CN110607306A - 一种重组猪表皮生长因子的表达方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种在大肠杆菌中高效表达重组猪表皮生长因子的制备方法及应用。其中包括如下步骤：（1）构建重组猪EGF表达载体；（2）构建重组大肠杆菌；（3）IPTG诱导表达重组猪表皮生长因子。本发明的方法能够在大肠杆菌中高效表达重组猪表皮生长因子，该重组猪表皮生长因子能够改善猪肠道健康，提高生长性能。

Description

一种重组猪表皮生长因子的表达方法

技术领域

本发明属于生物技术领域中的基因表达方法技术，具体涉及一种重组猪表皮生长因子的高效表达方法及应用。

背景技术

猪表皮生长因子（pEGF）是一种小肽，由53个氨基酸单链多肽组成，性质非常稳定，且耐热耐酸，是一种多功能的生长因子，在体内体外都对多种组织细胞有强烈的促分裂作用。具有促进胃肠组织生长和发育，修复受损的肠道粘膜组织的作用，可用于调节各种肠道酶的活性，提高营养物质消化吸收，抑制有害菌在肠道粘膜的定植，降低断奶仔猪的应激。同时，pEGF作为猪乳中含量较高的生长因子之一，它对初生仔猪胃肠道发育有着极其重要影响，一般认为，仔猪早期断奶是集约化养猪生产中的关键技术之一，它缩短了母猪生育周期最大限度地发挥母猪的生产能力，但早期断奶导致的断奶应激又是影响断奶仔猪生产性能的主要原因，而通过在饲料中添加pEGF可以有效缓解仔猪的断奶应激，来解决上述问题。

目前，pEGF主要有两种途径获得，一是从母猪乳液中进行分离，其工艺复杂且数量相当有限，另一种是通过工程菌表达获得，目前采用生物技术表达外源性的pEGF的工程菌有大肠杆菌、芽孢杆菌、毕赤酵母等。实际生产应用中，对于生产生物蛋白产品的基因工程菌要求为，遗传背景清晰，遗传性质稳定，便于基因操作，培养成本低，产量高活性好。大肠杆菌具有已经商业化，是非常成熟的表达系统，因此，大肠杆菌表达系统能够满足pEGF大规模商业化生产需求。

发明内容

本发明所解决的技术问题在于提供一种重组猪表皮生长因子的表达方法，该表达方法借助大肠杆菌表达系统进行表达，其表达效率高，表达产物能对猪肠道微生态环境进行维护，减少仔猪断奶应激，减少仔猪断奶后正常饲养态下的腹泻率，增加仔猪的生长性能，以解决上述技术背景中的缺陷。

本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：

本发明公开了一种重组猪表皮生长因子，该包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种重组载体，这种重组载体包含了SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

优选地，所述重组载体是重组大肠杆菌表达载体pET-41b(+)。

重组载体的构建步骤如下：

用Trizol提取猪肾脏皮质组织的总RNA，用于合成pEGF的cDNA。将RT-PCR 回收产物连接至克隆载体pGEM-T easy载体，获得pEGF基因。对质粒pGT-pEGF和pET-41b(+)进行双酶切（NcoI 和 HindIII）, 酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收目的条带和载体条带，用T4连接酶连接，以构建重组质粒pET-pEGF；

本发明还提供了一种重组菌，该重组菌包含前述的重组载体。

优选地，所述重组菌为大肠杆菌。

重组大肠杆菌的构建步骤如下：

将重组质粒pET-pEGF转化E.coli DH 5α感受态细胞，在含卡那霉素( 30 μg /mL)的LB平板上筛选阳性克隆，增菌培养后经菌落PCR 鉴定为阳性的菌落, 提取质粒，并对质粒进行酶切鉴定，送测序验证；得到重组子。

本发明还提供了一种发酵方法，该发酵方法的操作方法为：将前述的重组菌，置于LB培养基（含卡那霉素30μg /mL）培养基中培养，IPTG诱导表达，即可。

优选地，它包括如下步骤：

将重组菌接种到LB培养基（含卡那霉素30μg /mL）培养基中，于37℃振荡培养4-8h；将温度降至20-30℃，IPTG进行诱导表达12-24h；离心收集菌体。

进一步优选地，37℃振荡培养的时间为6h；诱导表达的温度为30℃，诱导时间为18h，IPTG终浓度为1mmol/L。

本发明还提供了前述方法制备得到的表达产物，比如发酵得到的培养液。

本发明还提供了一种纯化重组猪表皮生长因子的方法，步骤如下：

取前述表达产物，离心，沉淀重悬加细胞裂解液，冰浴超声破碎菌体，离心收集上清；经肠激酶酶切，再用柱层析纯化。

本发明还提供了前述方法制备得到的纯化产物。

本发明还提供了前述纯化产物在制备提高仔猪生长性能的饲料添加剂中的用途。

与现有技术相比，本发明的方法能够实现在大肠杆菌中高效地表达重组猪表皮生长因子，且活性很高，能有利于得到后续表达产物。

附图说明

图1为pET-pEGF载体构建示意图。

图2为PCR检测阳性重组大肠杆菌的结果。

图3为pET-pEGF酶切鉴定结果。

图4 SDS-PAGE 检测pEGF融合蛋白的可溶性表达结果。

图5 初步离心除杂纯化后的融蛋白。

图6 为肠激酶切除N端标签序列，再经柱层析纯化后的pEGF。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示以及实施例，进一步阐述本发明。

在下述实施例中，本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语（包括技术术语和科学术语）具有与本申请所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。

实施例一：制备含有目标基因片段的工程菌：

一、猪表皮生长因子EGF基因的获得：

用Trizol提取猪肾脏皮质组织的总RNA，用于合成pEGF的cDNA。将RT-PCR 回收产物连接至克隆载体pGEM-T easy载体，获得含有pEGF基因的质粒pGT-pEGF。

合成pEGF的cDNA时，所用引物序列如下：

上游引物：5’-AATAGTTACTCTGAATGCC -3’；

下游引物：5’-GCGCAGCTCCCACCATTT- 3’。

二、重组表达质粒pET-pEGF的构建：

表达载体pET-41b(+)和含有pEGF基因的质粒pGT-pEGF均含有NcoI 和 HindIII酶切位点。分别用NcoI 和 HindIII双酶切表达载体pET-41b(+)和质粒pGT-pEGF并进行回收，将回收后的载体条带和目的条带（pEGF）用T4连接酶连接，以构建重组质粒pET-pEGF。

三、表达pEGF重组大肠杆菌的构建：

将重组质粒pET-pEGF转化E.coli DH 5α感受态细胞，在含卡那霉素( 30 μg /mL)的LB平板上筛选阳性克隆，增菌培养后经菌落PCR 鉴定为阳性的菌落，提取质粒，并对质粒进行酶切鉴定，送测序验证，得到重组子。

图2为PCR检测阳性重组pEGF大肠杆菌基因组DNA的结果。说明本发明得到了含有目的片段pEGF的阳性转化子：重组大肠杆菌；其中，对应的数字1表示 DNA marker、2表示阴性对照组、3表示阳性对照组、4表示pEGF组。

实施例二：采用本发明重组大肠杆菌重组表达猪表皮生长因子：

1、诱导表达：

1.1表达方法：

取实施例1构建的重组大肠杆菌在100ml LB液体培养基（含卡那霉素30μg/ml）中37℃摇床培养6h，降温至30℃，加入终浓度1mmol/L 的IPTG诱导表达18h。

1.2重组pEGF蛋白纯化：

离心收集培养物，沉淀重悬加细胞裂解液，冰浴超声破碎菌体，离心收集上清；经肠激酶酶切，再用柱层析纯化。

2 检测：

2.1 表达产物pEGF的SDS-PAGE分析：

实验结果显示，通过SDS-PAGE电泳上可以看到重组大肠杆菌表达的一条融合蛋白，其表观分子量约为34kD左右（见图4），其中，M表示DNA marker； 1表示无诱导样本，2表示沉淀部分样本，3表示上清液部分样本；经过初步离心除杂纯化后的融合蛋白（见图5）；通过肠激酶切除N端标签序列，在经柱层析纯化后的pEGF其表观分子量约为7kD（见图6），与从氨基酸序列推断出的理论分子量（7kD）相当，说明表达得到了重组猪表皮生长因子。

2.2 活性检测——重组猪表皮生长因子对成纤维细胞生长的影响：

2.2.1 实验方法：

将细胞株（Balb/c 3T3，A549，Hela）在含有10%胎牛清、100u/ml氨苄青霉素和100u/ml链霉素的培养基1640中培养；当生长到对数中期时，将细胞转移至96孔板（7000个细胞/孔），并在含有上述补充物的培养基1640中孵育24h；将培养基替换为不含胎牛血清的培养基1640，将细胞培养24h；用PBS洗涤细胞1次，用重组的pEGF和标准品EGF（0.006-25ng/ml）处理细胞24-48h；每孔加入200ul甲基噻唑四氮唑（MTT）（5mg/ml）孵育4h；测定活细胞数：丢弃培养基后，每孔加入150ul二甲基亚砜（DMSO），将板保持在室温下30min，在570nm吸光度下测量OD值。

2.2.2 实验结果件下表：

表1 不同浓度EGF对成纤维细胞生长影响

实验结果表明，本发明制备得到的重组猪表皮生长因子，其对成纤维细胞生长率有显著促进作用，随着pEGF浓度的升高，成纤维细胞的生长率逐步增加（实验结果表现为570nmOD值逐步升高）；并且与市售的标准EGF相比，具有相似的活性。

实施例三：本发明工程菌的发酵罐发酵：

1、发酵方法：

取实施例1构建的重组大肠杆菌，在50L发酵罐中进行发酵。重组大肠杆菌发酵诱导表达条件为：37℃培养6h，降温至24℃，IPTG进行诱导表达18h，IPTG终浓度1mmol/L，全过程持续补加甘油。

2、检测：

实验结果表明：选择50L发酵罐，经IPTG诱导表达18h后pEGF含量达到6.5ug/ml。同时，实验结果还说明：采用本发明方法可以高效表达重组猪表皮生长因子，50L发酵罐装入35L培养基发酵培养，可以得到227.5mg重组猪表皮生长因子。

以下通过实验例的方式说明本发明的实际应用价值：

实验例一的本发明方法制备的重组猪表皮生长因子对断奶仔猪生产性能的影响。

通过在断奶仔猪的教槽料中添加实施例3制备的本发明重组猪表皮生长因子以及未添加的教槽料作为对照，验证猪表皮生长因子对动物生长性能的影响。

1 试验材料及方法：

1.1 试验动物：

本试验选择21日龄健康断奶仔猪96头。

1.2 试验时间及地点：

试验时间为2018年12月10日至2018年12月24日共计14天。试验地点为湖南浏阳某猪场。

1.3 试验设计：

随机随机选择21日龄健康断奶仔猪96头，将其分为试验组1、试验组2、试验组3及试验组4，每组两栏，12头仔猪/栏。试验组1饲喂饲料编号为1的饲料，试验组2饲喂饲料编号为2的饲料，以此类推。见下表。

表2试验设计

1.4 饲养管理：

试验仔猪自由采食和饮水，室温控制24~30℃；根据仔猪每日采食量，采用自动投料器每天定时（早7:00）投喂饲料一次，并定时观察（7:00、11:00、15:00、19:00），保证每天最后一次观察时料槽中略有余料；其他饲养管理按照猪场常规程序进行。

1.5 试验评价指标：

平均日采食量：以一个试验周期的总采食量除以试验天数，然后除以试验组的仔猪数量，获得该数据；

平均日增重：分别于试验第1天、试验第15天早晨空腹称重，计算生长阶段平均日增重；

料肉比：根据增重和采食量计算；

腹泻率：每天在打扫圈舍前（每日6:30及14:30）观察记录每头猪腹泻情况，腹泻率=腹泻仔猪头数/（猪总头数×时间）。

2 试验结果表述如下：

表3试验结果表格

实验结果表明，采用本发明方法表达得到的重组猪表皮生长因子能够非常明显提高仔猪的生产性能，使用剂量分别为100 ug/头、200 ug/头、400ug/头时，差别不明显。

综上所述，本发明构建得到了含有pEGF的重组大肠杆菌，该重组大肠杆菌能够高效表达重组猪表皮生长因子，能够有效促进成纤维细胞的生长，提供仔猪的生产性能，市场应用前景广阔。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 赛法特（长沙）生物技术有限公司

1

159

DNA

猪表皮生长因子基因序列

1

aatagttact ctgaatgccc gccgtcccac gacgggtact gcctccacgg tggtgtgtgt 60

atgtatattg aagccgtcga cagctatgcc tgcaactgtg tttttggcta cgttggcgag 120

cgatgtcagc acagagactt gaaatggtgg gagctgcgc 159

2

159

DNA

本发明重组表皮生长因子的基因序列

2

aatagttact ctgaatgccc gccgtcccac gacgggtact gcctccacgg tggtgtgtgt 60

atgtatattg aagccgtcga cagctatgcc tgcaactgtg tttttggcta cgttggcgag 120

cgatgtcagc acagagactt gaaatggtgg gagctgcgc 159

<120> 一种重组猪表皮生长因子的高效表达方法

<160> 0

<170> SIPOSequenceListing 1.0

Claims (11)

1.一种重组表皮生长因子的基因序列，其特征在于，该基因序列的核苷酸序列如SEQID NO. 2所示。

2.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体利用大肠杆菌表达载体pET-41b（+），其载体中包含了SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

3.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌为包括如权利要求2所述特征重组载体的重组大肠杆菌。

4.一种制备重组猪表皮生长因子的方法，其特征在于，利用权利要求3所述的重组菌作为原料，置于含卡那霉素30μg /mL的LB培养基中培养后，再利用IPTG诱导表达即可。

5.根据权利要求4所述的制备重组猪表皮生长因子的方法，其特征在于，将重组菌接种到LB培养基时，在37℃的温度条件下振荡培养4~8h；然后将温度降至20~30℃，利用IPTG进行诱导表达12~24h后离心收集菌体。

6.根据权利要求4所述的制备重组猪表皮生长因子的方法，其特征在于，将重组菌接种到LB培养基时，在37℃的温度条件下振荡培养6h；然后将温度降至30℃，利用1mmol/L的IPTG进行诱导表达18h后离心收集菌体。

7.一种制备重组猪表皮生长因子的表达产物，其特征在于，由权利要求5、6中任一一项所述方法制得的表达产物。

8.一种纯化重组猪表皮生长因子的方法，其特征在于，取权利要求7的表达产物离心、沉淀重悬加细胞裂解液，冰浴并超声破碎菌体，离心收集上清液；经肠激酶酶切，再用柱层析纯化。

9.一种重组猪表皮生长因子的纯化产物，其特征在于，用权利要求8的方法获得。

10.权利要求7所述表达产物在仔猪饲料添加剂中提高仔猪生长性能的应用。

11.权利要求9所述的纯化产物在仔猪饲料添加剂中提高仔猪生长性能的应用。