CN112760241B - 一株重组产黄青霉基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株重组产黄青霉基因工程菌及其构建方法与应用，所述重组产黄青霉基因工程菌由原始产黄青霉菌中StuA基因被Bleo抗性基因替代所得。本发明所提供的基因工程菌使产黄青霉在固定化发酵生产青霉素过程中生物膜量OD570增多了约2.5倍，使菌丝更好的吸附结合在塑料介质上；提高了菌种的抗逆性，使发酵过程中菌种形态更稳定；提高了青霉素的效价达到2126.775U/mL，同时缩短了整个发酵周期约24h，从而提高了发酵效率并减少了生产成本，有效解决了现有技术中产黄青霉发酵生产青霉素菌种形态不稳定，发酵周期长且持续性差，导致发酵效率低且成本高的问题。

Description

一株重组产黄青霉基因工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株重组产黄青霉基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

青霉素分子中含有6-氨基青霉烷酸(6APA)并作用于处于繁殖期的细菌细胞壁，作为β-内酰胺类抗生素的一种，自1929年被发现至今仍然在医疗健康领域发挥着极其重要的作用。青霉素有天然青霉素与半合成青霉素之分，二者生产方法截然不同。天然青霉素是通过菌种发酵然后进行提取精制获得，而半合成青霉素则是以微生物产生的青霉素裂解而成的中间体与有机酸进行酰化反应制得的。

工业化生产青霉素距今已有六十多年历史，随着菌种的改良与发酵工艺的改进，目前青霉素的产率相比原始产黄青霉菌提高了很多，并且成本大幅降低。但传统青霉素的工业化生产方法在发酵后期，菌体形态发生变化、代谢物阻遏效应严重还可能产生菌体自溶现象，严重影响了整体发酵的经济效益。针对这种状况，本发明采用基于生物膜的固定化方法，实现丝状真菌的固定化发酵。

生物膜是被自分泌胞外基质包裹的有形态群体，附着于有生命或无生命的物体表面。生物膜主要由脂质、蛋白质、糖类与eDNA、金属离子和水组成。目前对真菌生物膜的研究主要集中在解决真菌产生生物膜引起的炎症与其在医用设施上形成生物膜造成的损失等方面，很少有研究将生物膜机制引入真菌的工业化发酵中来。生物膜形成后，菌落显示出由信号分子介导的集群效应，使细胞自增殖、自修复和抗衰老的能力增强，从而使的生命周期得到延长，抗逆性增强，使实现高效且稳定的固定化工业生产成为可能。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株重组产黄青霉基因工程菌。

本发明还要解决的技术问题是提供上述重组产黄青霉基因工程菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述重组产黄青霉基因工程菌的应用。

发明思路：StuA基因通过调控真菌的营养生长、孢子形成和次生代谢过程，影响生物膜糖类的主要组成成分-乳糖氨基半乳糖(GAG)的合成与菌种的毒力。研究已证明生物膜的形成与GAG的合成与菌种毒力密切相关。通过实验，本发明中StuA基因能够调控生物膜的生成，影响发酵的固定化程度、发酵周期以及菌种抗逆性等，因而可以在固定化发酵青霉素的工业生产上得到应用。

为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一株重组产黄青霉基因工程菌，由原始产黄青霉菌中StuA基因被Bleo抗性基因替代所得。

其中，所述原始产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)为ATCC48271。

其中，所述StuA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

其中，所述StuA基因被bleo抗性基因替代后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了上述重组产黄青霉基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)制备原始产黄青霉菌的原生质体；

(2)提取原始产黄青霉菌的基因组DNA；

(3)构建基因敲除片段；

(4)同源重组，将步骤(3)构建的基因敲除片段导入步骤(1)制备的产黄青霉的原生质体中，得到重组产黄青霉基因工程菌。

步骤(1)中，所述制备产黄青霉菌的原生质体，包括如下步骤：

(1a)将产黄青霉菌株涂布接种到PDA平板(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)，待长满孢子后，滴加2mL刮孢缓冲液到平板中，用涂布棒将孢子刮下，转移至灭菌过的2mL离心管中，再用1mL刮孢子缓冲液清洗，然后转移至灭菌过的2mL离心管中；

(1b)接种400μL孢子液到100mL YEPD培养基(酵母浸出粉胨葡萄糖培养基)，在25℃，转速为220rpm条件下培养11.5h；

(1c)孢子萌发完毕后，用灭菌后的滤布过滤菌丝，配制酶解液(裂解酶，Lysingenzyme，蜗牛酶，各0.05g/mL，葡聚糖酶1.5μL/mL，纤维素酶10μL/mL)，在超声下充分溶解并用滤膜过滤除菌；

(1d)取1.5g左右菌丝于除菌酶液中，在25℃，转速220rpm的条件下酶解30min；后将转速降低至180rpm再培养2.5-3.5h；

(1e)30min后，将培养液于4℃，5000rpm离心10min，去上清液，加入1mL 1M山梨醇(冰水浴)，用枪吹吸混匀使原生质体悬浮，再加入15mL山梨醇，离心，去上清。然后再重复一次。去上清液，加入350μL Solution5，用枪吹吸混匀使原生质体悬浮。

步骤(3)中，所述基因敲除所需的片段的构建方法，包括如下步骤：

(3a)以步骤(2)得到的产黄青霉基因组DNA为模板，设计并以SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示的核苷酸序列为引物，扩增出StuA基因的上游同源臂，其核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；

(3b)以步骤(2)得到的产黄青霉基因组DNA为模板，设计并以SEQ ID NO.6和SEQID NO.7所示的核苷酸序列为引物，扩增出StuA基因的下游同源臂，其核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示；

(3c)以质粒pan8-1为模板，以SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列为引物，扩增出Bleo抗性表达元件；其中，质粒pan8-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；扩增得到的Bleo抗性表达元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

(3d)以StuA基因的上游同源臂、StuA基因的下游同源臂、Bleo抗性表达元件为模板，以SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列为引物，通过重叠延伸(overlap)PCR技术扩增得到基因敲除片段；扩增得到的基因敲除片段的核苷酸序列(即StuA基因的序列被bleo抗性基因替代，并且设计引物后转化导入菌中所用的核苷酸序列)如SEQ IDNO.15所示；其中，SEQ ID NO.15中包括了上、下游同源臂的部分序列。

步骤(4)中，所述将步骤(3)构建的基因敲除的片段导入步骤(1)制备的原生质体中进行同源重组的具体方法，包括如下步骤：

(4a)吸取100μL的原生质体到1.5mL灭菌离心管中，加入10μL步骤(2)中构建的基因敲除片段，并混匀。再加入50μL的Solution 4(PEG2000 0.2％，CaCl₂ 0.05％，KCl0.04％)，混匀，置于冰上并计时30min；

(4b)30min后，加入900μL Solution4于上述离心管，上下颠倒混匀，放置在室温并计时30min。30min后，5000rpm离心5min，弃400μL上清液，剩余菌体涂布于蔗糖浓度为1mol/L，腐草霉素浓度为35mmol/L的PDA培养基中，正置培养，得到转化子；

(4c)菌落PCR验证转化子。其具体方法如下：挑取适量转化子加入50μL的菌落PCR缓冲液(100mM/L Tris-Hcl、10mM/L EDTA、1M/L KCl)，95℃水浴10min后，取0.5μL加入PCR反应体系。PCR引物为Bleo-F和Bleo-R(如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示)，若琼脂糖电泳显示扩增条带，则表示转化成功。

为了解决上述第三个技术问题，本发明公开了上述重组产黄青霉基因工程菌在产青霉素中的应用。

其中，所述应用为以重组产黄青霉基因工程菌为发酵菌株，通过固定化发酵产青霉素。

其中，所述的固定化发酵是以塑料作为固定化介质，发酵制备青霉素；其中，所述的塑料为聚甲基丙烯酸甲酯，用量为15g/L。

其中，所述固定化发酵的发酵培养基中乳糖与磷酸二氢钾的质量比为3：1。

优选地，所述固定化发酵的发酵培养基中各组分的质量百分比为：黄豆饼粉4.8％、碳酸钙1.5％、乳糖3％、磷酸二氢钾1％、硫酸铵0.65％、硫酸钠0.2％、色拉油0.03％、苯乙酸2.5％，溶剂为水，pH＝5.8。

其中，所述的固定化发酵的条件为：发酵温度为25～30℃，发酵时间为72～144h，转速为180～220rpm。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有的优势如下：

本发明所提供的基因工程菌使产黄青霉在固定化发酵生产青霉素过程中生物膜量OD570增多了约2.5倍，使菌丝更好的吸附结合在塑料介质上；提高了菌种的抗逆性，使发酵过程中菌种形态更稳定；提高了青霉素的效价达到2126.775U/mL，同时缩短了整个发酵周期约24h，从而提高了发酵效率并减少了生产成本，有效解决了现有技术中产黄青霉发酵生产青霉素菌种形态不稳定，发酵周期长且持续性差，导致发酵效率低且成本高的问题。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1为原始产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)ATCC48271基因组的电泳图。

图2为pan8-1质粒图谱。

图3为StuA基因上、下游同源臂的PCR电泳图。

图4为基因敲除片段(长度为6548bp)的电泳图，其中Marker为DL10000的DNAMarker。

图5为原始产黄青霉和重组产黄青霉基因工程菌在不同孢子浓度下生物膜结晶紫染色图。

图6为原始产黄青霉和重组产黄青霉基因工程菌在不同孢子浓度下生物膜结晶紫染色OD570值对比图。

图7为孢子液接种到加入刚果红与钙荧光白的平板中培养结果。

图8为原始产黄青霉在不同乳糖含量的发酵培养基中的发酵产物青霉素效价对比图。

图9为原始产黄青霉在不同成分比列的发酵培养基中的发酵产物青霉素效价对比图。

图10为原始产黄青霉和重组产黄青霉基因工程菌第一批次的发酵产物青霉素效价对比图。

图11为原始产黄青霉和重组产黄青霉基因工程菌不同批次下发酵产物青霉素的效价对比图。

图12为产黄青霉菌株的生物膜电镜图(TM3000)。

图13为ΔStuA的生物膜电镜图(TM3000)。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本实施例中质粒(pan8-1)购买于厂家：淼灵质粒平台(货号：P0990)。

基因序列比对均来自：Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-1255。

实施例1：ΔStuA基因工程菌(重组产黄青霉基因工程菌)的构建

(一)提取原始产黄青霉菌(ATCC48271)基因组

使用Vazyme公司提取植物基因组的试剂盒(FastPure plant DNA IsolationMini kit)，具体方法如下：

1、菌种活化：将原始产黄青霉菌在PDA平板上涂布培养，孢子长满后，用刮孢子缓冲液轻轻刮下，制成孢子液(血球计数板计数10⁸/mL)。

2、取孢子液400μL接种于100mLYEPD培养基中，25℃，220rpm培养11.5h。

3、用灭菌滤布过滤培养液，收集菌丝体，5000r/min离心5min，用PBS缓冲液洗涤两次后，将收集的菌丝体用液氮冷冻然后充分研磨，至少3次，称取0.1g研磨好的粉末加入1.5mL离心管中，立即向离心管中加入400μL的Buffer A1和4μL的RNase A(10μL/mL)，充分振荡混匀。

4、将离心管置于65℃水浴锅中水浴加热10min，水浴过程中上下颠倒2-3次以混匀。

5、加入130μL的Buffer A2至离心管中，充分混匀，冰上放置5min，14000rmp离心5min，吸取上清至另外一个1.5mL的离心管中。

6、计算上清液的量，加入1.5倍上清液体积的Buffer A3，吹吸混匀。

7、将第6步所得的混合物转移至FastPure gDNA Cloumns IV(已放置吸附柱)，分多次12000rmp离心1min，弃滤液。

8、加入650μL的Buffer AW(按说明书加入乙醇)，12000rmp离心1min，弃滤液，重复一次。

9、将吸附柱放入新的收集管，12000rmp离心2min，弃滤液，空离后室温放置5min。

10、将吸附柱放入新的1.5mL离心管，加入35μL提前预热至65℃的ddH₂O，室温放置5min，12000rmp离心2min。

11、弃吸附柱，离心管内DNA于-20℃冰箱保存待用。通过琼脂糖凝胶电泳测定产黄青霉基因组浓度如图1所示。图1中，泳道1为DL15000的DNA marker，泳道2-6为提取的产黄青霉原始菌的基因组。

(二)运用PCR技术扩增StuA基因上、下游同源臂。

表1 PCR反应体系

以原始产黄青霉基因组为模板，以StuA-up-F为上游同源臂正向引物(如SEQ IDNO.3所示)，以StuA-up-R为上游同源臂反向引物(如SEQ ID NO.4所示)扩增上游同源臂(如SEQ ID NO.5所示)；以SEQ ID NO.6为下同源臂正向引物，以SEQ ID NO.7为下同源臂反向引物扩增下游同源臂(如SEQ ID NO.8所示)。反应体系见表1，具体反应条件：98℃变性10s，55～65℃退火30s，68℃延伸2min，上述步骤重复35次。反应完成后的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳定量，结果如图3所示。图3中，泳道1为DL5000的DNA Marker，泳道2-3为StuA的上游同源臂，泳道6-7为StuA的下游同源臂。

(三)扩增Bleo抗性表达元件

以pan8-1质粒(pan8-1质粒图谱见图2，核苷酸序列见SEQ ID NO.11)为模板，以StuA-Bleo-F为正向引物(如SEQ ID NO.9所示)，以StuA-Bleo-R为反向引物(如SEQ IDNO.10所示)扩增Bleo抗性表达元件(如SEQ ID NO.12所示)。反应体系见表1，反应条件：98℃变性10s，55～65℃退火30s，68℃延伸3min，上述步骤重复35次。反应完成后的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳定量，结果如图3所示，泳道4-5为Bleo抗性表达元件，其中Bleo抗性表达元件的核苷酸序列见SEQ ID NO.12。

(四)扩增基因敲除片段

以StuA上、下游同源臂及Bleo抗性表达元件为模板，以StuA-F为正向引物(如SEQID NO.13所示)，以StuA-R为反向引物(如SEQ ID NO.14所示)，利用Overlap PCR技术扩增StuA基因敲除片段。反应体系见表1，反应条件：98℃变性10s，5-65℃退火30s，68℃延伸7min，上述步骤重复35次。反应完成后的PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳定量，结果如图4所示。图4中，泳道5为DL15000的DNA marker，泳道1-4为基因敲除片段。其中敲除片段的核苷酸序列见SEQ ID NO.15。

(五)产黄青霉原生质体的制备及转化

1、将产黄青霉菌株涂布接种到PDA平板(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)，待长满孢子后，滴加2mL刮孢缓冲液到平板中，用涂布棒将孢子刮下，转移至灭菌过的2mL离心管中，再用1mL刮孢子缓冲液清洗，然后转移至灭菌过的2mL离心管中。

2、接种400μL孢子液到100mL YEPD培养基，在25℃，转速为220rpm条件下培养11.5h。

3、孢子萌发完毕后，用灭菌后的滤布过滤菌丝。配制酶解液(裂解酶，Lysingenzyme，蜗牛酶，各0.05g/mL，葡聚糖酶1.5μL/mL，纤维素酶10μL/mL)，在超声下充分溶解并用滤膜过滤除菌。

4、取1.5g左右菌丝于除菌酶液中，在25℃，转速220rpm的条件下酶解30min；后将转速降低至180rpm再培养2.5-3.5h。

5、30min后，将培养液于4℃，5000rpm离心10min，去上清液，加入1mL 1M山梨醇(冰水浴)，用枪吹吸混匀使原生质体悬浮，再加入15mL山梨醇，离心，去上清。然后再重复一次。去上清液，加入350μL Solution5，用枪吹吸混匀使原生质体悬浮。

6、吸取100μL的原生质体到1.5mL灭菌离心管中，加入10μL步骤(2)中构建的基因敲除片段，并混匀。再加入50μL的Solution 4(PEG2000 0.2％，CaCl₂ 0.05％，KCl0.04％)，混匀，置于冰上并计时30min。

7、30min后，加入900μL Solution4于上述离心管，上下颠倒混匀，放置在室温并计时30min。30min后，5000rpm离心5min，弃400μL上清液，剩余菌体涂布于蔗糖浓度为1mol/L，腐草霉素浓度为35mmol/L的PDA培养基中，正置培养，得到转化子。

8、菌落PCR验证转化子。其具体方法如下：挑取适量转化子加入50μL的菌落PCR缓冲液(100mM/L Tris-Hcl、10mM/L EDTA、1M/L KCl)，95℃水浴10min后，取0.5μL加入PCR反应体系。PCR引物为Bleo-F和Bleo-R(如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示)，若琼脂糖电泳显示扩增条带，则表示转化成功。

实施例2：结晶紫染色实验

将原始产黄青霉菌和ΔStuA基因工程菌分别涂布接种到PDA平板，待长满孢子后，加2mL刮孢缓冲液到平板中，用涂布棒将孢子刮下，再用1mL刮孢子液清洗后转移至已灭菌的5mL离心管中，并用刮孢缓冲液定容到2mL，从而得到孢子液。用血球计数板将孢子液稀释并定量至约10⁵个/mL，然后根据实验需要将孢子液按梯度稀释至10⁵、10⁴、10³、10²。

在24孔板中预先加入1mL合成培养基，然后取5μL不同浓度梯度的孢子液接种到培养基中。35℃下静置培养72h，使原始产黄青霉，以及ΔStuA基因工程菌在孔板底部成膜；然后倒掉培养基，用PBS缓冲液冲洗2遍后，加入浓度为0.1％的结晶紫染色15min；然后倒掉结晶紫，用PBS缓冲液冲洗2遍，再加入冰醋酸，然后在震荡仪中放置30min，震荡使结晶紫脱色；然后进行观察并用酶标仪检测OD570值。原始产黄青霉菌和基因工程菌的结晶紫染色对比图见图5，两菌株OD570的差异对比图见图6。

表2不同孢子浓度下生物膜结晶紫染色实验的OD值

菌株/个/mL	10<sup>5</sup>	10<sup>4</sup>	10<sup>3</sup>	10<sup>2</sup>
					原始产黄青霉菌	0.32	0.26	0.25	0.18
ΔStuA基因工程菌	2.72	1.66	1.08	0.73

图5和图6结果显示，ΔStuA基因工程菌的生物膜经过结晶紫染色再脱色后，染上的紫色明显比原始产黄青霉菌要更深，在浓度为10²个/mL时ΔStuA基因工程菌的颜色已经逐渐加深，与用酶标仪检测的OD570值相对照，数据结果与颜色相符。表明StuA基因敲除后，生物膜增多。

实施例3：细胞壁抗逆性实验

在PDA培养基中分别加入刚果红(CR)与钙荧光白(CFW)，然后制成平板，CR的加入量为500μg/mL，CFW的加入量为100μg/mL。

将原始产黄青霉菌和ΔStuA基因工程菌分别涂布接种到PDA平板，待长满孢子后，加2mL刮孢缓冲液到平板中，用涂布棒将孢子刮下，再用1mL刮孢子液清洗后转移至已灭菌的5mL离心管中，并用刮孢缓冲液定容到2mL，从而得到孢子液。用血球计数板将孢子液稀释并定量至约10⁵个/mL，然后根据实验需要将孢子液按梯度稀释至10⁵、10⁴、10³、10²。

各取一滴不同浓度梯度的孢子液接种到加入刚果红与钙荧光白的平板中，35℃下静置培养72h，得到的结果如图7所示。结果显示，ΔStuA基因工程菌在加入了刚果红与钙荧光白两种指示剂的培养基上的生长情况比原始产黄青霉菌要好，由于刚果红为葡聚糖合成酶抑制剂，钙荧光白为几丁质合成酶抑制剂，二者均影响细胞壁的合成，表明StuA基因敲除后，菌种的抗逆性明显增强。

实施例4：固定化发酵实验

1、塑料介质作为固定化介质的制备

(1)将塑料介质-聚甲基丙烯酸甲酯在去离子水中清洗4min左右，再将清洗后的塑料介质再在丙酮中抽提24h，去除表面油污和杂质，于烘箱45℃烘30min。

(2)将(1)经过处理的塑料介质置于SDCD16-3-20型电晕处理设备上进行电流强度为8A的电晕处理，处理时间为15min，4℃冰箱备用。

2.发酵培养基的配置

固定化发酵培养基的成分：黄豆饼粉4.8％、碳酸钙1.5％、乳糖3％、磷酸二氢钾1％、硫酸铵0.65％、硫酸钠0.2％、色拉油0.03％、苯乙酸2.5％，溶剂为水，pH＝5.8。

3、发酵步骤如下：

(1)于-80℃冰箱取出冷冻保藏的原始产黄青霉甘油菌、ΔStuA基因工程菌和ΔPc-somA菌株(根据专利CN110804559A制备而得)在PDA平板上划线活化，在25℃培养3天。

(2)3天后，待孢子成熟，用刮孢子液(0.9％NaCl+吐温80)将孢子收集，接种于500mL摇瓶中，其中装液量为100mL，于27℃，220rmp摇床培养72-168h，测定发酵液中的苯乙酸浓度低于0.01％，结束一批发酵，然后移出发酵液。反复进行批次发酵6次。

图10显示的是在同一发酵条件下，原始产黄青霉菌，ΔStuA基因工程菌以及ΔPc-somA菌株第一批次发酵结果的差异。发酵132h时，原始产黄青霉菌发酵产青霉素的效价最高为1687.102U/mL；发酵108h时，ΔStuA基因工程菌发酵产青霉素的效价最高为2126.775U/mL，ΔPc-somA菌株发酵产青霉素的效价最高为1982.88U/mL，ΔStuA基因工程菌青霉素效价与原始产黄青霉菌相比提高26.06％，发酵周期与游离发酵相比缩短约24h，ΔStuA基因工程菌青霉素效价与ΔPc-somA菌株相比提高7.26％。

图11显示的是在相同条件下，原始产黄青霉菌，ΔStuA基因工程菌以及ΔPc-somA菌株六批次反复发酵的结果。从原始产黄青霉菌，ΔStuA基因工程菌与ΔPc-somA菌株发酵产物青霉素的效价达到最高值后继续发酵得到产物的数据走向看，ΔStuA基因工程菌的发酵在后期具有更加稳定的特点。

本发明选取的产黄青霉原始产黄青霉菌是一株相对高产青霉素菌株，在此基础上，ΔStuA基因工程菌发酵产青霉素的效价有所提高，在连续发酵的中后期更具有稳定性，与其他菌株相比更具有优势，因而更加适合用于工业化发酵生产青霉素。

对比例1：

1、固定化介质的制备同实施例4。

2、配制发酵培养基时，改变乳糖的加入量，从3％增加到4.5％。

即固定化发酵培养基的成分：黄豆饼粉4.8％、碳酸钙1.5％、乳糖4.5％、磷酸二氢钾1％、硫酸铵0.65％、硫酸钠0.2％、色拉油0.03％、苯乙酸2.5％，溶剂为水，pH＝5.8。

3、发酵步骤同实施例4。

对比例2：

1、固定化介质的制备同实施例4。

2、配制发酵培养基时，改变乳糖的加入量，从3％减少到1.5％。

即固定化发酵培养基的成分：黄豆饼粉4.8％、碳酸钙1.5％、乳糖1.5％、磷酸二氢钾1％、硫酸铵0.65％、硫酸钠0.2％、色拉油0.03％、苯乙酸2.5％，溶剂为水，pH＝5.8。

3、发酵步骤同实施例4。

图8显示的是进行固定化发酵实验时，在固定化介质、发酵步骤等条件相同的情况下，发酵培养基中乳糖含量的改变对发酵结果的影响。从图中可以看出，在乳糖的加入量为3％时，发酵中后期的青霉素效价均高于另外三种配比，具有绝对优势，因此在之后实验中，配置发酵培养基时选用乳糖的加入量为3％。

对比例3：

1、固定化介质的制备同实施例4。

2、配制发酵培养基时，乳糖与磷酸二氢钾按4：1的比例加入，乳糖的量与实施例4相同，磷酸二氢钾的量从1％减少到0.75％。

即固定化发酵培养基的成分：黄豆饼粉4.8％、碳酸钙1.5％、乳糖3％、磷酸二氢钾1％、硫酸铵0.65％、硫酸钠0.2％、色拉油0.03％、苯乙酸2.5％，溶剂为水，pH＝5.8。

3、发酵步骤同实施例4。

对比例4：

1、固定化介质的制备同实施例4。

2、配制发酵培养基时，乳糖与磷酸二氢钾按5：1的比例加入，乳糖的量与实施例4相同，磷酸二氢钾的量从1％减少到0.6％。

即固定化发酵培养基的成分：黄豆饼粉4.8％、碳酸钙1.5％、乳糖3％、磷酸二氢钾0.6％、硫酸铵0.65％、硫酸钠0.2％、色拉油0.03％、苯乙酸2.5％，溶剂为水，pH＝5.8。

3、发酵步骤同实施例4。

对比例5：

1、固定化介质的制备同实施例4。

2、配制发酵培养基时，乳糖与磷酸二氢钾按6：1的比例加入，乳糖的量与实施例4相同，磷酸二氢钾的量从1％减少到0.5％。

即固定化发酵培养基的成分：黄豆饼粉4.8％、碳酸钙1.5％、乳糖3％、磷酸二氢钾0.5％、硫酸铵0.65％、硫酸钠0.2％、色拉油0.03％、苯乙酸2.5％，溶剂为水，pH＝5.8。

3、发酵步骤同实施例4。

对比例6：

1、固定化介质的制备同实施例4。

2、配制发酵培养基时，乳糖与磷酸二氢钾按2：1的比例加入，乳糖的量与实施例4相同，磷酸二氢钾的量从1％增加到1.5％。

即固定化发酵培养基的成分：黄豆饼粉4.8％、碳酸钙1.5％、乳糖3％、磷酸二氢钾1.5％、硫酸铵0.65％、硫酸钠0.2％、色拉油0.03％、苯乙酸2.5％，溶剂为水，pH＝5.8。

3、发酵步骤同实施例4。

图9显示的是，进行固定化发酵实验时，在固定化介质、发酵步骤等条件相同的情况下，发酵培养基中乳糖与磷酸二氢钾比例的改变对发酵结果的影响。从图中我们可以看出，在乳糖与磷酸二氢钾的比例为3：1时，发酵中后期的青霉素效价均高于另外三种配比，具有绝对优势，因此我们在配置发酵培养基时，选用乳糖含量3％，磷酸二氢钾含量1％的比例。

实施例5：观察生物膜在SEM电镜下的成像

固定化发酵108h后，将载体从发酵液中取出，用PBS缓冲液轻柔冲洗3遍，冲洗掉吸附在载体周围但没有成膜的菌丝。置于-80℃冰箱过夜使其冷冻，然后置于冻干机中进行冻干处理。再用导电胶将冻干后的载体粘在点镜台上，20mA 30s进行喷金操作。然后在TM3000中观察，生物膜电镜图见图12和图13。图12表示的是原始产黄青霉菌在载体上的成膜情况，图13表示ΔStuA基因工程菌在载体上的成膜情况。将SEM电镜图与结晶紫染色实验中的孔板图相对照，不难得出结论，原始产黄青霉菌在固定化载体上的生物膜很少，而ΔStuA基因工程菌在发酵过程中，在载体的内部连接处与外部孔隙形成了较多的生物膜，目前有研究发现生物膜可以作为一种固定化的催化剂，而有利于固定化发酵，在此实验中我们同样发现，生物膜的形成使青霉素的效价有所提高并且缩短了发酵周期，因而生物膜的形成是有利于固定化发酵生产青霉素的。

本发明提供了一株重组产黄青霉基因工程菌及其构建方法与应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一株重组产黄青霉基因工程菌及其构建方法与应用

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2837

<212> DNA

<213> StuA

<400> 1

atgtgttcga cgattgttaa tgatcttgat gactattgtg cttctctgaa ttcgtctttt 60

tcaaaaagtc tttattgcgc ttctgtctag gccttccgag tctttacaaa aggtttacga 120

cttactacga agcttcacta cgatattgca cgccccctgc attgcctgca tcttgcatca 180

cttgctatat acatattttt ttttctgaac gtttgattct gaaagcccat tgaatatttc 240

gtttgcaact ctttggcttt ctttttttgt tccgtgcaac gttcgcaagg tcctgtggtt 300

ttctaaagat tctgcagcct atattgatag cacgacggac gacatttacg acgtccgctg 360

ctcgcttcat ctctctattc taaaccgttt atccgtgcaa ccgaaaagct ggagctgcca 420

tcgatctcgc aggtccatac ccgcggtcct gctgacatcc cctggtacaa ccctcacgcg 480

gcggaacgac cgttattgcc cggcgacaaa ctccccgctc tcagcctgcc aacagccacc 540

cagggcctct cccggaccgc ctatccagac ccgtctgtga ccaattccac caactctagc 600

gctcgcacga gtctgtctag tgcttctgtg cctgtcaacg aacctaggag tcccccgtcc 660

tctgcggacc tgtctgggac ccagggccgt ctttcattag attcttccgc cccgactgaa 720

tacagtctcc cgccttcggt caacgaaggg tactatccta gcccgacttc tctcggcagc 780

atgaaccaga cccagccgta tatggatgtc cactcgcaca tgtcttctgc tcagtcatac 840

gctcctcaag gcgcaaccgc aggcgcaatg tcccagtatc agtaccacgg acaaccccct 900

gtgatgcagc ccgcgtcttc ttacgccccg gctgcttacc cccaatacgg ataccccact 960

ggcgtcacgt caccgccaac aggacaccca ccaagctcca tgggtggcca gatgccggct 1020

cagctgctgc cgttgcctgg taagctccaa agccagaacg tgatcgaaga ttattctgat 1080

cgttatcaag tgagcaatca cgccgtggcg cctccgagcg ggtatgggaa cagcactggc 1140

gctccgctac aagggttcgt atttgatggt actggtcaag ttgctcctcc gggagcgaag 1200

ccgcgagtga cagccacatt atgggaagat gaggggagcc tctgctacca ggtggaagcg 1260

aagggggtgt gtgtagctcg acgagagggt aagttgattc tgtggaaaaa ggtcaatttg 1320

agaactgttc actgacttgt tttctttttt ttaaccttcc agacaaccac atgatcaatg 1380

gtacaaagct gctaaatgta gctggcatga cccgtggtcg acgtgatgga attctcaaaa 1440

gcgaaaagct tcgccacgtt gtgaaaattg gaccgatgca tttgaaaggt gtctggtatg 1500

tattttgatc cttcagagca cgcgcagcat caattgctaa ttctttactc ttcaggatcc 1560

catttgagcg tgctctggaa tttgccaaca aggagaagat caccgatctg ttgtacccac 1620

tctttgtgca taatattggt ggtcttctat accacccggc caaccagact cggacaaaca 1680

tggtagtgca agagtcccag cagcggcgtt tggaaggccc tcccccgggc ccgcagcgca 1740

cgccgtctgg ctctcagcaa ggcccgattc accatcacca cccctctttg cagaccccca 1800

tgtcttctca tatgtcccaa ggcccaatga atggccagcc tggctccaga ccaggcctcg 1860

agcgtgccaa cacctttcct acaccgccag ccagtgcatc cagcatgatg aatcaaggca 1920

gctcatacga atggggcgga caagtgccac acacgcagcc cctgtccatc gacaccacac 1980

tgagcaacca gcgctcaatg ccaaccaccc ccgcgaccac cccaccgggc aacaacatgc 2040

agggcttgcc agcctaccaa ggccaaggat acgacagctc caagccctac tattccgcgg 2100

cgccacaaac acacgcccaa tacgcgccgc acaccccgct cacccaatca gggatgtcca 2160

gctacggcca acccctggct ggcgggtaca tgaaaagcga aatggcgcca ccaaacccac 2220

gcccgggcgt ctccgagccc gaaacctccg agcgcgactc aaaccgctac agccagagca 2280

atgggcccgg cgagaccgtc gccgagcacg atcaggagta catgcaagac cacaacgccg 2340

gctacaactc caaccgcggc tcctacacct acaccaccaa cccctccgtc agttccctca 2400

ccggcgaaca ctcccagctc accccggaga tgactagctc cccgagccag caaaacggct 2460

ctggtcgtat gaccccgcgc acgggcgccg gcccccctcc tcactgggct tcggggtata 2520

acactcctcc tcgtcccgcc gccactaccc tgtacaacgc tgtcagcgac actcgcggta 2580

ccccggccaa cggtgcttcg gacccttact ccatggcatc gaccacggcc ccggtctacc 2640

cgactggaaa tggctcgctg agtgcgggca gcaagcgtat gcgtgaggat gacgatatcc 2700

gtgccgagag tacggctgag tacgagacct cgaagcgccg caagaccatc accgatgcta 2760

ccctcggcgg tccggtcggt ggtccgccta ttcttcaacc gatgaagcct agcggggtca 2820

tggctcgtca tcggtga 2837

<210> 2

<211> 6548

<212> DNA

<213> StuA基因被bleo抗性基因替代后(Artificial Sequence)

<400> 2

gccgatgtcc ggtgaatgat ttggtgaatg gtttggagaa tgaatttacg cgctgggagt 60

attttagccg tttctttaag atggaccttg caggttttag cttgtagcat ctgtacccca 120

aatagagggg aaatggtggt gcaagcgctg gctcaagaag cgggagagcg caatccgcaa 180

tcgacggtgc agccgccgcg cattaccggg cctttctttt tttttacttt ctccctctgc 240

agctgctgac agatgtcttg cacgatgaaa gagaaccttg gaatgatcgg gacgagatta 300

gaatttccct actgcacaat attcaatata gtactccgta cctgtgtact actgccagtg 360

gtattcttag gtgtaattta gtatctcaac cacggtttca atcattaacc tcagattaaa 420

ccgtggatgt aattcccccc ggtcctctcc ccggttgacc acccctggtt cactgagtgg 480

gacccgcgcg cgtggagacg aaccttggaa ccctctcagc tgctatttat gaagtgctca 540

ggtgttatta ttgcatttat gaaacgttta aggctatgtt tctatatagg gtttatttta 600

tatagtactt aaaatatatt atgcattgtt ttgacgaatc ttgcagtctc gcccagccaa 660

gaatagtatc cagaagtcca gaataacccc ctcagaaaag gaataaatta attgaatctg 720

atcggtgact ccactaaggg aatcaactcc cagatccagc gggcctatcc cgggcgatca 780

gcgtgttgct ttctgcctgt cacacagacc aggatcctca gctgggaata tttctctttg 840

actcgtccct gcagttttta tgttgttggt atggtactga ttgggaaatg ctagttaata 900

cttgttgact gttaataatg ggaatgattt acctctttac cttgacgctt aactcttgct 960

gatccgggtg gtccttactt ggtggcgtag aaaataatat aataattctt cccaccaaaa 1020

aagaaaaaaa aataaaaaaa taaaagggaa atagaaatag aaataggaaa aaagaaaaaa 1080

ggaaaaaaaa aacagcagat atcgagtcta gaggatgatc tgaacgcacg gttctggtag 1140

tcactttcac tctctctcca ccgggtccac tgtgattgat tcgatggcct ctctctcttt 1200

ctcctccatt tttctcttcg tctctccctc aaaagacggg gcaagccggg atttctgcag 1260

aacaacattc ttctctttct tctcttgtga gaacttagtc agcttcttct tatcctccac 1320

tgatcgactt tcccgctgcg gctcagcgtc atttcgcttc acctcttttc ccctctctta 1380

accgctggcc ttcttgctaa gtttcactgt acgatttcct tttattttaa ggcccttttc 1440

cttttgccct ttattttatt ttattttata tatttgtggt ttttcttttt caaacgccat 1500

ctatccagcc tgcagtgcat agggatgcgt ttgctgcacc accccagcct ccacctttct 1560

gtacgtccct tgtatctcta cacacaggct caaatcaata agaagaacgg ttcgtctttt 1620

tcgtttatat cttgcatcgt cccaaagcta ttggcgggat attctgtttg cagttggctg 1680

acttgaagta atctctgcag atctttcgac actgaaatac gtcgagcctg ctccgcttgg 1740

aagcggcgag gagcctcgtc ctgtcacaac taccaacatg gagtacgata agggccagtt 1800

ccgccagctc attaagagcc agttcatggg cgttggcatg atggccgtca tgcatctgta 1860

cttcaagtac accaaccctc ttctgatcca gtcgatcatc ccgctgaagg gcgctttcga 1920

atcgaatctg gttaagatcc acgtcttcgg gaagccagcg actggtgacc tccagcgtcc 1980

ctttaaggct gccaacagct ttctcagcca gggccagccc aagaccgaca aggcctccct 2040

ccagaacgcc gagaagaact ggaggggtgg tgtcaaggag gagtaagctc cttattgaag 2100

tcggaggacg gagcggtgtc aagaggatat tcttcgctct gtattataga taagatgatg 2160

aggaattgga ggtagcatag cttcatttgg atttgctttc caggctgaga ctctagcttg 2220

gagcatagag ggtccctttg gctttcaata ttctcaagta tctcgagttt gaacttattc 2280

ccgtgaacct tttattcacc aatgagcatt ggaatgaaca tgaatctgag gactgcaatc 2340

gccatgaggt tttcgaaata catccggatg tcgaaggctt ggggcacctg cgttggttga 2400

atttagaacg tggcactatt gatcatccga tagctctgca aagggcgttg cacaatgcaa 2460

gtcaaacgtt gctagcagtt ccaggtggaa tgttatgatg agcattgtat taaatcagga 2520

gatatagcat gatctctagt tagctcacca caaaagtcag acggcgtaac caaaagtcac 2580

acaacacaag ctgtaaggat ttcggcacgg ctacggaaga cggagaagcc caccttcagt 2640

ggactcgagt accatttaat tctatttgtg tttgatcgag acctaataca gcccctacaa 2700

cgaccatcaa agtcgtatag ctaccagtga ggaagtggac tcaaatcgac ttcagcaaca 2760

tctcctggat aaactttaag cctaaactat acagaataag atggtggaga gcttataccg 2820

agctcccaaa tctgtccaga tcatggttga ccggtgcctg gatcttccta tagaatcatc 2880

cttattcgtt gacctagctg attctggagt gacccagagg gtcatgactt gagcctaaaa 2940

tccgccgcct ccaccatttg tagaaaaatg tgacgaactc gtgagctctg tacagtgacc 3000

ggtgactctt tctggcatgc ggagagacgg acggacgcag agagaagggc tgagtaataa 3060

gcgccactgc gccagacagc tctggcggct ctgaggtgca gtggatgatt attaatccgg 3120

gaccggccgc ccctccgccc cgaagtggaa aggctggtgt gcccctcgtt gaccaagaat 3180

ctattgcatc atcggagaat atggagcttc atcgaatcac cggcagtaag cgaaggagaa 3240

tgtgaagcca ggggtgtata gccgtcggcg aaatagcatg ccattaacct aggtacagaa 3300

gtccaattgc ttccgatctg gtaaaagatt cacgagatag taccttctcc gaagtaggta 3360

gagcgagtac ccggcgcgta agctccctaa ttggcccatc cggcatctgt agggcgtcca 3420

aatatcgtgc ctctcctgct ttgcccggtg tatgaaaccg gaaaggccgc tcaggagctg 3480

gccagcggcg cagaccggga acacaagctg gcagtcgacc catccggtgc tctgcactcg 3540

acctgctgag gtccctcagt ccctggtagg cagctttgcc ccgtctgtcc gcccggtgtg 3600

tcggcggggt tgacaaggtc gttgcgtcag tccaacattt gttgccatat tttcctgctc 3660

tccccaccag ctgctctttt cttttctctt tcttttccca tcttcagtat attcatcttc 3720

ccatccaaga acctttattt cccctaagta agtactttgc tacatccata ctccatcctt 3780

cccatccctt attccttgga acctttcagt tcgagctttc ccacttcatc gcagcttgac 3840

taacagctac cccgcttgag cagacatcac catggccaag ttgaccagtg ccgttccggt 3900

gctcaccgcg cgcgacgtcg ccggagcggt cgagttctgg accgaccggc tcgggttctc 3960

ccgggacttc gtggaggacg acttcgccgg tgtggtccgg gacgacgtga ccctgttcat 4020

cagcgcggtc caggaccagg tggtgccgga caacaccctg gcctgggtgt gggtgcgcgg 4080

cctggacgag ctgtacgccg agtggtcgga ggtcgtgtcc acgaacttcc gggacgcctc 4140

cgggccggcc atgaccgaga tcggcgagca gccgtggggg cgggagttcg ccctgcgcga 4200

cccggccggc aactgcgtgc acttcgtggc cgaggagcag gactgattcc ggatccactt 4260

aacgttactg aaatcatcaa acagcttgac gaatctggat ataagatcgt tggtgtcgat 4320

gtcagctccg gagttgagac aaatggtgtt caggatctcg ataagatacg ttcatttgtc 4380

caagcagcaa agagtgcctt ctagtgattt aatagctcca tgtcaacaag aataaaacgc 4440

gtttcgggtt tacctcttcc agatacagct catctgcaat gcattaatgc attggacctc 4500

gcaaccctag tacgcccttc aggctccggc gaagcagaag aatagcttag cagagtctat 4560

tttcattttc gggagacgag atcaagcaga tcaacggtcg tcaagagacc tacgagactg 4620

aggaatccgc tcttggctcc acgcgactat atatttgtct ctaattgtac tttgacatgc 4680

tcctcttctt tactctgata gcttgactat gaaaattccg tcaccagccc ctgggttcgc 4740

aaagataatt gcactgtttc ttccttgaac tctcaagcct acaggacaca cattcatcgt 4800

aggtataaac ctcgaaaatc attcctacta agatgggtat acaatagtaa ccatgcatgg 4860

ttgcctagtg aatgctccgt aacacccaat acgccggccg aaactttttt acaactctcc 4920

tatgagtcgt ttacccagaa tgcacaggta cacttgttta gaggtaatcc ttctttctag 4980

atcatgatag actgcgcatg cacaacccgc atggcgcgcc gtggtcttgt ctgcgtctca 5040

cgaacatttt ggagatcgac agacctcgcg gtgtcgaaac gaaacgaagc tcatttgtct 5100

ctctgctttt tttgttttca ggaagaaatc tctggtttcg agaatatcta actgtgggga 5160

ggagaactag gcgcaagatc tgttcacggt ccaacattag agcaatgttg aaagacttgt 5220

cacttgttga agacttggat agtgatcgca gacctcgatg actacgatgt gacgaatctc 5280

ttatgaacga attttctttg tgtgatgact tgggccatct taacgagttt ttcttttttt 5340

tgctttcttg ggttttgaaa aggatgtggc atggcctttg gttttactcc cctctctact 5400

ttctgctttt gccactctac tagagagatg attatggtaa tgaatggtta tgaactctgg 5460

gtctttagcg acatacaacg ttggttttgg tccggaatgg attgttcttt ttccaactgc 5520

ttttctattg tagaagtgaa tccctccccc tttcgacttt tgccttggat ttagtggaat 5580

gtatcgtctt ctaaccttca atcccgacat acaagacccg acctcgccct cttagagtac 5640

ctatccttcc ggtacaacta ggtttaatgt ggataaaaag tgctacaatt gaataatcaa 5700

aggacaaata gagggttaga ttatacagag gtctcttctt tgctagcaga aatgcgtata 5760

agtcatcggt atcaccgaca aaagctccac cgtcatatcc ttctcgatct tacgggtcgt 5820

ctccggcgac aaccacacgt acctctctac ttgtcctggg tacggttgtc caccatcgta 5880

aatgcactca aagccatagt catcatacat ctcggatggt ctaacaacgc tacagaccac 5940

gttcgtcgtt ggctcgagat cgatctccag agtcgctcgc gtcccgtcaa gcggtggaag 6000

agtttcctcc tgccagccct gctctgctgc ccggttttcc aagtctggga catagaatgg 6060

attatccctt ctccgggcaa tttgtaagag actttccgtt ggtgctcgtg caggcttgag 6120

ggctctatac atcgattcgt agtcagacat gacacaggta atggcgacct gcgggagcat 6180

ggatggtcac ttgacggcca aatggtgtag cgtgttcttg taaggcttca atggccacca 6240

tatcttccac aggatatact gtgaatcgtt gctaaagcca gcaatatcat tgatcatgac 6300

agcactggag gattttccac tggtaggttt cccagacagt tgagagttga atagatggag 6360

agtagagagc aatgagagct gggagccatg gtattttaga agcataggag gaccggacat 6420

caaatggcgc agaatgataa ctggtgcatg gacaaggtaa taaaagtacc acctgagtca 6480

ttgtacagac ccgtggattg ccttttcgag ttatttttgc cttttcggtt tagcgtccgt 6540

cgcgtaac 6548

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物StuA-up-F(Artificial Sequence)

<400> 3

gccgatgtcc ggtgaatgat t 21

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 引物StuA-up-R(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgtgtgtag agatacaagg gacgtacaga aaggtggagg ct 42

<210> 5

<211> 1587

<212> DNA

<213> StuA基因的上游同源臂(Artificial Sequence)

<400> 5

gccgatgtcc ggtgaatgat ttggtgaatg gtttggagaa tgaatttacg cgctgggagt 60

attttagccg tttctttaag atggaccttg caggttttag cttgtagcat ctgtacccca 120

aatagagggg aaatggtggt gcaagcgctg gctcaagaag cgggagagcg caatccgcaa 180

tcgacggtgc agccgccgcg cattaccggg cctttctttt tttttacttt ctccctctgc 240

agctgctgac agatgtcttg cacgatgaaa gagaaccttg gaatgatcgg gacgagatta 300

gaatttccct actgcacaat attcaatata gtactccgta cctgtgtact actgccagtg 360

gtattcttag gtgtaattta gtatctcaac cacggtttca atcattaacc tcagattaaa 420

ccgtggatgt aattcccccc ggtcctctcc ccggttgacc acccctggtt cactgagtgg 480

gacccgcgcg cgtggagacg aaccttggaa ccctctcagc tgctatttat gaagtgctca 540

ggtgttatta ttgcatttat gaaacgttta aggctatgtt tctatatagg gtttatttta 600

tatagtactt aaaatatatt atgcattgtt ttgacgaatc ttgcagtctc gcccagccaa 660

gaatagtatc cagaagtcca gaataacccc ctcagaaaag gaataaatta attgaatctg 720

atcggtgact ccactaaggg aatcaactcc cagatccagc gggcctatcc cgggcgatca 780

gcgtgttgct ttctgcctgt cacacagacc aggatcctca gctgggaata tttctctttg 840

actcgtccct gcagttttta tgttgttggt atggtactga ttgggaaatg ctagttaata 900

cttgttgact gttaataatg ggaatgattt acctctttac cttgacgctt aactcttgct 960

gatccgggtg gtccttactt ggtggcgtag aaaataatat aataattctt cccaccaaaa 1020

aagaaaaaaa aataaaaaaa taaaagggaa atagaaatag aaataggaaa aaagaaaaaa 1080

ggaaaaaaaa aacagcagat atcgagtcta gaggatgatc tgaacgcacg gttctggtag 1140

tcactttcac tctctctcca ccgggtccac tgtgattgat tcgatggcct ctctctcttt 1200

ctcctccatt tttctcttcg tctctccctc aaaagacggg gcaagccggg atttctgcag 1260

aacaacattc ttctctttct tctcttgtga gaacttagtc agcttcttct tatcctccac 1320

tgatcgactt tcccgctgcg gctcagcgtc atttcgcttc acctcttttc ccctctctta 1380

accgctggcc ttcttgctaa gtttcactgt acgatttcct tttattttaa ggcccttttc 1440

cttttgccct ttattttatt ttattttata tatttgtggt ttttcttttt caaacgccat 1500

ctatccagcc tgcagtgcat agggatgcgt ttgctgcacc accccagcct ccacctttct 1560

gtacgtccct tgtatctcta cacacag 1587

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> 正向引物(Artificial Sequence)

<400> 6

aggtaatcct tctttctaga tcatgataga ctgcgcatgc aca 43

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 反向引物(Artificial Sequence)

<400> 7

gttacgcgac ggacgctaaa c 21

<210> 8

<211> 1587

<212> DNA

<213> 下游同源臂(Artificial Sequence)

<400> 8

aggtaatcct tctttctaga tcatgataga ctgcgcatgc acaacccgca tggcgcgccg 60

tggtcttgtc tgcgtctcac gaacattttg gagatcgaca gacctcgcgg tgtcgaaacg 120

aaacgaagct catttgtctc tctgcttttt ttgttttcag gaagaaatct ctggtttcga 180

gaatatctaa ctgtggggag gagaactagg cgcaagatct gttcacggtc caacattaga 240

gcaatgttga aagacttgtc acttgttgaa gacttggata gtgatcgcag acctcgatga 300

ctacgatgtg acgaatctct tatgaacgaa ttttctttgt gtgatgactt gggccatctt 360

aacgagtttt tctttttttt gctttcttgg gttttgaaaa ggatgtggca tggcctttgg 420

ttttactccc ctctctactt tctgcttttg ccactctact agagagatga ttatggtaat 480

gaatggttat gaactctggg tctttagcga catacaacgt tggttttggt ccggaatgga 540

ttgttctttt tccaactgct tttctattgt agaagtgaat ccctccccct ttcgactttt 600

gccttggatt tagtggaatg tatcgtcttc taaccttcaa tcccgacata caagacccga 660

cctcgccctc ttagagtacc tatccttccg gtacaactag gtttaatgtg gataaaaagt 720

gctacaattg aataatcaaa ggacaaatag agggttagat tatacagagg tctcttcttt 780

gctagcagaa atgcgtataa gtcatcggta tcaccgacaa aagctccacc gtcatatcct 840

tctcgatctt acgggtcgtc tccggcgaca accacacgta cctctctact tgtcctgggt 900

acggttgtcc accatcgtaa atgcactcaa agccatagtc atcatacatc tcggatggtc 960

taacaacgct acagaccacg ttcgtcgttg gctcgagatc gatctccaga gtcgctcgcg 1020

tcccgtcaag cggtggaaga gtttcctcct gccagccctg ctctgctgcc cggttttcca 1080

agtctgggac atagaatgga ttatcccttc tccgggcaat ttgtaagaga ctttccgttg 1140

gtgctcgtgc aggcttgagg gctctataca tcgattcgta gtcagacatg acacaggtaa 1200

tggcgacctg cgggagcatg gatggtcact tgacggccaa atggtgtagc gtgttcttgt 1260

aaggcttcaa tggccaccat atcttccaca ggatatactg tgaatcgttg ctaaagccag 1320

caatatcatt gatcatgaca gcactggagg attttccact ggtaggtttc ccagacagtt 1380

gagagttgaa tagatggaga gtagagagca atgagagctg ggagccatgg tattttagaa 1440

gcataggagg accggacatc aaatggcgca gaatgataac tggtgcatgg acaaggtaat 1500

aaaagtacca cctgagtcat tgtacagacc cgtggattgc cttttcgagt tatttttgcc 1560

ttttcggttt agcgtccgtc gcgtaac 1587

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 引物StuA-Bleo-F(Artificial Sequence)

<400> 9

agcctccacc tttctgtacg tcccttgtat ctctacacac ag 42

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> 引物StuA-Bleo-R(Artificial Sequence)

<400> 10

tgtgcatgcg cagtctatca tgatctagaa agaaggatta cct 43

<210> 11

<211> 6054

<212> DNA

<213> 质粒(pan8-1)

<400> 11

gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg 60

tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg 120

gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt 180

caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct 240

ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc 300

acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acccttgtat ctctacacac 360

aggctcaaat caataagaag aacggttcgt ctttttcgtt tatatcttgc atcgtcccaa 420

agctattggc gggatattct gtttgcagtt ggctgacttg aagtaatctc tgcagatctt 480

tcgacactga aatacgtcga gcctgctccg cttggaagcg gcgaggagcc tcgtcctgtc 540

acaactacca acatggagta cgataagggc cagttccgcc agctcattaa gagccagttc 600

atgggcgttg gcatgatggc cgtcatgcat ctgtacttca agtacaccaa ccctcttctg 660

atccagtcga tcatcccgct gaagggcgct ttcgaatcga atctggttaa gatccacgtc 720

ttcgggaagc cagcgactgg tgacctccag cgtcccttta aggctgccaa cagctttctc 780

agccagggcc agcccaagac cgacaaggcc tccctccaga acgccgagaa gaactggagg 840

ggtggtgtca aggaggagta agctccttat tgaagtcgga ggacggagcg gtgtcaagag 900

gatattcttc gctctgtatt atagataaga tgatgaggaa ttggaggtag catagcttca 960

tttggatttg ctttccaggc tgagactcta gcttggagca tagagggtcc ctttggcttt 1020

caatattctc aagtatctcg agtttgaact tattcccgtg aaccttttat tcaccaatga 1080

gcattggaat gaacatgaat ctgaggactg caatcgccat gaggttttcg aaatacatcc 1140

ggatgtcgaa ggcttggggc acctgcgttg gttgaattta gaacgtggca ctattgatca 1200

tccgatagct ctgcaaaggg cgttgcacaa tgcaagtcaa acgttgctag cagttccagg 1260

tggaatgtta tgatgagcat tgtattaaat caggagatat agcatgatct ctagttagct 1320

caccacaaaa gtcagacggc gtaaccaaaa gtcacacaac acaagctgta aggatttcgg 1380

cacggctacg gaagacggag aagcccacct tcagtggact cgagtaccat ttaattctat 1440

ttgtgtttga tcgagaccta atacagcccc tacaacgacc atcaaagtcg tatagctacc 1500

agtgaggaag tggactcaaa tcgacttcag caacatctcc tggataaact ttaagcctaa 1560

actatacaga ataagatggt ggagagctta taccgagctc ccaaatctgt ccagatcatg 1620

gttgaccggt gcctggatct tcctatagaa tcatccttat tcgttgacct agctgattct 1680

ggagtgaccc agagggtcat gacttgagcc taaaatccgc cgcctccacc atttgtagaa 1740

aaatgtgacg aactcgtgag ctctgtacag tgaccggtga ctctttctgg catgcggaga 1800

gacggacgga cgcagagaga agggctgagt aataagcgcc actgcgccag acagctctgg 1860

cggctctgag gtgcagtgga tgattattaa tccgggaccg gccgcccctc cgccccgaag 1920

tggaaaggct ggtgtgcccc tcgttgacca agaatctatt gcatcatcgg agaatatgga 1980

gcttcatcga atcaccggca gtaagcgaag gagaatgtga agccaggggt gtatagccgt 2040

cggcgaaata gcatgccatt aacctaggta cagaagtcca attgcttccg atctggtaaa 2100

agattcacga gatagtacct tctccgaagt aggtagagcg agtacccggc gcgtaagctc 2160

cctaattggc ccatccggca tctgtagggc gtccaaatat cgtgcctctc ctgctttgcc 2220

cggtgtatga aaccggaaag gccgctcagg agctggccag cggcgcagac cgggaacaca 2280

agctggcagt cgacccatcc ggtgctctgc actcgacctg ctgaggtccc tcagtccctg 2340

gtaggcagct ttgccccgtc tgtccgcccg gtgtgtcggc ggggttgaca aggtcgttgc 2400

gtcagtccaa catttgttgc catattttcc tgctctcccc accagctgct cttttctttt 2460

ctctttcttt tcccatcttc agtatattca tcttcccatc caagaacctt tatttcccct 2520

aagtaagtac tttgctacat ccatactcca tccttcccat cccttattcc ttggaacctt 2580

tcagttcgag ctttcccact tcatcgcagc ttgactaaca gctaccccgc ttgagcagac 2640

atcaccatgg ccaagttgac cagtgccgtt ccggtgctca ccgcgcgcga cgtcgccgga 2700

gcggtcgagt tctggaccga ccggctcggg ttctcccggg acttcgtgga ggacgacttc 2760

gccggtgtgg tccgggacga cgtgaccctg ttcatcagcg cggtccagga ccaggtggtg 2820

ccggacaaca ccctggcctg ggtgtgggtg cgcggcctgg acgagctgta cgccgagtgg 2880

tcggaggtcg tgtccacgaa cttccgggac gcctccgggc cggccatgac cgagatcggc 2940

gagcagccgt gggggcggga gttcgccctg cgcgacccgg ccggcaactg cgtgcacttc 3000

gtggccgagg agcaggactg attccggatc cacttaacgt tactgaaatc atcaaacagc 3060

ttgacgaatc tggatataag atcgttggtg tcgatgtcag ctccggagtt gagacaaatg 3120

gtgttcagga tctcgataag atacgttcat ttgtccaagc agcaaagagt gccttctagt 3180

gatttaatag ctccatgtca acaagaataa aacgcgtttc gggtttacct cttccagata 3240

cagctcatct gcaatgcatt aatgcattgg acctcgcaac cctagtacgc ccttcaggct 3300

ccggcgaagc agaagaatag cttagcagag tctattttca ttttcgggag acgagatcaa 3360

gcagatcaac ggtcgtcaag agacctacga gactgaggaa tccgctcttg gctccacgcg 3420

actatatatt tgtctctaat tgtactttga catgctcctc ttctttactc tgatagcttg 3480

actatgaaaa ttccgtcacc agcccctggg ttcgcaaaga taattgcact gtttcttcct 3540

tgaactctca agcctacagg acacacattc atcgtaggta taaacctcga aaatcattcc 3600

tactaagatg ggtatacaat agtaaccatg catggttgcc tagtgaatgc tccgtaacac 3660

ccaatacgcc ggccgaaact tttttacaac tctcctatga gtcgtttacc cagaatgcac 3720

aggtacactt gtttagaggt aatccttctt tctagaagtc ctcgtgtact gtgtaagcgc 3780

ccactccaca tctccactcg acctgcaggc atgcaagctt ggcgtaatca tggtcatagc 3840

tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca 3900

taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct 3960

cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac 4020

gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc 4080

tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt 4140

tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg 4200

ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg 4260

agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat 4320

accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta 4380

ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct 4440

gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 4500

ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa 4560

gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg 4620

taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag 4680

tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt 4740

gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta 4800

cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc 4860

agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 4920

cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 4980

cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 5040

ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 5100

taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt 5160

tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 5220

ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 5280

atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg 5340

gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 5400

tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg 5460

cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg 5520

taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 5580

ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa 5640

ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 5700

cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt 5760

ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg 5820

gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 5880

gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 5940

aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca 6000

ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtc 6054

<210> 12

<211> 3459

<212> DNA

<213> Bleo抗性表达元件(Artificial Sequence)

<400> 12

agcctccacc tttctgtacg tcccttgtat ctctacacac aggctcaaat caataagaag 60

aacggttcgt ctttttcgtt tatatcttgc atcgtcccaa agctattggc gggatattct 120

gtttgcagtt ggctgacttg aagtaatctc tgcagatctt tcgacactga aatacgtcga 180

gcctgctccg cttggaagcg gcgaggagcc tcgtcctgtc acaactacca acatggagta 240

cgataagggc cagttccgcc agctcattaa gagccagttc atgggcgttg gcatgatggc 300

cgtcatgcat ctgtacttca agtacaccaa ccctcttctg atccagtcga tcatcccgct 360

gaagggcgct ttcgaatcga atctggttaa gatccacgtc ttcgggaagc cagcgactgg 420

tgacctccag cgtcccttta aggctgccaa cagctttctc agccagggcc agcccaagac 480

cgacaaggcc tccctccaga acgccgagaa gaactggagg ggtggtgtca aggaggagta 540

agctccttat tgaagtcgga ggacggagcg gtgtcaagag gatattcttc gctctgtatt 600

atagataaga tgatgaggaa ttggaggtag catagcttca tttggatttg ctttccaggc 660

tgagactcta gcttggagca tagagggtcc ctttggcttt caatattctc aagtatctcg 720

agtttgaact tattcccgtg aaccttttat tcaccaatga gcattggaat gaacatgaat 780

ctgaggactg caatcgccat gaggttttcg aaatacatcc ggatgtcgaa ggcttggggc 840

acctgcgttg gttgaattta gaacgtggca ctattgatca tccgatagct ctgcaaaggg 900

cgttgcacaa tgcaagtcaa acgttgctag cagttccagg tggaatgtta tgatgagcat 960

tgtattaaat caggagatat agcatgatct ctagttagct caccacaaaa gtcagacggc 1020

gtaaccaaaa gtcacacaac acaagctgta aggatttcgg cacggctacg gaagacggag 1080

aagcccacct tcagtggact cgagtaccat ttaattctat ttgtgtttga tcgagaccta 1140

atacagcccc tacaacgacc atcaaagtcg tatagctacc agtgaggaag tggactcaaa 1200

tcgacttcag caacatctcc tggataaact ttaagcctaa actatacaga ataagatggt 1260

ggagagctta taccgagctc ccaaatctgt ccagatcatg gttgaccggt gcctggatct 1320

tcctatagaa tcatccttat tcgttgacct agctgattct ggagtgaccc agagggtcat 1380

gacttgagcc taaaatccgc cgcctccacc atttgtagaa aaatgtgacg aactcgtgag 1440

ctctgtacag tgaccggtga ctctttctgg catgcggaga gacggacgga cgcagagaga 1500

agggctgagt aataagcgcc actgcgccag acagctctgg cggctctgag gtgcagtgga 1560

tgattattaa tccgggaccg gccgcccctc cgccccgaag tggaaaggct ggtgtgcccc 1620

tcgttgacca agaatctatt gcatcatcgg agaatatgga gcttcatcga atcaccggca 1680

gtaagcgaag gagaatgtga agccaggggt gtatagccgt cggcgaaata gcatgccatt 1740

aacctaggta cagaagtcca attgcttccg atctggtaaa agattcacga gatagtacct 1800

tctccgaagt aggtagagcg agtacccggc gcgtaagctc cctaattggc ccatccggca 1860

tctgtagggc gtccaaatat cgtgcctctc ctgctttgcc cggtgtatga aaccggaaag 1920

gccgctcagg agctggccag cggcgcagac cgggaacaca agctggcagt cgacccatcc 1980

ggtgctctgc actcgacctg ctgaggtccc tcagtccctg gtaggcagct ttgccccgtc 2040

tgtccgcccg gtgtgtcggc ggggttgaca aggtcgttgc gtcagtccaa catttgttgc 2100

catattttcc tgctctcccc accagctgct cttttctttt ctctttcttt tcccatcttc 2160

agtatattca tcttcccatc caagaacctt tatttcccct aagtaagtac tttgctacat 2220

ccatactcca tccttcccat cccttattcc ttggaacctt tcagttcgag ctttcccact 2280

tcatcgcagc ttgactaaca gctaccccgc ttgagcagac atcaccatgg ccaagttgac 2340

cagtgccgtt ccggtgctca ccgcgcgcga cgtcgccgga gcggtcgagt tctggaccga 2400

ccggctcggg ttctcccggg acttcgtgga ggacgacttc gccggtgtgg tccgggacga 2460

cgtgaccctg ttcatcagcg cggtccagga ccaggtggtg ccggacaaca ccctggcctg 2520

ggtgtgggtg cgcggcctgg acgagctgta cgccgagtgg tcggaggtcg tgtccacgaa 2580

cttccgggac gcctccgggc cggccatgac cgagatcggc gagcagccgt gggggcggga 2640

gttcgccctg cgcgacccgg ccggcaactg cgtgcacttc gtggccgagg agcaggactg 2700

attccggatc cacttaacgt tactgaaatc atcaaacagc ttgacgaatc tggatataag 2760

atcgttggtg tcgatgtcag ctccggagtt gagacaaatg gtgttcagga tctcgataag 2820

atacgttcat ttgtccaagc agcaaagagt gccttctagt gatttaatag ctccatgtca 2880

acaagaataa aacgcgtttc gggtttacct cttccagata cagctcatct gcaatgcatt 2940

aatgcattgg acctcgcaac cctagtacgc ccttcaggct ccggcgaagc agaagaatag 3000

cttagcagag tctattttca ttttcgggag acgagatcaa gcagatcaac ggtcgtcaag 3060

agacctacga gactgaggaa tccgctcttg gctccacgcg actatatatt tgtctctaat 3120

tgtactttga catgctcctc ttctttactc tgatagcttg actatgaaaa ttccgtcacc 3180

agcccctggg ttcgcaaaga taattgcact gtttcttcct tgaactctca agcctacagg 3240

acacacattc atcgtaggta taaacctcga aaatcattcc tactaagatg ggtatacaat 3300

agtaaccatg catggttgcc tagtgaatgc tccgtaacac ccaatacgcc ggccgaaact 3360

tttttacaac tctcctatga gtcgtttacc cagaatgcac aggtacactt gtttagaggt 3420

aatccttctt tctagatcat gatagactgc gcatgcaca 3459

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 基因敲除片段的上引物(Artificial Sequence)

<400> 13

caatccgcaa tcgacggtgc 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 基因敲除片段的下引物(Artificial Sequence)

<400> 14

ggctcccagc tctcattgct 20

<210> 15

<211> 6217

<212> DNA

<213> 基因敲除片段(Artificial Sequence)

<400> 15

caatccgcaa tcgacggtgc agccgccgcg cattaccggg cctttctttt tttttacttt 60

ctccctctgc agctgctgac agatgtcttg cacgatgaaa gagaaccttg gaatgatcgg 120

gacgagatta gaatttccct actgcacaat attcaatata gtactccgta cctgtgtact 180

actgccagtg gtattcttag gtgtaattta gtatctcaac cacggtttca atcattaacc 240

tcagattaaa ccgtggatgt aattcccccc ggtcctctcc ccggttgacc acccctggtt 300

cactgagtgg gacccgcgcg cgtggagacg aaccttggaa ccctctcagc tgctatttat 360

gaagtgctca ggtgttatta ttgcatttat gaaacgttta aggctatgtt tctatatagg 420

gtttatttta tatagtactt aaaatatatt atgcattgtt ttgacgaatc ttgcagtctc 480

gcccagccaa gaatagtatc cagaagtcca gaataacccc ctcagaaaag gaataaatta 540

attgaatctg atcggtgact ccactaaggg aatcaactcc cagatccagc gggcctatcc 600

cgggcgatca gcgtgttgct ttctgcctgt cacacagacc aggatcctca gctgggaata 660

tttctctttg actcgtccct gcagttttta tgttgttggt atggtactga ttgggaaatg 720

ctagttaata cttgttgact gttaataatg ggaatgattt acctctttac cttgacgctt 780

aactcttgct gatccgggtg gtccttactt ggtggcgtag aaaataatat aataattctt 840

cccaccaaaa aagaaaaaaa aataaaaaaa taaaagggaa atagaaatag aaataggaaa 900

aaagaaaaaa ggaaaaaaaa aacagcagat atcgagtcta gaggatgatc tgaacgcacg 960

gttctggtag tcactttcac tctctctcca ccgggtccac tgtgattgat tcgatggcct 1020

ctctctcttt ctcctccatt tttctcttcg tctctccctc aaaagacggg gcaagccggg 1080

atttctgcag aacaacattc ttctctttct tctcttgtga gaacttagtc agcttcttct 1140

tatcctccac tgatcgactt tcccgctgcg gctcagcgtc atttcgcttc acctcttttc 1200

ccctctctta accgctggcc ttcttgctaa gtttcactgt acgatttcct tttattttaa 1260

ggcccttttc cttttgccct ttattttatt ttattttata tatttgtggt ttttcttttt 1320

caaacgccat ctatccagcc tgcagtgcat agggatgcgt ttgctgcacc accccagcct 1380

ccacctttct gtacgtccct tgtatctcta cacacaggct caaatcaata agaagaacgg 1440

ttcgtctttt tcgtttatat cttgcatcgt cccaaagcta ttggcgggat attctgtttg 1500

cagttggctg acttgaagta atctctgcag atctttcgac actgaaatac gtcgagcctg 1560

ctccgcttgg aagcggcgag gagcctcgtc ctgtcacaac taccaacatg gagtacgata 1620

agggccagtt ccgccagctc attaagagcc agttcatggg cgttggcatg atggccgtca 1680

tgcatctgta cttcaagtac accaaccctc ttctgatcca gtcgatcatc ccgctgaagg 1740

gcgctttcga atcgaatctg gttaagatcc acgtcttcgg gaagccagcg actggtgacc 1800

tccagcgtcc ctttaaggct gccaacagct ttctcagcca gggccagccc aagaccgaca 1860

aggcctccct ccagaacgcc gagaagaact ggaggggtgg tgtcaaggag gagtaagctc 1920

cttattgaag tcggaggacg gagcggtgtc aagaggatat tcttcgctct gtattataga 1980

taagatgatg aggaattgga ggtagcatag cttcatttgg atttgctttc caggctgaga 2040

ctctagcttg gagcatagag ggtccctttg gctttcaata ttctcaagta tctcgagttt 2100

gaacttattc ccgtgaacct tttattcacc aatgagcatt ggaatgaaca tgaatctgag 2160

gactgcaatc gccatgaggt tttcgaaata catccggatg tcgaaggctt ggggcacctg 2220

cgttggttga atttagaacg tggcactatt gatcatccga tagctctgca aagggcgttg 2280

cacaatgcaa gtcaaacgtt gctagcagtt ccaggtggaa tgttatgatg agcattgtat 2340

taaatcagga gatatagcat gatctctagt tagctcacca caaaagtcag acggcgtaac 2400

caaaagtcac acaacacaag ctgtaaggat ttcggcacgg ctacggaaga cggagaagcc 2460

caccttcagt ggactcgagt accatttaat tctatttgtg tttgatcgag acctaataca 2520

gcccctacaa cgaccatcaa agtcgtatag ctaccagtga ggaagtggac tcaaatcgac 2580

ttcagcaaca tctcctggat aaactttaag cctaaactat acagaataag atggtggaga 2640

gcttataccg agctcccaaa tctgtccaga tcatggttga ccggtgcctg gatcttccta 2700

tagaatcatc cttattcgtt gacctagctg attctggagt gacccagagg gtcatgactt 2760

gagcctaaaa tccgccgcct ccaccatttg tagaaaaatg tgacgaactc gtgagctctg 2820

tacagtgacc ggtgactctt tctggcatgc ggagagacgg acggacgcag agagaagggc 2880

tgagtaataa gcgccactgc gccagacagc tctggcggct ctgaggtgca gtggatgatt 2940

attaatccgg gaccggccgc ccctccgccc cgaagtggaa aggctggtgt gcccctcgtt 3000

gaccaagaat ctattgcatc atcggagaat atggagcttc atcgaatcac cggcagtaag 3060

cgaaggagaa tgtgaagcca ggggtgtata gccgtcggcg aaatagcatg ccattaacct 3120

aggtacagaa gtccaattgc ttccgatctg gtaaaagatt cacgagatag taccttctcc 3180

gaagtaggta gagcgagtac ccggcgcgta agctccctaa ttggcccatc cggcatctgt 3240

agggcgtcca aatatcgtgc ctctcctgct ttgcccggtg tatgaaaccg gaaaggccgc 3300

tcaggagctg gccagcggcg cagaccggga acacaagctg gcagtcgacc catccggtgc 3360

tctgcactcg acctgctgag gtccctcagt ccctggtagg cagctttgcc ccgtctgtcc 3420

gcccggtgtg tcggcggggt tgacaaggtc gttgcgtcag tccaacattt gttgccatat 3480

tttcctgctc tccccaccag ctgctctttt cttttctctt tcttttccca tcttcagtat 3540

attcatcttc ccatccaaga acctttattt cccctaagta agtactttgc tacatccata 3600

ctccatcctt cccatccctt attccttgga acctttcagt tcgagctttc ccacttcatc 3660

gcagcttgac taacagctac cccgcttgag cagacatcac catggccaag ttgaccagtg 3720

ccgttccggt gctcaccgcg cgcgacgtcg ccggagcggt cgagttctgg accgaccggc 3780

tcgggttctc ccgggacttc gtggaggacg acttcgccgg tgtggtccgg gacgacgtga 3840

ccctgttcat cagcgcggtc caggaccagg tggtgccgga caacaccctg gcctgggtgt 3900

gggtgcgcgg cctggacgag ctgtacgccg agtggtcgga ggtcgtgtcc acgaacttcc 3960

gggacgcctc cgggccggcc atgaccgaga tcggcgagca gccgtggggg cgggagttcg 4020

ccctgcgcga cccggccggc aactgcgtgc acttcgtggc cgaggagcag gactgattcc 4080

ggatccactt aacgttactg aaatcatcaa acagcttgac gaatctggat ataagatcgt 4140

tggtgtcgat gtcagctccg gagttgagac aaatggtgtt caggatctcg ataagatacg 4200

ttcatttgtc caagcagcaa agagtgcctt ctagtgattt aatagctcca tgtcaacaag 4260

aataaaacgc gtttcgggtt tacctcttcc agatacagct catctgcaat gcattaatgc 4320

attggacctc gcaaccctag tacgcccttc aggctccggc gaagcagaag aatagcttag 4380

cagagtctat tttcattttc gggagacgag atcaagcaga tcaacggtcg tcaagagacc 4440

tacgagactg aggaatccgc tcttggctcc acgcgactat atatttgtct ctaattgtac 4500

tttgacatgc tcctcttctt tactctgata gcttgactat gaaaattccg tcaccagccc 4560

ctgggttcgc aaagataatt gcactgtttc ttccttgaac tctcaagcct acaggacaca 4620

cattcatcgt aggtataaac ctcgaaaatc attcctacta agatgggtat acaatagtaa 4680

ccatgcatgg ttgcctagtg aatgctccgt aacacccaat acgccggccg aaactttttt 4740

acaactctcc tatgagtcgt ttacccagaa tgcacaggta cacttgttta gaggtaatcc 4800

ttctttctag atcatgatag actgcgcatg cacaacccgc atggcgcgcc gtggtcttgt 4860

ctgcgtctca cgaacatttt ggagatcgac agacctcgcg gtgtcgaaac gaaacgaagc 4920

tcatttgtct ctctgctttt tttgttttca ggaagaaatc tctggtttcg agaatatcta 4980

actgtgggga ggagaactag gcgcaagatc tgttcacggt ccaacattag agcaatgttg 5040

aaagacttgt cacttgttga agacttggat agtgatcgca gacctcgatg actacgatgt 5100

gacgaatctc ttatgaacga attttctttg tgtgatgact tgggccatct taacgagttt 5160

ttcttttttt tgctttcttg ggttttgaaa aggatgtggc atggcctttg gttttactcc 5220

cctctctact ttctgctttt gccactctac tagagagatg attatggtaa tgaatggtta 5280

tgaactctgg gtctttagcg acatacaacg ttggttttgg tccggaatgg attgttcttt 5340

ttccaactgc ttttctattg tagaagtgaa tccctccccc tttcgacttt tgccttggat 5400

ttagtggaat gtatcgtctt ctaaccttca atcccgacat acaagacccg acctcgccct 5460

cttagagtac ctatccttcc ggtacaacta ggtttaatgt ggataaaaag tgctacaatt 5520

gaataatcaa aggacaaata gagggttaga ttatacagag gtctcttctt tgctagcaga 5580

aatgcgtata agtcatcggt atcaccgaca aaagctccac cgtcatatcc ttctcgatct 5640

tacgggtcgt ctccggcgac aaccacacgt acctctctac ttgtcctggg tacggttgtc 5700

caccatcgta aatgcactca aagccatagt catcatacat ctcggatggt ctaacaacgc 5760

tacagaccac gttcgtcgtt ggctcgagat cgatctccag agtcgctcgc gtcccgtcaa 5820

gcggtggaag agtttcctcc tgccagccct gctctgctgc ccggttttcc aagtctggga 5880

catagaatgg attatccctt ctccgggcaa tttgtaagag actttccgtt ggtgctcgtg 5940

caggcttgag ggctctatac atcgattcgt agtcagacat gacacaggta atggcgacct 6000

gcgggagcat ggatggtcac ttgacggcca aatggtgtag cgtgttcttg taaggcttca 6060

atggccacca tatcttccac aggatatact gtgaatcgtt gctaaagcca gcaatatcat 6120

tgatcatgac agcactggag gattttccac tggtaggttt cccagacagt tgagagttga 6180

atagatggag agtagagagc aatgagagct gggagcc 6217

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物Bleo-F(Artificial Sequence)

<400> 16

cgagctcggt acccttgtat ctcta 25

<210> 17

<211> 375

<212> DNA

<213> 引物Bleo-R (Artificial Sequence)

<400> 17

atggccaagt tgaccagtgc cgttccggtg ctcaccgcgc gcgacgtcgc cggagcggtc 60

gagttctgga ccgaccggct cgggttctcc cgggacttcg tggaggacga cttcgccggt 120

gtggtccggg acgacgtgac cctgttcatc agcgcggtcc aggaccaggt ggtgccggac 180

aacaccctgg cctgggtgtg ggtgcgcggc ctggacgagc tgtacgccga gtggtcggag 240

gtcgtgtcca cgaacttccg ggacgcctcc gggccggcca tgaccgagat cggcgagcag 300

ccgtgggggc gggagttcgc cctgcgcgac ccggccggca actgcgtgca cttcgtggcc 360

gaggagcagg actga 375

Claims (7)

1.一株重组产黄青霉基因工程菌，其特征在于，由原始产黄青霉菌中StuA基因被Bleo抗性基因替代所得；

其中，所述原始产黄青霉菌为ATCC48271；

其中，所述StuA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

其中，所述StuA基因被bleo抗性基因替代后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述重组产黄青霉基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）制备原始产黄青霉菌的原生质体；

（2）提取原始产黄青霉菌的基因组DNA；

（3）构建基因敲除片段；

（4）将步骤（3）构建的基因敲除片段导入步骤（1）制备的产黄青霉的原生质体中，得到重组产黄青霉基因工程菌；

步骤（3）中，所述基因敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。

3.权利要求1所述重组产黄青霉基因工程菌在产青霉素中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，以重组产黄青霉基因工程菌为发酵菌株，通过固定化发酵产青霉素。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述固定化发酵的发酵培养基中乳糖与磷酸二氢钾的质量比为3：1。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述固定化发酵的发酵培养基中各组分的质量百分比为：黄豆饼粉 4.8%、碳酸钙1.5%、乳糖3%、磷酸二氢钾1%、硫酸铵0.65%、硫酸钠0.2%、色拉油0.03%、苯乙酸2.5%，溶剂为水，pH=5.8。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的固定化发酵的条件为：发酵温度为25℃~30℃，发酵时间为72~144 h，转速为180~220 rpm。

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