CN102993309B

CN102993309B - 一种人生长素融合蛋白TAT-hGH及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102993309B
Application number: CN201210398482.1A
Authority: CN
Inventors: 徐进平; 孟小林; 王健; 倪雅雯
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2012-10-18
Filing date: 2012-10-18
Publication date: 2014-12-03
Anticipated expiration: 2032-10-18
Also published as: CN102993309A

Abstract

本发明公开了一种人生长素与穿膜肽TAT的融合蛋白TAT-hGH及其制备方法和应用，编码该融合蛋白TAT-hGH的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用基因工程制备该融合蛋白TAT-hGH的方法。融合蛋白TAT-hGH具有促Jurkat细胞增殖活性，以及影响下游因子IGFⅠ转录水平的功能。同时，融合蛋白TAT-hGH具有穿肠功能。本发明融合蛋白TAT-hGH可以口服，通过穿过肠细胞膜而进入血液中，通过血液循环到达不同的组织，增加了hGH的利用效率，同时也提高了药效。此外本发明制备方法可应用于大规模的工业生产中，表达量大，操作简单，成本低。

Description

一种人生长素融合蛋白TAT-hGH及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因生物工程技术领域，具体涉及一种人生长素TAT-hGH重组融合蛋白，更具体涉及含有人生长素基因的基因工程菌株E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-TAT-hGH)，本发明还涉及所述TAT-hGH重组融合蛋白的制备方法以及该融合蛋白TAT-hGH在促细胞增殖、促动物生长和穿肠中的应用。

背景技术

人生长素(human growth hormone，hGH)是一种由人的脑垂体前叶合成并分泌的蛋白类激素。生长激素先翻译成激素原，即生长激素前提蛋白，生长激素前体蛋白含有217个氨基酸，氨基端1~26个氨基酸为信号肽，若信号肽的不能特异性切除，则该激素无法产生活性。成熟的人生长激素是单一无糖基化多肽链，由191个氨基酸组成，N端和C端均为苯丙氨酸，分子量在22kDa左右（ChohHaoLi(1982)Human Growth Hormone：1979—1981．Molecular and CellularBiochemistry，46：31-41）。含两个二硫键，由这些半胱氨酸残基形成的二硫键对生长激素生物活性的稳定维持着极其重要的作用。

生长素通过介质，间接促进生长期的骨骺软骨形成，促进骨及软骨的生长，从而使躯体增高。生长激素对中间代谢及能量代谢也有影响，可促进蛋白质合成，增强对钠、钾、钙、磷、硫等重要元素的摄取与利用，同时通过抑制糖的消耗，加速脂肪分解，使能量来源由糖代谢转向脂肪代谢。目前在临床上，已被广泛地用于儿童生长激素缺乏症、成人生长激素缺乏症、大面积烧伤、短肠综合症、肠外瘘、急性坏死性胰腺炎、重症感染、扩张性心肌病、呼吸功能衰竭、重症乙肝(肝硬化)、肾衰等治疗领域，在减肥、美容等领域也在迅速增长。

值得一提的是现在科学发现hGH减少才会出现人体的衰老。在人的青春期，hGH的分泌量逐步上升，直到青春期后期，达到高峰，之后逐渐下降，60岁以上的老年人，他的hGH的分泌量不到青春期最高峰值的1/6，分泌水平已经不到青春期的一半，从此以后人体开始显露衰老迹象。1996年，美国FDA批准HGH 为唯一的抗衰老激素治疗药物。

hGH能起作用，绝大部分情况下都是通过胰岛素样生长因子(Insμlin GrowthFactor，IGF)介导。人体有很多组织都能合成并分泌IGF，IGF是一种受hGH调节的单链多肽，包括IGF I、IGF Ⅱ等，hGH的大多数效应都是由IGF I介导，而血液中的IGF I主要来源于肝（DauhGHaday W．H．，Rotwein P．(1989)Insulin-like growth factors I and II：Peptide,messenger ribonucleic acid and genestructures，serum，and tissue concentrations.Endocrine Review，10:68—91）。

在1920年，科学家就发现了hGH的存在，最初的来源是提取于动物的垂体，但是临床试验发现，在人体中，这种GH是没有活性的。1956年，科学家李和Papkoff首次从人的垂体中提取出hGH,1958年，美国内分泌学家M．Rabem首次将hGH注射到一个缺乏hGH的小孩体内，治愈了第一例侏儒症，使hGH真正开始了在临床上的应用。但是从人体中提取的hGH，不仅受到资源限制，同时成本过高，还存在的病毒污染，美国食品和药物管理局下令停止生产和销售这种从人脑中提取的天然的hGH。而如今hGH大多采用基因工程的方法生产。基因工程方法的生产也可分成两类：一类是在原核生物中生产，另一类是在真核细胞中生产。

在1979年，Gooddel等就已将化学合成的hGH DNA转录入大肠杆菌表达载体的lac启动子末端，再将这个质粒转化大肠杆菌，经过发酵，从表达产物中纯化得到Met—rhGH。这是第二代生长激素，也是rhGH的第一代产品。虽然这种hGH的治疗效果与天然的hGH无异，但是由于它比天然的hGH N端多一个Met残基的，使用后，50%-80％的病人会产生抗体，所以N端不带Met的rhGH的出现就备受期待。直到1985年，191个氨基酸的rhGH终于出现，Gray和他的同事在将rhGH基因连接到大肠杆菌碱性磷酸酶的信号肽序列之后，使rhGH分泌到大肠杆菌的周质空间，但是产量很低。此时rhGH的发展，进入了第二代，产量成了rhGH生产研究上的追求。1986年Becker和Hsiun将ompA作为引导序列,rhGH产量可达10—15μg/mL，1987年,Chang等人利用STII作为引导序列，在phoA启动子下，表达的rhGH产量达到了15～20μg/mL，产量得到进一步提高，目的基因的表达占了菌体总蛋白的6％～10%，其定位在细胞周质中,且超过90％在菌体中表达的rhGH被正确的引导和加工。同年，Kato等将hGH基因和细菌的kill gene相联，hGH的分泌表达量达到20.5mg/L，其中可以直接分泌到培养基中的rhGH达11.2mg/L，而滞留在周质空间的约有8.6mg/L。1989年，HsillIlg等利用细菌素释放蛋白的表达和外膜蛋白omp的信号肽，进一步提高了hGH的表达水平，使其分泌至大肠杆菌培养基中的表达水平提高69.6μg/mL。

除使用大肠肝菌表达系统之外，在原核表达这方面，枯草杆菌表达系统也是一大热门，比较为大家熟知的是美国的Gencncor和Genentech公司，他们通过详细的比较几种启动子、核糖体结合位点序列、转录终止子和宿主菌株，优化组合，最终rhGH表达量可以达到1.5g/L。

原核表达系统之外，越来越多的研究集中于真核表达系统，真核表达系统中使用最多的是酵母表达系统，土耳其的P1nar Cal1k研究了PH对毕式酵母表达rhGH的影响，发现在PH为5.0时，产量达到最高值0.27g/L。除此之外，Johanna利用中国仓鼠卵巢细胞表达系统表达了rhGH，经过纯化获得了35.8μg/ml的蛋白，K.Kadonookuda等人利用杆状病毒作为表达载体，转入家蚕幼虫，使rhGH的表达量达到每毫升的家蚕幼虫血淋巴中有160μg蛋白。等开发了一种转基因兔的生产系统，即利用家兔作为最终生产系的乳腺反应器。原理是将hGH基因以及鼠的乳腺表达启动子相连后，转入兔的受精卵细胞，人工受精，获得F1代雌兔，至其哺乳期，从其乳汁中可以纯化出hGH。但是真核表达通常要求技术高、而且表达周期长，产量较原核表达低，而且由于hGH没有糖链，用原核表达也不会存在由于翻译后无修饰造成对生物活性的影响，因此市场中的大部分rhGH原核表达系统为主，而且以大肠杆菌系统表达占多数。

近年来发现有一些小分子的多肽可以介导外源物质穿过细胞膜，这种小分子多肽被称之为细胞穿膜肽（cell penetrating peptides,CPP）。许多CPP都是来源于某些直接与宿主细胞相互作用的病毒结构蛋白的蛋白转导结构域（proteintransduction domains,PTD）。现在研究最多、应用范围最广的细胞穿膜肽来源于人免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的转录激活因子（Trans-activating transcriptionalactivator,Tat）。Tat蛋白中存在3个功能结构域，分别是：位于N-端的酸性区，主要起反式激活的功能；位于第22-37位氨基酸之间的DNA结合区，该区域富含半胱氨酸；位于第47-60位氨基酸之间的碱性区，是主要的蛋白转导结构域，参与Tat蛋白的细胞内化作用。Tat蛋白共有86个氨基酸，是HIV复制所必需的调节因子。Schwarze发现位于Tat蛋白中第47-57位之间的11个氨基酸YGRKKRRQRRR不仅能够独立穿过细胞膜，而且其穿膜效率比全长的Tat蛋白还要高。这段多肽即是TAT穿膜肽。

不管是单独的TAT穿膜肽，或者是携带其他大分子物质如蛋白质、寡聚核苷酸或脂质体等，在穿膜时都可以表现出较高的穿膜活性。在携带外源物质穿膜时，TAT介导的穿膜似乎与其要携带的分子大小无关，100KD的蛋白质、40nm大小的纳米颗粒、甚至200nm大小的脂质体都可以经TAT运载入细胞内。而且，以这种方式运输到细胞内的脂质体甚至可以在进入细胞内1h后仍然可保持结构的完整性。相反的，没有与TAT穿膜肽连接的物质在与细胞共同孵育时均不能够进入细胞内。

TAT穿膜肽的序列中由于有6个精氨酸和2个赖氨酸残基，因此是带有高度正电荷的多肽。以不带电荷的丙氨酸替代其中的任何一个碱性氨基酸残基都会使穿膜活性降低，而替代序列中的其他氨基酸残基时穿膜活性则不会发生改变。这说明TAT穿膜肽所带的正电荷是其穿膜功能所必需的，因此推测这些正电荷很可能是能够与真核细胞的细胞膜发生强的静电作用，从而介导了穿膜过程。对TAT穿膜肽的亲和性分析发现，它能够与许多细胞膜表面的阴离子通过静电作用强烈地结合，与之结合的细胞表面分子可以是核仁素、蛋白聚糖等。精氨酸丰富的多肽可以穿过细胞膜，而其他氨基酸如赖氨酸、组氨酸等丰富的多肽却不具有此功能。然而，由精氨酸组成的支链聚合物与直链聚合物具有同样的穿膜效率。此外，研究发现TAT穿膜肽不会因为手性结构的改变而影响其穿膜活性，其手性分子与自然结构具有相同的穿膜活性。这说明这种细胞穿膜肽很可能不依赖于特定的结合位点。然而，多肽的长度是影响穿膜效率的重要因素。穿膜效率与精氨酸的个数有关，含有6个或者更多精氨酸的多肽要比含有少于5个精氨酸多肽的穿膜效率高一些，在多肽小于15个氨基酸时，穿膜效率会随着多肽大小的增加而增强。大于15个氨基酸的多肽虽然也可具有穿膜活性，但其效率却会明显减小。

尽管对于TAT穿膜肽的穿膜功能研究的比较多，但是到目前为止，关于TAT穿膜肽进入细胞的分子机制还没有完全研究清楚。早期研究认为是通过直接转运机制穿过细胞膜，且是不依赖于能量的，但最近的研究也有与这一观点不同的结果。尽管其进入细胞的机制还没有完全研究透彻，但TAT穿膜肽的应用已经十分广泛。

hGH作为可以刺激增长的蛋白质激素，现如今已被大量应用于临床上，治疗生长激素缺乏症、大面积烧伤、短肠综合症等疾病，同时伴随着1990年7月5日美国威斯康辛医学院的Daniel Rudman在《新英格兰医学杂志》上发表了他那一篇震惊医学界的论文——Effects of human growth hormone in men over60 years old，人生长激素在抗衰老方面的作用逐渐被人们关注，人生长激素的市场需求已经变的越来越大，但是无论是其在临床上的治疗，还是抗衰老的应用，都因只能通过注射给药，方法繁琐，导致病人的治疗极其不便，而且其抗衰老方面的使用也很难普及。将hGH基因和TAT蛋白转导域序列进行融合，可以使人生长素能够通过口服给药方式进行治疗，这是一种实际可行的新思路。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种TAT-hGH融合蛋白，其氨基酸序列为SEQID NO.2所示。该融合蛋白可以促进Jurakat细胞增殖，作用Hep3B细胞后影响其IGFmRNA转录水平，同时还可以穿过肠细胞膜而进入血液中，使hGH可以不经注射而直接进入血液中，通过血液在人体内的循环，使其融合蛋白到达不同的组织，增加了hGH的利用效率，同时也提高了药效。

本发明的目的是在于提供了一种大肠杆菌基因工程菌E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-TAT-hGH)，该菌株的保藏号为：CCTCC No.M2012348，该菌株能表达TAT-hGH的融合蛋白。

本发明的另一个目的是在于提供了一种融合蛋白TAT-hGH的制备方法，该方法可应用于大规模的工业生产中，表达量大，操作简单，成本低。

本发明的再一个目的是在于提供一种融合蛋白TAT-hGH具有穿肠功能，在穿肠中的应用。

本发明的还有一个目的是在于提供了一种融合蛋白TAT-hGH在促动物生长中的应用。

为了达到上述的目的，本发明采用以下技术方案：

重组人生长素与穿膜肽融合蛋白TAT-hGH，其为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白。

本发明还进一步包括编码上述蛋白的基因，优选其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。本发明还包括含有上述基因的载体，以及含有所述基因或所述载体的基因工程菌。

本发明优选的一种表达重组人生长素与穿膜肽融合蛋白TAT-hGH的基因工程菌株，该菌株为E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-TAT-hGH)，已于2012年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址：武汉市武昌珞珈山邮编：430072），分类命名为：大肠埃希氏菌（Escherichia.coli）Origami B(DE3)pLysS(pET-TAT-hGH)，保藏号为：CCTCC No.M2012348。其能够在常规的大肠杆菌培养基中生长，并具有氨苄抗性、卡纳抗性、四环素抗性，经过IPTG诱导后能大量表达TAT-hGH蛋白。

本发明还提供一种表达所述融合蛋白TAT-hGH的基因工程菌株的构建方法，它包括下列步骤：

A.人生长素基因的制备：合成人生长素基因，将人生长素基因克隆到pMD18-T载体中，挑取单菌落用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，得到的阳性克隆子即为包含hGH基因的大肠杆菌，用于基因的扩增和保藏。

B.融合基因的制备：通过重叠延伸PCR的方法将TAT 33bp碱基连入hGH的5'端构成TAT-hGH，将PCR产物组插入pMD18-T载体，转化E.coli JM109，挑取单菌落用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，得到的阳性克隆子即为包含TAT-hGH的大肠杆菌E.coli JM109(pMD-TAT-hGH)，用于基因的扩增和保藏。

C.表达载体的构建：首先双酶切重组质粒pMD-TAT-hGH和质粒pET-22b（+）,胶回收含TAT-hGH基因的片段和开环pET-22b（+）片段，16℃连接后转化到感受态E.coli JM109中，所得到的阳性克隆子为包含TAT-hGH的E.coli JM109(pET-TAT-hGH)。

D.基因工程菌的构建和鉴定：将质粒pET-TAT-hGH转化感受态E.coliOrigami B(DE3)pLysS，PCR鉴定筛选出阳性转化子，挑取单菌落用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，阳性克隆为表达TAT-hGH的大肠杆菌基因工程菌株E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-TAT-hGH)。。

本发明还进一步提供所述重组人生长素与穿膜肽融合蛋白TAT-hGH的制备方法，该方法包括以下步骤：培养所述的基因工程菌，在能表达所述融合蛋白的条件，其中所述条件包括诱导或非诱导条件下，表达所述的融合蛋白TAT-hGH，然后分离、纯化该融合蛋白TAT-hGH。

具体地，该方法包括如下步骤：

A.挑取所述的基因工程菌E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-TAT-hGH)的单菌落，接种于5ml选择性LB液体培养基中，37℃，250rpm/min振摇培养过夜；

B.次日将培养过夜的菌液200μl再接种于20ml 2YT液体培养基中，37℃，250rpm/min振摇培养至光密度OD ₆₀₀=0.6时，加入IPTG于菌液中，使IPTG终浓度为1mM，37℃，250rpm/min振摇培养4小时；

C.采用柱亲和层析法纯化获得融合蛋白TAT-hGH。

本发明利用大肠杆菌表达TAT跨膜域和hGH的融合蛋白，意在利用hGH进行疾病治疗以及美容驻颜。通过基因工程生产的TAT-hGH融合蛋白可以仍然保持hGH的活性，仍然可以促进Jurkat细胞进行增殖。本发明另一个创新之处在于，将TAT穿膜肽和hGH融合表达，由于TAT穿膜肽可以携带外源蛋白穿过细胞膜，因此将TAT-hGH口服后，该融合蛋白可以穿过肠细胞膜而进入血液中，使hGH可以不经注射而直接进入血液中，通过血液在人体内的循环，使其融合蛋白到达不同的组织，增加了hGH的利用效率，同时也提高了药效。

TAT穿膜肽目前还没有直接应用于工业生产，但其独特的穿膜效率十分具有吸引力。而且本发明公开的基因工程菌株的构建方法可以应用于大规模的工业生产中，表达量大，操作简单，成本低。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

（1）本发明制备TAT-hGH融合蛋白可以穿过肠细胞膜而进入血液中，使GH可以不经注射而直接进入血液中，通过血液在人体内的循环，使其融合蛋白到达不同的组织，增加了hGH的利用效率，同时也提高了药效。

（2）口服人生长素可以取代注射人生长素，减少病人的痛苦。

（3）本发明提供的融合蛋白TAT-hGH的制备方法，该方法可应用于大规模的工业生产中，表达量大，操作简单，成本低。

附图说明

图1为重组表达质粒pET-TAT-hGH的构建过程图。

图2为重组表达质粒pET-TAT-hGH酶切及PCR鉴定图。

泳道1：D15000DNA Maker；泳道2：Xho I单酶切产物；泳道3：Xho I及Nde I双酶切产物；泳道4：hGH PCR产物；泳道5：TAT-hGH PCR产物；泳道6：DNAMakerⅢ。

图3SDS-PAGE检测TAT-hGH表达的图谱。

泳道1：蛋白Marker；泳道2：加入IPTG诱导的E.coli OrigamiB(DE3)/pET-22b(+)菌液；泳道3：加入IPTG诱导的E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-TAT-hGH)菌液；泳道4：加入IPTG诱导的E.coli OrigamiB(DE3)/pET-22b(+)上清；泳道5：加入IPTG诱导的E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-TAT-hGH)菌液上清；泳道6：加入IPTG诱导的E.coli OrigamiB(DE3)/pET-22b(+)菌液沉淀；泳道7：加入IPTG诱导的E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-TAT-hGH)菌液沉淀。

图4为SDS-PAGE检测TAT-hGH纯化图谱。

泳道1：蛋白Marker；泳道2：加入IPTG诱导的E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-TAT-hGH)菌液上清；泳道3：纯化的TAT-hGH蛋白。

图5-1为30min时融合蛋白TAT-hGH-GFP和hGH-GFP穿膜结果图谱。

(a)蓝光下hGH-GFP作用30min肠组织切片；(b)可见光下hGH-GFP作用30min肠组织切片；(c)蓝光下TAT-hGH-GFP作用30min肠组织切片；(d)可见光下TAT-hGH-GFP作用30min肠组织切片。

图5-2为60min时融合蛋白TAT-hGH-GFP和hGH-GFP穿膜结果图谱。

图5-3为120min时融合蛋白TAT-hGH-GFP和hGH-GFP穿膜结果图谱。

图6-1为终浓度500ng/ml TAT-hGH对Hep3B细胞中IGF Ⅰ转录水平影响图谱。

图6-2为终浓度5ng/ml TAT-hGH对Hep3B细胞中IGF Ⅰ转录水平影响示意图谱。

具体实施方式

本实验所涉及的分子生物学方法为常规方法，为本领域人员所熟悉。本发明中未详细阐述的请参见《分子克隆实验指南》J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔等主编。

实施例1重组质粒pMD-TAT-hGH的构建和鉴定

1.PCR

根据hGH的序列(GenBank:V00520.1)以及TAT PTD中11个氨基酸的碱基序列设计引物，引物设计如下：

上游引物1：5`-AAACGTCGTCAGCGTCGTCGTTTCCCAACCATTCCC-3`

上游引物2：5`-GAATCCCATATGTATGGCCGTAAGAA-3`（划线处为Nde I酶切位点）

下游引物1：5`-TTACTCGAGGAAGCCACAGCTGCCCT-3`（划线处为XhoI酶切位点）

以上引物由英俊公司合成。

分3次PCR合成TAT-hGH：以pMD18T-hGH质粒（Generay公司合成）为模板，上游引物1，下游引物1，退火温度55℃，做PCR扩增目的片段hGH，电泳并作回收；以上一步回收产物为模板，上游引物2，下游引物1，退火温度51℃做PCR,电泳并作回收，即得到TAT-hGH基因片段。

50μl体系采用如下条件进行PCR反应：

向无菌PCR管中加上述组分的操作在冰上进行，用移液枪抽吸混匀，4000rpm瞬时离心后，将PCR管置于PCR仪中。

2.PCR扩增片段的回收

使用Biomiga公司的回收试剂盒进行，步骤如下：

（1）从凝胶上割下带有目的片段的凝胶块到一个1.5ml的离心管中，加入1倍体积的Buffer GC，置于55℃-60℃水浴中8-10分钟，期间颠倒混匀几次，直至凝胶块完全溶化。冷却离心管至室温。

（2）转移以上混合液（每次不超过700μl）至一个带有收集管的吸附柱中，室温下，13000g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回到收集管中。

（3）加入650μlDNA Wash Buffer至吸附柱中，室温下，13000g离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回到收集管中。

（4）室温下，13000g，将吸附柱打开盖子离心2min，去除残留的乙醇。

（5）转移吸附柱至1.5ml收集管中，加入30-50μl 60℃预热的Elution Buffer到吸附柱膜中央，室温放置一分钟，13000g离心一分钟，将洗脱液放回到吸附柱中重新洗脱一次。

（6）回收产物-20℃冰箱保存。

3.加A反应

取KOD Polymerase扩增获得的PCR片段为模板，用Mastermix Taq DNApolymerase 72℃延伸20min按如下体系：

4.冷氯化钙法制备E.coli JM109感受态细胞

（1）以无菌牙签挑取平板上的E.coli JM109单菌落，接种到20ml LB培养基中，37℃，220rpm活化过夜。

（2）取10～20μl上述活化大肠杆菌，接种到20ml新鲜的LB培养基中，37℃，220rpm培养2～3h，至OD600值为0.4～0.6。

（3）取1.5ml步骤2）的菌液加入无菌的Eppendorf离心管中，4℃，4,000rpm离心10min，弃上清。

（4）加入200μl冰预冷的0.1M氯化钙轻轻振荡重悬菌体沉淀，冰浴30min。4℃，4,000rpm离心10min，弃上清。

（5）加入100μl冰预冷的0.1M氯化钙重悬沉淀，得到制备好的感受态细胞。4℃保存，7天内使用。

5.PCR产物与pMD-18T载体连接

所有反应体系在冰上进行，按如下体积进行：

以上反应产物于22℃水浴连接1小时。

连接产物转化E.coli JM109感受态细胞：

（1）取10μl连接反应液，加入到100μl上述制备的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。

（2）42℃水浴中热激90s，迅速移至冰中冰浴2min。

（3）加入900μl新鲜LB液体培养基，37℃，150rpm轻摇，复苏45min。

（4）4,000rpm离心5min，吸弃900μl上清，将剩余的菌液用移液枪轻轻混匀。

（5）取100μl细菌悬液，用无菌三角玻璃涂棒涂布于含氨卞青霉素的LB平板上，正向放置1-2小时，直至液体被充分吸收，倒置平版，与37℃培养箱中培养过夜，挑选阳性克隆，得到菌株E.coli JM109/pMD-TAT-hGH。

6菌落PCR鉴定

（1）从LB转化平板上挑取单菌落，接种于20ml LB培养液，37℃培养过夜，取1μl菌液作为模板进行菌液PCR鉴定。

（2）20μl体系采用如下条件进行PCR反应：

上游引物3：5`-GAATCCCATATGTATGGCCGTAAGAA-3`

下游引物1：5`-TTACTCGAGGAAGCCACAGCTGCCCT-3`

琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。

7.酶切鉴定

碱裂解法提取质粒pMD-TAT-hGH

（1）用接种环接种少量保种菌液pMD-TAT-hGH/JM109，于氨苄青霉素平板上划线，37℃静置培养过夜；

（2）用无菌牙签挑取生长在氨苄青霉素平板上的白色单菌落，接种到20ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养过夜；

（3）次日取培养的菌液1.5ml于1.5ml Eppendorf管中，12,000rpm离心30s，吸弃上清，收集菌体沉淀，加入100μl冰预冷的溶液I，剧烈振荡使沉淀完全悬浮；

（4）再加入200μl溶液Ⅱ（天根质粒提取试剂盒溶液），颠倒数次混匀，待整个溶液澄清，冰浴静置5min；

（5）加入150μl冰预冷的溶液Ⅲ（天根质粒提取试剂盒溶液），轻微振荡均匀，冰浴10min，澄清的溶液会出现絮状沉淀；

（6）4℃,12,000rpm离心10-15min，转移上清至一个新的无菌Eppendorf管中；

（7）加入等体积的酚/氯仿，充分混匀，4℃，12,000rpm，离心5min，取上清液转入另一支无菌的Eppendorf管中；

（8）离心后取上清，加入900μl预冷的无水乙醇，-20℃沉淀10min；

（9）12,000rpm离心15min，去上清，吸弃液体，倒置于无菌滤纸上待其干燥；

（10）加入70％乙醇1ml，稍微震荡后放置2min，4℃，12,000rpm离心10min，吸弃液体，干燥；

（11）DNA沉淀溶于40μl含RNase A(10mg/ml)的ddH₂O中，-20℃存放。

质粒双酶切：

将上述反应体系组分在冰上混合并混匀，5000rpm瞬时离心，置于37℃水浴锅中保温反应3h，加反应量0.1倍体积的10×loading buffer终止反应，全部用于1%的琼脂糖凝胶电泳。

用Generay公司合成的pMD18T-hGH质粒为模板，通过PCR扩增，获得627bp DNA片段，为TAT-hGH,。琼脂糖凝胶电泳结果显示在约627bp处有DNA亮带，其大小与理论值一致。将纯化后的PCR片段产物与pMD-18T载体连接，转化入E.coli JM109，并涂布于加有Amp的固体LB培养平板上。挑取阳性克隆，分别通过PCR和小量提取重组质粒DNA进行酶切鉴定。琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR片段和酶切结果均在约627bp处有DNA亮带，其大小与理论值一致。

8.pMD-TAT-hGH融合基因核苷酸序列测定

质粒pMD-TAT-hGH DNA经PCR和酶切鉴定后，随机选取阳性克隆送北京华大基因公司进行DNA测序分析。pMD-TAT-hGH质粒经全自动测序分析，

目的基因核苷酸序列为：

TATGGCCGTAAGAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGA

CAACGCTAGTCTCCGCGCCCATCGTCTGCACCAGCTGGCCTTTGACACCTACCAGGAGTTTGAAG

AAGCCTATATCCCAAAGGAACAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGTTTC

TCAGAGTCTATTCCGACACCCTCCAACAGGGAGGAAACACAACAGAAATCCAACCTAGAGCTGCT

CCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCGTGGCTGGAGCCCGTGCAGTTCCTCAGGAGTGTCTTCG

CCAACAGCCTGGTGTACGGCGCCTCTGACAGCAACGTCTATGACCTCCTAAAGGACCTAGAGGAA

GGCATCCAAACGCTGATGGGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGGACTGGGCAGATCTTCAAGCA

GACCTACAGCAAGTTCGACACAAACTCACACAACGATGACGCACTACTCAAGAACTACGGGCTGC

TCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAGACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCT

GTGGAGGGCAGCTGTGGCTTC

实施例2基因工程菌株E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-TAT-hGH)的构建

1.双酶切

分别将pET-22b(+)质粒（购自novagen公司）和pMD-TAT-hGH质粒DNA进行双酶切。反应体系见下表：

将上述反应体系组分在冰上混合并混匀，5000rpm瞬时离心，置于37℃水浴锅中保温反应3h，加反应量0.1倍体积的10×loading buffer终止反应，全部用于1%的琼脂糖凝胶电泳。回收TAT-hGH和pET-22b(+)片段。

2.连接

将1中回收的TAT-hGH和pET-22b(+)片段在冰上混合，按下表所示加入。

将10μl混合液放在无菌PCR管中，用移液枪轻轻抽吸几下混匀，5000rpm瞬时离心，将混合液集中在管底，然后16℃连接过夜。

3.转化E.coli JM109

感受态细胞的制备同同实施案例1。

连接产物转化E.coli JM109感受态细胞后，涂布于含氨卞青霉素的LB平板上，37℃培养箱中培养过夜，挑选阳性克隆，得到菌株E.coliJM109(pET-TAT-hGH)。

4.E.coli JM109(pET-TAT-hGH)的鉴定

从LB转化平板上挑取单菌落，接种于20ml LB培养液，37℃培养过夜，取1μl菌液作为模板进行菌液PCR鉴定。将PCR鉴定所得阳性克隆的菌液转接50μl于20ml新鲜液体LB培养基（含终浓度为30μg/ml的氨苄青霉素）中，37℃，300rpm摇床培养过夜，碱裂解法小量提取质粒，用Nde Ⅰ和Xho I双酶切鉴定阳性重组子，

单酶切：

双酶切：

将上述反应体系组分在冰上混合并混匀，5000rpm瞬时离心，置于37℃水浴锅中保温反应3h，加反应量0.1倍体积的10×loading buffer终止反应，取8μl酶切产物，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。根据单,双酶切后是否有大小正确的带来判断该质粒是否为阳性重组子。

5.转化E.coli Origami B(DE3)pLysS

转化方法同JM109转化法。将质粒pET-TAT-hGH转化E.coli Origami B(DE3)pLysS，获得基因工程菌E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-TAT-hGH)。

6.E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-TAT-hGH)的鉴定

方法同E.coli JM109(pET-TAT-hGH)的鉴定。

pET-TAT-hGH构建过程如附图1所示，首先将连入载体pMD18T的片段hGH通过两轮延伸PCR，在hGH 5'添加TAT序列,获得TAT-hGH片段，连入载体pMD18T，获得质粒pMD-TAT-hGH，然后用NdeI和XhoI进行双酶切，插入表达载体pET-22b(+)中，获得重组表达质粒pET-TAT-hGH。

pET-TAT-hGH酶切及PCR鉴定如附图2所示，pET-22b空载体大小是5493bp，插入TAT-hGH片段后，是6111bp，图示结果与理论结果一致，而TAT-hGHPCR产物和双酶切结果也与目标片段TAT-hGH大小一致。

7.pET-TAT-hGH融合基因核苷酸序列测定

质粒pET-TAT-hGH DNA经PCR和酶切鉴定后，随机选取阳性克隆送北京华大基因公司进行DNA测序分析。pET-TAT-hGH质粒经全自动测序分析，TAT-hGH基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

上述所构建的含有质粒pET-TAT-hGH的菌株为E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-TAT-hGH)，菌种保藏号CCTCC No.M2012348。

实施例3基因工程融合蛋白TAT-hGH的表达

挑取转化有质粒的单菌落，接种于5ml选择性LB液体培养基中，37℃，250rpm/min振摇培养过夜。次日将培养过夜的菌液200μl再接种于20ml（1:100）选择性2YT液体培养基（17g蛋白胨，10g酵母提取物,5g NaCl，加水至1000ml）中，37℃，250rpm/min振摇培养至光密度（OD ₆₀₀=0.6）时，加入1mol/L IPTG于菌液中，使IPTG终浓度为1mM，37℃，250rpm/min振摇培养4小时。

各取发酵液1ml于1.5ml EP管中，13000rpm离心1min,吸去上清，将沉淀加去离子水水重悬，作为跑SDS-PAGE胶的菌体样液。另取4ml发酵液于1.5mlEP管中，13000rpm离心1min,收集其沉淀，加入750μl去离子水，重悬，放在冰上，进行超声破碎，间隙时间15s,破碎时间5s，功率400v，循环五次后，将破碎液至于冷冻离心机内，8000rpm离心5min,，上清作为跑SDS-PAGE胶的菌体上清样液。将待检测样品加入等体积的2×SDS上样缓冲液，煮沸加热5min，SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离，考马斯亮蓝染色3小时后，脱色观察结果。

对经1mM IPTG 4小时诱导的E.coli Origami B(DE3)/pET-22b(+)-TAT-hGH和E.coli Origami B(DE3)/pET-22b(+)的菌体总蛋白进行电泳分析。融合蛋白TAT-hGH理论值大小约为24kDa。SDS-PAGE发现了目标蛋白条带，如图3所示。而经IPTG诱导的E.coli Origami B(DE3)/pET-22b(+)没有出现条带。且在加入IPTG诱导的E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-TAT-hGH)的菌液，上清，沉淀均有蛋白表达，约24kDa，与预计大小相一致。

实施例4融合蛋白TAT-hGH的纯化

1．柱亲和层析

（1）将离心后的菌体用1×Ni-NTA结合缓冲液悬浮起来后，冰水超声破碎，功率400w，破碎2s,间歇5s,如此周期进行50次。

（2）将破碎液装入10ml EP管中，配平后放入冷冻离心机，4℃下，8000rpm离心30min,。吸取上清，使用0.45μm规格的滤膜进行过滤。

（3）将样品加到NTA层析柱中，泵的速度控制在30/ml左右，收集流出液，用于SDS-PAGE分析蛋白质的结合情况。

（4）用大约20ml的1×Ni-NTA结合缓冲液洗，流速控制在20ml/h左右，直至在核酸检测仪上显示的数值为零。之后分别用20mM,40mM,漂洗缓冲液洗脱杂蛋白，同样洗完的条件是核酸检测仪上显示的数值为零。流速控制在40ml/h左右，用1.5mlEP管收集每一种浓度的漂洗液，SDS-PAGE分析，目标蛋白是否有洗脱，以及杂蛋白的洗脱情况。

（5）用大约20mlNTA体积1×Ni-NTA结合缓冲液洗脱目的蛋白，流速控制在15ml/小时左右，收集洗脱液。SDS-PAGE分析。

2.透析

将透析袋（截留分子量为8kDa-14kDa）一端用透析袋夹夹紧，加入纯化后的蛋白后夹紧另一端，将装好的透析袋放入PBS缓冲液（8gNaCl，0.2gKCl，1.44gK₂HPO₄，0.24gKH₂PO₄，HCl调pH值至7.4，加水定容至1000ml）中，透析24h,12h更换一次缓冲液。

3.浓缩

将透析袋放在冰上，把PEG20,000撒在透析袋上，置于4度下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。将浓缩后的蛋白从透析袋中取出，装入1.5ml EP管中，配平后放入冷冻离心机，4℃下，8000rpm离心5min。吸取上清，分装入EP管中，每管100μl.20℃冷冻保存。

对E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-TAT-hGH)进行大批量发酵，破碎离心后取上清，通过镍柱进行TAT-hGH蛋白的纯化，如附图4所示TAT-hGH蛋白中的his标签与镍柱的结合效率很高，有单一条带。

实施例5融合蛋白TAT-hGH穿肠功能的检测

1.肠组织样品的制备

实验前，SPF级昆明小鼠禁食12h，不禁水，用乙醚麻醉后，用断颈法将其杀死，分离出小肠，用剪刀剪成2cm小段，HBSS缓冲液冲洗排除内容物，每段肠一端结扎，另一端用注射器注入100μl待检测样品后结扎。样品分3组，PBS组，hGH-GFP组，TAT-hGH-GFP组。hGH-GFP组和TAT-hGH-GFP组蛋白浓度均为200μg/ml。

将结扎后的肠组织样品浸入HBSS缓冲液中，37℃，5％CO₂，进行孵育，定时取样，分别是30min,1h,2h。取样时，用HBSS缓冲液冲洗小肠片段，洗净后立即包埋于OCT冰冻切片包埋剂中，放入液氮中，直至其变白，存放于-70℃低温冰箱中。

2.肠组织冷冻切片制备

用冰冻切片机把冷冻组织样品切成8μm冷冻切片，将冷冻组织切片转移至防脱载玻片，室温放置10min后,在4℃冷丙酮中固定10min,常温晾干后就可进行观察。

3.荧光显微镜下观察组织切片

将固定后的上述组织切片置于荧光显微镜下，选择20×视野，在蓝色光下观察荧光，并在同视野下切换到可见光观察组织。

4.融合蛋白穿肠功能检测结果

如附图5所示，在TAT-hGH-GFP蛋白作用小肠片段30min时，已经可以观察到少量荧光，这就说明就已经有部分蛋白穿过肠壁细胞，1h时，已经有很明显的荧光，2h时，组织切片上荧光面积变大,且荧光变强，这就证明有大量的蛋白穿过肠壁细胞，而hGH-GFP蛋白作用的小肠片段则几乎看不到荧光，也就是说基本没有蛋白穿过肠壁细胞。由此证明TAT-hGH具有穿肠功能。

实施例6融合蛋白TAT-hGH促进Jurkat细胞增殖活性的检测

1.细胞铺板

往稀释后密度达到5×10⁴个/ml的细胞悬液中加入PHA，使其终浓度达到30mg/L。吹散细胞后往96孔细胞培养板中加样。

调零孔：加入PHA的含有10％胎牛血清的RPMI 164090μl，PBS10μl.

对照孔：加入PHA的细胞悬液90μl，PBS10μl.

加药孔：加入PHA的细胞悬液90μl，加入10μl使其终浓度分别为的0.005μg/ml、0.05μg/ml、0.5μg/ml、5μg/ml TAT-hGH纯化样品，以及其终浓度分别为的0.005μg/ml、0.05μg/ml、0.5μg/ml、5μg/ml hGH纯化样品。

每孔均做3个复孔。

2.细胞培养

37°，5%CO₂，培养46h后，每孔加入10μl 5mg/ml MTT.，加MTT时小心避光再次37°，5%CO₂培养2h.

3.吸光值测定

离心（1000转，10min），小心吸掉上清，每孔加入100μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD_570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。

4.融合蛋白TAT-hGH促进Jurkat细胞增殖活性检测结果

如表1所示，不同浓度TAT-hGH和hGH作用PHA刺激下的Jurakt细胞，均有不同程度的增殖现象，且在最高浓度5μg/ml时，增殖效果最为明显,且增殖效果呈浓度依赖。

表1：TAT-hGH及hGH不同浓度下对Jurkat细胞增殖的影响

实施例7融合蛋白TAT-hGH对下游因子IGF Ⅰ影响的检测

1.细胞铺板

将已铺满细胞瓶的Hep3B细胞稀释至60%，吹散细胞后往加入6孔板。放入细胞培养箱中，保持5％CO2，37℃。培养5h。用PBS清洗细胞，每孔加入2ml不含10%胎牛血清的DMEM。此时可以向细胞板中加入待测蛋白样。分为5组,每组设3个平行孔。

5组处理如下：

⑴PBS组；

⑵终浓度5ng/ml hGH标准品组；

⑶终浓度5ng/ml TAT-hGH纯化蛋白组；

⑷终浓度500ng/ml hGH标准品组；

⑸终浓度500ng/ml TAT-hGH纯化蛋白组；

再将6孔细胞培养板放入细胞培养箱中，保持5％CO2，37℃。培养18h。

2.Hep3B细胞RNA的提取：

⑴吸尽上清培养基，每孔用1ml PBS冲洗贴壁细胞2次后，每孔加1ml Trozol,将细胞裂解后，全部吸出，加入1.5mlEP管中。

⑵室温下放置5min,12,000rpm,离心1min.取上清加入新的EP管。

⑶向每管中加入200μl氯仿，盖上管盖，手动颠倒振荡30s,室温下放置3min.

⑷12,000rpm,离心10min.样品分三层,下层黄色的为有机相，蛋白质主要在此层，中间层，DNA主要在此层，上层无色的为水相，RNA主要存在于水相中。

⑸小心吸取上层水相转移到新的EP管中，在得到的水相溶液中加入等体积的异丙醇，混匀后，于室温下放置30min。12,000rpm,离心10min.小心吸去上清。

⑹每管加入1ml 75%乙醇（75ml无水乙醇，25ml 0.1%DEPC ddH₂O），重悬洗涤沉淀。5,000rpm,离心3min。小心吸去上清。在室温下放置晾干3min，加入20μl0.1%ddH₂O，反复吹打，混匀，充分溶解RNA。

3.去除RNA中的基因组DNA

按下表将各成分加入到一个无RNA酶的PCR管中：

37℃下孵育30min.。80℃水浴10min。

4.RNA逆转录成cDNA

在置于冰上的无菌无核酸酶的PCR管中，按模板RNA11μl，Oligo(dT)₁₈引物2μl顺序加入。轻轻混合，短暂离心后，65℃孵育5min,置于冰上冷却。

再按表下表顺序加入反应物。

轻轻混匀，短暂离心。将样品放入PCR仪中，42℃60min，之后70℃5min。

5.荧光定量法测定IGF I浓度

引物设计：

IGF Ⅰ-fp 5`AAGCCTACAAAGTCAGCTCG 3`

IGF Ⅰ-rp 5`GGTCTTGTTTCCTGCACTTC 3`

GAPDH-fp 5`AAGGCTGTGGGCAAGG 3`

GAPDH-rp 5`TGGAGGAGTGGGTGTCG 3`

IGF Ⅰ组以IGF Ⅰ-fp为5’引物，IGF Ⅰ-rp为3’引物，GAPDH组以GAPDH-fp为5’引物，GAPDH-rp为3’引物，模板均为上一步骤中RNA逆转录成的cDNA。按下表将各成分加入到荧光定量PCR板中（每孔）。

轻轻混匀，短暂离心。将样品放入PCR仪中，反应过程如下表

6.融合蛋白对下游因子IGF Ⅰ影响的检测结果

设定以PBS作用的Hep3B细胞中IGFⅠ的量为1，则500ng/ml hGH标准品作用的Hep3B细胞中IGFⅠ的量是0.502，500ng/ml TAT-hGH纯化蛋白作用的Hep3B细胞中IGFⅠ的量是0.144。5ng/ml hGH标准品作用的Hep3B细胞中IGFⅠ的量是2.12，5ng/ml TAT-hGH纯化蛋白作用的Hep3B细胞中IGFⅠ的量是10.20。

Claims

1.一种人生长素与穿膜肽的融合蛋白TAT-hGH，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.一种分离的DNA分子，其特征在于：该DNA分子编码权利要求1所述的融合蛋白TAT-hGH。

3.根据权利要求2所述的所述的DNA分子，其特征在于：所述的DNA分子的核酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.一种载体，其特征在于包含权利要求2或3所述的DNA分子。

5.一种宿主细胞，其特征在于包含权利要求4所述的载体。

6.重组基因工程菌株，该菌株的保藏号为：CCTCC No. M2012348，其能够在常规的大肠杆菌培养基中生长，并具有氨苄抗性、卡那抗性、四环素抗性，其特征在于：经过IPTG诱导后，能大量表达可溶性的权利要求1所述的融合蛋白TAT-hGH。

7.权利要求1所述融合蛋白TAT-hGH在制备促进细胞增殖药物中的应用。

8.权利要求1所述融合蛋白TAT-hGH在制备促动物生长药物中的应用。