CN110317821A - 一种融合蛋白thg及其应用 - Google Patents
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Abstract
发明公开了一种渔用口服或浸泡型重组融合蛋白THG及其制备方法和应用，利用基因工程技术将透皮增强肽基因序列(TDZ)、渔用生长激素基因(HG)和细胞穿膜肽基因序列(TAT)进行柔性结合，获得THG融合基因，转化大肠杆菌，筛选获得了一株可生产THG融合蛋白的基因工程菌。该菌株为大肠杆菌BL21（DE3）hsdS gal pET‑28a‑THG；CCTCC NO：M 2018014，该培养物已于2018年01月09日由中国典型培养物保藏中心收到，并登记入册。将该基因工程菌株进行诱导表达和THG融合蛋白的纯化，获得THG融合蛋白。该融合蛋白能降低机体生物屏障，能有效地促进细胞同化作用，加快鱼类生长，可减少鱼类养殖中的粪便排放，环境和生态效益好，在渔业生产上具体明显的经济价值和应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因生物工程技术领域，具体涉及一种重组融合蛋白THG的菌株，还涉及一种重组融合蛋白THG的序列信息，还涉及一种能表达重组融合蛋白THG的制备方法，以及一种重组融合蛋白THG在促进鱼类生长、提高鱼类饲料利用率等方面中应用。
背景技术
鱼类生长激素(growth hormone，GH)是由鱼脑垂体远端的嗜酸性细胞分泌与合成的一类单链多肽。它在鱼的生长、能量的固定、性腺的发育等方面都具有重要的调节作用，也是水产养殖中一直备受研究者关注的领域。鱼类生长激素能够促进鱼类生长发育，提高饵料利用率，减少饵料的损耗，减少化学类药物的使用，降低对水环境的污染程度，对促进水产业的发展具有重要的经济和社会意义（王 伟，汪亚平，朱作言，人工合成草鱼生长激素cDNA在大肠杆菌中的表达，遗传学报，2001，28(4)：306～312）。生长激素在鱼类之间具有很高的保守性，不同种鱼的 GH 都可促进某一种鱼类的生长，表明一种外源生长激素可以对多种鱼类起作用。早期的研究发现，将动物的脑垂体匀浆后，加入饵料中，投喂给鱼，鱼体生长加快，似乎鱼体的肠道能够吸收具有生物活性的生长激素，经研究证实，鱼体的后肠上皮细胞，通过泡饮作用，可以吸收完整的大分子蛋白，具有生物学活性的生长激素可以进入鱼体血液中，从而促进鱼体生长（王 伟，孙永华，汪亚平，朱作言，草鱼生长激素在毕赤酵母中的高效分泌表达，遗传学报，2003，30 (4)：301～306）。多肽生长激素具有调节和促进生长的作用，是脊椎动物（包括鱼类）体内固有的成分，并可在动物体内自动降解而不影响人类食用。现行的鱼用生长激素，常用注射的方式对鱼类有效，口服或浸泡等方式，效果有限，也就鲜有报道。原因在于，生长激素蛋白分子缺乏穿膜机制。
透皮增强肽，也称为蛋白转导域，是目前最强、最快的跨膜转运分子，具有水性、低裂解性并通过非吞噬作用进入各种细胞膜等特点，具有很强的跨膜转运能力，能够携带比其相对分子质量大100 倍的外源性大分子进入细胞。同时，现在研究最多、应用范围最广的细胞穿膜肽(Trans-activating transcriptional activator, Tat) Tat蛋白中存在3个功能结构域，分别是：位于N一端的酸性区，主要起反式激活的功能；位于第22-37位氨基酸之间的DNA结合区，该区域富含半胱氨酸；位于第47-60位氨基酸之间的碱性区，是主要的蛋白转导结构域，参与Tat蛋白的细胞内化作用。Schwarze发现位于Tat蛋白中第47-57位之间的11个氨基酸YGRKKRRQRRR 不仅能够独立穿过细胞膜，而且其穿膜效率比全长的Tat蛋白还要高，这段多肽即是TAT 穿膜肽。本专利就是将透皮增强肽、鱼用生长激素和分子穿膜肽等三个基因进行柔性融合，获得有穿膜活性的生长激素蛋白，解决了生长激素口服，鱼体不能吸收，效果差的问题。而在这方面，尤其是在多基因片段之间柔性融合方面，更未见报道。
发明内容
本发明的主要目的是提供了一种THG融合蛋白，其序列为SEQ ID NO.2所示。本发明首次将透皮增强肽(TDS)、鱼生长激素(GH)、细胞穿膜肽(TAT)与融合表达，获得的融合蛋白可以顺利穿过鱼体鳃部细胞和肠道膜细胞，进入鱼体循环系统中，可直接发挥其促生长作用。
本发明的另一个目的在于提供了一种THG融合蛋白的制备方法，大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）pET28a-THG，工程菌大量表达该融合蛋白。表达量大且可溶，易于工业化生产，成本低，安全性高。
本发明的另一个目的是提供了一种大肠杆菌基因工程菌株，Escherichia coliBL21(DE3) hsdS gal pET28a-THG，大肠杆菌BL21(DE3) hsdS gal pET28a-THG,CCTCC NO：M2018014。该菌株可以表达含透皮增强肽TDS、鱼生长激素(GH)、细胞穿膜肽TAT等融合蛋白THG，使其能顺利穿过细胞膜进入胞内产生作用，该菌株能大量表达THG蛋白，且操作简便快捷，可更好的应用于工业化生产中，为制备口服促生长制品提供良好的基础。
本发明还有一个目的是提供了一种THG表达蛋白在促进草鱼生长中的应用，通过选取大小不同的幼鱼，用一定剂量的融合蛋白分别以剂量对其口服喂食，观察其促生长效果的差异性，可得出最优化的饲养方式。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施。
A．TDS-GH-TAT融合基因的制备。
人工合成TDS基因、GH基因和TAT序列，利用融合PCR技术，实现三段基因序列的柔性融合。先是TDS基因和GH基因柔性融合（图1）再是；基因和GH基因，与TAT序列的柔性融合（图2）。
B．TDS-GH-TAT融合基因表达载体的构建。
用BamH1对TDS-GH-TAT序列和质粒pET28a（+）进行酶切，并用T4连接酶连接，得到重组质粒pET28a-THG(图3)。
C．大肠杆菌基因工程菌的制备。
将质粒pET28a-THG转化到表达菌株Escherichia coli BL21 (DE3)（由Novagen公司购得，实验室保种）中，PCR鉴定筛选出阳性转化子，所得阳性克隆即为本发明涉及的能够表达THG的大肠杆菌基因工程菌株Escherichia coli BL21(DE3) hsdS gal pET28a-THG。
申请人于2018年1月9日将该菌送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏地址：中国武汉，武汉大学，分类命名：大肠杆菌BL21(DE3) hsdS gal pET28a-THG, CCTCCNO:M2018014，通过上述方法获得了一种大肠杆菌基因工程菌株Escherichia coli BL21(DE3)pET28a-THG。
D．基因工程融合蛋白的制备。
将上述基因工程菌Escherichia coli BL21 (DE3) pET28a-THG转接到LB培养基中，经IPTG诱导，融合蛋白THG以包涵体的形式表达，且表达效率和纯化的蛋白产率高，如图4，图5所示，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2 所示。
E．一种THG融合蛋白促进草鱼生长中的应用，其应用过程是。
将大肠杆菌基因工程菌株发酵所得目的蛋白纯化并溶于PBS（pH 7.4，含1.0-2.0mM的L-精氨酸）中，并对蛋白进行定量检测，得到目的蛋白含量为1.0 mg/mL的THG融合蛋白，对草鱼生长和免疫机理的检测是饲养5周后，对每一周每一组的草鱼进行测量体重、体长，根据测算的数据，求算出草鱼的增长率、增重率、肥满度和生存率，以此为依据对草鱼生长情况进行分析，实验结果表明，THG蛋白，无论是浸泡还是口服，对鱼类生长均有较好的促进作用（图6，图7）。
与现有技术相比，本发明具有以下优点。
A．将透皮增强肽TDS、鱼生长激素(GH)和细胞穿膜肽TAT进行柔性融合，获得融合蛋白，活性强，穿膜效果好，可以顺利穿过鱼体鳃部和肠道膜细胞，进入鱼体循环系统中发挥其促生长作用，比单纯的TAT-GH融合效果要强。
B．选取了大肠杆菌作为表达系统，比酵母表达系统或其他植物系统，其操作简单，生长周期短，产量高，成本低，适用于大规模的工业化生产中。同时，本研究中所用的融合基因序列已经过了优化，表达效率显著高于未改造前。
C. 本方法生产的口服型和浸泡型渔用生长激素，给药方式比传统的注射方法，省事省力。
附图说明。
图1为TDS与GH融合图。
图1中：M，DL2000分子标准；1，TDS序列片段；2，GH基因片段；3，TDS-GH融合片段。
图2为TDS与GH，和TAT序列的融合图。
图2中，M，DL2000分子标准；1，TDS-GH融合片段；2，TAT序列片段； 3，THG（TDS-GH-TAT）基因片段。
图3为融合表达载体pET28a-THG的构建。
在图3中，M，DL5000分子标准；1，THG基因片段；2，pET28a-THG质粒经BamHI酶切。
图4为pET28a-THG原核诱导融合示意图。
在图4中，M, 蛋白分子标准。1, 诱导前的总蛋白；2, 诱导后的总蛋白；3，菌体超声处理后上清中的总蛋白；4, 菌体超声处理后下部分的蛋白。
图5为Western blot验证纯化后的THG融合蛋白。
在图5中，M, 蛋白分子标准；1，纯化的THG融合蛋白经Western blot检测。
图6为THG融合蛋白的口服拌料投喂后，草鱼的增重率。
图7为THG融合蛋白的浸泡草鱼后，草鱼的增重率情况。
具体实施方式
本实验中所涉及的分子生物学方法为常规方法，为本领域人员所熟悉。本发明中未详细阐述的请参见《分子克隆实验指南》 J.萨姆布鲁克，D.W. 拉塞尔等主编。
实施例一：融合基因THG的制备。
1） TAT核苷酸片段的生成。
上游引物TDF1一条，下游引物TDR一条，一次聚合合成。
TDF1:GGATCCATGGCCTGCAGCTCGAAGAAATCCAAGCACTGCGGCGGCAGCGGCAGCGGC。
TDR:GATGACTGCGTTGTTGAAGAGCCGCTGGTTCTCTGACATGCTGCCGCTGCCGCTGCC。
先将两条引物分别配成10 μM/L混合后，95 ℃加热10 min后，室温冷却l.0 h后，生成TDS核苷酸片段，4 ℃保存备用。其生成的细胞穿膜肽TDS及柔性联系序列为：ggatccatggcctgcagctcgaagaaatccaagcactgcggcggcag。
2）TAT与TDS和GH的柔性融合。
以TAT和人工合成的TDS和GH为模板，经PCR扩增得THG融合基因，在引物中加入BamH 1酶切位点，以利于后续的重组质粒构建工作，设计的特异引物序列如下。
TATF:CTGGGCGGCTCCGGCAGCGGCGGCTCCGGCAGCGGCGGCTCCGGCAGCTACGCGCGCGC。
TATR:GCTCATCTTTCTCAGACGCGCGGGCCTGGCGGGCCGCGGCGCGCGCGTAGCTGCC。
PCR反应的总体积为50 μL，PCR扩增条件为：热启动（94℃，5min），继续进行35个循环，每一循环的程序为94℃，30 sec；56 ℃，30sec；72 ℃，30 sec，最后一个延伸反应（72℃，5.0 min)取扩增产物5.0 μL在1.2％琼脂糖凝胶上电泳，EB染色后，紫外灯下观察，拍照，扩增产物用PCR纯化试剂盒纯化。
实施例二：THG融合基因的表达载体构建和工程菌株的获得。
用BamH1酶切 pET28a并进行末端磷酸化处理，纯化并回收 pET28a载体，同时用BamH1酶切 THG片段，将目的片段THG与开环pET28a载体，在16 ℃连接过夜，转化大肠杆菌TP10感受态细胞；其步骤和方法，按照《分子克隆实验指南》进行；选取5个克隆进行测序，鉴定方向和序列信息正确的菌株，提取质粒，并和Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞冰浴30 min。42 ℃水浴中热激90sec，速移至冰水中2-3 min，无菌下，加入 600 μ1液体LB培养基，37 ℃，100 rpm轻摇，温浴45 min使细胞复苏。取上述菌液150u l ,用无菌三角玻棒均匀涂布在50 μ g/ml Kan的LB平板上，正向放置1-2 h，直至液体被全部吸收，倒置于37℃培养箱中培养过夜。选取5个克隆进行测序，鉴定THG插入到pET-28a载体中的方向和序列信息，分析编码框的完整性。由此法可得到Escherichia coli BL21(DE3)hsdS galpET28a-THG菌落。
实施例三：基因工程融合蛋白THG的诱导表达和纯化。
重组基因工程菌株 Escherichia coli BL21(DE3) pET-28a -THG的单菌落接种到10 ml新鲜液体LB(含终浓度为50 ug/ml 卡那霉素)培养基中。37℃ 150 rpm 摇床培养过夜。无菌条件下，从培养过夜的菌中，取出0.5 ml 菌液接种到50 ml的新鲜液体LB中，37℃培养箱中 200 rpm 摇床培养4.0 h，再从培养液中，取出2.0 ml 菌液接种到200 ml的新鲜液体LB中，37℃，200 rpm 摇床培养4.0 h，取至OD600为0.8时（约4h）加入终浓度为0.5mM IPTG，37℃诱导4h后，离心6000 g, 4℃, 10 min收集菌体，用 10 mM PBS（pH 8.0）重悬超声波破壁，离心收集上清和沉淀并用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。以优化后的条件扩大培养，超声波破壁后，离心12000 g, 4℃, 20 min收集沉淀，并用尿素变性液在4℃冰箱中溶解处理过夜，4℃离心12000 g, 30 min收集上清。融合蛋白THG的纯化按Ni-NTA说明书进行，用SDS-PAGE检测蛋白纯化结果。得到纯化的THG蛋白，其序列为SEQ ID NO.2所示。
实施例四：融合蛋白THG的抗体制备和Western blot鉴定。
纯化的THG融合蛋白与弗氏不完全佐剂等量混合，腹腔注射Bal/C小白鼠5只，间隔2周免疫1次，共三次，最后1次免疫后第7天，从小白鼠眼眶取少量的血，37℃温箱中作用2h后，4℃放置过夜，取上清采用ELISA检测效价。如达到1:10000，就可大量取血，同上制备血清。THG的鼠源抗血清，4℃保存备用。
纯化后的融合蛋白THG，经SDS-PAGE电泳，转膜，利用THG的鼠源抗血清进行Western blot鉴定，证明纯化后的融合蛋白THG是所需要的蛋白，且特异性好。
实施例五：分光光度法测定蛋白含量。
A．试剂准备。
1）将样品用蒸馏水做适当倍数的稀释。
2）取1.5 mL离心管，按照下表的比例分别加入各溶液，其中0号管为空白对照。
| 溶液管号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 双蒸水 (μL) | 1000 | 900 | 800 | 750 | 700 |
| 1mg/mL BSA (μL) | 0 | 100 | 200 | 250 | 300 |
| BSA浓度(μg/mL) | 0 | 100 | 200 | 250 | 300 |
B．具体步骤。
1）选取酶标板上7个孔，分为标准组和样品组。
标准组：5个孔，每个标准品设置1个重复，各孔分别加入150 μL相应浓度的标准蛋白质溶液；对应管编号为0、1、2、3、4、5。
样品组：剩余2孔，分为2个重复组，同一重复组编号相同。其中编号不同的两孔分别加入浓度不同的150 μL样品稀释液。
2）各酶标孔加入150 μL Bradord工作液，迅速混匀。
3）室温25-30 ℃，反应5 min后，以0号管为空白对照，在酶标仪上测各孔的A595值。
4）以标准组各孔A595平均值为纵坐标，对应的蛋白质浓度为横坐标，在MicrosoftExceL 软件中绘制标准曲线。
5）根据两个相同样品稀释液A595值的平均值，在标准曲线上计算出该样品经过稀释后的蛋白质浓度，选择合适稀释度的样品计算最终的样品蛋白浓度，再由稀释倍数计算原样品蛋白质浓度。
C．最终将目的蛋白溶于PBS（pH 7.4，含1.0—2.0 mM的L-精氨酸）中，并根据标准曲线，将THG融合蛋白浓度调整到1.0 mg/mL。
实施例六：鱼类口服THG蛋白促生长实验。
选取规格整齐的草鱼作为实验对象，先对实验鱼进行训养3周后，随机对鱼进行分组实验。对草鱼生长和免疫机理的检测是饲养5周后，对每一周每一组的草鱼进行测量体重、体长，根据测算的数据，求算出草鱼的增长率、增重率、肥满度和生存率，以此为依据对草鱼生长情况进行分析。实验分组、投喂添加剂量及投喂方式如下。
（1）对照组：A组、D组、F组，投喂普通饲料添加pET28a（载体）蛋白的0.02%。
（2）实验组，B组、C组、E组，THG拌喂组，THG蛋白先和少量饲料颗粒混匀，后再和大量饲料混合，最后，THG蛋白占饲料的0.02%。
A、B、C、D、E、F、G、H等6箱，每箱15尾鱼，充氧。每天上午9点投喂，投喂鱼体总重的3%，每天下午16点30分换水，每次换水量约为总水位的三分之一。每周测量一次鱼的体长和体重，并记录。结果如图6。
实施例七：鱼类浸泡THG融合蛋白后的生长实验。
选取规格整齐的草鱼作为实验对象，先对实验鱼进行训养3周后，随机对鱼进行分组实验。对草鱼生长和免疫机理的检测是饲养5周后，对每一周每一组的草鱼进行测量体重、体长，根据测算的数据，求算出草鱼的增长率、增重率、肥满度和生存率，以此为依据对草鱼生长情况进行分析。实验分组、投喂添加剂量及投喂方式如下。
（1）对照组：A组、D组、F组，浸泡pET28a（载体）蛋白占水体体积量的0.05%，浸泡时间30 min。
（2）实验组，B组、C组、E组，THG浸泡组，THG蛋白占水体体积量的0.05%，浸泡时间30min。
A、B、C、D、E、F、G、H等6箱，每箱15尾鱼，充氧。每天上午9点投喂，投喂鱼体总重的3%，每天下午16点30分换水，每次换水量约为总水位的三分之一。每周测量一次鱼的体长和体重，并记录。结果如图7。
序列表
<110> 鲁东大学
<120> 一种融合蛋白THG及其应用
<141> 2019-06-17
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 723
<212> DNA
<213> 口服型草鱼生长激素基因(Escherichia coli)
<400> 1
ggatccatgg cctgcagctc gaagaaatcc aagcactgcg gcggcagcgg cagcggcagc 60
atgtcagaga accagcggct cttcaacaac gcagtcatcc gtgtccagca cctgcaccag 120
ctggctgcag agatgatcaa cgacttcgag gacaacctgt tgcctgagga acgcagacag 180
ctgagcaaga tcttccctct gtccttctgc aactccgact ccatcgaggc gcccactggc 240
aaggacgaga cgcagaagag ctccatgctg aagctccttc gcatctcgtt ccgcctcatc 300
gagtcctggg agttccccag ccagaccctg agcggagccg tctcgaacag tctgaccgtc 360
ggaaacccca accagatcac cgagaagctg gccgacctga aggtgggcat cagcgtgctc 420
atcaagggat gcctggacgg tcagccaaac atggatgaca acgactccct gccactgccg 480
ttcgaggact tctacctgac catgggggag agcagcctca gagagagctt ccgtcttctg 540
gcttgcttca agaaggacat gcacaaggtg gagacctacc tgagggtagc gaactgcagg 600
agatccctgg actcaaactg caccctgggc ggctccggca gcggcggctc cggcagcggc 660
ggctccggca gctacgcgcg cgccgcggcc cgccaggccc gcgcgtctga gaaagatgag 720
cta 723
<210> 2
<211> 241
<212> PRT
<213> 口服型草鱼生长激素基因(Escherichia coli)
<400> 2
Gly Ser Met Ala Cys Ser Ser Lys Lys Ser Lys His Cys Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Ser Gly Ser Met Ser Glu Asn Gln Arg Leu Phe Asn Asn Ala Val
20 25 30
Ile Arg Val Gln His Leu His Gln Leu Ala Ala Glu Met Ile Asn Asp
35 40 45
Phe Glu Asp Asn Leu Leu Pro Glu Glu Arg Arg Gln Leu Ser Lys Ile
50 55 60
Phe Pro Leu Ser Phe Cys Asn Ser Asp Ser Ile Glu Ala Pro Thr Gly
65 70 75 80
Lys Asp Glu Thr Gln Lys Ser Ser Met Leu Lys Leu Leu Arg Ile Ser
85 90 95
Phe Arg Leu Ile Glu Ser Trp Glu Phe Pro Ser Gln Thr Leu Ser Gly
100 105 110
Ala Val Ser Asn Ser Leu Thr Val Gly Asn Pro Asn Gln Ile Thr Glu
115 120 125
Lys Leu Ala Asp Leu Lys Val Gly Ile Ser Val Leu Ile Lys Gly Cys
130 135 140
Leu Asp Gly Gln Pro Asn Met Asp Asp Asn Asp Ser Leu Pro Leu Pro
145 150 155 160
Phe Glu Asp Phe Tyr Leu Thr Met Gly Glu Ser Ser Leu Arg Glu Ser
165 170 175
Phe Arg Leu Leu Ala Cys Phe Lys Lys Asp Met His Lys Val Glu Thr
180 185 190
Tyr Leu Arg Val Ala Asn Cys Arg Arg Ser Leu Asp Ser Asn Cys Thr
195 200 205
Leu Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser
210 215 220
Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala Ser Glu Lys Asp Glu
225 230 235 240
Leu
Claims (6)
1.一种合成的基因，其序列为SEQ ID NO.1所示，其由723个碱基构成，其中，包含一个独立的ORF阅读框，无内含子。
2.权利要求1所述基因编码的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.2所示，由241个氨基酸组成。
3.含有权利要求1所述基因的基因工程菌：Escherichia coli BL21（DE3）hsdS galpET-28a-THG，大肠杆菌 BL21（DE3）hsdS gal pET-28a-THG；CCTCC NO: M2018014，该培养物已于2018年01月09日由中国典型培养物保藏中心收到，并登记入册。
4.权利要求2所述蛋白的制备方法，其步骤主要有菌株的三级培养，诱导和提取融合蛋白，采用含150—200 mM的咪唑溶液洗脱目的蛋白，经离心透析后，目的蛋白溶于PBS（pH7.4，含1.0—2.0 mM的L-精氨酸）中进行蛋白复性，即得一种活性的THG融合蛋白，其序列为SEQ ID NO.2所示。
5.权利要求1所述的基因或权利要求2所述蛋白在制备水产饲料添加剂或在促进鱼类生长方面的应用。
6.权利要求1所述的基因或权利要求2所述蛋白在制备鱼类生长调节药物中的应用。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111286511A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-06-16 | 鲁东大学 | 一种生产人表皮生长因子与灵芝免疫调节蛋白方法和应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102250255A (zh) * | 2011-06-28 | 2011-11-23 | 广西南宁众达生物工程有限公司 | 抗对虾白斑综合症病毒工程蛋白tat-vp28-gh及制备和用途 |
| CN102703483A (zh) * | 2012-06-08 | 2012-10-03 | 武汉凯肽来生物科技有限公司 | 罗非鱼重组口服蛋白tat-gh及制备方法和应用 |
| CN102766645A (zh) * | 2012-06-08 | 2012-11-07 | 武汉凯肽来生物科技有限公司 | 一种促进黄鳝生长的口服重组蛋白tat-gh及制备方法和应用 |
| CN102899342A (zh) * | 2012-06-08 | 2013-01-30 | 武汉凯肽来生物科技有限公司 | 鲇生长激素与穿肠膜肽tat融合蛋白及制备方法和应用 |
-
2019
- 2019-06-17 CN CN201910520601.8A patent/CN110317821B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102250255A (zh) * | 2011-06-28 | 2011-11-23 | 广西南宁众达生物工程有限公司 | 抗对虾白斑综合症病毒工程蛋白tat-vp28-gh及制备和用途 |
| CN102703483A (zh) * | 2012-06-08 | 2012-10-03 | 武汉凯肽来生物科技有限公司 | 罗非鱼重组口服蛋白tat-gh及制备方法和应用 |
| CN102766645A (zh) * | 2012-06-08 | 2012-11-07 | 武汉凯肽来生物科技有限公司 | 一种促进黄鳝生长的口服重组蛋白tat-gh及制备方法和应用 |
| CN102899342A (zh) * | 2012-06-08 | 2013-01-30 | 武汉凯肽来生物科技有限公司 | 鲇生长激素与穿肠膜肽tat融合蛋白及制备方法和应用 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111286511A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-06-16 | 鲁东大学 | 一种生产人表皮生长因子与灵芝免疫调节蛋白方法和应用 |
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| GR01 | Patent grant | ||
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