CN112111474B

CN112111474B - 一种酶活性提高的重组溶菌酶lyz-2及其突变体和应用

Info

Publication number: CN112111474B
Application number: CN202011046867.2A
Authority: CN
Inventors: 肖志壮; 薛海曌; 于文君; 方安然; 付五兵; 张大伟; 吕伟; 杨玉超
Original assignee: Qingdao Red Cherry Biotechnology Co ltd
Current assignee: Qingdao Red Cherry Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-09-29
Filing date: 2020-09-29
Publication date: 2022-08-30
Anticipated expiration: 2040-09-29
Also published as: CN112111474A

Abstract

本发明提供了一种酶活性提高的重组溶菌酶LYZ‑2及其突变体和应用。本本发明优化了天然溶菌酶的基因序列，并在此基础上利用易错PCR方法进行了随机突变，获得了重组溶菌酶LYZ‑2及溶菌酶突变体LYZ‑2‑m，其酶活均得到了显著的提高。本发明得到的重组溶菌酶LYZ‑2及溶菌酶突变体LYZ‑2‑m能够添加到养殖动物的饲料中，改善动物的生长状况，提高了成活率。本发明为基因工程方法规模化生产溶菌酶奠定了理论与实践基础，并且本发明得到的溶菌酶性质良好，在养殖行业有很好的应用前景。

Description

一种酶活性提高的重组溶菌酶LYZ-2及其突变体和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种酶活性提高的重组溶菌酶LYZ-2及其突变体和应用。

背景技术

溶菌酶(lysozyme，LYZ)又称胞壁质酶、N-乙酞胞壁质聚糖水解酶，能水解细菌细胞壁的肽聚糖引起细胞裂解，水解位点是N-乙酞葡萄糖胺和N-乙酞胞壁酸之间的3，4-糖苷键。溶菌酶是由英国生物学家Flemin于1922年在人体内首次发现，因其能明显溶解细菌细胞壁，故命名为溶菌酶。

自然界中溶菌酶来源广泛，根据其生物来源可以分为4种类型：动物源溶菌酶、植物源溶菌酶、微生物溶菌酶和噬菌体T4溶菌酶。溶菌酶能溶解微生物细胞壁使其失去生理活性，具有抑菌、抗病毒和消炎作用，同时还是人体内的非特异性免疫因子，可提高机体的免疫力。另外，溶酶菌本身是天然蛋白质，能在胃肠道作为营养物质消化、吸收，无毒性，也不在体内残留，在食品保鲜、营养保健、医药、化妆品、饲料及基因工程研究领域均有重要应用。

目前市售溶菌酶主要是从鸡蛋清中提取得到的，但因原料受限且含量较少，提取纯化过程步骤繁琐，导致溶菌酶产量低、成本高。而化学方法合成溶菌酶的成本极为昂贵，也会限制溶菌酶的应用。采用基因工程的手段构建溶菌酶的表达宿主，并通过大规模发酵实现溶菌酶的工业化生产，成本低廉、操作简单，为溶菌酶大规模应用提供广阔的前景。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种酶活性提高的重组溶菌酶LYZ-2及其突变体和应用。本发明利用基因合成的方法将果蝇溶菌酶的天然序列优化得到了重组溶菌酶LYZ-2的编码基因，同时通过易错PCR的方法对LYZ-2的编码基因进行随机突变获得突变体LYZ-2-m的编码基因，以此得到的重组溶菌酶酶活得到了显著提升；本发明的另一目的在于提供了包含重组溶菌酶LYZ-2和其突变体LYZ-2-m基因的重组表达载体，然后将其转入毕赤酵母感受态细胞中筛选得到活性高、热稳定性好的转化子，最终能够用于大规模的溶酶菌发酵生产，诱导发酵产生的溶菌酶活性高、耐热性好，适合应用于动物养殖中。

本发明的另一目的在于提供了上述重组溶菌酶LYZ-2和其突变体LYZ-2-m在制备养殖动物饲料添加剂中的应用，所述的动物为家禽和家畜。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种酶活性提高的重组溶菌酶LYZ-2，所述的重组溶菌酶LYZ-2的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。

本发明还提供了所述的重组溶菌酶LYZ-2的编码基因，所述的重组溶菌酶LYZ-2的编码基因序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了一种溶菌酶突变体LYZ-2-m，所述的溶菌酶突变体LYZ-2-m的氨基酸序列如SEQ ID No：4所示，其是由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的重组溶菌酶LYZ-2的第93位氨基酸由丙氨酸变为苯丙氨酸获得。

本发明还提供了所述的溶菌酶突变体LYZ-2-m的编码基因，所述的溶菌酶突变体LYZ-2-m的编码基因序列如SEQ ID NO：3所示。

进一步的，所述的重组溶菌酶LYZ-2最高发酵酶活为622632U/mL。

进一步的，所述的溶菌酶突变体LYZ-2-m的最高发酵酶活为618372U/mL。

进一步的，所述的重组溶菌酶LYZ-2或溶菌酶突变体LYZ-2-m的最适反应pH为6.5，最适反应温度为40℃。

进一步的，所述的重组溶菌酶LYZ-2或溶菌酶突变体LYZ-2-m具有很好的热稳定性和pH稳定性，并更耐酸性环境。

进一步的，所述的重组溶菌酶LYZ-2或溶菌酶突变体LYZ-2-m具有较好的蛋白酶耐受性。

本发明还提供了含有所述的重组溶菌酶LYZ-2的编码基因或所述的溶菌酶突变体LYZ-2-m的编码基因的重组表达载体。

进一步的：所述重组表达载体为pPIC9K和pPICZ-alpha。

本发明还提供了含有所述的重组溶菌酶LYZ-2的编码基因或所述的溶菌酶突变体LYZ-2-m的编码基因的重组菌株。

进一步的：所述重组菌株为毕赤酵母GS115和X-33。

本发明还提供了所述的重组溶菌酶LYZ-2或所述的溶菌酶突变体LYZ-2-m在用于制备动物养殖饲料添加剂中的应用。

进一步的，所述重组溶菌酶LYZ-2或溶菌酶突变体LYZ-2-m能够显著提高养殖动物的日增重，降低料肉比，促进动物的生长性能。

进一步的，所述重组溶菌酶LYZ-2或溶菌酶突变体LYZ-2-m能够有效降低养殖动物腹泻率以及体内支链脂肪酸相对含量，提高养殖动物的成活率。

进一步的，所述动物包括家禽动物和家畜动物。

进一步的，所述重组溶菌酶LYZ-2或溶菌酶突变体LYZ-2-m在养殖肉鸡时的使用方法为：在玉米豆粕型日粮中添加50U/g LYZ-2或LYZ-2-m。

进一步的，所述重组溶菌酶LYZ-2或溶菌酶突变体LYZ-2-m在养殖仔猪时的使用方法为：在母猪产前十天饲料中添加150U/g的LYZ-2或LYZ-2-m，并在仔猪断奶后两周教槽料中添加150U/g的LYZ-2或LYZ-2-m。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：

本发明优化了溶菌酶的基因序列，并在优化序列的基础上随机突变得到突变体基因，然后将两者转化到毕赤酵母中进行重组表达，利用简单高效生产重组溶菌酶的方法，本发明得到的重组溶菌酶LYZ-2，其比天然序列在毕赤酵母中的表达量提高了147.6％，溶菌酶突变体LYZ-2-m在80℃水浴处理5min后耐热性提高55％；并且通过溶菌酶工业化高密度发酵，得到的溶菌酶LYZ-2和LYZ-2-m，发酵液酶活分别为622632U/mL和618372U/mL，酶活得到了显著的提升，能够为基因工程方法规模化生产溶菌酶奠定了理论与实践基础，使其在食品、医药、饲料、日化等行业具有很好的应用前景。另外，将溶菌酶LYZ-2和LYZ-2-m添加到动物养殖的饲料中，能够有效改善动物的生长状况，降低了其腹泻率，抑制动物肠道内有害菌生长，且提高了养殖动物在幼崽阶段的成活率，非常有利于动物的养殖，促进养殖业的发展。

附图说明

图1为本发明中溶菌酶基因序列优化前后摇瓶发酵酶活比较结果；

图2为本发明中溶菌酶基因序列随机突变前后热稳定性比较结果；

图3为本发明中溶菌酶相对酶活随反应温度变化的结果；

图4为本发明中溶菌酶相对酶活随反应pH变化的结果；

图5为本发明中溶菌酶热稳定性试验结果；

图6为本发明中溶菌酶的pH耐受性试验结果；

图7为本发明中溶菌酶的蛋白酶耐受性试验结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。以下结合实施实例对本发明做进一步说明，需要指出的是，本实施例仅用于解释本发明，而非对本发明范围的限制。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可以参照《分子克隆实验指南》(第三版)中所列的具体方法进行，或按照试剂盒、产品说明书进行。具体实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。

1、菌株和载体

毕赤酵母GS115、质粒pPIC9K、大肠杆菌DH5α购自Invitrogen公司。

2、试剂与培养基

质粒提取试剂盒、片段纯化回收试剂盒、限制性内切酶等购自宝生物工程(大连)有限公司；溶菌酶检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

LB培养基：1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl；

MD培养基：1.34％YNB，0.4mg/L生物素，2％葡萄糖；

YPD培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖；

BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB，0.4mg/L生物素，1％甘油；

BMMY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB，0.4mg/L生物素，1％甲醇；

以上培养基为固体时加入2％的琼脂粉。

3、实验方法

(1)菌株培养条件：大肠杆菌37℃培养，毕赤酵母30℃培养。液体培养时摇床转速为200rpm。

(2)毕赤酵母GS115转化方法：

将活化的毕赤酵母GS115接种到含有20mL YPD液体培养基中，30℃摇瓶培养至OD_600nm为1.2～1.5后低温离心收集菌体，依次用20mL冰冷无菌水和5mL浓度为1mol/L的冰冷山梨醇溶液清洗菌体，最后用1mL山梨醇溶液重悬菌体制得酵母感受态悬液。将100μL酵母感受态与10μL线性化载体混匀后转移到预冷的电转杯中电击转化，电转化的条件为1.5kV，6msec。电击后加入1mL山梨醇溶液，转移至1.5mL离心管中30℃温育1h；5000rpm离心5min，收集菌体涂布于MD筛选平板上倒置培养，直至长出阳性单克隆。

(3)溶菌酶酶活检测方法：按照南京建成生物工程研究所的溶菌酶检测试剂盒说明书中空白对照法进行操作，反应体系的配置见表1。

表1溶菌酶活测定反应体系

①将底物菌液2mL震荡混匀后分装到玻璃试管中，冰浴5min。

②迅速加入200μL待测发酵液以及水(空白对照)和溶菌酶标准品(标准对照)，震荡混匀，迅速转移至37℃水浴锅中反应15min，结束后取出冰浴5min以终止反应。

③用1cm光径比色皿中，530nm双蒸水调透光度100％，逐管读取各试验管的透光度。

实施例1：重组溶菌酶的制备获取

一、溶菌酶LYZ基因优化、随机突变与载体构建

来源于果蝇的溶菌酶LYZ的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；根据溶菌酶LYZ成熟区的氨基酸序列和毕赤酵母密码子的偏好性，设计了优化后的溶菌酶LYZ-2的基因序列(如SEQ ID NO：2所示)。以优化后的LYZ-2基因为模板扩增溶菌酶基因，使用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒(Stratagene)随机引入突变。所用引物为：

5’-GCGCGAATTCAGAACTATGGATAGATGTTCTTTGGCT-3’：

5’-TAAAGCGGCCGCCGTGTAGTGGTCCTGT-3’；

下划线处分别为EcoRI和NotI酶切位点。

反应条件为：94℃预变性10min，94℃变性60s，58℃退火60s和72℃延伸2min，共30个循环。经过1％琼脂糖电泳后，使用试剂盒回收目的基因片段。

将溶菌酶密码子优化前天然基因序列、密码子优化后基因序列、目的基因片段均构建到pPIC9K的EcoR I和Not I两个酶切位点之间，得到溶菌酶LYZ的重组表达质粒pPIC9K-LYZ、pPIC9K-LYZ-2、pPIC9K-LYZ-2-m。

二、溶菌酶在毕赤酵母中的转化与高拷贝筛选

用Sal I酶切线性化上述重组表达质粒，采用电击转化的方法将线性化载体分别转化到表达宿主毕赤酵母GS115中，在MD平板上筛选得到溶菌酶表达菌株的转化子。将生长出的转化子用生理盐水清洗，适当稀释涂布于含不同浓度的遗传霉素(200mg/L、400mg/L和800mg/L)的YPD平板上，筛选出高度耐受遗传霉素的转化子即为高拷贝重组转化子，得到毕赤酵母重组菌株。将筛选出的未经优化的溶菌酶天然序列转化子命名为毕赤酵母LYZ，密码子优化后得到的转化子命名为毕赤酵母LYZ-2，随机突变后转化子命名为毕赤酵母LYZ-2-m。

三、溶菌酶重组表达菌株诱导发酵及测序

1、将毕赤酵母LYZ、毕赤酵母LYZ-2和毕赤酵母LYZ-2-m重组菌株在YPD平板上划线，30℃静置培养72h，挑取上述三种重组菌株的单菌落接种于BMGY培养基中，30℃振荡培养18h后，离心获得菌体。将适量菌体转入BMMY培养基中，使菌体浓度达到OD₆₀₀为1，30℃继续振荡培养，每24h添加培养体积1％的甲醇，诱导表达96h后，将培养液离心获得上清，上清液即为重组菌株发酵液。按照南京建成生物工程研究所的溶菌酶检测试剂盒说明书中描述的方法测定重组菌株发酵液的酶活，并将溶菌酶LYZ-2突变前后的发酵液在80℃水浴处理5min，检测剩余活力，以未处理酶液的酶活定义为100％，计算相对酶活力。同时筛选出酶活最高的转化子。

酶活测定结果如图1所示(仅显示同一类转化子中酶活最高的一个转化子)，本发明中毕赤酵母LYZ-2发酵液平均酶活较优化前毕赤酵母LYZ发酵液提高了147.6％，随机突变转化子毕赤酵母LYZ-2-m发酵液的酶活变化不大。80℃水浴处理5min后溶菌酶酶活残留率结果如图2所示，毕赤酵母LYZ-2-m的耐热性比毕赤酵母LYZ-2提高了55％。

2、挑取转化毕赤酵母LYZ、毕赤酵母LYZ-2和毕赤酵母LYZ-2-m单菌落接种到装有4mL YPD液体培养基的试管中振荡培养16h，提取基因组作为模板，用AOX1通用引物扩增，PCR结束后用琼脂糖凝胶电泳检测目的条带，并将得到的DNA送基因测序公司测序。测序结果验证毕赤酵母LYZ-2和毕赤酵母LYZ-2-m序列正确，并且还显示溶菌酶突变体LYZ-2-m的基因序列如SEQ ID No：3所示，翻译后的氨基酸序列如SEQ ID No：4所示，突变体LYZ-2-m的突变位点为LYZ-2的A93F(第93位氨基酸由丙氨酸变为苯丙氨酸，其对应的DNA序列由GCT变为TTC)单点突变。

实施例2：溶菌酶重组工程菌在生产溶菌酶中的应用

一、重组溶菌酶的制备

将酶活最高的转化子毕赤酵母LYZ-2及毕赤酵母LYZ-2-m分别于YPD平板上划线，30℃倒置培养3天长出单菌落，挑取长势良好的单菌落继续在YPD平板上划线培养，将连续传代3次得到的毕赤酵母单菌落接种于20mL BMGY培养基中，30℃、200rpm培养24h；以2％的接种量接种到300mL BMGY培养基中，30℃、200rpm培养至OD₆₀₀为5.0，分别得到LYZ-2种子液及LYZ-2-m种子液，将其接种到发酵罐。

发酵生产的工艺条件为：BSM培养基，pH 5.0、温度30℃、搅拌速率500rpm、通风量1.0～1.5(v/v)，溶氧控制在20％以上。

发酵过程分为三个阶段：

(1)菌体培养阶段：按8％比例接入种子液，30℃培养20～24h，使发酵液中甘油耗尽；

(2)饥饿阶段：当碳源甘油耗尽后，暂不补加任何碳源，待溶氧上升至80％饥饿阶段结束；

(3)诱导表达阶段：用氨水调节pH至目标值，流加甲醇诱导，并且保持溶氧在20％以上，诱导时间为160～200h；待发酵结束后，发酵液通过板框过滤机，将过滤除菌后的酶液喷干，得到重组溶菌酶冻干粉，用于后续的酶学性质和应用测试。

本发明中溶菌酶LYZ-2的最高发酵酶活为622632U/mL，其突变体溶菌酶LYZ-2-m的最高发酵酶活为618372U/mL。

二、重组溶菌酶的酶学性质测定

按照常规方法测定溶菌酶LYZ-2和溶菌酶LYZ-2-m的温度曲线、pH曲线、温度耐受性、pH耐受性和胃/胰蛋白酶耐受性。

1、溶菌酶温度曲线测定：

分别检测溶菌酶在20℃、30℃、35℃、37℃、40℃、50℃、60℃、70℃的反应活力(每组样品3个平行)，以最高酶活为100％，计算相对酶活。结果如图3所示，溶菌酶LYZ-2和LYZ-2-m的最适反应温度为40℃。

2、溶菌酶pH曲线测定：

用缓冲液配制pH分别为3.0，4.0，5.0，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，9.0，10.0的底物菌液，37℃检测不同pH下溶菌酶的活力(每组样品3个平行)，以最高酶活为100％，计算相对酶活。酶活测定结果如图4所示，溶菌酶LYZ-2和LYZ-2-m的最适反应pH为6.5。

3、溶菌酶热稳定性测定：

将酶液在75℃、80℃、85℃水浴处理3min，以未处理酶液的酶活定义为100％，计算相对酶活力。结果如图5所示，溶菌酶LYZ-2在75℃水浴处理3min后酶活残留67.4％，80℃和85℃酶活残留分别为46.5％和33.1％；而溶菌酶LYZ-2-m在各温度下酶活残留率分别为83.1％、61.5％和50.3％，其热稳定性显著高于LYZ-2。

4、溶菌酶pH稳定性测定：

用缓冲液将酶液的pH分别调至3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，37℃放置1h，在pH 6.5、37℃条件下测定其酶活剩余，以未处理酶液的酶活定义为100％，计算相对酶活力。结果如图6所示，溶菌酶LYZ-2和LYZ-2-m对酸性环境的耐受性远超过碱性环境，在pH为4.0条件下37℃处理1h后酶活基本保持不变。

5、溶菌酶蛋白酶耐受性测定：

胃蛋白酶耐受性：将溶菌酶溶解于人工胃液中，37℃放置2h，在pH 6.5、37℃条件下测定其酶活，以未处理酶液的酶活定义为100％，计算相对酶活力。

胰蛋白酶耐受性：将溶菌酶溶解于人工肠液中，37℃放置4h，在pH 6.5、37℃条件下测定其酶活，以未处理酶液的酶活定义为100％，计算相对酶活力。

蛋白酶耐受性结果如图7所示，溶菌酶LYZ-2在人工胃液处理2h后酶活剩余42.7％，在人工肠液中处理4h后酶活剩余83.5％，溶菌酶LYZ-2-m的蛋白酶耐受性结果与LYZ-2相差不大。

实施例3：溶菌酶对白羽肉鸡生长性能的影响

选择1日龄优质白羽肉鸡400羽，用粉料预饲7天，预饲期结束后筛除体重差异明显的鸡，将剩余300羽左右的鸡随机分为3个处理组，每个处理组的重复3个栏位(每个栏位大约30只鸡)，要求每个栏位鸡的平均体重近似，试验处理方式如表2所示。

表2白羽肉鸡试验处理方式

试验周期42天，采食颗粒料自由饮水，采用人工光照，全程不使用抗生素作为生长促进剂。试验过程中每周记录动物的生长性能指标和采食量，结果如表3所示。

表3溶菌酶对白羽肉鸡生长性能的影响

从表4养殖试验结果可以看出，添加50U/g溶菌酶LYZ-2或LYZ-2-m于玉米豆粕型日粮中均能显著提高白羽肉鸡的增重，并降低料肉比，说明本发明的溶菌酶LYZ-2和LYZ-2-m在肉鸡养殖中有很好的应用效果，能够促进肉鸡的生长性能。

实施例4：溶菌酶对仔猪哺乳阶段和保育阶段的影响

选取36头临产母猪，随机分为3组，对照组和试验组1、试验组2各12头，均单栏限位饲养。保证采食和饮水足够，免疫及消毒程序按照猪场常规方法进行。对照组饲喂常规日粮；试验组1母猪产前十天饲料中添加溶菌酶LYZ-2(150U/g)，仔猪断奶后两周教槽料中添加溶菌酶LYZ-2(150U/g)；试验组2则将试验组1中的溶菌酶LYZ-2替换为LYZ-2-m，添加量与添加时间保持不变。

试验过程中每天早、中、晚观测仔猪排粪情况，仔细观察其含水量、形状、颜色是否正常，记录腹泻仔猪头数。此外，准确记录各组仔猪数、出生和断奶时仔猪空腹重量。试验结束后，检测后肠食糜中挥发性脂肪酸含量。试验数据以重复为单位进行处理。

表4溶菌酶对仔猪腹泻的影响

从表4仔猪腹泻情况结果能够看出，在日粮中添加溶菌酶LYZ-2或LYZ-2-m均有效减少了仔猪腹泻头数，降低了腹泻率，说明本发明的溶菌酶LYZ-2和LYZ-2-m对仔猪腹泻起到了明显的防治作用。

表5溶菌酶对哺乳、断奶仔猪生产性能的影响

从表5的生产性能试验结果可以看出，与对照组相比，试验组1仔猪在哺乳阶段的成活率提高7.45％，断奶平均重增加370g/头，提高7.71％；试验组2仔猪在哺乳阶段的成活率提高6.41％，断奶平均重增加330g/头，提高6.88％。上述结果说明，日粮中添加溶菌酶LYZ-2和LYZ-2-m均可有效提高仔猪哺乳阶段成活率、断奶平均重和平均日增重。

表6溶菌酶LYZ-2对仔猪结肠食糜挥发性脂肪酸含量的影响

在后肠食糜中，支链脂肪酸含量与蛋白发酵程度呈正相关，支链脂肪酸比例越高，表明蛋白发酵程度越高，同时产生的毒素含量越高，越容易损害肠黏膜、破坏肠道完整性，进而造成肠道疾病的发生。从表7结果看出，添加溶菌酶LYZ-2或LYZ-2-m后，试验组支链VFA/总VFA显著少于对照组，这表明溶菌酶LYZ-2和LYZ-2-m能有效减少后肠的蛋白发酵，促进了饲料的消化吸收，抑制肠道内有害菌生长。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 青岛红樱桃生物技术有限公司

<120> 一种酶活性提高的重组溶菌酶LYZ-2及其突变体和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 122

<212> PRT

<213> 果蝇(Drosophilid)

<400> 1

Arg Thr Met Asp Arg Cys Ser Leu Ala Arg Glu Met Ser Lys Leu Gly

1 5 10 15

Val Pro Arg Asp Gln Leu Ala Lys Trp Thr Cys Ile Ala Gln His Glu

20 25 30

Ser Ser Phe Arg Thr Gly Val Val Gly Pro Ala Asn Ser Asn Gly Ser

35 40 45

Asn Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile Asn Asn Lys Tyr Trp Cys Lys Pro

50 55 60

Ala Asp Gly Arg Phe Ser Tyr Asn Glu Cys Gly Leu Ser Cys Asn Ala

65 70 75 80

Leu Leu Thr Asp Asp Ile Thr Asn Ser Val Lys Cys Ala Arg Lys Ile

85 90 95

Gln Arg Gln Gln Gly Trp Thr Ala Trp Ser Thr Trp Lys Tyr Cys Ser

100 105 110

Gly Ser Leu Pro Ser Ile Asn Ser Cys Phe

115 120

<210> 2

<211> 398

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaattcagaa ctatggatag atgttctttg gctagagaaa tgtctaagtt gggagttcct 60

agagatcaat tggctaagtg gacttgtatt gctcaacatg aatcttcttt tagaactgga 120

gttgttggac ctgctaactc taacggatct aacgattacg gtatttttca aattaacaac 180

aagtactggt gtaagccagc tgatggtaga ttttcttaca acgaatgtgg tttgtcttgt 240

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<210> 3

<211> 398

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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agagatcaat tggctaagtg gacttgtatt gctcaacatg aatcttcttt tagaactgga 120

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<210> 4

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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20 25 30

Ser Ser Phe Arg Thr Gly Val Val Gly Pro Ala Asn Ser Asn Gly Ser

35 40 45

Asn Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile Asn Asn Lys Tyr Trp Cys Lys Pro

50 55 60

Ala Asp Gly Arg Phe Ser Tyr Asn Glu Cys Gly Leu Ser Cys Asn Ala

65 70 75 80

Leu Leu Thr Asp Asp Ile Thr Asn Ser Val Lys Cys Phe Arg Lys Ile

85 90 95

Gln Arg Gln Gln Gly Trp Thr Ala Trp Ser Thr Trp Lys Tyr Cys Ser

100 105 110

Gly Ser Leu Pro Ser Ile Asn Ser Cys Phe

115 120

Claims

1.一种溶菌酶突变体LYZ-2-m，其特征在于，所述的溶菌酶突变体LYZ-2-m的氨基酸序列如SEQ ID No：4所示，其是由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的重组溶菌酶LYZ-2的第93位氨基酸由丙氨酸变为苯丙氨酸获得。

2.一种溶菌酶突变体LYZ-2-m的编码基因，其特征在于，所述的溶菌酶突变体LYZ-2-m的编码基因序列如SEQ ID NO：3所示。

3.含有权利要求2所述的溶菌酶突变体LYZ-2-m的编码基因的重组表达载体。

4.含有权利要求2所述的溶菌酶突变体LYZ-2-m的编码基因的重组菌株。

5.权利要求1所述的溶菌酶突变体LYZ-2-m在用于制备动物养殖饲料添加剂中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述动物为家禽动物和家畜动物。