lys Lys 270

Tyr Asn Tyr Leu Gln Ser Leu Gly Lys Tyr 280

Tyr Gly Tyr Gly Ala Gly Asn Pro Leu Gly 290

Pro Ala Gln Gly Ile Gly Phe Thr Asn Glu 300

Leu Ile Ala Arg Leu Thr Arg Ser Pro Val 310

Gln Asp His Thr Ser Thr Asn Ser Thr Leu 320

Val Ser Asn Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn 330

Ala Thr Met Tyr Val Asp Phe Ser His Asp 340

Asn Ser Met Val Ser Ile Phe Phe Ala Leu 350

Gly Leu Tyr Asn Gly Thr Glu Pro Leu Ser 360

Arg Thr Ser Val Glu Ser Ala Lys Glu Leu 370

Asp Gly Tyr Ser Ala Ser Trp Val Val Pro 380

Phe Gly Ala Arg Ala Tyr Phe Glu Thr Met 390

Gln Cys Lys Ser Glu Lys Glu Pro Leu Val 400

Arg Ala Leu Ile Asn Asp Arg Val Val Pro 410

Leu His Gly Cys Asp Val Asp Lys Leu Gly 420

Arg Cys Lys Leu Asn Asp Phe Val Lys Gly 430

Leu Ser Trp Ala Arg Ser Gly Gly Asn Trp 440

Gly Glu Cys Phe Ser 445

Claims

1.一种耐高温中性植酸酶Physh-A，是如下a)或b)的蛋白：

a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与水解植酸相关的由a)衍生的蛋白质。

2.权利要求1所述耐高温中性植酸酶的编码基因。

3.如权利要求2所述编码基因，其特征在于，所述编码基因是如下1)或2)或3)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1；

2)在严格条件下与序列1限定的DNA片段杂交且编码与水解植酸相关蛋白的DNA分子；

3)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性，且编码与水解植酸相关蛋白的DNA分子。

4.包含权利要求2或3所述编码基因的重组载体。

5.如权利要求4的重组载体，其特征在于，通过将所述编码基因插入表达载体pPIC9的EcoR I及NotⅠ位点之间，构建重组载体。

6.包含权利要求2或3所述耐高温中性植酸酶基因的重组菌株。

7.如权利要求6的重组菌株，其特征在于，所述菌株为毕赤酵母。

8.一种制备耐高温中性植酸酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组植酸酶表达；以及

3)回收并纯化所表达的耐高温中性植酸酶。

9.权利要求1所述耐高温中性植酸酶用于水解植酸的应用。