CN111235118B - 一种人3型腺病毒复制缺陷型重组病毒、构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种人3型腺病毒复制缺陷型重组病毒、构建方法及应用。本发明以野生型人3型腺病毒衣壳蛋白六邻体基因为保护性抗原基因，以E1、E3区基因缺失的人5型复制缺陷型腺病毒为载体，以整合E1区基因的AD293细胞为包装细胞系。该复制缺陷型疫苗免疫小鼠后，可诱导机体产生较高的体液免疫，产生针对野生型人3型腺病毒的特异性中和性抗体，免疫途径为肌肉注射或滴鼻，该疫苗候选株具有制备方法简单、免疫操作简便、安全高效等优点，具备良好的应用前景。

Description

一种人3型腺病毒复制缺陷型重组病毒、构建方法及应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种人3型腺病毒复制缺陷型重组病毒、构建 方法及应用。

背景技术

人腺病毒(Human adenovirus，HAdV)是一种较常见的呼吸道系统感染病原体，传染性 强，可引起多系统多器官感染，易感人群主要为婴幼儿儿童，可引起急性呼吸道疾病(Acute Respiratory Disease，ARD)和婴幼儿致死性肺炎等重症病情，腺病毒肺炎是我国发病率最高 的一种病毒性肺炎之一。人腺病毒有51个血清型，其中人3型腺病毒为地方性、流行性和散 发性感染，在欧洲、亚洲、美洲和大洋洲均有报道，传染性强，具有强毒性并能导致严重的 临床症状例如重症肺炎甚至死亡。近年来，在我国腺病毒所造成的地方型流行频频暴发，主 要是以3型腺病毒等为主，针对腺病毒感染的预防和治疗已成为我国公共卫生事业亟待解决 的问题。

腺病毒是双链DNA病毒，基因组全长30-38kb，六邻体蛋白(hexon)是衣壳蛋白之一， 是刺激机体产生免疫保护性抗体、特异性抗体的最主要的蛋白。腺病毒感染后的治疗同其他 病毒所致疾病一样，目前并没有特异性的药物，只能对症治疗，主要靠机体自身免疫系统产 生的抗病毒性中和抗体消灭病毒从而使疾病痊愈。构建一株可以持续高水平表达六邻体蛋白 的重组病毒，刺激机体产生的保护性抗体可以预防同型腺病毒的感染。目前，世界上尚无人 3型腺病毒疫苗，研制开发价格低廉、安全有效、具有我国自主知识产权的腺病毒疫苗，对 今后我国3型腺病毒感染的防治十分重要，尤其是在人口密集、腺病毒经常暴发的城市进行 儿童疫苗接种，其经济效益和社会效益巨大，应用前景广阔。

人5型腺病毒为腺病毒中致病力最弱的病毒株，野生型病毒株也仅会偶致普通感冒；病 毒基因不整合到宿主细胞基因组中，无遗传毒性。该病毒载体经基因工程改造，调控病毒基 因早期复制的E1区缺失，致使病毒在感染普通细胞内不能复制其DNA，无法产生子代新病 毒，但可以转录表达蛋白；只对细胞实施一次感染，无环境污染，遗传背景清楚，安全性能 好，已经成为生物学、医学研究方面常用的工具。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种人3型腺病毒复制缺陷型重组病毒、构建 方法及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种人3型腺病毒复制缺陷型重组病毒，所述人3型腺病毒复制 缺陷型重组病毒以人5型复制缺陷型的腺病毒为载体，所述人5型复制缺陷型的腺病毒的基 因组缺失部分E1区和E3区基因，且在E1区位置插入了人3型腺病毒六邻体完整基因，并 在AD293细胞中包装得到重组病毒。

进一步地，所述人3型腺病毒六邻体完整基因的核苷酸序列见SEQ ID NO.3。

一种如上述的人3型腺病毒复制缺陷型重组病毒的制备方法，包括：将含有人3型腺病 毒六邻体完整基因的穿梭质粒与腺病毒骨架质粒在细菌内同源重组，得到的重组腺病毒载体 在AD293细胞中包装获得该重组腺病毒疫苗；所述腺病毒骨架质粒为缺失部分E1区和E3 区基因的人5型腺病毒载体。

进一步地，包括：

将SEQ ID NO.3所示的3型腺病毒六邻体完整基因片段克隆至穿梭质粒，获得质粒pSAd3H；

将pSAd3H与人5型腺病毒载体骨架质粒转化入可表达重组酶的大肠杆菌，利用两质粒 同源臂进行同源重组，获得3型腺病毒重组载体prAd3H；

将线性化后prAd3H转染入AD293包装出人3型腺病毒复制缺陷型重组病毒颗粒。

进一步地，所述穿梭质粒为pShuttle-CMV-GFP质粒。

进一步地，所述可表达重组酶的大肠杆菌为大肠杆菌BJ5183。

如上述的人3型腺病毒复制缺陷型重组病毒的制备方法在制备人3型腺病毒复制缺陷型 重组病毒中的应用。

如上述的人3型腺病毒复制缺陷型重组病毒在制备治疗或预防3型腺病毒感染疾病的药 物或疫苗中的应用。

进一步地，所述药物或疫苗的剂型为注射剂、滴鼻剂。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明首次将人5型复制缺陷型腺病毒载体用于腺病毒自身疫苗的研究，构建的重组腺 病毒在感染的人体细胞内表达3型腺病毒完整的六邻体蛋白，最大限度的保持腺病毒六邻体 衣壳蛋白三聚体天然构象的形成，保证其免疫原性，增强疫苗效果，为腺病毒疫苗的研制探 索一条新的途径。

本发明以野生型人3型腺病毒完整的衣壳蛋白六邻体基因为保护性抗原基因，以E1、E3 区基因缺失的人5型复制缺陷型腺病毒为载体，以整合E1区基因的AD293细胞为包装细胞 系。该复制缺陷型疫苗免疫小鼠后，可诱导机体产生较高的体液免疫，产生针对野生型人3 型腺病毒的特异性中和性抗体，免疫途径为肌肉注射或滴鼻，该疫苗候选株具有制备方法简 单、免疫操作简便、安全高效等优点，具备良好的应用前景。

与现有技术中已经存在的将5型复制缺陷型腺病毒载体用于其他病毒的疫苗研制中的技 术相比，本发明的疫苗，操作方法和之前的类似，区别在于腺病毒载体表达的是腺病毒自身 蛋白(六邻体蛋白)，会更加兼容，更加高效，而且表达的蛋白有可能会组装到腺病毒自身结 构蛋白上，形成衣壳嵌合型病毒样颗粒，使得该疫苗更加高效，更加稳定。人3型腺病毒六 邻体蛋白是刺激机体产生保护性抗体的最重要的抗原蛋白，但是现有技术研究都只选择部分 蛋白基因序列，因为六邻体蛋白比较大，长度接近1000个氨基酸，太长，不容易操作。本发 明的技术难点在于：相对于其他病毒疫苗的制备，本发明插入的外源蛋白(六邻体蛋白)是 完整长度的蛋白，比较大，在293细胞内包装出感染性的病毒颗粒比较困难，而本发明成功 构建了表达较大腺病毒结构蛋白的腺病毒疫苗载体，可以很好表达该蛋白。

附图说明

图1为本发明人3型复制缺陷型重组腺病毒疫苗的技术路线示意图；

图2为本发明人3型复制缺陷型重组腺病毒疫苗候选株rAd3H的构建流程图；

图3为重组质粒prAd3H酶切鉴定图；

图4为重组病毒疫苗候选株rAd3H感染AD293细胞后第八天荧光显微镜观察结果图；

图5为RT-PCR扩增鉴定重组腺病毒疫苗候选株rAd3H六邻体基因的表达图；

图6为重组腺病毒疫苗候选株rAd3H六邻体蛋白的Western-blot检测图；

图7为荧光稀释法检测定量重组腺病毒疫苗候选株rAd3H滴度图；

图8为重组腺病毒疫苗候选株rAd3H与野生株腺病毒Ad3的复制动力学图；

图9为本发明人3型复制缺陷型重组腺病毒疫苗候选株rAd3H的电镜观察图；

图10为本发明人3型复制缺陷型重组腺病毒疫苗候选株rAd3H免疫小鼠周期简易流程 图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进 一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。 此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明中涉及的蛋白或其片段可以是重组的、天然的、合成的蛋白或其片段；本发明中 涉及的蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核 或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。

本发明人3型复制缺陷型重组腺病毒疫苗的技术路线示意图见图1所示。本发明的人3 型腺病毒复制缺陷型重组减毒疫苗候选株是以人5型复制缺陷型腺病毒为载体、针对人3型 腺病毒的疫苗，将克隆有保护性抗原基因的穿梭质粒与腺病毒骨架质粒在细菌内同源重组， 得到的重组腺病毒载体在AD293细胞中包装获得该重组腺病毒疫苗。

本发明的人3型腺病毒六邻体完整结构蛋白与复制缺陷型人3型腺病毒重组疫苗候选株 由部分缺失E1、E3区人5型腺病毒为基本骨架，在其E1区插入了人3型腺病毒的六邻体完 整结构蛋白构成。其基因结构和构建模式见图2。因为腺病毒载体较大，直接对其进行改造 十分不便，因此将其拆成骨架质粒AdEasy-1和可携带目的基因(Hexon of HAdV-3)的穿梭 质粒pShuttle-CMV-GFP两部分(购自AdEasy^TMAdenoviral Vector System)。

本发明的技术方案为：首先从临床样本中分离出我国流行的人3型腺病毒毒株培养型别 鉴定，将六邻体蛋白基因进行测序及分子进化分析，筛选代表性的基因片段。本发明中六邻 体基因抗原基因，来自于人3型腺病毒野生株HAdV-3GZ01(GenBank:DQ099432.4)。其次， 利用穿梭质粒pShuttle-CMV-GFP中多克隆位点，将HAdV-3GZ01株完整六邻体基因克隆至 穿梭质粒，获得质粒pSAd3H。再次，将其线性化后，与5型腺病毒载体骨架质粒pAdEasy-1 共同化学转化入可表达重组酶的大肠杆菌BJ5183，利用两质粒同源臂进行同源重组，获得3 型腺病毒重组载体prAd3H。第四，将线性化后prAd3H转染入AD293包装出3型重组腺病 毒病毒颗粒。肌肉注射、滴鼻2种途径免疫小鼠，同时设立野生株3型腺病毒作为免疫对照， 并加强免疫一次。中和实验测定小鼠的体液免疫水平，检测该发明疫苗预防人3型腺病毒感 染的效果及较优的免疫途径。

本发明提供的优选的具体实验方案如下实施例所示。

实施例1 3型复制缺陷型腺病毒的构建及目标蛋白的表达

1、含人3型腺病毒的六邻体基因的质粒pSAd3H的构建过程

本发明涉及的人3型腺病毒的六邻体的基因为完整的人3型腺病毒六邻体抗原基因，核 苷酸序列见SEQ ID NO.3所示，来自于人3型腺病毒野生株GZ01(GenBank:DQ099432)。 根据人3型腺病毒(HAdV-3GZ01株)六邻体蛋白核苷酸序列、穿梭质粒pShuttle-CMV-GFP 多克隆位点中的酶切位点设计一对引物：

上游外引物序列为SEQ ID No.1(Ad3-GZ01-EcoRV-HexF：TGAGATATCGCCACCATGGCCACCCCATC)所示的序列；

下游外引物序列为SEQ ID No.2(Ad3-GZ01-HexR-XhoI：AGACTCGAGTTATGTGGTGGCGTTGCC)所示的序列。

HAdV-3GZ01株六邻体片段高保真扩增体系：以HAdV-3GZ01总DNA为模板，SEQ IDNo.1，SEQ ID No.2为扩增引物(浓度为10μM)，扩增产物片段长度为2859bp，得到左右 两端分别含有EcoRV、XhoI酶切位点的人3型腺病毒六邻体蛋白核苷酸序列。PCR体系及程 序见下表所示。

PCR扩增条件：

限制性内切酶反应：以Axygen公司PCR Cleanup Kit纯化后的HAdV-3GZ01株六邻体 片段或者穿梭质粒pShuttle-CMV-GFP为模板，加入相应的NEB公司限制性内切酶，在其最 适温度过夜酶切，取2μL电泳检测酶切效果。酶切条件如下表所示。

酶切后DNA片段的切胶回收：按照Axygen公司胶回收试剂盒DNA Gel ExtractionKit 的操作说明。

T4 DNA连接酶催化的连接反应：

16℃过夜反应。

DNA的化学转化:-80℃冰箱中取100μL BJ5183感受态细胞悬液，置冰上溶解；加入适量 连接产物与感受态细胞混匀，置冰上30min；42℃水浴热击90s(注意不要摇动管)；快速转 移冰浴5min；加入900μL的LB培养基，混匀后37℃180rpm/min振摇培养60min；取 100-200μL菌液涂布于LB平板上(含筛选的卡那抗生素)，正向放置半小时后倒置37℃培 养12-16h后，挑取单个菌落进行鉴定。

将单菌落提取质粒，以EcoRV、XhoI双酶切鉴定，并测序六邻体基因正确性，筛选得到 的阳性质粒命名为pSAd3H。

2、含人3型腺病毒六邻体的5型复制缺陷型重组腺病毒质粒prAd3H的构建过程

本实施例中涉及的腺病毒骨架质粒含有除部分E1区和E3区基因以外的所有人5型腺病 毒基因组，名为pAdEasy-1。

将含有HAdV-3 GZ01株六邻体的质粒pSAd3H用PmeI酶切，37℃酶切，体系如下：

切胶回收后去磷酸化处理。通过化学转化将去磷酸化的产物和骨架质粒pAdEasy-1共转 化至大肠杆菌BJ5183中(方法同上)，利用同源臂进行同源重组。菌液涂布卡那抗性平板， 次日挑选单克隆菌落进行摇菌。利用人3型腺病毒六邻体基因的特异性引物PCR初筛阳性重 组子(引物及相关条件同步骤1中)，提取质粒，进行多种限制性内切酶分别单酶切重组腺 病毒质粒prAd3H，以pAdeasy-1作对照，鉴定重组过程中是否丢失片段或者核苷酸突变，获 得含人3型腺病毒六邻体的5型复制缺陷型重组腺病毒质粒prAd3H。重组质粒prAd3H酶切 鉴定图见图3所示，其中M：DNA marker；1：prAd3H/EcoRI；2：prAd3H/EcoRV；3：prAd3H/NotI；4：prAd3H/SalI；5：prAd3H/XhoI。

3、表达人3型腺病毒基因的重组病毒rAd3H的构建

用PacI酶37℃酶切含人3型腺病毒六邻体的5型复制缺陷型腺病毒质粒prAd3H，得到 线性化的片段。

采用脂质体Lipofectamine LTX介导DNA转染至AD293细胞，使其在细胞内包装出人 3型重组腺病毒rAd3H的病毒颗粒。该病毒是在5型复制缺陷型重组腺病毒的E1区插入了人 3型腺病毒六邻体完整结构蛋白的重组病毒，该病毒可作为疫苗，用于预防人3型腺病毒感 染。转染过程如下：

在培养瓶中复苏AD293细胞，传代到6孔板培养(设空白细胞对照)。6孔板中每孔加入2mL 5×10⁵/mL细胞；次日，待观察孔中有70％-90％粘连细胞后(约有1×10⁶个细胞)， 可进行转染；取一1.5mL Ep管，加入120μL Opti-MEM Medium，10μL LTX脂质体转染剂， 轻轻吹打5次混匀；取一1.5mL Ep管，加入120μL Opti-MEM Medium,加入2.5μg DNA，再 加入2.5μL PLUS Reagent，轻轻吹打5次混匀；取130μL含PLUS的DNA，加入稀释后的 LTX脂质体转染剂管中(体积比1:1)，轻轻吹打5次混匀，室温孵育5分钟；取250μL DNA-lipid 复合物加入6孔板的AD293细胞中；37℃培养7-10天，观察并记录CPE或荧光显微镜(激 发光488nm)下观察GFP(绿色荧光蛋白)的表达，并定期补充0.5mL完全培养基；细胞病 变完全后，将板-80℃、37℃反复冻融3次，收集病毒细胞液，500g离心10min，保存上清。 重组病毒疫苗候选株rAd3H感染AD293细胞后第八天荧光显微镜观察结果图见图4所示。

4、六邻体蛋白的表达检测

用病毒液感染AD293细胞，观察细胞病变，鉴定重组病毒的感染性。RT-PCR扩增六邻 体高变区(HVR)，检测人3型腺病毒六邻体基因的转录，Western-blot实验、间接免疫荧光 实验检测重组腺病毒中人3型腺病毒六邻体蛋白的表达。转染细胞冻融后再次感染AD293细 胞，测定重组病毒rAd3H的复制动力学,并与野生株病毒(HAdV-3GZ01株)对比，评价重 组病毒的感染性；再通过电子显微镜直接观察包装出的重组病毒形态。详细过程如下：

RT-PCR验证六邻体基因的转录，操作如下：

(1)RNA的提取：按照TAKARA公司试剂RNAiso Plus的操作说明。

A.RNAiso Plus对细胞的处理：

处理粘附细胞：a.弃上清(尽量去除干净)；b.10cm²培养皿加1-2mL RNAiso Plus，涡 旋皿，确保细胞表面被RNAiso Plus覆盖；(若细胞难以消化，可用细胞刮)；c.收集细胞至离心管，反复吹打细胞确保细胞完全悬浮，混匀充分；d.室温15-30℃静置5min,从核蛋白中分离RNA。

B.提取总RNA:a.上管中加入氯仿(0.2mL/1Ml RNAiso Plus)，盖紧盖子，震荡30s，充分混匀直至溶液变乳白色(小心液体漏出)。b.室温静置5min。c.4℃，12,000g，15min， 小心取出。溶液将会分为三层，最上层含有RNA，中间层含有大部分DNA，最下层为有机 溶剂层。d.小心吸取最上层至一新离心管，切勿触及中间层。e.加入异丙醇1mL(每1 mLRNAisoPlus)，上下颠倒10次，充分混匀后室温静置10min(或-20℃长期保存)。f.4℃， 12,000g，10min。一般离心后，试管底部会出现RNA沉淀。g.小心移除上清，切勿触及沉 淀(可残留少量异丙醇)，加入同上清体积的75％预冷的乙醇，轻轻上下颠倒10次，清洗沉 淀。4℃，7500g，5min，弃上清，切勿触及沉淀。h.开盖空气干燥沉淀数分钟，加入适量 (30ul)DEPC处理水(勿离心或者加热干燥沉淀，可能造成RNA难以溶解)。吸光度分析: OD₂₆₀/OD₂₈₀:1.7-2.1。

(2)消化DNA

a.在微量离心管中配制下列反应液：

b.37℃反应20min。

c.加入5μL 25mM EDTA(DEPE水配置，过滤除菌)，80℃加热处理2min。

d.立即开始反转或者-80℃冻存。

e.取2μL RNA作为模板，做PCR扩增HVR 1.5kb，验证DNA是否消化干净。

(3)RT反转录

a.取5×First-Strand Buffer和0.1M DTT置于室温平衡迅速融化。

b.在微量离心管中配制下列反应液：配置后，置于65℃变性5min，随后立即置于冰上 冷却5min。(HVRR：TTTCTGAAGTTCCACTCGTAGGTGTA)

c.再加入下列反应体系：

d.37℃反应2min；加1μL(200units)M-MLV；37℃反应50min；终止反应70℃，15min；-80℃保存cDNA。

(4)PCR扩增六邻体片段HVR：(HVRF1:CAGGATGCTTCGGAGTACCTGAG)

RT-PCR扩增1.7kb鉴定六邻体基因的表达图见图5所示。其中，A：M：DNA marker；1：rAd3H感染组RNA RT-PCR；2：rAd-shuttle感染组RNA RT-PCR；3：mock组RNA RT-PCR； 4：阳性对照；5：阴性对照。B：M：DNA marker；1-2：rAd3H感染组cDNA PCR；3-4：rAd-shuttle 感染组cDNA PCR；5：mock组cDNA PCR；6：阳性对照；7：阴性对照。

再进行间接免疫荧光和Western-blot实验验证重组腺病毒的六邻体抗原，操作如下：

(1)蛋白电泳及转膜：待细胞病变完全后，反复冻融3次，离心取上清，加入5×loading buffer，100℃煮沸10min后上样8％SDS-PAGE分离胶、10％SDS-PAGE浓缩胶；恒压80V 电泳，至溴酚蓝刚跑至分离胶和浓缩胶分界处时(大约需时15-20min)，停止电泳；换稳压 120V，待溴酚蓝跑到分离胶底部时，停止电泳(大约需时45min-1h)。随后及时转膜，条件为恒压25V，转40min，取出，做好标记。

(2)封闭、孵抗体及显影：转膜结束后，取出印迹膜，Wash buffer(TBST)中震摇5min， 置于含5％的脱脂牛奶的TBST封闭液中，摇床室温摇1h。后加入1:1000的鼠抗人3型腺 病毒六邻体抗体(广州医科大学广州呼吸疾病研究所惠赠)和1:1000的GAPDH抗体(Bioworld，MB001)4℃摇床上孵育过夜。次日Wash buffer中震摇5min，重复洗5次(减 少背景)。加入二抗(HRP标记的山羊抗小鼠IgG，BIOWORLDE，1:10,000稀释)孵育，室 温孵育一个小时后Wash buffer中震摇5min，重复洗5次，去除未结合二抗，务必彻底清洗， 再用去离子水震摇清洗5min。用吸水纸稍微吸干膜上的TBST，置于板上，现配混合两种显 色底物(鲁米诺和过氧化氢等体积混合，一般1mL/membrane)，将混合物覆盖在膜表面，放 置2min后放入显影仪暗箱，调整焦距，选择不同曝光时间拍摄照片，完成显影。

重组腺病毒rAd3H六邻体Western-blot检测图见图6所示，其中，A.120KDa HAdV-3hexon蛋白位置B.35KDa GAPDH内参蛋白位置。

测定3型复制缺陷型腺病毒与野生株的复制动力学，操作如下：

(1)分别提取rAd3H、Ad3病毒的核酸，通过实时荧光定量PCR，根据构建的T-penton标准质粒(其中T-penton标准质粒全序列见SEQ ID NO.4；qPCR检测用的引物序列见SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6；penton Seq见SEQ ID NO.7)，将其稀释至10¹-10⁷，根据标准曲线定 量病毒的滴度。(2)AD293细胞提前一天铺六孔板，待其细胞密度为70-80％时，加入稀释 至10³copies/μL的rAd3H、Ad3 500μL/孔(MOI＝0.01)，每个病毒做3个副孔，从12-120h 间每隔12h取一个六孔板放入-80℃冰箱，反复冻融三次，提取核酸。(3)实时荧光定量PCR 根据标准曲线定量病毒的滴度，并绘制rAd3H、Ad3的生长动力学曲线。

重组腺病毒rAd3H与野生株Ad3的复制动力学图见图8所示。结果显示：重组腺病毒rAd3H和野生株的一步动力学生长情况相似，均在48小时前迅速复制增值，48小时时DNA 复制水平达到高峰，随后维持稳定。

3型复制缺陷型腺病毒rAd3H负染后，电镜观察其形态，操作如下：

将200目的铜网放在病毒的小液滴上2-3min，吸干后放在磷钨酸的染液上2-3min，吸干 后放入40℃的烘箱中风干10min，电子显微镜观察重组病毒。结果见图9所示：电子显微镜 下观察到直径在70-90nm之间的典型的腺病毒颗粒，与文献公布的野生型腺病毒形态一致。

实施例2 3型复制缺陷型腺病毒的免疫原性

大量扩增3型复制缺陷型腺病毒，氯化铯密度梯度法纯化病毒，操作如下：

(1)收获细胞：将培养出现90％CPE的AD293细胞反复冻融3次，1000g离心10min，收集上清，-80℃冻存；(2)病毒的不连续密度梯度离心(下面所有操作均以30mL离心管 为例)：a.预冷超速离心机离心转子至4℃。b.缓慢加入8mL 1.4g/mL氯化铯至超高速离心 机配套的离心管中，再尤其轻缓地加入6mL 1.2g/mL氯化铯；c.在不连续梯度氯化铯溶液顶部加入20mL病毒收集液，若病毒液体积少于20mL，则用pH 7.9 10mmol/L Tris-HCl配平至20mL；(注意：病毒量必须少于10⁹AD293细胞中所得，否则将超过密度梯度负荷量)d.使 用分析天平，严格配平离心管，30000rpm，4℃，离心3hr；f.垂直缓慢取出离心管，直立 固定离心管；g.先从梯度顶部吸去大部分杂质；h.再小心吸取病毒带，注意避免吸取其它带 及杂质；(注意：感染性和缺陷性病毒颗粒之间区域较浑浊，切勿吸取此浑浊区。)将吸取 的病毒溶液转移至15mL离心管，进行下一步处理。(3)病毒溶液的去盐和浓缩：a.将收集 的病毒溶液转移至透析袋(分子筛为MWCO：25000Da)内，于4℃透析1hr；(透析液为： pH 8.0 10mmol/L Tris-Cl，2mmol/L MgCl₂，5％蔗糖)；b.更换透析液，4℃透析1hr，重复 透析3次以除去氯化铯盐；c.收集透析后的病毒液，0.45μm的滤膜滤器过滤；d.将不超过12mL的病毒液加入至超滤管内(Amicon Ultra-15 100kd)，4℃，3500g，离心30min，病毒 液浓缩至150-200μL；e.加入15mL 0.1mol/L Tris-Cl(pH 7.4)，4℃，3500g，离心30min； f.加入2mL 0.1mol/LTris-Cl(pH 7.4)，4℃，3500g，离心10min；此步骤重复离心洗涤2次； g.轻轻吹打3-5次超滤膜(注意不要捣破)，将过滤器中病毒浓缩液转移至EP管中，-80℃ 冻存。

将野生型腺病毒GZ01用间接免疫荧光计数法检测病毒滴度，操作如下：

(1)D0，取293细胞(或A549)消化吹打成单个细胞悬液，计数，稀释为细胞浓度为2×10⁵cells/mL，96孔板中每孔加入100μL；(2)D1，吸除细胞培养基，每个病毒稀释度 做3个复孔，每孔加入100μL病毒液，加入系列稀释(维持培养基稀释)的病毒液(10⁹– 10³)(注意：应先加NC阴性对照孔，再加实验组：先加低浓度病毒，再加高浓度病毒)； (3)置于含5％CO₂的37℃培养箱内孵育40-48hr；(4)吸除培养基，通风橱内干燥5min。 轻缓加入100μL预冷甲醇至每孔细胞用于固定，将96孔板-20℃下10min；(5)吸除甲醇， 用100μL PBST轻缓洗板3次，每次5min；第4次加入0.1mL含1％BSA的PBST，37℃ 封闭30min；(6)吸除洗液，每孔加入100μL稀释后的鼠抗人3型腺病毒六邻体抗体(用 PBST 1:1000倍稀释)，室温摇床上缓慢摇动1hr；(7)吸除抗体，用150μL PBST轻缓洗 板3次，每次5min；倒置平板于纸巾上，使其尽量干燥；(8)每孔加入100μL FITC标记 的羊抗小鼠IgG抗体(用PBST 1:200来稀释)，室温摇床上缓慢摇动孵育1hr；(9)吸除 抗体，用150μL PBST轻缓洗板3次，每次5min；(10)吸除PBST，用10×物镜观察， 荧光显微镜下计数并计算绿色阳性的细胞数目，平板室温避光保存。公式为：FFU/mL＝10ⁿ×平均GFP阳性的细胞数/孔×100(n:稀释倍数)。

重组病毒利用荧光稀释定量方法计算滴度，观察结果如图7所示。阴性对照孔荧光视野 下无绿色荧光细胞，10³倍稀释孔全视野为绿色荧光细胞，10⁶倍稀释孔平均绿色荧光细胞数 约为200多，观察结果见图7。计算公式：FFU/mL＝10ⁿ×平均GFP阳性的细胞数/孔×100 (n:稀释倍数)。

将测定滴度的3型复制缺陷型腺病毒免疫小鼠并加强免疫一次，本发明人3型复制缺陷 型重组腺病毒疫苗候选株免疫小鼠周期简易流程图见图10所示，操作如下：

(1)购买36只4-6周龄、20g左右重量的Balb/c小鼠(购自南方医科大学动物实验中心)，于IVC动物饲养系统中调整饲养一周；(2)按照一下表格进行分组分笼饲养，免疫 前：取对照组小鼠行眼球取血，作为腺病毒抗体滴度测定对照，其后免疫期间无操作，正常 饲养。(2)肌肉注射(100μL/只)：加入70μL PBS稀释30μL病毒原液，于小鼠左右后 腿肌肉丰富地方各注射50μL；(3)戊巴比妥钠麻醉小鼠后，左右鼻孔交替缓慢滴加30μL 病毒原液；(4)两组实验组小鼠在第14天分别进行加强免疫；(5)在第21、28、35、42 天，两组实验组小鼠随机分别取2只小鼠，空白对照组取一只，进行摘眼球取血，血液静置 10min后，离心1200g，15min收集上清血清，混匀后，-80℃冻存备用。

将收集的小鼠血清行微量中和试验-血清中和抗体滴度测定，操作如下：

(1)测定HAdV-3GZ01病毒液的TCID₅₀；(2)D1：取1管测好TCID₅₀的病毒液，用 无血清DMEM培养基稀释为200个TCID₅₀/100μL的病毒悬液(准备3-3.5mL，4℃保存)； (3)血清预处理：56℃30min灭活补体；倍比稀释血清；(4)分别把每个稀释度的血清加 到4个孔，每孔50μL；再每个well加入50μL稀释后的病毒(100TCID₅₀/50μL)；混匀，37℃ 1h；(6)同时，消化、传代细胞，计数，用2％FBS DMEM维持培养基稀释细胞为2×10⁵cells/mL； 在血清病毒中和孵育1h后，每孔加入100μL细胞；(7)每日观察并记录CPE；第6天记录 出现CPE的孔数。(8)血清50％中和滴度计算，按Reed-Muench两氏法进行，距离比例＝ (高于50％病变率的百分数-50％)/(高于50％病变率的百分数-低于50％病变率的百分数)； lgTCID₅₀＝距离比例×稀释度对数之间的差+高于50％病变率的稀释度的对数，最后换算成稀 释倍数(如1/128，滴度即为128)。结果如下表：

重组腺病毒株rAd3H免疫后小鼠血清中和效价较低，滴鼻免疫组第1周血清效价较后三 周血清效价高，其后三周呈下降趋势，但总体效价变化幅度不大。肌肉注射免疫组较滴鼻组 效价高，第3周效价有小幅度升高，第四周有所降低。两种免疫方式中肌肉注射免疫获得血 清效价较高。

野生株HAdV-3GZ01因为是复制型的活病毒，所以免疫后小鼠血清中和效价较重组病毒 株免疫高，鼻滴免疫组前三周呈平稳趋势，第4周有所下降；肌肉注射免疫组较滴鼻组效价 高，第3周效价有小幅度升高，第四周有所降低。两种免疫方式中肌肉注射免疫获得血清效 价较高。

中和试验证实3型复制缺陷型腺病毒疫苗所免疫的小鼠，其血清可产生针对3型腺病毒 的中和抗体，可用于3型腺病毒感染的预防，免疫的较优途径为肌肉注射。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原 则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广东龙帆生物科技有限公司

<120> 一种人3型腺病毒复制缺陷型重组病毒、构建方法及应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Ad3-GZ01-EcoRV-HexF)

<400> 1

tgagatatcg ccaccatggc caccccatc 29

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Ad3-GZ01-HexR-XhoI)

<400> 2

agactcgagt tatgtggtgg cgttgcc 27

<210> 3

<211> 2835

<212> DNA

<213> 人3型腺病毒的六邻体(DNA)

<400> 3

atggccaccc catcgatgat gccccaatgg gcatacatgc acatcgccgg acaggatgct 60

tcggagtacc tgagtccggg tctggtgcag ttcgcccgtg caacagacac ctacttcagt 120

atggggaaca aatttagaaa ccccacagtg gcgcccaccc acgatgtgac caccgatcgt 180

agccagcgcc tgatgctgcg cttcgtgccc gttgaccggg aagacaatac ctactcttac 240

aaagttcgct acacgctggc tgtaggcgac aacagagtgc ttgacatggc cagcacattc 300

tttgacattc ggggggtgct tgatagaggt cctagcttca agccatattc cggcacagct 360

tacaattcac tcgctcctaa gggcgcgccc aatacatctc agtggatagt tacaacgaat 420

cgagacaatg cagtaactac caccacaaac acatttggca ttgcttccat gaagggagac 480

aatattacta aagaaggttt gcaaattggg aaagacatta ccactactga aggagaagaa 540

aagcccattt atgccgataa aacatatcag ccagagcctc aagttggaga agaatcatgg 600

actgatactg atggaacaaa tgaaaagttt ggtggaagag cccttaaacc agctaccaac 660

atgaagccat gctacgggtc ttttgcaaga cctacaaaca taaaaggggg ccaagctaaa 720

aacagaaaag taaaaccaac aaccgaagga ggggttgaaa ctgaggaacc agatattgat 780

atggaatttt tcgatggtag ggatgctgtt gcaggagctt tagcgcctga aattgtgctt 840

tatacggaaa atgtaaattt ggaaactcca gacagtcatg tggtatataa accaggaacg 900

tctgataact ctcatgcaaa tttgggtcaa caagccatgc ctaacagacc caattacatt 960

ggattcaggg ataactttgt aggcctaatg tactacaaca gtactggaaa tatgggagtt 1020

ttggctggcc aagcatcaca actgaatgca gtggttgact tgcaggacag aaatactgaa 1080

ctgtcatatc agcttttgct tgattctctg ggagacagaa ccagatactt cagcatgtgg 1140

aatcaggctg tggacagtta cgatcccgat gttcgcatta ttgaaaatca tggcatcgag 1200

gatgaactgc ctaattactg ttttcctctg gatggcatag gaccagggca caggtatcaa 1260

ggcattaaag ttaaaaccga tgacgctaat ggatgggaaa aagatgctaa tgttgataca 1320

gctaatgaaa tagccatagg aaacaacctg gctatggaaa ttaatatcca agctaacctt 1380

tggagaagtt ttctgtactc caatgtggct ttgtaccttc cagatgttta caagtacacg 1440

ccacctaaca ttactttgcc cactaacacc aacacctatg agtacatgaa cgggcgagtg 1500

gtatccccat ctctggttga ttcatacatc aacatcggcg ccaggtggtc tcttgaccca 1560

atggacaatg tgaatccatt caaccaccac cgcaatgctg gtctgcgcta caggtccatg 1620

cttctgggaa atggtcgtta tgtgcctttc cacatacaag tgcctcaaaa attctttgct 1680

gtcaaaaacc tacttcttct acctggctcc tacacctacg agtggaactt cagaaaggat 1740

gtgaacatgg tcctgcaaag ttcccttgga aatgacctca gaacagatgg tgctaccata 1800

agtttcacca gcatcaatct ctatgccacc ttcttcccca tggctcacaa cacagcttcc 1860

acccttgaag ccatgctgcg caacgatacc aatgatcagt catttaacga ctacctctct 1920

gcagctaaca tgctttaccc cattcctgcc aatgcaacca acattccaat ttccatccca 1980

tctcgcaact gggcagcctt caggggctgg tccttcacca ggctcaaaac caaggagact 2040

ccatctcttg gatcagggtt cgatccctac ttcgtatatt ctggatctat tccctacctg 2100

gatggcacct tctaccttaa ccacactttc aagaaggtct ccatcatgtt tgactcctca 2160

gtcagctggc ctggcaatga caggctgttg agcccaaatg agtttgaaat caagcgcact 2220

gtggacgggg aaggatacaa cgtggcacaa tgcaacatga ccaaagactg gttcctagtt 2280

cagatgcttg ccaactacaa cattggctac cagggctttt acatccctga gggatacaag 2340

gatcgcatgt actctttttt cagaaacttc cagcctatga gcaggcaggt ggttgatgag 2400

gttaattaca ctgactacaa agccgtcacc ttaccatacc aacacaacaa ctctggcttt 2460

gtagggtacc ttgcacctac tatgagacaa ggggaacctt acccagccaa ttatccatac 2520

ccgctcatcg gaactactgc cgttaagagt gttacccaga aaaagttcct gtgcgacagg 2580

accacgtggc gcattccctt ctccagcaac ttcatgtcca tgggggccct taccgacctg 2640

ggacagaaca tgctctatgc caactcagcc catgcgctgg acatgacttt tgaggtggat 2700

cccatggatg agcccaccct gctttatctt cttttcgaag tcttcgacgt ggtcagagtg 2760

caccagccac accgcggcgt catcgaggcc gtctacctgc gcacaccgtt ctcggccggc 2820

aacgccacca cataa 2835

<210> 4

<211> 2834

<212> DNA

<213> 全序列(T-penton)

<400> 4

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa gcttgcatgc ctgcaggtcg 420

acgataccac cgtcagtgaa aacgttcctg ctctcacaga tcacgggacg ctaccgctgc 480

gcaacagcat cggaggagtc cagcgagtga ccattactga cgccagacgc cgcacctgcc 540

cctacgttta caaggccctg ggcatatatc tctagaggat ccccgggtac cgagctcgaa 600

ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca 660

caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact 720

cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct 780

gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc 840

ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca 900

ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg 960

agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca 1020

taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa 1080

cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc 1140

tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc 1200

gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 1260

gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg 1320

tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag 1380

gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta 1440

cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg 1500

aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt 1560

tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt 1620

ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag 1680

attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat 1740

ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc 1800

tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat 1860

aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc 1920

acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag 1980

aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag 2040

agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt 2100

ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg 2160

agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt 2220

tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc 2280

tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc 2340

attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa 2400

taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg 2460

aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc 2520

caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag 2580

gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt 2640

cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt 2700

tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc 2760

acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac 2820

gaggcccttt cgtc 2834

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(pentonF)

<400> 5

accaccgtca gtgaaaacg 19

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(pentonR)

<400> 6

tatgcccagk gccttgt 17

<210> 7

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列(penton Seq)

<400> 7

accaccgtca gtgaaaacgt tcctgctctc acagatcacg ggacgctacc gctgcgcaac 60

agcatcggag gagtccagcg agtgaccatt actgacgcca gacgccgcac ctgcccctac 120

gtttacaagg ccctgggcat a 141

Claims (8)

1.一种人3型腺病毒复制缺陷型重组病毒，其特征在于：所述人3型腺病毒复制缺陷型重组病毒以人5型复制缺陷型的腺病毒pAdEasy-1为载体，所述人5型复制缺陷型的腺病毒的基因组缺失部分E1区和E3区基因，且在E1区位置插入了人3型腺病毒六邻体完整基因，并在AD293细胞中包装得到重组病毒。

2.根据权利要求1所述的一种人3型腺病毒复制缺陷型重组病毒，其特征在于：所述人3型腺病毒六邻体完整基因的核苷酸序列见SEQ ID NO.3。

3.一种如权利要求1或2所述的人3型腺病毒复制缺陷型重组病毒的制备方法，其特征在于，包括：将含有人3型腺病毒六邻体完整基因的穿梭质粒pShuttle-CMV-GFP质粒与腺病毒骨架质粒在细菌内同源重组，得到的重组腺病毒载体在AD293细胞中包装获得该重组腺病毒疫苗；所述腺病毒骨架质粒为缺失部分E1区和E3区基因的人5型腺病毒载体pAdEasy-1。

4.根据权利要求3所述的人3型腺病毒复制缺陷型重组病毒的制备方法，其特征在于，包括：将SEQ ID NO.3所示的3型腺病毒六邻体完整基因片段克隆至穿梭质粒，获得质粒pSAd3H；将pSAd3H与人5型腺病毒载体骨架质粒转化入可表达重组酶的大肠杆菌，利用两质粒同源臂进行同源重组，获得3型腺病毒重组载体prAd3H；

将线性化后prAd3H转染入AD293包装出人3型腺病毒复制缺陷型重组病毒颗粒。

5.根据权利要求4所述的人3型腺病毒复制缺陷型重组病毒的制备方法，其特征在于：所述可表达重组酶的大肠杆菌为大肠杆菌BJ5183。

6.如权利要求4-5任一所述的人3型腺病毒复制缺陷型重组病毒的制备方法在制备人3型腺病毒复制缺陷型重组病毒中的应用。

7.如权利要求1或2所述的人3型腺病毒复制缺陷型重组病毒在制备治疗或预防3型腺病毒感染疾病的药物或疫苗中的应用。

8.根据权利要求7所述的人3型腺病毒复制缺陷型重组病毒在制备治疗或预防3型腺病毒感染疾病的药物或疫苗中的应用，其特征在于：所述药物或疫苗的剂型为注射剂、滴鼻剂。

Images