CN112159819B - 小黄鱼生长激素生物反应器家蚕品系的构建方法 - Google Patents

小黄鱼生长激素生物反应器家蚕品系的构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112159819B
CN112159819B CN202010915249.0A CN202010915249A CN112159819B CN 112159819 B CN112159819 B CN 112159819B CN 202010915249 A CN202010915249 A CN 202010915249A CN 112159819 B CN112159819 B CN 112159819B
Authority
CN
China
Prior art keywords
growth hormone
yellow croaker
silkworm
bioreactor
pcgh
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010915249.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112159819A (zh
Inventor
翁宏飚
牛宝龙
沈卫锋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Academy of Agricultural Sciences filed Critical Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN202010915249.0A priority Critical patent/CN112159819B/zh
Publication of CN112159819A publication Critical patent/CN112159819A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112159819B publication Critical patent/CN112159819B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormones [GH] (Somatotropin)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/033—Rearing or breeding invertebrates; New breeds of invertebrates
    • A01K67/0333—Genetically modified invertebrates, e.g. transgenic, polyploid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/033—Rearing or breeding invertebrates; New breeds of invertebrates
    • A01K67/04—Silkworms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/79—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/70—Invertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vectore
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Abstract

小黄鱼生长激素生物反应器家蚕品系的构建方法，属于家蚕转基因遗传育种技术领域。该方法包括：（1）合成小黄鱼生长激素与转铁蛋白融合基因；（2）获得piggBAC转基因质粒pLX‑Red‑PcGH‑TF；（3）转基因质粒导入家蚕受精卵；（4）获得G1代蚕卵；（5）筛选标记基因阳性个体；（6）验证小黄鱼生长激素在家蚕中高效表达；（7）鉴定遗传稳定性；（8）建立小黄鱼生长激素生物反应器家蚕品系。本发明一方面，高效低成本生产小黄鱼生长激素，并可以进一步加工成小黄鱼功能性添加剂，应用于小黄鱼养殖。另一方面，缓解了蚕桑生产面临的发展困境，提高蚕桑产业效益的效果。

Description

小黄鱼生长激素生物反应器家蚕品系的构建方法
技术领域
本发明属于家蚕转基因遗传育种技术领域，具体涉及小黄鱼生长激素生物反应器家蚕品系的构建方法。
背景技术
改革开放以来，在“以养为主”的发展方针指引下，水产养殖业发展取得巨大成就。水产养殖业的快速发展为解决城乡居民“吃鱼难”、保障优质动物蛋白的供给、降低天然水域水生生物资源的利用强度、促进渔业产业兴旺和渔民生活富裕等都作出了突出贡献。但是，与新时代的发展要求相比，水产养殖业还面临着一些困难和问题。为促进水产养殖业绿色高质量发展，确保水产品质量安全，农业农村部会同其他有关部委联合印发了《关于加快推进水产养殖业绿色发展的若干意见》，围绕加强科学布局、转变养殖方式、改善养殖环境、强化生产监管、拓宽发展空间、加强政策支持及落实保障措施等方面作出部署，要求强化投入品的管理。2019年中央一号文件更是将绿色投入品等领域自主创新列为需加快突破的农业关键核心技术之一。
生长激素(Growth hormone，GH)是包括鱼类在内的所有脊椎动物脑下垂体分泌的糖蛋白类激素，具有促进鱼体生长发育，加速蛋白质的合成，促进脂类降解，提高饵料效率等功能，在鱼类育种和渔业生产中的应用一直受到研究者的关注。鱼类生长激素基因的开发应用可概括为两个方面：其一，采用转基因方法，培育快速生长的转基因鱼；其二，应用基因工程技术，外源表达鱼类生长激素，并通过有效途径，使养殖鱼类从体外获取生长激素蛋白质，进而提高生长速度，提高饲料效率，从而降低养殖成本。
在我国，由于公众对转基因食品生物安全性和环境安全性的关注，虽然我国生长激素转基因鱼早已培育完成，但似乎离上市还是遥遥无期。在这种情况下，通过补充外源生长激素蛋白，来提高水产养殖效益，不失为一种切实可行的选择。大量的研究表明，通过注射、埋植、浸泡或食道插管等途径给药生长激素，都可以促进鱼类的生长，说明外源补充的生长激素与内源激素一样具有生物活性。由于天然鱼体中GH含量很低，提取工艺复杂，较难规模化生产，因此，通过基因工程技术生产重组生长激素，是获得大量外源鱼类生长激素最为经济有效的方法。虽然外源激素在鱼体内存在着半衰期短，需要连续添加等不足，但仍然显示出作为鱼饲料功能性添加剂，具有广阔的前景。
外源蛋白表达系统中，大肠杆菌表达系统和酵母表达系统，由于不具备或仅有很低的蛋白质修饰功能，因而这两种系统表达虽然具有易培养、操作简单等优点，但表达的蛋白质因糖基化修饰不足，因而生物活性低，甚至无生物活性。另外，转基因微生物的生物安全性也是值得关注的问题。
家蚕是一种全变态昆虫，通过在幼虫期食桑摄取营养迅速成长壮大，约25左右天时间，体重可增加约1万倍，体积约增加6000倍。同时，家蚕具有很好的蛋白修饰功能，可进行蛋白质的糖基化、磷酸化等修饰，非常适合作为生物反应器，进行外源生产有生物活性的生长激素蛋白质。家蚕生物反应器主要有两种类型。一种是寄主型生物反应器，主要是家蚕-杆状病毒表达系统。该系统存在病毒接种不便，以及涉及病毒载体等问题，不适合绿色水产投入品的生产。第二种为可遗传的转基因生物反应器，即转基因家蚕。近十几年来，家蚕转基因技术得到快速发展，已建立了多种家蚕转基因方法，其中最为有效的piggBAC-蚕卵显微注射方法，已在多个实验室获得成功。另外，家蚕是寡食性昆虫，在一般情况下，仅取食桑叶。并且，在长期的人工驯化过程中，家蚕失去了野外生存能力，蚕蛾不能飞翔，缺乏逃逸能力,自然条件下，不会发生因家蚕与野外昆虫杂交，而导致的基因漂移。因此，转基因家蚕具有良好的生物安全性。以转基因蚕体为原料，加工制备的功能性饲料添加剂，主要成分除含有鱼类生长激素蛋白质外，与常规蚕体成分完全一致，不含质粒，是一种绿色安全的投入品。以转基因家蚕为水产饲料添加剂，类似于以转基因大豆作为水产饲料原料，因而具有良好的公众接受度。
小黄鱼与大黄鱼、墨鱼、带鱼并称为“四大海产”，特别在东海海域、其捕捞量曾占主要经济鱼类产量的12.6%。但受过度捕捞及海洋环境变化等影响，小黄鱼资源受到严重破坏，产量极不稳定。近年来，随着小黄鱼人工驯化和养殖技术的成熟，小黄鱼人工养殖将逐步兴起。据此，我们认为构建可高效表达小黄鱼生长激素的家蚕品系，用于低成本小黄鱼功能性饲料添加剂生产，将对提高小黄鱼人工养殖效率具有十分重要的意义。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于构建转小黄鱼生长激素基因家蚕品系，利用家蚕生物反应器，低成本生产小黄鱼功能性饲料添加剂，以提高小黄鱼综合养殖效益。
为了实现上述目的，将采用以下技术方案：
小黄鱼生长激素生物反应器家蚕品系的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）设计并合成小黄鱼生长激素与转铁蛋白融合基因,插入启动子、终止子和His标签，得到含有优化融合基因序列的pUC57-PcGH-TF质粒，该pUC57-PcGH-TF质粒的插入片段序列如SEQ ID No.1所示；
（2）将piggBAC载体pXL-Red与步骤（1）得到的pUC57-PcGH-TF质粒的插入片段体外重组，获得piggBAC转基因质粒pXL-Red-PcGH-TF，该转基因质粒pXL-Red-PcGH-TF的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
（3）将步骤（2）得到的piggBAC转基因质粒pXL-Red-PcGH-TF导入家蚕受精卵；
（4）饲养G0代家蚕，获得G1代蚕种；
（5）在G1代幼虫中，筛选标记基因（标记基因是红色荧光蛋白。piggBAC转基因质粒pXL-Red中有RFP基因。）阳性个体，并以F为正向引物和R为反向引物，采用PCR鉴定和测序鉴定小黄鱼生长激素与转铁蛋白融合基因插入家蚕基因中，所述正向引物F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，反向引物R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
（6）对G1代阳性个体，采用定性和定量检测验证小黄鱼生长激素的表达水平，筛选建立小黄鱼生长激素高效表达的生物反应器家系；
（7）对步骤（6）建立的生物反应器家系，与家蚕皓月品种连续回交4代，鉴定小黄鱼生长激素与转铁蛋白融合基因在家蚕基因组中的遗传稳定性和表达稳定性；
（8）建立小黄鱼生长激素生物反应器家蚕品系。
所述的小黄鱼生长激素生物反应器家蚕品系的构建方法，其特征在于所述步骤（1）中合成小黄鱼生长激素与转铁蛋白融合基因具体为：利用小黄鱼全基因组测序信息和小黄鱼转录组信息，通过同源检束方法，分别获得小黄鱼生长激素基因和转铁蛋白基因序列，设计小黄鱼生长激素和转铁蛋白融合基因，根据家蚕密码子偏好，优化并合成融合基因，并在融合基因前依次加上IE2启动子序列、Kozak序列和真核生物磷酸转运相关肽段的编码序列，融合基因后加上6×His标签编码序列及SV40序列，最后在外源基因表达盒的两端设置kpnⅠ和HindⅢ克隆位点，合成插入片段克隆到pUC57载体的Sma I Blunt位点，得到pUC57-PcGH-TF质粒。
所述的小黄鱼生长激素生物反应器家蚕品系的构建方法，其特征在于所述步骤（2）中piggBAC载体pXL-Red与融合基因体外重组具体为：采用分别以限制性内切酶kpnⅠ和HindⅢ切割piggBAC载体pXL-Red及pUC57-PcGH-TF质粒，电泳分离得到载体片段和目的基因表达框片段，连接并转化感受态细胞，挑斑，测序鉴定正确后，获得piggBAC转基因质粒pXL-Red-PcGH-TF。
所述的小黄鱼生长激素生物反应器家蚕品系的构建方法，其特征在于所述步骤（3）中转基因质粒pXL-Red-PcGH-TF导入家蚕受精卵具体为：以非滞育家蚕品系Nistari的新产受精卵为受体，将步骤（2）得到的piggBAC转基因质粒pXL-Red-PcGH-TF稀释至400ng/ul，以显微注射方式导入15nl至家蚕受精卵中，在温度25℃，湿度80%的条件下催青至孵化。
所述的小黄鱼生长激素生物反应器家蚕品系的构建方法，其特征在于所述步骤（4）中获得G1代蚕种具体为：蚕卵孵化后，按家蚕常规饲养程序饲养，上蔟结茧后，常规蛹期保护，羽化后自交制种获得G1代。
所述的小黄鱼生长激素生物反应器家蚕品系的构建方法，其特征在于所述步骤（5）的具体为：将步骤（4）得到的G1代蚕种在温度25℃，湿度80%条件下催青至孵化，收蚁，常规饲养至2龄，荧光解剖镜下筛选红色荧光个体，饲养至上蔟结茧，羽化后制种，提取红色荧光阳性蛾体的基因组DNA，设计小黄鱼生长激素基因特异性引物，对DNA进行PCR鉴定和测序鉴定。
所述的小黄鱼生长激素生物反应器家蚕品系的构建方法，其特征在于所述步骤（6）中定性和定量检测的具体为：以小鼠抗鲤鱼生长激素单克隆抗体进行WB检测，定性筛选表达外源蛋白的个体，并通过ELISA定量检测，筛选建立小黄鱼生长激素高效表达的生物反应器家系。
所述的小黄鱼生长激素生物反应器家蚕品系的构建方法，其特征在于所述步骤（7）的具体为：对4代中每代筛选红色荧光个体饲养至上蔟结茧，制种后，取样基因组DNA及总蛋白，采用PCR检测外源基因情况，及WB检测样品中小黄鱼生长激素的表达情况，明确插入的外源基因的遗传稳定性和表达稳定性。
所述的小黄鱼生长激素生物反应器家蚕品系的构建方法，其特征在于所述步骤（8）中建立小黄鱼生长激素生物反应器家蚕品系的具体为：利用杂交、回交及人工饲料摄食性筛选的方法，将阳性家系基因组中的小黄鱼生长激素基因导入家蚕皓月品系中，建立生物反应器家蚕品系。
本发明具有以下有益效果：
本发明利用转小黄鱼生长激素基因，建立小黄鱼生长激素生物反应器家蚕品系。一方面，高效低成本生产小黄鱼生长激素，并可以进一步加工成小黄鱼功能性添加剂，应用于小黄鱼养殖，起到促进小黄鱼生长，提高养殖效益的效果。另一方面，缓解了蚕桑生产面临的发展困境，提高蚕桑产业效益的效果。将外源表达小黄鱼活性生长激素的蚕蛹，加工成高附加值的水产功能性饲料添加剂，达到变废为宝的目的。
附图说明
图1为红色荧光阳性幼虫图；
图2为G1代标记基因阳性个体结茧羽化后的蚕蛾图；
图3为小黄鱼生长激素基因特异性引物扩增产物的测序结果；
图4为WB结果图，其中左部为鲤鱼生长激素单克隆抗体，右部为Actin抗体；
图5为标记基因阳性蛾体基因组DNA的PCR扩增电泳图，利用小黄鱼GH基因特异性引物，对连续4个世代的红色荧光阳性蛾体基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物的电泳结果；
图6为连续4个世代标记基因阳性蛾体的WB结果图。
具体实施方式
以下将结合具体实施例与附图对本发明作进一步说明。
实施例：
（1）小黄鱼生长激素基因和转铁蛋白基因的克隆：利用小黄鱼全基因组测序信息和小黄鱼转录组信息，通过同源检束方法，分别获得小黄鱼生长激素基因（GH）和转铁蛋白基因（TF）序列，设计小黄鱼生长激素和转铁蛋白融合基因；并根据家蚕密码子偏好，优化融合基因序列。在融合基因前依次加上IE2启动子序列、Kozak序列和真核生物磷酸转运相关肽段的编码序列，融合基因后加上6×His标签编码序列及SV40序列，最后在外源基因表达盒的两端设置kpnⅠ和HindⅢ克隆位点，合成插入片段克隆到pUC57载体的Sma I (Blunt)位点，得到pUC57-PcGH-TF质粒，该pUC57-PcGH-TF质粒插入片段的序列如SEQ ID NO.1所示。
（2）piggBAC转基因载体构建：分别以限制性内切酶kpnⅠ和HindⅢ切割piggBAC载体pXL-Red（由中科院上海植物生理研究所谭安江研究员馈赠）和pUC57-PcGH-TF质粒，电泳分离后，分别回收7.4kb的载体片段，及3.7kb的融合基因表达框片段，连接并转化感受态细胞，挑斑，测序鉴定正确后，获得piggBAC转基因质粒pXL-Red-PcGH-TF，该转基因质粒pXL-Red-PcGH-TF的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
（3）蚕卵显微注射：以非滞育家蚕品系Nistari的新产受精卵为受体，将扩繁纯化后的pXL-Red-PcGH质粒与A3 helper质粒稀释至400ng/ul后，等量混匀，通过显微注射方式导入家蚕受精卵中，每卵注射15nl混合质粒后，速干胶封住注射孔，置于培养箱中，25℃、80%湿度条件下催青至孵化。
（4）G0代转基因家蚕饲养：蚕卵孵化收蚁后，按常规家蚕饲养方法饲养至上蔟结茧，蚕蛹羽化后自交制种，得到G1代蚕种。
（5）转基因阳性个体筛选：G1代蚕种，按常规方法催青至孵化，收蚁饲养至2龄饷食，荧光解剖镜下筛选红色荧光个体（如图1），饲养至上蔟结茧，羽化后交配制种，并分别提取红色荧光阳性蛾体（如图2）的基因组DNA和蛋白质。设计小黄鱼生长激素基因特异性引物（ F: 5’-TCCTGCAAGACTTCTGCAAC-3’， R: 5’-AGCAAGCCAGCAGTTCGTAT-3’），对基因组DNA进行PCR鉴定，并进一步对扩增产物进行测序鉴定，序列比对后发现扩增产物与合成的融合基因序列完全一致，说明小黄鱼融合基因确实插入家蚕基因组（如图3）。
（6）提取的阳性蛾体蛋白质，经PAGE凝胶电泳分离、转膜后，用鲤鱼生长激素单克隆抗体杂交，在120 Kd位置有明显的杂交条带，与融合蛋白的分子量大小一致，说明外源小黄鱼生长激素在蛾体中得到高效表达（如图4）。通过ELISA定量检测，筛选建立小黄鱼生长激素高效表达的生物反应器家系，表达的外源小黄鱼GH蛋白约为0.26ng/mg总蛋白。
（7）生物反应器家蚕家系遗传稳定性和表达稳定性检测：对所构建的生物反应器家系，连续自交传代4代，每代筛选红色荧光个体饲养至上蔟结茧，制种后，分别提取蛾体基因组DNA和蛋白质，用于小黄鱼生长激素基因特异性引物PCR扩增基因组DNA，均可获得目的条带（图5），鲤鱼生长激素抗体WB检测均显示小黄鱼生长激素在蛾体中有高表达（图6），从而确定外源基因可在家蚕家系基因组中稳定遗传和稳定高效表达。
（8）利用杂交、回交及人工饲料摄食性筛选的方法，将阳性家系基因组中的小黄鱼生长激素基因导入家蚕皓月品系中，建立生物反应器家蚕品系。
序列表
<110> 浙江省农业科学院
<120> 小黄鱼生长激素生物反应器家蚕品系的构建方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2898
<212> DNA
<213> pUC57-PcGH-TF质粒插入片段(pUC57-PcGH-TF plasmids are inserted intofragments)
<400> 1
gtcgacatga acagagtgct gctgctgctg tcagtgctgt cactgggtgt gagctctcaa 60
caaatcactg aatcacaaag actgttctca atcgtggtgt ctagagtgca acacctgcac 120
ctgctggctc aaagactgtt ctcagacttc gaatcatcac tgcaaacaga agaacaaaga 180
caactgaaca aaatcttcct gcaagacttc tgcaactctg actacatcat ctcacctatc 240
gacaaacacg aaacacaaag atcatcagtg ctgaaactgc tgtcaatctc atacagactg 300
gtggaaagct gggaattccc tagcagatca ctgtcaggtg gttcagctcc tagaaaccaa 360
atcagcccta aactgtcaga actgaaaaca ggaatcctgc tgctgatcag agctaaccaa 420
gacgctgctg aaatcttccc tgactcaagc gctctgcaac tggctcctta cggtaactac 480
taccaatctc tgtctggtga agaaagcctg agaagaacat acgaactgct ggcttgcttc 540
aaaaaagaca tgcacaaagt ggaaacatac ctgacagtgg ctaaatgcag actgtcacct 600
gaagctaact gcacactggc agaagctgct gctaaagaag ctgctgccaa agaagctgcc 660
gctaaggaag ctgctgctaa agctctggaa gctgaagccg ctgctaagga agctgcagct 720
aaagaggctg ccgctaaaga agctgccgct aaagctatga aaacactgct gctggtggct 780
ttcgtgggat gcctggctgc tgtgtcagct gctccggcta acacagtgaa atggtgcctg 840
aaatcagaac aagaatacca gaaatgcctg gctctgaaag ctaaagctcc tgctttcgct 900
tgcgtgaaaa aagacaacac actggactgc atcatcgcta tcaaagctgg tgaagctgac 960
gctatcacac tggacggagg tgacatctac acagctggac tgaacaacta cgacctgcaa 1020
ccaatcatcg ctgaggacta cggaagcgct tctgacacat gctactacgc tgtggccgtg 1080
gtgaaaaaag gtactggttt cggaatcaaa gacttgcaag gaaaaaagac ctgccacaca 1140
ggtctgggaa aatctgctgg ttggaacatc cctgtgggta cactgttgag catgaacctg 1200
ctgcagtgga gcggtgtgga ggactctcct gttgaagaag ctgtggctaa ctacttccaa 1260
gcctcctgcg ctccaggagc tgctgctggt tcaaaactgt gccaattgtg caaaggtgac 1320
tgctcaagaa gccacaaaga accttactac gactacgacg gtgctttcca gtgcctggtg 1380
gaagatgctg gtcaagtggc tttcgtgaaa cacttgacag tcccggccgc tgaaaaagac 1440
aaatacgaac tgctgtgcaa agacaacaca agagcttcta tcgactctta caaaacatgc 1500
cacttggcta gagtgccagc tcacgctgtg gtgacaagaa aagacgaaca actggctgaa 1560
ctcatctgga cttcactgaa cagcgtgcaa ggcttcaacc tgttctcttc agaaggttac 1620
ccttctggta aaaacctgat gttcaaagac tcaactcaga gactggtgag agtgcctcca 1680
caaactgact ctttcttgta cctgggagct gaatacatgg gtatcatcag ctctttgaaa 1740
agagaacaaa caccagctgc tacaagctct gctatcaaat ggtgcgctgt gggacacgct 1800
gaaaccgcta aatgcgacac atggtccatc tctgctgtga ctgacgaagg tactgacatc 1860
gaatgccaaa acgctccaac agtcgacgac tgcctgaaga aaatcatgag aaaagaagct 1920
gacgctatgg ctgttgacgg cggacaagtg tacactgctg gaaaatgcgg tctggtgcca 1980
gtgatggtgg aacaatacga ccagggtctg tgcggtacat caggtgctgc tagctcttac 2040
tacgctgttg ctgtggtgaa aaaatcttcc ggactgactt gggaaactct gaaaggtaaa 2100
aaatcttgcc acactggttt cggtagaaca gctggttgga acatgccaat gggtcacatt 2160
cacacacaaa ctaacgactg cgacttcact aagttcttct cagctggatg cgctccgggt 2220
tctgacccga actcgccatt ctgcacacag tgcgctggtt caggaaaagc tgtgggtgac 2280
gaaagcaaat gcaaggcttc agctgacgaa cagtactacg gatacgctgg tgctttcaga 2340
tgcctggtgg aaggagctgg tgacgtggct ttcatcaaac acactatcgt gccggaaaac 2400
tctgacggta acggtcctag ctgggcttct gctgtgcacg ctgctgacta cgaactgatc 2460
tgccctggaa aaagccctgt gccaatcact gactacgctt catgcaacct gggagctgtg 2520
cctgctcacg ctgtggtgac aagacctaac ctgcactccg aagtggtgag aatcctgcaa 2580
gaccaacagt caaaattcgg tccgggtgga tctgactctt cattcgaact gttcaaatca 2640
gactccggca aaaacctgct gttcaaagac tcaactaaat gcctgcaaga aattcaagaa 2700
gctacatcat acgaccaatt cctgggaact gaatacatga acgctatgaa atctctgaga 2760
cagtgcaacg acaacacacc ggacctggaa aaatcatgca cattccacac atgccaacag 2820
aaaaacgatc tggagaaatc ttgcactttc cacacctgcc aacaaaaaaa ccaccaccac 2880
caccatcact aagggccc 2898
<210> 2
<211> 10232
<212> DNA
<213> 转基因质粒pXL-Red-PcGH-TF(Transgenic plasmid PXL-red-PCGH-TF)
<400> 2
ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60
attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120
gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180
caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240
ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300
cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360
agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420
cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480
caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540
gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600
taaaacgacg gccagtgagc gcgcctcgtt cattcacgtt tttgaacccg tggaggacgg 660
gcagactcgc ggtgcaaatg tgttttacag cgtgatggag cagatgaaga tgctcgacac 720
gctgcagaac acgcagctag attaacccta gaaagataat catattgtga cgtacgttaa 780
agataatcat gcgtaaaatt gacgcatgtg ttttatcggt ctgtatatcg aggtttattt 840
attaatttga atagatatta agttttatta tatttacact tacatactaa taataaattc 900
aacaaacaat ttatttatgt ttatttattt attaaaaaaa aacaaaaact caaaatttct 960
tctataaagt aacaaaactt ttatcgaatt cctgcagccc gggggatcct cttaattaac 1020
tcgcgttaag atacattgat gagtttggac aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat 1080
gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt aaccattata agctgcaata 1140
aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt ttatgtttca ggttcagggg gaggtgtggg 1200
aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca aatgtggtat ggctgattat gatcagttat 1260
ctagatccgg tggatcttac gggtcctcca ccttccgctt tttcttgggt cgagatctca 1320
ggaacaggtg gtggcggccc tcggtgcgct cgtactgctc cacgatggtg tagtcctcgt 1380
tgtgggaggt gatgcccagc ttggcgtcca cgtagtagta gccgggcagc tgcacgggct 1440
tcttggccat gtagatggac ttgaactcca ccaggtagtg gccgccgtcc ttcagcttca 1500
gggccttgtg ggtctcgccc ttcagcacgc cgtcgcgggg gtacaggcgc tcggtggagg 1560
cctcccagcc catggtcttc ttctgcatca cggggccgtc ggaggggaag ttcacgccga 1620
tgaacttcac cttgtagatg aagcagccgt cctgcaggga ggagtcctgg gtcacggtcg 1680
ccacgccgcc gtcctcgaag ttcatcacgc gctcccactt gaagccctcg gggaaggaca 1740
gcttcttgta gtcggggatg tcggcggggt gcttcacgta caccttggag ccgtactgga 1800
actgggggga caggatgtcc caggcgaagg gcagggggcc gcccttggtc accttcagct 1860
tcacggtgtt gtggccctcg taggggcggc cctcgccctc gccctcgatc tcgaactcgt 1920
ggccgttcac ggtgccctcc atgcgcacct tgaagcgcat gaactcggtg atgacgttct 1980
cggaggaggc catggtggcg accggtttgc gcttcttctt gggtggggtg ggatctccca 2040
tggtggcctg aatctcaact tgcacctgaa ggtagtgcag caaggatgag caaaagggaa 2100
gaacccagaa aagaacggga aaacttaccc caattagaat tgtcttgtcg ccgccagtgt 2160
caacttgcaa ctgaaacaat atccaacatg aacgtcaatt tatactgccc taatggcgaa 2220
cacgataaca atatttcttt tattatgccc tctaaaacca acgcggttat cgtttattta 2280
ttcaaattag atatagaaca tccgccgaca tacaatgtta atgcaaaaac gcgtttggtg 2340
agcggatacg aaaacagtcg gccgataaac attaatctga ggtcggtaac accgtccttg 2400
aacggaacac gaggagcgta cgtgatcagc tgcattcgcg cgccgcgcct ttatcgagat 2460
ttatttgcat acaacaagta cactgcgccg ttgggatttg tggtaacgcg cacacatgca 2520
gagctgcaag tgtggcacat tttgtctgtg cgcaaaacct ttgaagccaa aagtacgagg 2580
tccgttacgg gcatgctact agcgcacacg gacaatggac ccgacaaatt ctacgccaag 2640
gatttaatga taatgtcggg caacgtatcc gttcatttta tcaataacct acaaaaatgt 2700
cgcgcgcatc acaaagacat cgatatattt aacatttatg tccgactgca atcgatatag 2760
tgtgtgcact cgagcgtcgt tgatttacgt atagctgcaa atgaattatt taatatcaat 2820
catgttttac gcgtagaatt ctacccgtaa agcgagttta gttatgagcc atgtgcaaaa 2880
catgacatca gcttttattt ttataacaaa tgacatcatt tcttgattgt gttttacacg 2940
tagaattcta ctcgtaaagc gagttcagtt ttgaaaaaca aatgacatca tctttttgat 3000
tgtgctttac aagtagaatt ctacccgtaa atcaagttcg gttttgaaaa acaaatgagt 3060
catattgtat gatatcatat tgcaaaacaa atgactcatc aatcgatcgt gcgttacacg 3120
tagaattcta ctcgtaaagc gagtttatga gccgtgtgca aaacatgaca tcatctcgat 3180
ttgaaaaaca aatgacatca tccactgatc gtgcgttaca agtagaattc tactcgtaaa 3240
gccagttcgg ttatgagccg tgtgcaaaac atgacatcag cttatgactc atacttgatt 3300
gtgttttacg cgtagaattc tactcgtaaa gccagttcaa ttttaaaaac aaatgacatc 3360
atccaaatta ataaatgaca agcaatggga tccactagtt ctagagcggc cgccaccgcg 3420
gtggagctcc agcttttgtt ccctttagtg agggttaatt agatcttaat acgactcact 3480
atagggcgaa ttgggtacct catgatgata aacaatgtat ggtgctaatg ttgcttcaac 3540
aacaattctg ttgaactgtg ttttcatgtt tgccaacaag cacctttata ctcggtggcc 3600
tccccaccac caactttttt gcactgcaaa aaaacacgct tttgcacgca ggcccataca 3660
tagtacaaac tctacgtttc gtagactatt ttacataaat agtctacacc gttgtatacg 3720
ctccaaatac actaccacac attgaacctt tttgcagtgc aaaaaagtac gtgtcggcag 3780
tcacgtaggc cggccttatc gggtcgcgtc ctgtcacgta cgaatcacat tatcggaccg 3840
gacgagtgtt gtcttatcgt gacaggacgc cagcttcctg tgttgctaac cgcagccgga 3900
cgcaactcct tatcggaaca ggacgcgcct ccatatcagc cgcgcgttat ctcatgcgcg 3960
tgaccggaca cgaggcgccc gtcccgctta tcgcgcctat aaatacagcc cgcaacgatc 4020
tggtaaacac agttgaacag catctgttcg aagccaccat gaagtttttg gtgtttttct 4080
cgacctgcgt gctggcggcc agcgccgtcg acatgaacag agtgctgctg ctgctgtcag 4140
tgctgtcact gggtgtgagc tctcaacaaa tcactgaatc acaaagactg ttctcaatcg 4200
tggtgtctag agtgcaacac ctgcacctgc tggctcaaag actgttctca gacttcgaat 4260
catcactgca aacagaagaa caaagacaac tgaacaaaat cttcctgcaa gacttctgca 4320
actctgacta catcatctca cctatcgaca aacacgaaac acaaagatca tcagtgctga 4380
aactgctgtc aatctcatac agactggtgg aaagctggga attccctagc agatcactgt 4440
caggtggttc agctcctaga aaccaaatca gccctaaact gtcagaactg aaaacaggaa 4500
tcctgctgct gatcagagct aaccaagacg ctgctgaaat cttccctgac tcaagcgctc 4560
tgcaactggc tccttacggt aactactacc aatctctgtc tggtgaagaa agcctgagaa 4620
gaacatacga actgctggct tgcttcaaaa aagacatgca caaagtggaa acatacctga 4680
cagtggctaa atgcagactg tcacctgaag ctaactgcac actggcagaa gctgctgcta 4740
aagaagctgc tgccaaagaa gctgccgcta aggaagctgc tgctaaagct ctggaagctg 4800
aagccgctgc taaggaagct gcagctaaag aggctgccgc taaagaagct gccgctaaag 4860
ctatgaaaac actgctgctg gtggctttcg tgggatgcct ggctgctgtg tcagctgctc 4920
cggctaacac agtgaaatgg tgcctgaaat cagaacaaga ataccagaaa tgcctggctc 4980
tgaaagctaa agctcctgct ttcgcttgcg tgaaaaaaga caacacactg gactgcatca 5040
tcgctatcaa agctggtgaa gctgacgcta tcacactgga cggaggtgac atctacacag 5100
ctggactgaa caactacgac ctgcaaccaa tcatcgctga ggactacgga agcgcttctg 5160
acacatgcta ctacgctgtg gccgtggtga aaaaaggtac tggtttcgga atcaaagact 5220
tgcaaggaaa aaagacctgc cacacaggtc tgggaaaatc tgctggttgg aacatccctg 5280
tgggtacact gttgagcatg aacctgctgc agtggagcgg tgtggaggac tctcctgttg 5340
aagaagctgt ggctaactac ttccaagcct cctgcgctcc aggagctgct gctggttcaa 5400
aactgtgcca attgtgcaaa ggtgactgct caagaagcca caaagaacct tactacgact 5460
acgacggtgc tttccagtgc ctggtggaag atgctggtca agtggctttc gtgaaacact 5520
tgacagtccc ggccgctgaa aaagacaaat acgaactgct gtgcaaagac aacacaagag 5580
cttctatcga ctcttacaaa acatgccact tggctagagt gccagctcac gctgtggtga 5640
caagaaaaga cgaacaactg gctgaactca tctggacttc actgaacagc gtgcaaggct 5700
tcaacctgtt ctcttcagaa ggttaccctt ctggtaaaaa cctgatgttc aaagactcaa 5760
ctcagagact ggtgagagtg cctccacaaa ctgactcttt cttgtacctg ggagctgaat 5820
acatgggtat catcagctct ttgaaaagag aacaaacacc agctgctaca agctctgcta 5880
tcaaatggtg cgctgtggga cacgctgaaa ccgctaaatg cgacacatgg tccatctctg 5940
ctgtgactga cgaaggtact gacatcgaat gccaaaacgc tccaacagtc gacgactgcc 6000
tgaagaaaat catgagaaaa gaagctgacg ctatggctgt tgacggcgga caagtgtaca 6060
ctgctggaaa atgcggtctg gtgccagtga tggtggaaca atacgaccag ggtctgtgcg 6120
gtacatcagg tgctgctagc tcttactacg ctgttgctgt ggtgaaaaaa tcttccggac 6180
tgacttggga aactctgaaa ggtaaaaaat cttgccacac tggtttcggt agaacagctg 6240
gttggaacat gccaatgggt cacattcaca cacaaactaa cgactgcgac ttcactaagt 6300
tcttctcagc tggatgcgct ccgggttctg acccgaactc gccattctgc acacagtgcg 6360
ctggttcagg aaaagctgtg ggtgacgaaa gcaaatgcaa ggcttcagct gacgaacagt 6420
actacggata cgctggtgct ttcagatgcc tggtggaagg agctggtgac gtggctttca 6480
tcaaacacac tatcgtgccg gaaaactctg acggtaacgg tcctagctgg gcttctgctg 6540
tgcacgctgc tgactacgaa ctgatctgcc ctggaaaaag ccctgtgcca atcactgact 6600
acgcttcatg caacctggga gctgtgcctg ctcacgctgt ggtgacaaga cctaacctgc 6660
actccgaagt ggtgagaatc ctgcaagacc aacagtcaaa attcggtccg ggtggatctg 6720
actcttcatt cgaactgttc aaatcagact ccggcaaaaa cctgctgttc aaagactcaa 6780
ctaaatgcct gcaagaaatt caagaagcta catcatacga ccaattcctg ggaactgaat 6840
acatgaacgc tatgaaatct ctgagacagt gcaacgacaa cacaccggac ctggaaaaat 6900
catgcacatt ccacacatgc caacagaaaa acgatctgga gaaatcttgc actttccaca 6960
cctgccaaca aaaaaaccac caccaccacc atcactaagg gcccgatcca ccggatctag 7020
ataactgatc ataatcagcc ataccacatt tgtagaggtt ttacttgctt taaaaaacct 7080
cccacacctc cccctgaacc tgaaacataa aatgaatgca attgttgttg ttaacttgtt 7140
tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc 7200
atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttaacgcga 7260
gttaattaag aactagtaag cttgatatct ataacaagaa aatatatata taataagtta 7320
tcacgtaagt agaacatgaa ataacaatat aattatcgta tgagttaaat cttaaaagtc 7380
acgtaaaaga taatcatgcg tcattttgac tcacgcggtc gttatagttc aaaatcagtg 7440
acacttaccg cattgacaag cacgcctcac gggagctcca agcggcgact gagatgtcct 7500
aaatgcacag cgacggattc gcgctattta gaaagagaga gcaatatttc aagaatgcat 7560
gcgtcaattt tacgcagact atctttctag ggttaatcta gctgcatcag gatcatatcg 7620
tcgggtcttt tttccggctc agtcatcgcc caagctggcg ctatctgggc atcggggagg 7680
aagaagcccg tgccttttcc cgcgaggttg aagcggcatg gaaagagttt gccgaggatg 7740
actgctgctg cattgacgtt gagcgaaaac gcacgtttac catgatgatt cgggaaggtg 7800
tggccatgca cgcctttaac ggtgaactgt tcgttcaggc cacctgggat accagttcgt 7860
cgcggctttt ccggacacag ttccggatgg tcagcccgaa gcgcatcagc aacccgaaca 7920
ataccggcga cagccggaac tgccgtgccg gtgtgcagat taatgacagc ggtgcggcgc 7980
tgggatatta cgtcagcgag gacgggtatc ctggctggat gccgcagaaa tggacatgga 8040
taccccgtga gttacccggc gggcgcgctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt 8100
gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa 8160
agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc 8220
tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag 8280
aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 8340
cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 8400
atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 8460
taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 8520
aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 8580
tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 8640
gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 8700
cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 8760
cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 8820
atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 8880
tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat 8940
ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 9000
acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 9060
aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 9120
aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 9180
tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 9240
cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 9300
catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg 9360
ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat 9420
aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat 9480
ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg 9540
caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 9600
attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa 9660
agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc 9720
actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt 9780
ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag 9840
ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt 9900
gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag 9960
atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac 10020
cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc 10080
gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca 10140
gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg 10200
ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc ac 10232
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Primers F(引物F)
<400> 3
tcctgcaaga cttctgcaac 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Primers R(引物R)
<400> 4
agcaagccag cagttcgtat 20

Claims (8)

1.小黄鱼生长激素生物反应器家蚕品系的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）设计并合成小黄鱼生长激素与转铁蛋白融合基因，插入启动子、终止子和His标签，得到含有优化融合基因序列的pUC57-PcGH-TF质粒，该pUC57-PcGH-TF质粒的插入片段序列如SEQ ID No.1所示；
（2）将piggBAC载体pXL-Red与步骤（1）得到的pUC57-PcGH-TF质粒的插入片段体外重组，获得piggBAC转基因质粒pXL-Red-PcGH-TF，该转基因质粒pXL-Red-PcGH-TF的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
（3）将步骤（2）得到的piggBAC转基因质粒pXL-Red-PcGH-TF导入家蚕受精卵；
（4）饲养G0代家蚕，获得G1代蚕种；
（5）在G1代幼虫中，筛选标记基因阳性个体，并以F为正向引物和R为反向引物，采用PCR鉴定和测序鉴定小黄鱼生长激素与转铁蛋白融合基因插入家蚕基因中，所述正向引物F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，反向引物R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
（6）对G1代阳性个体，采用定性和定量检测验证小黄鱼生长激素的表达水平，筛选建立小黄鱼生长激素表达的生物反应器家系；
（7）对步骤（6）建立的生物反应器家系连续自交传代4代，鉴定小黄鱼生长激素与转铁蛋白融合基因在家蚕基因组中的遗传稳定性和表达稳定性；
（8）建立小黄鱼生长激素生物反应器家蚕品系：利用杂交、回交及人工饲料摄食性筛选的方法，将阳性家系基因组中的小黄鱼生长激素基因导入家蚕皓月品系中，建立生物反应器家蚕品系。
2.如权利要求1所述的小黄鱼生长激素生物反应器家蚕品系的构建方法，其特征在于所述步骤（1）中合成小黄鱼生长激素与转铁蛋白融合基因具体为：利用小黄鱼全基因组测序信息和小黄鱼转录组信息，通过同源检束方法，分别获得小黄鱼生长激素基因和转铁蛋白基因序列，设计小黄鱼生长激素和转铁蛋白融合基因，根据家蚕密码子偏好，优化并合成融合基因，并在融合基因前依次加上IE2启动子序列、Kozak序列和真核生物磷酸转运相关肽段的编码序列，融合基因后加上6×His标签编码序列及SV40序列，最后在外源基因表达盒的两端设置kpnⅠ和HindⅢ克隆位点，合成插入片段克隆到pUC57载体的Sma I Blunt位点，得到pUC57-PcGH-TF质粒。
3.如权利要求2所述的小黄鱼生长激素生物反应器家蚕品系的构建方法，其特征在于所述步骤（2）中piggBAC载体pXL-Red与融合基因体外重组具体为：采用分别以限制性内切酶kpnⅠ和HindⅢ切割piggBAC载体pXL-Red及pUC57-PcGH-TF质粒，电泳分离得到载体片段和目的基因表达框片段，连接并转化感受态细胞，挑斑，测序鉴定正确后，获得piggBAC转基因质粒pXL-Red-PcGH-TF。
4.如权利要求1所述的小黄鱼生长激素生物反应器家蚕品系的构建方法，其特征在于所述步骤（3）中转基因质粒pXL-Red-PcGH-TF导入家蚕受精卵具体为：以非滞育家蚕品系Nistari的新产受精卵为受体，将步骤（2）得到的piggBAC转基因质粒pXL-Red-PcGH-TF稀释至400ng/ul，以显微注射方式导入15nl至家蚕受精卵中，在温度25℃，湿度80%的条件下催青至孵化。
5.如权利要求1所述的小黄鱼生长激素生物反应器家蚕品系的构建方法，其特征在于所述步骤（4）中获得G1代蚕种具体为：蚕卵孵化后，按家蚕饲养程序饲养，上蔟结茧后，蛹期保护，羽化后自交制种获得G1代。
6.如权利要求1所述的小黄鱼生长激素生物反应器家蚕品系的构建方法，其特征在于所述步骤（5）的具体为：将步骤（4）得到的G1代蚕种在温度25℃，湿度80%条件下催青至孵化，收蚁，饲养至2龄，荧光解剖镜下筛选红色荧光个体，饲养至上蔟结茧，羽化后制种，提取红色荧光阳性蛾体的基因组DNA，设计小黄鱼生长激素基因特异性引物，对DNA进行PCR鉴定和测序鉴定。
7.如权利要求1所述的小黄鱼生长激素生物反应器家蚕品系的构建方法，其特征在于所述步骤（6）中定性和定量检测的具体为：以小鼠抗鲤鱼生长激素单克隆抗体进行WB检测，定性筛选表达外源蛋白的个体，并通过ELISA定量检测，筛选建立小黄鱼生长激素表达的生物反应器家系。
8.如权利要求1所述的小黄鱼生长激素生物反应器家蚕品系的构建方法，其特征在于所述步骤（7）的具体为：对4代中每代筛选红色荧光个体饲养至上蔟结茧，制种后，取样基因组DNA及总蛋白，采用PCR检测外源基因情况，及WB检测样品中小黄鱼生长激素的表达情况，明确插入的外源基因的遗传稳定性和表达稳定性。
CN202010915249.0A 2020-09-03 2020-09-03 小黄鱼生长激素生物反应器家蚕品系的构建方法 Active CN112159819B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010915249.0A CN112159819B (zh) 2020-09-03 2020-09-03 小黄鱼生长激素生物反应器家蚕品系的构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010915249.0A CN112159819B (zh) 2020-09-03 2020-09-03 小黄鱼生长激素生物反应器家蚕品系的构建方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112159819A CN112159819A (zh) 2021-01-01
CN112159819B true CN112159819B (zh) 2022-03-18

Family

ID=73858626

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010915249.0A Active CN112159819B (zh) 2020-09-03 2020-09-03 小黄鱼生长激素生物反应器家蚕品系的构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112159819B (zh)

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1362520A (zh) * 2001-01-02 2002-08-07 成都天友发展有限公司 蜘蛛拖牵丝蛋白基因在转基因家蚕中时空表达系统的构建方法
WO2003074699A1 (fr) * 2002-03-06 2003-09-12 Toray Industries, Inc. Procede de production de proteine physiologiquement active utilisant un ver a soie genetiquement modifie
JP4798428B2 (ja) * 2005-07-26 2011-10-19 日東紡績株式会社 外来酵素蛋白質の製造法、それに用いる遺伝子組換えカイコおよびその製造法
CN102559691B (zh) * 2011-12-31 2013-08-28 浙江省农业科学院 家蚕性染色体连锁基因PdpⅠ及其隐性致死突变基因和它们在家蚕性比控制中的应用
KR101380742B1 (ko) * 2012-03-27 2014-04-10 알카진(주) 능성어 양식에서 사료첨가제로 사용하기 위한 능성어 성장호르몬을 발현하는 형질전환 누에 및 그 제조방법과 벡터
CN102993309B (zh) * 2012-10-18 2014-12-03 武汉大学 一种人生长素融合蛋白TAT-hGH及其制备方法和应用
CN107384967B (zh) * 2017-03-30 2020-10-13 浙江省农业科学院 一种将外源基因定点插入到家蚕w染色体中的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN112159819A (zh) 2021-01-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112921054B (zh) 一种用于治疗β-地中海贫血的慢病毒载体及其制备方法和应用
CN104593413A (zh) 利用家蚕后部丝腺合成分泌人血清白蛋白的方法
CN107384967B (zh) 一种将外源基因定点插入到家蚕w染色体中的方法
CN105368732B (zh) 一株产木糖醇的工业酿酒酵母菌株及构建方法
CN104962576B (zh) 一种柱状黄杆菌基因定向敲除质粒及应用
CN112159819B (zh) 小黄鱼生长激素生物反应器家蚕品系的构建方法
CN107267538B (zh) 一种植物质体表达载体的构建方法及应用
CN109234318B (zh) 一种提高红曲霉菌胞外色素的方法
CN114540355A (zh) Hhex软骨组织特异性敲除小鼠动物模型及其构建方法
CN112266914A (zh) 一种熊蜂生假丝酵母强组成型启动子及其应用
US6503712B1 (en) Methods and compositions for preparing a genomic library for knockout targeting vectors
CN107849515A (zh) 转基因微藻及其作为用于递送干扰rna分子的饲料的用途
CN110452893B (zh) 一种高保真CRISPR/AsCpf1突变体的构建及其应用
CN114343086A (zh) 一种小黄鱼促生长饲料添加剂的制备、饲料添加和应用方法
CN113151276A (zh) 一种il-4基因缺失斑马鱼
CN113755442B (zh) 一种用于药物活性测定的细胞株及其制备方法与应用
CN108949800B (zh) 一种高效便利定位基因插入座位的丝状真菌遗传转化系统及其应用
CN109777829A (zh) 一种基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法
CN100351394C (zh) 人呼吸道合胞病毒荧光定量pcr试剂盒及其检测方法
KR102624832B1 (ko) 근육 특이적 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체 델타(PPARδ) 과발현 형질전환 개 생산
KR102553935B1 (ko) 단백질을 발현하는 세포의 배양 방법
CN112760241B (zh) 一株重组产黄青霉基因工程菌及其构建方法与应用
CN110862443A (zh) 一种调控小麦面粉面筋质量的1Dx2Rp113蛋白及其编码基因与应用
CN114317529B (zh) 一种寡核苷酸链随机拼合方法
CN102649961B (zh) 一种乙肝病毒核心抗原的核酸适配体序列及用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant