CN110117622B - 一种CRISPR/Cas基因编辑系统及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种CRISPR/Cas基因编辑系统及其制备方法和应用，属于基因编辑技术领域，所述CRISPR/Cas基因编辑系统包括pcDNA3.1‑LjCas9质粒和pLjCas9‑sgRNA质粒。所述应用包括以下步骤：确定靶标序列，设计单链寡核苷酸对；退火获得双链DNA片段；连接到pLjCas9‑sgRNA质粒中获得靶标序列sgRNA表达载体；靶标序列sgRNA表达载体与pcDNA3.1‑LjCas9质粒共转染细胞后培养。所述基因编辑系统能够对靶标DNA进行特异性切割，编辑效率高。

Description

一种CRISPR/Cas基因编辑系统及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，尤其涉及一种CRISPR/Cas基因编辑系统及其制备方法和应用。

背景技术

ZFN、TALEN及CRISPR/Cas9打靶技术是目前研究较为成熟的几种基因组修饰技术。(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)是细菌和古细菌一种不断进化适应的免疫防御机制。CRISPR/Cas9利用一段小RNA来识别并剪切DNA以降解外来核酸分子。Cong等(MultiplexGenome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.Science.2013)及Mali等(RNA-guidedhuman genome engineering via Cas9.Science.2013)证明Cas9系统能在293T、K562、iPS等多种细胞中，进行有效的靶向酶切，非同源重组(NHEJ)、同源重组(HR)效率在3-25％之间，与TALEN酶切效果相当，但效率仍待进一步提升。如果能够开发出效率更高的CRISPR/Cas系统，将促进基因编辑技术的发展和产业化应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高效的CRISPR/Cas基因编辑系统及其制备方法和应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种CRISPR/Cas基因编辑系统，包括pcDNA3.1-LjCas9质粒和pLjCas9-sgRNA质粒；

所述pcDNA3.1-LjCas9质粒包括初始质粒pcDNA3.1(+)和编码LjCas9的DNA片段；

所述pLjCas9-sgRNA质粒包括初始质粒pUC57和sgRNA通用表达框DNA片段。

优选的，所述编码LjCas9的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选的，sgRNA通用表达框DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

优选的，所述pLjCas9-sgRNA质粒的核苷酸序列如SEQ ED NO：3所示。

本发明提供了所述的基因编辑系统的制备方法，包括以下步骤：

将编码LjCas9的DNA片段插入到初始质粒pcDNA3.1(+)中构建获得pcDNA3.1-LjCas9质粒；

将sgRNA通用表达框DNA片段插入到初始质粒pUC57中获得pLjCas9-sgRNA质粒。

优选的，步骤1)中所述编码LjCas9的DNA片段的插入位点为初始质粒pcDNA3.1(+)的BamH I酶切位点和EcoR I酶切位点之间；步骤2)中所述sgRNA通用表达框DNA片段的插入位点为初始质粒pUC57的EcoRV酶切位点。

本发明提供了所述的基因编辑系统在基因编辑中的应用，包括以下步骤：

1)确定待编辑基因的靶标序列，并根据所述靶标序列设计所述靶标序列的单链寡核苷酸对；

2)将所述单链寡核苷酸对退火获得双链DNA片段；

3)将所述双链DNA片段连接到pLjCas9-sgRNA质粒中获得靶标序列sgRNA表达载体；

4)将所述靶标序列sgRNA表达载体与所述pcDNA3.1-LjCas9质粒共转染细胞后培养36～60h。

优选的，步骤1)中所述靶标序列的长度为15～25bp。

优选的，所述靶标序列sgRNA表达载体与所述pcDNA3.1-LjCas9质粒质量的比例为(1～5)：(1～5)。

优选的，步骤3)中所述双链DNA片段与pLjCas9-sgRNA质粒通过酶切后连接；所述酶切用酶为BbsⅠ酶。

本发明的有益效果：本发明提供的CRISPR/Cas基因编辑系统，包括pcDNA3.1-LjCas9质粒和pLjCas9-sgRNA质粒；所述pcDNA3.1-LjCas9质粒包括初始质粒pcDNA3.1(+)和编码LjCas9的DNA片段；所述pLjCas9-sgRNA质粒包括初始质粒pUC57和sgRNA通用表达框DNA片段。所述基因编辑系统能够对靶标DNA进行特异性切割，编辑效率高。

进一步的，本发明中所述sgRNA通用表达框DNA片段包括顺次连接的U6启动子序列、转录起始信号、spacer克隆位点、sgRNA下游序列、U6终止子序列和bGH polyA序列；所述sgRNA通用表达框包含两个连续的转录终止信号，即U6终止子编码序列和bGH polyA序列，可增加sgRNA的转录效率；能够显著提高sgRNA在细胞中的表达效率，从而提高基因编辑效率。根据实施例的记载，本发明提供的CRISPR/Cas基因编辑系统的敲出率高达60～70％。

附图说明

图1为实施例2中pLjCas9-T1质粒与pcDNA3.1-LjCas9载体共转染细胞产生的序列突变；

图2为实施例3中pLjCas9-T2质粒与pcDNA3.1-LjCas9载体共转染细胞产生的序列突变；

图3为实施例4中pLjCas9-T3质粒与pcDNA3.1-LjCas9载体共转染细胞产生的序列突变。

具体实施方式

本发明提供了一种CRISPR/Cas基因编辑系统，包括pcDNA3.1-LjCas9质粒和pLjCas9-sgRNA质粒；所述pcDNA3.1-LjCas9质粒包括初始质粒pcDNA3.1(+)和编码LjCas9的DNA片段；所述pLjCas9-sgRNA质粒包括初始质粒pUC57和sgRNA通用表达框DNA片段。

在本发明中，所述pcDNA3.1-LjCas9质粒包括初始质粒pcDNA3.1(+)和编码LjCas9的DNA片段；本发明对所述初始质粒pcDNA3.1(+)的来源没有特殊限定，优选的采用市售产品。本发明中，所述编码LjCas9的DNA片段的核苷酸序列优选的如SEQ ID NO：1所示。本发明中，所述编码LjCas9的DNA片段的插入位点优选为初始质粒pcDNA3.1(+)的BamH I酶切位点和EcoR I酶切位点之间。

在本发明中，所述pLjCas9-sgRNA质粒包括初始质粒pUC57和sgRNA通用表达框DNA片段。在本发明中，所述初始质粒pUC57优选的来源是市售商品；所述sgRNA通用表达框DNA片段包括顺次连接的U6启动子序列、转录起始信号、spacer克隆位点、sgRNA下游序列、U6终止子编码序列和bGHpolyA序列；所述sgRNA通用表达框DNA片段优选的将上述序列整合后进行调整，所述sgRNA通用表达框DNA片段的核苷酸序列优选的如SEQ ID NO：2所示。在本发明中，所述sgRNA通用表达框DNA片段优选的插入初始质粒pUC57的EcoRV酶切位点。本发明中，所述pLjCas9-sgRNA质粒的核苷酸序列最优选的如SEQ ED NO：3所示。

本发明提供了所述的基因编辑系统的制备方法，包括以下步骤：

将编码LjCas9的DNA片段插入到初始质粒pcDNA3.1(+)中构建获得pcDNA3.1-LjCas9质粒；

将sgRNA通用表达框DNA片段插入到初始质粒pUC57中获得pLjCas9-sgRNA质粒。

在本发明中，所述编码LjCas9的DNA片段的插入位点为初始质粒pcDNA3.1(+)的BamH I酶切位点和EcoR I酶切位点之间；在本发明中，所述插入优选的通过将所述编码LjCas9的DNA片段和初始质粒pcDNA3.1(+)分别进行双酶切后进行连接；所述双酶切用酶为BamH I酶和EcoR I酶。本发明中，所述酶切的体系以50μL计，优选的包括BamH I酶1μL；EcoRI酶1μL，编码LjCas9的DNA片段1μg，Buffer H 5μL和余量的双蒸水。在本发明中，所述酶切体系中的试剂优选的购自宝生物工程(大连)有限公司。本发明在所述酶切后将酶切产物进行连接。在本发明中，所述连接的体系以10μL计，优选的包括T4DNA连接酶1μL，T4DNA连接Buffer1μL，编码LjCas9的DNA片段的酶切产物4μL，初始质粒pcDNA3.1(+)酶切产物4μL；所述连接过程中所用试剂优选的购自NEB公司，货号M0202S；所述连接的温度优选为4℃，所述连接的时间优选为10～14h。本发明在获得所述pcDNA3.1-LjCas9质粒后优选的将所述质粒导入大肠杆菌感受态细胞中进行克隆，本发明对所述克隆的具体操作没有特殊限定，采用本领域常规的操作即可。

本发明将sgRNA通用表达框DNA片段插入到初始质粒pUC57中获得pLjCas9-sgRNA质粒。在本发明中，所述sgRNA通用表达框DNA片段的插入位点优选为初始质粒pUC57的EcoRV酶切位点；本发明对所述sgRNA通用表达框DNA片段插入到初始质粒pUC57中的方法没有特殊限定，按照本领域常规的酶切连接法插入自行制备或委托生物公司进行合成。在本发明的一个具体实施过程中，委托生工生物工程(上海)股份有限公司制备pLjCas9-sgRNA质粒。

本发明还提供了所述的基因编辑系统在基因编辑中的应用，包括以下步骤：1)确定待编辑基因的靶标序列，并根据所述靶标序列设计所述靶标序列的单链寡核苷酸对；2)将所述单链寡核苷酸对退火获得双链DNA片段；3)将所述双链DNA片段连接到pLjCas9-sgRNA质粒中获得靶标序列sgRNA表达载体；4)将所述靶标序列sgRNA表达载体与所述pcDNA3.1-LjCas9质粒共转染细胞后培养36～60h。

在本发明中，首先确定待编辑基因的靶标序列；本发明对所述待编辑基因没有特殊限定，任何哺乳动物细胞中的基因均可作为待编辑的基因；在本发明中，所述靶标序列的长度优选为15～25bp，更优选为18～22bp。本发明在确定靶标序列后，根据所述靶标序列设计所述靶标序列的单链寡核苷酸对；在本发明中，所述单链寡核苷酸对通过如下规则设计：正向寡核苷酸序列为在靶标序列5’端加上CACCG(若靶标序列5’端末端为G，则省去最后一个G，即仅加上CACC)，反向寡核苷酸为在靶标序列的反向互补序列5’端加上AAAC、3’端加上C(若靶标序列5’端末端为G，则3’端不加C)。

本发明在获得所述单链寡核苷酸对后，将所述单链寡核苷酸对退火获得双链DNA片段。在本发明中，所述单链寡核苷酸对优选的委托生物科技公司进行合成。在本发明中，所述退火的具体步骤和条件为：95℃5min，72℃10min，置冰上。

本发明将所述双链DNA片段连接到pLjCas9-sgRNA质粒中获得靶标序列sgRNA表达载体；在本发明中，所述双链DNA片段与pLjCas9-sgRNA质粒通过酶切后连接；所述酶切用酶为BbsⅠ酶。本发明对所述酶切和连接的具体方法和参数没有特殊限定，采用本领域常规的酶切和连接的方法和参数即可。

本发明在获得靶标序列sgRNA表达载体后，将所述靶标序列sgRNA表达载体与所述pcDNA3.1-LjCas9质粒共转染细胞后培养24～72h。在本发明中，所述靶标序列sgRNA表达载体与所述pcDNA3.1-LjCas9质粒的质量比例优选为(1～5)：(1～5)。在本发明中，所述细胞优选为哺乳动物细胞，在本发明的一个优选的具体实施例中，所述细胞为迪庆绵羊皮肤上皮细胞系DQSHS1，购自中国科学院昆明细胞库，编号：KCB 94026。本发明中，所述培养的时间优选为24～72h，更优选为48h。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

CRISPR/Cas基因编辑系统的构建

1.质粒载体pcDNA3.1-LjCas9的构建

合成4185bp的编码LjCas9的DNA片段(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)，通过BamHI、EcoR I双酶切插入到pcDNA3.1(+)中，获得pcDNA3.1-LjCas9载体。

BamH I酶购自宝生物工程(大连)有限公司，货号1010S、EcoR I酶购自宝生物工程(大连)有限公司，货号1040S

酶切体系：50μL，试剂购自宝生物工程(大连)有限公司)：BamH I酶1μL，EcoR I酶1μL，编码LjCas9的DNA片段或cDNA3.1(+)质粒1μg，Buffer H 5μL，补加双蒸水至50μL。酶切温度为37℃，酶切时间为3h。

连接的步骤和参数：

连接体系(10μL，连接试剂购自NEB公司，货号M0202S)：1μL T4DNA连接酶，1μLT4DNA连接Buffer，4μL编码LjCas9的DNA片段(4.2kb)，4μL pcDNA3.1(+)载体(5.4kb)。

连接条件：4℃过夜。

转化的步骤和参数：

将5μL连接产物加入50μL感受态细胞(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号9057)中，轻弹混匀，于冰上静置30min，42℃热激90S，于冰上静置2min，添加500μL的LB培养基，置于37℃摇床中以200转/min的转速复苏1h，取100μL复苏菌液均匀涂抹于含有60mg/mL氨苄青霉素的固体LB培养基上，37℃静置培养12～16h。

挑菌：在上一步的固体LB培养板中挑取单菌落5～10个，置于1mL含60mg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，在37℃摇床中以200转/min的转速培养2～3h，用于测序。测序验证正确的进行后续实验。

2.质粒载体pLjCas9-sgRNA的构建

向导RNA通用表达载体pLjCas9-sgRNA序列构成：

sgRNA表达载体(U6启动子):合成序列，见pX335序列中中1-249(U6启动子)+G(转录起始信号)+spacer克隆位点(两个反向的Bbs1位点，两个Bbs1位点之间插入330bp随机序列)+sgRNA下游序列+U6终止子+bGH polyA终止信号。

U6启动子序列：

gagggcctat ttcccatgat tccttcatatttgcatatac gatacaaggc tgttagagag

ataattggaattaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgatttcttggctttatatatctt gtggaaagga

cgaaacacc(SEQ ID NO：4)

转录起始信号：G

spacer克隆位点：gggtcttcg(SEQ ID NO：5)

随机序列：

ggcgagctgcacgctgccgtcctcgatgttgtggcggatcttgaagttcaccttgatgccgttcttctgcttgtcggccatgatatagacgttgtggctgttgtagttgtactccagcttgtgccccaggatgttgccgtcctccttgaagtcgatgcccttcagctcgatgcggttcaccagggtgtcgccctcgaacttcacctcggcgcgggtcttgtagttgccgtcgtccttgaagaagatggtgcgctcctggacgtagccttcgggcatggcggacttgaagaagtcgtgctgcttcatgtggtcggggtagcggctgaagca(SEQ ID NO：6)

spacer克隆位点：agaagacctgc(SEQ ID NO：7)

sgRNA下游序列：

ttttgaagggttgttaaatcagtaagttaaaaatttcaatttactgatttaacaaccttatttttaaatcaagcaaggctttcgggccgagttttcavatgtgtaccgcttatagcggtttttttttt(SEQ ID NO：8)

U6终止子：tttttt(SEQ ID NO：9)

bGH polyA终止信号：

ctag agctcgctgatcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc

ccccgtgccttccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga

ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca

ggacagcaag ggggaggatt gggaagagaatagcaggcat gctgggga(SEQ ID NO：10)

获得964bp的sgRNA通用表达框整理后序列如SEQ ID NO：2所示。

gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgggtcttcgggcgagctgcacgctgccgtcctcgatgttgtggcggatcttgaagttcaccttgatgccgttcttctgcttgtcggccatgatatagacgttgtggctgttgtagttgtactccagcttgtgccccaggatgttgccgtcctccttgaagtcgatgcccttcagctcgatgcggttcaccagggtgtcgccctcgaacttcacctcggcgcgggtcttgtagttgccgtcgtccttgaagaagatggtgcgctcctggacgtagccttcgggcatggcggacttgaagaagtcgtgctgcttcatgtggtcggggtagcggctgaagcaagaagacctgttttgaaggttgttaaatcagtaagttgaaaaatttcaatttactgatttaacaaccttatttttaaatcaagcaaggctttcgggccgagttttcacatgtgtaccgcttatagcggttttttttttttttttctagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagagaatagcaggcatgctgggga

将上述964bp序列交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并克隆到pUC57载体上(克隆位置为EcoRV酶切位点，432-433bp之间)，获得pLjCas9-sgRNA质粒。

pLjCas9-sgRNA载体全序列长3674bp，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，具体下：

tcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattcgagctcggtacctcgcgaatgcatctagatgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgggtcttcgggcgagctgcacgctgccgtcctcgatgttgtggcggatcttgaagttcaccttgatgccgttcttctgcttgtcggccatgatatagacgttgtggctgttgtagttgtactccagcttgtgccccaggatgttgccgtcctccttgaagtcgatgcccttcagctcgatgcggttcaccagggtgtcgccctcgaacttcacctcggcgcgggtcttgtagttgccgtcgtccttgaagaagatggtgcgctcctggacgtagccttcgggcatggcggacttgaagaagtcgtgctgcttcatgtggtcggggtagcggctgaagcaagaagacctgttttgaaggttgttaaatcagtaagttgaaaaatttcaatttactgatttaacaaccttatttttaaatcaagcaaggctttcgggccgagttttcacatgtgtaccgcttatagcggttttttttttttttttctagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagagaatagcaggcatgctggggaatcggatcccgggcccgtcgactgcagaggcctgcatgcaagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtc

实施例2

CRISPR/Cas基因编辑系统在在哺乳动物细胞系基因编辑中的应用

迪庆绵羊皮肤上皮细胞系DQSHS1，购自中国科学院昆明细胞库，编号：KCB 94026。

1、sgRNA靶点设计

在绵羊6号染色体(NCBI GI:417531944)的序列中提取绵羊DKK2基因第一外显子的编码区(18259978-18260199，如下所示)，设计靶标位点。

靶标序列T1：

gctcacagttcggcagctcg(74-93)(SEQ ID NO：12)

2、sgRNA表达质粒对的构建

首先根据设计的靶标序列送公司合成单链寡核苷酸，具体序列如下：

Tj1-F：caccgctcacagttcggcagctcg(SEQ ID NO：13)

Tj1-R：aaaccgagctgccgaactgtgagc(SEQ ID NO：14)

Tj1-F与Tj1-R退火获得带粘性末端的双链DNA短片段，经BbsⅠ酶切，连入pLjCas9-sgRNA载体中(pLjCas9-sgRNA同时使用BbsⅠ酶切，产生3.3kb和0.3kb片段，回收3.3kb片段与双链DNA短片段连接)，获得T1靶标序列sgRNA的表达载体pLjCas9-T1。

菌落PCR通用引物对(获得375bp片段者为阳性，获得705bp片段者为阴性，PA-R为测序引物)：

U6-F:5'cttgggtagtttgcagtt 3'(SEQ ID NO：15)

PA-R:5'cagtgggagtggcacctt 3'(SEQ ID NO：16)

测序验证方法：使用测序引物PA-R进行常规测序，测序结果与相应靶标的正向寡核苷酸Tj1-F进行比对，同源性为100％者判定为正确的质粒。

将pLjCas9-T1与pcDNA3.1-LjCas9载体按照1:1的质量比例转染迪庆绵羊皮肤上皮细胞系DQSHS1，48h后，提取细胞基因组DNA，使用引物对DKK2-F、DKK2-R进行PCR扩增，对获得的440bp的PCR产物进行克隆测序。共挑取10个单克隆菌落测序，原始序列测序结果如下：cgcggtgctgatggtggagagctcacagttcggcagctcgcgggccaaactcaactccat(SEQ ID NO：17)，其中分别有6个单克隆的序列发生改变，序列有不同程度的敲除(如附图1所示)。该结果表明，pLjCas9-T1与pcDNA3.1-LjCas9载体混合转染对迪庆绵羊皮肤上皮细胞系DQSHS1的敲除效率达到60％，这一结果说明，本实验构建的CRISPR/LjCas9系统效率较高，可以识别20bp左右的靶标DNA序列并开展特异性切割，产生特定基因的序列突变。

实施例3

CRISPR/Cas基因编辑系统在在哺乳动物细胞系基因编辑中的应用

迪庆绵羊皮肤上皮细胞系DQSHS1，购自中国科学院昆明细胞库，编号：KCB 94026。

1、sgRNA靶点设计

在绵羊6号染色体(NCBI GI:417531944)的序列中提取绵羊DKK2基因第一外显子的编码区(18259978-18260199，如下所示)，设计靶标位点。

靶标序列T2：

gctctccaccatcagcaccg(75-56)(SEQ ID NO：18)

2、sgRNA表达质粒对的构建

首先根据设计的靶标序列送公司合成单链寡核苷酸，具体序列如下：

Tj2-F：caccgctctccaccatcagcaccg(SEQ ID NO：19)

Tj2-R：aaaccggtgctgatggtggagagc(SEQ ID NO：20

Tj2-F与Tj2-R退火获得带粘性末端的双链DNA短片段，经BbsⅠ酶切，连入pLjCas9-sgRNA载体中(pLjCas9-sgRNA同时使用BbsⅠ酶切，产生3.3kb和0.3kb片段，回收3.3kb片段与双链DNA短片段连接)，获得T2靶标序列sgRNA的表达载体pLjCas9-T2。

菌落PCR通用引物对(获得375bp片段者为阳性，获得705bp片段者为阴性，PA-R为测序引物)：

U6-F:5'CTTGGGTAGTTTGCAGTT 3'(SEQ ID NO：15)

PA-R:5'CAGTGGGAGTGGCACCTT 3'(SEQ ID NO：16)

测序验证方法：使用测序引物PA-R进行常规测序，测序结果与相应靶标的正向寡核苷酸Tj2-F进行比对，同源性为100％者判定为正确的质粒。

将pLjCas9-T2与pcDNA3.1-LjCas9载体按照1:1的质量比例转染迪庆绵羊皮肤上皮细胞系DQSHS1，48h后，提取细胞基因组DNA，使用引物对DKK2-F、DKK2-R进行PCR扩增，对获得的440bp的PCR产物进行克隆测序。共挑取10个单克隆菌落测序，原始序列测序结果如下：ctgcctgctcctactggccgcggtgctgatggtggagagctcacagttcggcagctcgcg(SEQ ID NO：21)，其中分别有7个单克隆的序列发生改变，序列有不同程度的敲除(如附图2所示)。该结果表明，pLjCas9-T2与pcDNA3.1-LjCas9载体混合转染对迪庆绵羊皮肤上皮细胞系DQSHS1的敲除效率达到70％，这一结果说明，本实验构建的CRISPR/LjCas9系统效率较高，可以识别20bp左右的靶标DNA序列并开展特异性切割，产生特定基因的序列突变。

实施例4

CRISPR/Cas基因编辑系统在在哺乳动物细胞系基因编辑中的应用

迪庆绵羊皮肤上皮细胞系DQSHS1，购自中国科学院昆明细胞库，编号：KCB 94026。

1、sgRNA靶点设计

在绵羊6号染色体(NCBI GI:417531944)的序列中提取绵羊DKK2基因第一外显子的编码区(18259978-18260199，如下所示)，设计靶标位点。

靶标序列T3：

caactccatcaagtcctctc(105-124)(SEQ ID NO：22)

2、sgRNA表达质粒对的构建

首先根据设计的靶标序列送公司合成单链寡核苷酸，具体序列如下：

Tj3-F：caccgcaactccatcaagtcctctc(SEQ ID NO：23)

Tj3-R：aaacgagaggacttgatggagttgc(SEQ ID NO：24)

Tj3-F与Tj3-R退火获得带粘性末端的双链DNA短片段，经BbsⅠ酶切，连入pLjCas9-sgRNA载体中(pLjCas9-sgRNA同时使用BbsⅠ酶切，产生3.3kb和0.3kb片段，回收3.3kb片段与双链DNA短片段连接)，获得T1靶标序列sgRNA的表达载体pLjCas9-T1。

菌落PCR通用引物对(获得375bp片段者为阳性，获得705bp片段者为阴性，PA-R为测序引物)：

U6-F:5'CTTGGGTAGTTTGCAGTT 3'(SEQ ID NO：15)

PA-R:5'CAGTGGGAGTGGCACCTT 3'(SEQ ID NO：16)

测序验证方法：使用测序引物PA-R进行常规测序，测序结果与相应靶标的正向寡核苷酸Tj3-F进行比对，同源性为100％者判定为正确的质粒。

将pLjCas9-T3与pcDNA3.1-LjCas9载体按照1:1的质量比例转染迪庆绵羊皮肤上皮细胞系DQSHS1，48h后，提取细胞基因组DNA，使用引物对DKK2-F、DKK2-R进行PCR扩增，对获得的440bp的PCR产物进行克隆测序。共挑取10个单克隆菌落测序，原始序列测序结果如下：ggcagctcgcgggccaaactcaactccatcaagtcctctctgggcggggagacgcctgcc(SEQ ID NO：25)，其中分别有6个单克隆的序列发生改变，序列有不同程度的敲除(如附图3所示)。该结果表明，pLjCas9-T3与pcDNA3.1-LjCas9载体混合转染对迪庆绵羊皮肤上皮细胞系DQSHS1的敲除效率达到60％，这一结果说明，本实验构建的CRISPR/LjCas9系统效率较高，可以识别20bp左右的靶标DNA序列并开展特异性切割，产生特定基因的序列突变。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种CRISPR/Cas基因编辑系统及其制备方法和应用

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4185

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggatccatga aagaaataaa agactacatc attggtctcg atatcgggac aaattcatgt 60

ggatacgttg taacagacaa acaaaacaat attttaaagc ttaaaggtaa aactgctatt 120

ggtgcacgcc tttttaaaga aggcgaagct gcagctgata gacgtgcctt tagaaccact 180

agaagaagat tagcaagacg tcgctggaga ctaagtttac ttgaagaaat ctttgatgaa 240

gaaatgaaca aggttgatcc aagtttcttt agaagactaa aagagtcaga ttattctcct 300

aaagatagac gtaagcaatt taattcaatt gtttttgaaa gtagtgaagc agataaggct 360

ttttacgaaa aatatccaac tatttatcat ttgcgtaatg ctttaatgca tgataatcaa 420

aaacatgatt tgcgagaaat tttcttagca gttcaccata ttgttaaata tcgtgggaac 480

tttttacgag aagattctgt taaggctttt aaagcagcta aattcacttt acaaggtgaa 540

gatggaatag gaccagttga taagttaaat gatttgttaa aagaaattta tattgaagct 600

gctcctgaac ttgcaaccga caatctatct aagattgaag atattatcaa agataagaag 660

ttgtataagc aagataagtt aaaacaaatt gctaatttgt tgcctaaagc tgttgattct 720

aaggataaag ctaagcttaa taaagatatt gccaaacaag tagctaatgc tttgatgggc 780

tatatgttta gattagatac actctttagt tttactgatg ttgatgtgaa ggactataaa 840

ttaaaattta gcgatgctaa tattgatgaa tctttggatg ctttgactag tttattgaca 900

gatgcacaaa tagaatttgt attagaactg caaagcattt ataatactat agttttaaat 960

gaaattgtcc cagatggaat gagcctttct gaatcaatgg ttaagaaata tgatgaccat 1020

aagaaagact tgaagttata taaagaatat attgattctt taagtgatca gaaaaaagct 1080

aagcaacttg aagcagcgta tgcgttatat gttaattatc gcaaggcaga tttattagca 1140

gctaagaaat tgtttgaaaa gaagataggg gataaaaagt ttgtcgatgt aataagtaac 1200

ttcgaagtat ttggcaaatt tgtttctgat aatttagatg attcagaatt ggctaataag 1260

attaaggcta gacttgatct aggtgaattt ttaccaaaac aaagaaccaa tcaaaatgga 1320

gtaattccat atcagttgca tcaagttgaa ttaactcaaa tccttgaaaa acaaggtaag 1380

tattatccat ttttgattac acctaatcct gttgaaagtc atagaaataa tgctccttat 1440

gaaattagcg aacttgtatc attccgtgtg ccatattatg ttggaccatt aattgataat 1500

caaagtatca aagataaaca aaataaaaat aaatttgctt ggatggtgcg tcaaaagcaa 1560

ggtcaaataa cgccttggaa ttttgaagaa atggttgata ctacagaatc agctaatcaa 1620

tttatcaaga gaatgacaag gaaggatacg tatttattag ctgaagatgt tttaccaaaa 1680

tctagtttaa tttatcaaaa atttatgata ttagatgaat taaatagaat aaaaattgac 1740

ggcaaaaaat taacaagtaa actaaagcat gatatttttg aaaaattatt taagaagcaa 1800

aaaagcatca atttagataa cttaaagaat tatttattag cagagggcaa tattccaggt 1860

ttgattgagg gcctttctga tggaattaat tttaacaata gtttttcaac ttatattgat 1920

tatcgtaata tcttgggtga tgagattgat aatcccaata agcaagctga cttcgaaaag 1980

atgattgaat ggtcaactgt gtttgaagac cgtaagattt tcaagcgaaa gctaaaagaa 2040

attacttggc taacacctga acaaattaaa caagtaagta gtaaacgcta ttcaggatgg 2100

gggagattat ctaagaagtt attaactcaa attacggatg aaaatggtgt taatatcttg 2160

caaagactct ggaatgaacc tgaaacttta actgaagttt tagctaatcc ggttataaaa 2220

agaaaaattt cggaagcaaa tagccttttt gttcaaatta ataaggttga aaatatttta 2280

gatgatgcct atacttctcc tcaaaataaa aaagcaattc gtcaggtaat tagagtggtt 2340

gatgatatta ttgccgcagc tcatggtaaa aagcctagcc aaattgctat tgaatttgca 2400

cgaagtagtc aaaataaagc taaagtgcca gacacacgaa aaaagcaact tgataaaatt 2460

tataataaaa ttagttcaga aattttagat tcgtctatca aaaatgaatt aaagaatttg 2520

aaaagcaata agtatttatc caaagataaa ctatttttgt atttcaaaca aatggggagg 2580

gatgcatata ctggtgataa gctttctctt gatcagcttc aaaattacga tattgatcat 2640

atttttccaa gatcttttat taaggatgat tcattagata atcgtgtatt aacgcagaaa 2700

ccgataaatg ctaaaaagtc agattatggt attccagctt tggaatttgg caataaatat 2760

gttcctgatt tggggattac tgtaaaggaa atgtggaagc tatggcaaga aaatggatta 2820

attagtaaat ctaagctaat aaacttatgt actaatccta aaaaaattgg atcgaaaaga 2880

gcttctggat ttattaatcg ccaattagtt gaaacgagtc aagttattaa attagtcgca 2940

attatactgc aagctgaatt cccggatact gaaataatag aggttaaggc tttacaaaat 3000

acaactctta gggaaagttt tcatttatat aagaatcggt cagtaaatga ttatcatcat 3060

gcaattgatg cgtacttaac aacgatagtt ggaaattatt tatatcaagt ttatccaaaa 3120

cttagaccat attttgttta tggtcaattt aaaaaattta accaagaaaa aaatattgat 3180

atacttaaac gactaaagaa ttttaatttc ttaaggcaat tgatttttaa cacagatgat 3240

aatatctata tttccggaac taaagaaata gtatttaata aaaaagatat tatccataaa 3300

ctggaaactg cttatgggta taaatatatg aatatctcac gtgagtgtta tcaagaaact 3360

tcaagtttat ttaatcaaac tctttatgca cataattcaa gtgtaaaaaa tagtttaatt 3420

cccaaaaaga aaggattacc aacagaaatt tatggaggtt atagtggaaa taaagattct 3480

ttttttgtct tagttaaaat agtgaaaaaa agaactaatc tttatagaat tgttggaatt 3540

cctacaagag aattagccaa gcttaactca tcaaataatt ataatcaagc tttaaataag 3600

attgttgaat cgaaactctg cttaaaggaa accgaaagct ttaaaatatt aattaagcga 3660

ttattatatg gtacgttaat tgttgacaat ggccagaaat ttagaattgg cagttttaaa 3720

gaaaagcata atgttcaaca gttggtatta cagttaaagt cgatgaagta tattaaattt 3780

tatatcgatg gtggccaaaa ttattttact gatgtagagc gaaaaaaatt agaaaagcaa 3840

gacagagata aatgtttact atatgtattt gatgatatta tgaatgtagt taataaacgt 3900

tttactttat ttgatatgtc aaaatatgag aaagatggtg attctctaag agaaaaattt 3960

aattgcctgg attttaatga taaagtatca atattatcag atttacttaa agcatttcat 4020

gctaattctg atcggactag tattacaaag ttgaaaatta caaacttggg tagacatcag 4080

gccggaaaaa acggaattac attaactact aatgcacaaa tcatatatca atcaccgact 4140

ggcttatttg aaagacgcat taaaataaaa gacttatgag aattc 4185

<210> 2

<211> 964

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacaccg ggtcttcggg cgagctgcac gctgccgtcc tcgatgttgt ggcggatctt 300

gaagttcacc ttgatgccgt tcttctgctt gtcggccatg atatagacgt tgtggctgtt 360

gtagttgtac tccagcttgt gccccaggat gttgccgtcc tccttgaagt cgatgccctt 420

cagctcgatg cggttcacca gggtgtcgcc ctcgaacttc acctcggcgc gggtcttgta 480

gttgccgtcg tccttgaaga agatggtgcg ctcctggacg tagccttcgg gcatggcgga 540

cttgaagaag tcgtgctgct tcatgtggtc ggggtagcgg ctgaagcaag aagacctgtt 600

ttgaaggttg ttaaatcagt aagttgaaaa atttcaattt actgatttaa caaccttatt 660

tttaaatcaa gcaaggcttt cgggccgagt tttcacatgt gtaccgctta tagcggtttt 720

tttttttttt ttctagagct cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat 780

ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc 840

tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg 900

ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agagaatagc aggcatgctg 960

ggga 964

<210> 3

<211> 3674

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acctcgcgaa 420

tgcatctaga tgagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg 480

ctgttagaga gataattgga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata 540

cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa 600

tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct 660

tgtggaaagg acgaaacacc gggtcttcgg gcgagctgca cgctgccgtc ctcgatgttg 720

tggcggatct tgaagttcac cttgatgccg ttcttctgct tgtcggccat gatatagacg 780

ttgtggctgt tgtagttgta ctccagcttg tgccccagga tgttgccgtc ctccttgaag 840

tcgatgccct tcagctcgat gcggttcacc agggtgtcgc cctcgaactt cacctcggcg 900

cgggtcttgt agttgccgtc gtccttgaag aagatggtgc gctcctggac gtagccttcg 960

ggcatggcgg acttgaagaa gtcgtgctgc ttcatgtggt cggggtagcg gctgaagcaa 1020

gaagacctgt tttgaaggtt gttaaatcag taagttgaaa aatttcaatt tactgattta 1080

acaaccttat ttttaaatca agcaaggctt tcgggccgag ttttcacatg tgtaccgctt 1140

atagcggttt tttttttttt tttctagagc tcgctgatca gcctcgactg tgccttctag 1200

ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac 1260

tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca 1320

ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagagaatag 1380

caggcatgct ggggaatcgg atcccgggcc cgtcgactgc agaggcctgc atgcaagctt 1440

ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca 1500

caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact 1560

cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct 1620

gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc 1680

ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca 1740

ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg 1800

agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca 1860

taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa 1920

cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc 1980

tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc 2040

gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 2100

gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg 2160

tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag 2220

gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta 2280

cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg 2340

aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt 2400

tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt 2460

ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag 2520

attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat 2580

ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc 2640

tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat 2700

aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc 2760

acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag 2820

aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag 2880

agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt 2940

ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg 3000

agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt 3060

tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc 3120

tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc 3180

attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa 3240

taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg 3300

aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc 3360

caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag 3420

gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt 3480

cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt 3540

tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc 3600

acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac 3660

gaggcccttt cgtc 3674

<210> 4

<211> 249

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacacc 249

<210> 5

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gggtcttcg 9

<210> 6

<211> 330

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggcgagctgc acgctgccgt cctcgatgtt gtggcggatc ttgaagttca ccttgatgcc 60

gttcttctgc ttgtcggcca tgatatagac gttgtggctg ttgtagttgt actccagctt 120

gtgccccagg atgttgccgt cctccttgaa gtcgatgccc ttcagctcga tgcggttcac 180

cagggtgtcg ccctcgaact tcacctcggc gcgggtcttg tagttgccgt cgtccttgaa 240

gaagatggtg cgctcctgga cgtagccttc gggcatggcg gacttgaaga agtcgtgctg 300

cttcatgtgg tcggggtagc ggctgaagca 330

<210> 7

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agaagacctg c 11

<210> 8

<211> 128

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttttgaaggg ttgttaaatc agtaagttaa aaatttcaat ttactgattt aacaacctta 60

tttttaaatc aagcaaggct ttcgggccga gttttcavat gtgtaccgct tatagcggtt 120

tttttttt 128

<210> 9

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tttttt 6

<210> 10

<211> 232

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctagagctcg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc 60

cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa 120

atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg 180

ggcaggacag caagggggag gattgggaag agaatagcag gcatgctggg ga 232

<210> 11

<211> 222

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atggccgcac tgatgcgggg caaggactcc tcccgctgcc tgctcctact ggccgcggtg 60

ctgatggtgg agagctcaca gttcggcagc tcgcgggcca aactcaactc catcaagtcc 120

tctctgggcg gggagaggcc tgcccagggc gccaatcgat ctgcgggcac ttaccaagga 180

ctggctttcg gcggcagtaa gaagggcaaa aacctggggc ag 222

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gctcacagtt cggcagctcg 20

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

caccgctcac agttcggcag ctcg 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aaaccgagct gccgaactgt gagc 24

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cttgggtagt ttgcagtt 18

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cagtgggagt ggcacctt 18

<210> 17

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cgcggtgctg atggtggaga gctcacagtt cggcagctcg cgggccaaac tcaactccat 60

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gctctccacc atcagcaccg 20

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

caccgctctc caccatcagc accg 24

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

aaaccggtgc tgatggtgga gagc 24

<210> 21

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ctgcctgctc ctactggccg cggtgctgat ggtggagagc tcacagttcg gcagctcgcg 60

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

caactccatc aagtcctctc 20

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

caccgcaact ccatcaagtc ctctc 25

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

aaacgagagg acttgatgga gttgc 25

<210> 25

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ggcagctcgc gggccaaact caactccatc aagtcctctc tgggcgggga gacgcctgcc 60

Claims (8)

1.一种CRISPR/Cas基因编辑系统，其特征在于，包括pcDNA3.1-LjCas9质粒和pLjCas9-sgRNA质粒；

所述pcDNA3.1-LjCas9质粒包括初始质粒pcDNA3.1(+)和编码LjCas9的DNA片段；

所述pLjCas9-sgRNA质粒包括初始质粒pUC57和sgRNA通用表达框DNA片段；

所述编码LjCas9的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述sgRNA通用表达框DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述的基因编辑系统，其特征在于，所述pLjCas9-sgRNA质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

3.权利要求1或2所述的基因编辑系统的制备方法，包括以下步骤：

将编码LjCas9的DNA片段插入到初始质粒pcDNA3.1(+)中构建获得pcDNA3.1-LjCas9质粒；

将sgRNA通用表达框DNA片段插入到初始质粒pUC57中获得pLjCas9-sgRNA质粒。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述编码LjCas9的DNA片段的插入位点为初始质粒pcDNA3.1(+)的BamH I酶切位点和EcoR I酶切位点之间；步骤2)中所述sgRNA通用表达框DNA片段的插入位点为初始质粒pUC57的EcoRV酶切位点。

5.权利要求1或2所述的基因编辑系统在非疾病治疗目的的基因编辑中的应用，包括以下步骤：

1)确定待编辑基因的靶标序列，并根据所述靶标序列设计所述靶标序列的单链寡核苷酸对；

2)将所述单链寡核苷酸对退火获得双链DNA片段；

3)将所述双链DNA片段连接到pLjCas9-sgRNA质粒中获得靶标序列sgRNA表达载体；

4)将所述靶标序列sgRNA表达载体与所述pcDNA3.1-LjCas9质粒共转染细胞后培养36～60h。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤1)中所述靶标序列的长度为15～25bp。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述靶标序列sgRNA表达载体与所述pcDNA3.1-LjCas9质粒的质量比例为(1～5)：(1～5)。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤3)中所述双链DNA片段与pLjCas9-sgRNA质粒通过酶切后连接；所述酶切用酶为BbsⅠ酶。

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