CN114150001A

CN114150001A - 一种用于弓形虫基因编辑的CRISPR/Cas9载体的构建方法

Info

Publication number: CN114150001A
Application number: CN202111308182.5A
Authority: CN
Inventors: 陈兆国; 程龙; 米荣升; 钱旻; 龚海燕; 黄燕
Original assignee: Shanghai Veteromaru Research Institute Caas China Animal Health And Epidemiology Center Shanghan Branch Center
Current assignee: Shanghai Veteromaru Research Institute Caas China Animal Health And Epidemiology Center Shanghan Branch Center
Priority date: 2021-11-05
Filing date: 2021-11-05
Publication date: 2022-03-08

Abstract

本发明提供一种用于弓形虫基因编辑的CRISPR/Cas9载体的构建方法，属于分子生物技术领域。所述的方法包括如下步骤：设计合成两条单链DNA寡核苷酸，通过退火反应形成双链寡核苷酸；利用T4DNA连接酶将双链寡核苷酸连接到经BaeⅠ限制性核酸内切酶酶切的载体，转化大肠杆菌DH5α株感受态细胞，挑取单克隆培养后测序验证，即可得到用于弓形虫基因编辑的CRISPR/Cas9质粒。将此方法用于构建弓形虫蛋白基因编辑虫种具有快速、高效、低成本等特点。

Description

一种用于弓形虫基因编辑的CRISPR/Cas9载体的构建方法

技术领域

本发明涉及一种用于弓形虫基因编辑的CRISPR/Cas9载体的构建方法，属于分子生物技术领域。

背景技术

弓形虫(Toxoplasma)是一种专性细胞内寄生的机会致病原虫，因为发现地为刚地，所以被命名为刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)。弓形虫感染人后多呈隐性感染，机体免疫系统完善的感染者多无明显临床表现。但在某些机体免疫功能异常的情况下，如器官移植、应用免疫抑制剂、艾滋病人，可发生严重的病症，如弓形虫脑炎、弓形虫眼病、视网膜脉络丛炎等，甚至可以危及生命引起死亡。弓形虫作为一种模式生物对于研究其他顶复门寄生原虫必然会起到重要作用，基因编辑技术的发展无疑大力推动了弓形虫的研究。高效地对弓形虫进行基因编辑能够为阐明深入的机制研究奠定基础，同时加快抗弓形虫药物和特异性疫苗的研究进展。

CRISPR/Cas9是继指核酸内切酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶 (TALEN)之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。与前两代技术相比，其成本低、操作简便、快捷高效，更为重要的是它能够在活细胞中快速有效地编辑任何基因。

现阶段，CRISPR/Cas技术在弓形虫中的应用主要以实验模型构建和敲除基因对弓形虫的生物学作用的研究为主。敲除基因多为弓形虫主要的毒力因子，如棒状体蛋白基因、微线体蛋白基因和致密颗粒蛋白基因等，也包括氨基肽酶和钙依赖性蛋白激酶基等相关基因并且CRISPR/Cas9介导的敲除方法步骤已趋于成熟和完善。其次，CRISPR/Cas9的实用性还可体现在基因筛选上，目前多用于弓形虫重要功能基因的鉴定和药物靶点的筛选，如顶复门寄生虫共存的CLAMP 蛋白基因和潜在良好的药物靶点－微管蛋白乙酰化转移酶基因(TgATAT)等。

SgRNA(small guide RNA)是CRISPR基因敲除、敲入系统中重要的组成部分。早先发现的guide RNA由两部分组成：trac RNA和cr RNA,此两部分融合表达后，即成为sgRNA，能很好地使guide的功能，其可以与cas9蛋白结合，引导cas9酶靶向基因组DNA进行剪切。

发明内容

本发明目的在于提供一种用于弓形虫基因编辑的CRISPR/Cas9载体的构建方法。所述的方法包括如下步骤：设计合成两条单链DNA寡核苷酸，通过退火反应形成双链寡核苷酸；利用T4 DNA连接酶将双链寡核苷酸连接到经BaeⅠ限制性核酸内切酶酶切的载体，转化大肠杆菌DH5α株感受态细胞，挑取单克隆培养后测序验证，即可得到用于弓形虫基因编辑的CRISPR/Cas9质粒。将此方法用于构建弓形虫蛋白基因编辑虫种具有快速、高效、低成本等特点。

本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：

本发明提供一种用于弓形虫基因编辑的CRISPR/Cas9载体的构建方法，所述的方法包括如下步骤：首先设计合成两条单链DNA寡核苷酸，通过退火两条单链DNA寡核苷酸形成双链寡核苷酸；利用T4 DNA连接酶将双链寡核苷酸连接到经BaeⅠ限制性核酸内切酶酶切的载体，转化大肠杆菌DH5α株感受态细胞，挑取单克隆培养后测序验证，确认后的重组质粒即为可用于弓形虫基因编辑的 CRISPR/Cas9质粒。

上述所述的一种用于弓形虫基因编辑的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其具体包括如下步骤：

1)crRNA特异性寡核苷酸序列设计

选择19-20个碱基对的靶序列作为crRNA，加入GTTTT碱基到所述寡核苷酸的3'末端合成其上链寡核苷酸链，加CAACT到所述寡核苷酸的3'末端合成其下链寡核苷酸链，将两条寡核苷酸链退火稀释至一定浓度后进行退火反应即可得到带有进入载体合适末端的双链核苷酸；

其中所述的crRNA序列SEQ.No.1所示，上链寡核苷酸序列如SEQ.No.2所示，下链寡核苷酸序列如SEQ.No.3所示。

优选地，所述的单链寡核苷酸在退火反应前使用双蒸水稀释到浓度200μM，所述的退火反应的体系组成为：上链寡核苷酸链5μL，下链寡核苷酸链5μL，双蒸水8μL，寡核苷酸退火缓冲液2μL，其退火反应程序为：将反应体系加热至95℃并保温4min，然后将反应混合物在5-10min冷却至25℃，短暂离心后混匀，使用双蒸水将混匀后溶液依次稀释100倍、100倍即可得到5nM的双链寡核苷酸；

2)酶切载体制备:

a、合成U6-BaeⅠ核酸片段，其序列如SEQ.No.4所示；使用正向引物SEQ. No.5和反向引物SEQ.No.6对其进行扩增得到扩增后片段Y1；使用正向引物SEQ. No.7和反向引物SEQ.No.8对pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT进行扩增得到扩增后片段Y2；使用正向引物SEQ.No.9和反向引物SEQ.No.10对 pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT进行扩增得到扩增后片段Y3；使用正向引物SEQ. No.11和反向引物SEQ.No.12对pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT进行扩增得到扩增后片段Y4；

b、使用无缝克隆连接试剂盒对Y1-Y4进行连接反应，将连接后的片段转化pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT质粒，转化成功后质粒提取进行载体序列测定，转化成功的质粒命名为pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT-BaeI；

c、配置BaeⅠ内切酶反应体系，其组成为DNA1μg，10×CutSmart Buffer5μL， BaeⅠ内切酶1.0μL，SAM to 20μM，Nuclease-free Water to 50μL，25℃孵育2 h进行酶切反应，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收大片段目的带，得到带有粘性末端的酶切载体；其中带有粘性末端的酶切载体的序列如SEQ.No.13 所示。

其中无缝克隆连接反应的体系为2×ClonExpress Mix 5μL，片段 Y1+Y2+Y3+Y4的体积为0.04*插入片段碱基对数/浓度，使用双蒸水加到10μL。

3)使用T4 DNA连接酶连接寡核苷酸片段和酶切载体：其中连接反应体系的组成为：5nM的双链寡核苷酸1μL，T4 DNA连接酶0.5μL，10×T4 DNA连接酶缓冲液1μL，pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT-BaeI载体2μL，使用无核酸酶水加至10μL，配制完成后4℃连接过夜，将反应液转化感受态细胞DH5α，挑取单克隆细菌，用测序引物进行序列测定。其中连接后的

优选地，所述的PCR扩增反应的反应体系组成为：2×PCR buffer 23μL，2mMdNTPs10μL，10μM上游引物1μL，10μM下游引物1μL，KOD FX(1.0U/μL)

1μL，Template DNA1μL，使用双蒸水加至50μL，所述的PCR扩增反应的反应程序为变性前94℃，2min；变性94℃，30s→退火55℃30s→延伸68℃， 1min/kb，35个循环，延伸68℃，5min。

本发明相对于用于弓形虫基因编辑使用的CRISPR/Cas9质粒的方法，具有快速、高效、低成本等特点。

附图说明

图1.本发明用于弓形虫基因编辑的CRISPR/Cas9载体的构建路线图。

图2.U6-BaeI DNA片段和载体片段PCR扩增结果

图3BaeI酶切的pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT-BaeI载体产生的粘性末端

具体实施方式

以下通过具体实施例进一步描述本发明，但本领域技术人员应能知晓，所述实施例并不以任何方式限定本发明专利保护的范围。

下述实施例中所使用的材料为：BaeⅠ限制性内切酶(R0613S)购买于NEB 公司，T4DNA连接酶(M0202V)购买于NEB公司，KodFx购买于TOBOTO 公司，无缝克隆(C115-01)购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，高纯度琼脂糖凝胶回收试剂盒(D2111-03)购于广州美基生物科技有限公司，质粒提取试剂盒(DP105)购于天根生化科技(北京)有限公司，DH5α感受态细胞购自于北京擎科新业生物技术有限公司，Tris、EDTA、NaCl购买于生工生物工程(上海) 股份有限公司。

所述的pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT(54467)质粒购于addgene公司。

所述的DNA片段由北京擎科新业生物技术有限公司合成，合成DNA序列命名为U6-BaeⅠ序列。

本发明所述的一种用于弓形虫基因编辑的CRISPR/Cas9载体的构建方法，具体包括下述步骤：

1)crRNA特异性寡核苷酸序列设计

选择19-20个碱基对的靶序列作为crRNA，加入GTTTT碱基到所述寡核苷酸的3'末端合成其上链寡核苷酸链，加CAACT到所述寡核苷酸的3'末端合成其下链寡核苷酸链，将两条寡核苷酸链退火稀释至一定浓度后进行退火反应即可得到带有进入载体合适末端的双链核苷酸；其中所述的crRNA序列SEQ.No.1所示，上链寡核苷酸序列如SEQ.No.2所示，下链寡核苷酸序列如SEQ.No.3所示。

所述的单链寡核苷酸在退火反应前使用双蒸水稀释到浓度200μM，所述的退火反应的体系组成为：上链寡核苷酸链5μL，下链寡核苷酸链5μL，双蒸水 8μL，寡核苷酸退火缓冲液2μL，其退火反应程序为：将反应体系加热至95℃并保温4min，然后将反应混合物在5-10min冷却至25℃，短暂离心后混匀，使用双蒸水将混匀后溶液依次稀释100倍、100倍即可得到5nM的双链寡核苷酸；

2)酶切载体制备:

a、合成U6-BaeⅠ核酸片段，其序列如SEQ.No.4所示；使用正向引物SEQ. No.5和反向引物SEQ.No.6对其进行扩增得到扩增后片段Y1；使用正向引物SEQ. No.7和反向引物SEQ.No.8对pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT进行扩增得到扩增后片段Y2；使用正向引物SEQ.No.9和反向引物SEQ.No.10对 pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT进行扩增得到扩增后片段Y3；使用正向引物SEQ. No.10和反向引物SEQ.No.11对pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT进行扩增得到扩增后片段Y4；

c、配置BaeⅠ内切酶反应体系，其组成为DNA1μg，10×CutSmart Buffer5μL， BaeⅠ内切酶1.0μL，SAM to 20μM，Nuclease-free Water to 50μL，25℃孵育2 h进行酶切反应，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收大片段目的带，得到带有粘性末端的酶切载体；

3)使用T4 DNA连接酶连接寡核苷酸片段和酶切载体：其中连接反应体系的组成为：5nM的双链寡核苷酸1μL，T4 DNA连接酶0.5μL，10×T4 DNA连接酶缓冲液1μL，pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT-BaeI载体2μL，使用无核酸酶水加至10μL，配制完成后4℃连接过夜，将反应液转化感受态细胞DH5α，挑取单克隆细菌，用测序引物进行序列测定。

其中该构建方法中的实验方法如下所示：

1.1 PCR反应

(1)PCR反应体系

(2)PCR反应条件

1.2 DNA琼脂糖凝胶回收

1.配制1％浓度的琼脂糖凝胶，电泳分离DNA片段。当DNA片段分离后，把凝胶放置于紫外灯下，快速切下含目的DNA片段的凝胶，并尽量去除多余的凝胶。

2.称取凝胶块的重量，并转移至1.5mL离心管中。按100mg凝胶块相当 100μL体积计算，加入1倍体积Buffer GDP。50～55℃水浴10～15min，让凝胶块完全溶解。水浴期间，颠倒混匀3次加速溶胶。

3.短暂离心收集管壁上的液滴。将HiPure DNA Mini Column套在2ml离心管中。把溶胶液转移至柱子中。12,000×g离心60s。

4.倒弃滤液，把柱子套回2ml离心管中。加入300μL Buffer GDP至柱子中。静置1min。12,000×g离心60s。

5.倒弃滤液，把柱子套回2ml离心管中。加入600μL Buffer DW2(已用无水乙醇稀释)至柱子中。12,000×g离心60s。

6.倒弃滤液，把柱子套回2ml离心管中。加入600μL Buffer DW2(已用无水乙醇稀释)至柱子中。12,000×g离心60s。

7.倒弃滤液，把柱子套回2ml离心管中。12,000×g离心2min。离心心后打开柱子的盖子，空气干燥5min以彻底去除乙醇。

8.把柱子套在新1.5ml离心管中，加入20μL ddH₂O至柱子膜中央，放置 2min。12,000×g离心1min。丢去柱子，DNA用于后续连接步骤。

1.3利用无缝克隆进行多片段重组

使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司生产的无缝克隆连接试剂盒进行多片段重组，反应体系如下表配置

反应条件50℃1小时，4度保存，连接好的产物用于后续转化步骤。

1.4转化

1.取100μL感受态细胞冰上融化，加入连接产物，轻轻混匀，冰上静止30min。

2. 42℃水浴热激1min，迅速转移至冰浴中，静置2min

3.向离心管中加入500μL LB培养液，放入37℃摇床中，200r/min培养1h

4. 5000r/min离心3min，弃400μL LB培养液上清，用剩余200μL LB培养液重悬细菌

5.将重悬的液体全部均匀涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素的预热的LB平板上，37℃培养箱倒置过夜。

6.挑取单克隆细菌接入5mL，含有氨苄抗生素100μg/LB液体培养基中，放入 37℃摇床中，200r/min培养过夜，进行后续质粒提取，使用测序引物进行载体序列测定，观察载体是否有突变，并将序列正确的载体命名为 pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT-BaeI。

1.5质粒提取步骤

1.5mL过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000r/min 离心1min，尽量吸除上清。

2.向留有菌体沉淀的离心管中加入150μL溶液P1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

3.向离心管中加入150μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

4.向离心管中加入350μL溶液P5，立即快速地上下颠倒混匀12-20次，充分混匀，此时将出现絮状沉淀。12,000r/min(～13,400×g)离心2min。

5.将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中。12,000r/min离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

6.向吸附柱CP3中加入300μl漂洗液PWT，12,000r/min离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

7.将吸附柱CP3放入收集管中,12,000r/min离心1min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

8.将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50μl

ddH₂O，12,000r/min离心1min将质粒溶液收集到离心管中，质粒用于后续测序和酶切反应。

1.6酶切质粒

质粒酶切按照下表配置BaeⅠ内切酶系，25℃孵育2h.。将酶切产物进行脂糖凝胶电泳，切胶回收大片段目的带，胶回收方法同3.4DNA琼脂糖凝胶回收。回收产物-20℃保存，酶切产生的粘性末端见图1。

1.7 crRNA特异性寡核苷酸序列设计及双链寡核苷酸的制备

3.7.1 crRNA特异性寡核苷酸序列设计

选择19-20个碱基对的靶序列后，继续设计crRNA特异性寡核苷酸引物。要将双链寡核苷酸克隆到BaeⅠ酶切的pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT-BaeI载体，必须添加以下5个核苷酸到相应的单链寡核苷酸的3'端。

(1)上链寡核苷酸链：加入GTTTT碱基到所述寡核苷酸的3'末端。该GTTTT序列与酶切载体突出端序列CAAAA反向互补，一并构成tracrRNA的前5个碱基。

(2)下链寡核苷酸：底部链寡核苷酸是靶序列的反向互补。加CAACT到所述寡核苷酸的3'末端。该CAACT序列与酶切载体突出端序列GTTGA反向互补，一并构成U6启动子的最后4个碱基和所需polIII启动转录起始位点的第一个碱基。

(3)退火两条单链寡核苷酸产生带有克隆进入BaeⅠ酶切

pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT-BaeI载体合适末端的双链寡核苷酸。

以弓形虫TGME49_275380(SRS47D)基因为例，选择crRNA序列为 5’GCAGAACTCCGCCAGGAAGA3’，合成上链寡核苷酸序列 5’GCAGAACTCCGCCAGGAAGAGTTTT3’，合成下链寡核苷酸 5’TCTTCCTGGCGGAGTTCTGCCAACT3’。

3.7.2双链寡核苷酸制备

1.将合成的单链寡核苷酸用ddH₂O稀释至浓度200uM。

2.按照下表配置退火反应体系

3.将上述的管子使用加热模块95℃加热4min。

4.从散热块中取出管，并让反应混合物5-10min以内冷却至25℃进行。

5.离心管短暂(约5s)。轻轻混匀。

6.取一个新的EP管，将上述溶液用ddH₂O稀释100倍，浓度为500nM。

7.取一个新的EP管，将上述溶液用ddH₂O稀释100倍，浓度为5nM。(注意溶液的温度切勿高于室温)

1.8连接反应

使用T4 DNA连接酶(NEB公司)连接寡核苷酸片段和酶切载体，按照下表配置体系。

反应条件，4℃连接过夜，将上述反应液转化感受态细胞DH5α(参照3.4转化方法)，挑取单克隆细菌，用测序引物进行序列测定。

序列表

<110> 中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）

<120> 一种用于弓形虫基因编辑的CRISPR/Cas9载体的构建方法

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

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<223> design

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caagtaagca gaagcacgct gtatttccgg gagggtgcga cgagacaaag tgcgcgagtt 60

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gttgcgacgg ctgcgccgct gcactgtgaa ttgggcgcca atattgcatc ctaggcctga 300

cgcgcctcct gcagaacgcg agacactggg atatgtagag ccaaggggga aaccttcgaa 360

ctctcgaatg tcttctctga caagaatcat atttccatca gttctgtcag attttcaaat 420

ggcgacctgc agaggcctgc ttcctccctg tgcgctcttc gaaggggctt tctgtcgcgc 480

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<210> 13

<211> 10343

<212> DNA

<213> Artificial

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<223> recombinate

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<221> D-loop

<400> 13

caagtaagca gaagcacgct gtatttccgg gagggtgcga cgagacaaag tgcgcgagtt 60

gaaatcgtcg tggggacgat tgcaccgcgg ccacatgttg gagacactga ggacacacgg 120

gaaacgcgaa agatttcaaa ttaacgtacc caagcgcgaa agcttgcgca gcatacactc 180

gaagcgaaca tcccgaacca tcgagaggcg gagagcgata agtctttcac gctgcgaagt 240

gttgcgacgg ctgcgccgct gcactgtgaa ttgggcgcca atattgcatc ctaggcctga 300

cgcgcctcct gcagaacgcg agacactggg atatgtagag ccaaggggga aaccttcgaa 360

ctctcgaatg tcttctctga caagaatcat atttccatca gttctgtcag attttcaaat 420

ggcgacctgc agaggcctgc ttcctccctg tgcgctcttc gaaggggctt tctgtcgcgc 480

agggtcacct cgtccccgaa gggggtgttt gccttctggt aaatggggat gtcaagttgc 540

agctgaggta ccaaagttta tattccccca gaacatcagg ttaatggcgt ttttgatgtc 600

attttcgcgg tggctgagat cagccacttc ttccccgata acggagaccg gcacactggc 660

catatcggtg gtcatcatgc gccagctttc atccccgata tgcaccaccg ggtaaagttc 720

acgggagact ttatctgaca gcagacgtgc actggccagg gggatcacca tccgtcgccc 780

gggcgtgtca ataatatcac tctgtacatc cacaaacaga cgataacggc tctctctttt 840

ataggtgtaa accttaaact gcatttcacc agcccctgtt ctcgtcagca aaagagccgt 900

tcatttcaat aaaccgggcg acctcagcca tcccttcctg attttccgct ttccagcgtt 960

cggcacgcag acgacgggct tcattctgca tggttgtgct taccagaccg gagatattga 1020

catcatatat gccttgagca actgatagct gtcgctgtca actgtcactg taatacgctg 1080

cttcatagca tacctctttt tgacatactt cgggtataca tatcagtata tattcttata 1140

ccgcaaaaat cagcgcgcaa atacgcatac tgttatctgg cttttagtaa gccggatcca 1200

cgcggcgtac tttggtacct gtcgacgttt tagagctaga aatagcaagt taaaataagg 1260

ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gcttttttga gctccagctt 1320

ttgttccctt tagtgagggt taatttcgag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc 1380

tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg 1440

taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc 1500

cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg 1560

gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 1620

ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 1680

agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 1740

ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 1800

caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 1860

gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 1920

cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 1980

tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 2040

gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 2100

cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 2160

tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg 2220

tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 2280

caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 2340

aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 2400

cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat 2460

ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc 2520

tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc 2580

atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc 2640

tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc 2700

aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc 2760

catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt 2820

gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc 2880

ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa 2940

aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt 3000

atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg 3060

cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc 3120

gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa 3180

agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt 3240

gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt 3300

caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag 3360

ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta 3420

tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat 3480

aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctaaa ttgtaagcgt taatattttg 3540

ttaaaattcg cgttaaattt ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc 3600

ggcaaaatcc cttataaatc aaaagaatag accgagatag ggttgagtgt tgttccagtt 3660

tggaacaaga gtccactatt aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc 3720

tatcagggcg atggcccact acgtgaacca tcaccctaat caagtttttt ggggtcgagg 3780

tgccgtaaag cactaaatcg gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc ttgacgggga 3840

aagccggcga acgtggcgag aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg 3900

ctggcaagtg tagcggtcac gctgcgcgta accaccacac ccgccgcgct taatgcgccg 3960

ctacagggcg cgtcccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg 4020

cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt 4080

tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgagcgcgcg 4140

taatacgact cactataggg cgaattgggt accgggcccc ccctcgaggt cgacggtatc 4200

gataagcttt tacatccgtt gccttttcca cggtccgtga tttcatgtgc gtgcagcttc 4260

aaagactggt cgttgcgact aataagactg cagtgacagg tcgaatggtg ggcaccttgc 4320

tgatgactat ctactgcaaa gtctgagaca acgaacgaaa cttcccacac gaggcatttg 4380

aaactgacgg tgtctaggta atatgcactg caagacacgg tactggggcc tcgctgaatt 4440

aggggccgat ctcgttgccc tatcagtgct cacagtgccg caacgtaaca ccagggcagg 4500

ttcttgacag tggcaacaat gtgcgacggg cgtgtgaacg tttcgtagtc atagcgctag 4560

cacgtaccta gccacatggt cgtgaggagc tttaccatgc gtctagaagg tggatgcggg 4620

acacgccttc ctggcctttg gctcccgaga cgcgtgttct aaccacaaac cttgagacgc 4680

gtgttccaac cacgcaccct gacacgcgtg ttccaaccac gcaccctgag acgcgtgttc 4740

taaccacgca ccctgagacg cgtgttctaa ccacgcaccc tgagacgcgt gttctgccgc 4800

acaatgtgca cctgtaggaa gctgtagtca ctgctgattc tcactgttct cggcaagggc 4860

cgacgaccgg agtacagttt ttgtgggcag agccgttgtg cagctttccg ttcttctcgg 4920

ttgtgtcaca tgtgtcattg tcgtgtaaac acacggttgt atgtcggttt cgctgcacca 4980

cttcattatt tcttctggtt ttttgacgag tatgcatcta gacaaaatgg acaagaagta 5040

cagcatcggc ctggacatcg gcaccaactc tgtgggctgg gccgtgatca ccgacgagta 5100

caaggtgccc agcaagaaat tcaaggtgct gggcaacacc gaccggcaca gcatcaagaa 5160

gaacctgatc ggcgccctgc tgttcgacag cggagaaaca gccgaggcca cccggctgaa 5220

gagaaccgcc agaagaagat acaccagacg gaagaaccgg atctgctatc tgcaagagat 5280

cttcagcaac gagatggcca aggtggacga cagcttcttc cacagactgg aagagtcctt 5340

cctggtggaa gaggataaga agcacgagcg gcaccccatc ttcggcaaca tcgtggacga 5400

ggtggcctac cacgagaagt accccaccat ctaccacctg agaaagaaac tggtggacag 5460

caccgacaag gccgacctgc ggctgatcta tctggccctg gcccacatga tcaagttccg 5520

gggccacttc ctgatcgagg gcgacctgaa ccccgacaac agcgacgtgg acaagctgtt 5580

catccagctg gtgcagacct acaaccagct gttcgaggaa aaccccatca acgccagcgg 5640

cgtggacgcc aaggccatcc tgtctgccag actgagcaag agcagacggc tggaaaatct 5700

gatcgcccag ctgcccggcg agaagaagaa tggcctgttc ggcaacctga ttgccctgag 5760

cctgggcctg acccccaact tcaagagcaa cttcgacctg gccgaggatg ccaaactgca 5820

gctgagcaag gacacctacg acgacgacct ggacaacctg ctggcccaga tcggcgacca 5880

gtacgccgac ctgtttctgg ccgccaagaa cctgtccgac gccatcctgc tgagcgacat 5940

cctgagagtg aacaccgaga tcaccaaggc ccccctgagc gcctctatga tcaagagata 6000

cgacgagcac caccaggacc tgaccctgct gaaagctctc gtgcggcagc agctgcctga 6060

gaagtacaaa gagattttct tcgaccagag caagaacggc tacgccggct acatcgatgg 6120

cggagccagc caggaagagt tctacaagtt catcaagccc atcctggaaa agatggacgg 6180

caccgaggaa ctgctcgtga agctgaacag agaggacctg ctgcggaagc agcggacctt 6240

cgacaacggc agcatccccc accagatcca cctgggagag ctgcacgcca ttctgcggcg 6300

gcaggaagat ttttacccat tcctgaagga caaccgggaa aagatcgaga agatcctgac 6360

cttccgcatc ccctactacg tgggccctct ggccagggga aacagcagat tcgcctggat 6420

gaccagaaag agcgaggaaa ccatcacccc ctggaacttc gaggaagtgg tggacaaggg 6480

cgccagcgcc cagagcttca tcgagcggat gaccaacttc gataagaacc tgcccaacga 6540

gaaggtgctg cccaagcaca gcctgctgta cgagtacttc accgtgtaca acgagctgac 6600

caaagtgaaa tacgtgaccg agggaatgag aaagcccgcc ttcctgagcg gcgagcagaa 6660

aaaagccatc gtggacctgc tgttcaagac caaccggaaa gtgaccgtga agcagctgaa 6720

agaggactac ttcaagaaaa tcgagtgctt cgactccgtg gaaatctccg gcgtggaaga 6780

tcggttcaac gcctccctgg gcacatacca cgatctgctg aaaattatca aggacaagga 6840

cttcctggac aatgaggaaa acgaggacat tctggaagat atcgtgctga ccctgacact 6900

gtttgaggac agagagatga tcgaggaacg gctgaaaacc tatgcccacc tgttcgacga 6960

caaagtgatg aagcagctga agcggcggag atacaccggc tggggcaggc tgagccggaa 7020

gctgatcaac ggcatccggg acaagcagtc cggcaagaca atcctggatt tcctgaagtc 7080

cgacggcttc gccaacagaa acttcatgca gctgatccac gacgacagcc tgacctttaa 7140

agaggacatc cagaaagccc aggtgtccgg ccagggcgat agcctgcacg agcacattgc 7200

caatctggcc ggcagccccg ccattaagaa gggcatcctg cagacagtga aggtggtgga 7260

cgagctcgtg aaagtgatgg gccggcacaa gcccgagaac atcgtgatcg aaatggccag 7320

agagaaccag accacccaga agggacagaa gaacagccgc gagagaatga agcggatcga 7380

agagggcatc aaagagctgg gcagccagat cctgaaagaa caccccgtgg aaaacaccca 7440

gctgcagaac gagaagctgt acctgtacta cctgcagaat gggcgggata tgtacgtgga 7500

ccaggaactg gacatcaacc ggctgtccga ctacgatgtg gaccatatcg tgcctcagag 7560

ctttctgaag gacgactcca tcgataacaa agtgctgact cggagcgaca agaaccgggg 7620

caagagcgac aacgtgccct ccgaagaggt cgtgaagaag atgaagaact actggcgcca 7680

gctgctgaat gccaagctga ttacccagag gaagttcgac aatctgacca aggccgagag 7740

aggcggcctg agcgaactgg ataaggccgg cttcatcaag agacagctgg tggaaacccg 7800

gcagatcaca aagcacgtgg cacagatcct ggactcccgg atgaacacta agtacgacga 7860

gaacgacaaa ctgatccggg aagtgaaagt gatcaccctg aagtccaagc tggtgtccga 7920

tttccggaag gatttccagt tttacaaagt gcgcgagatc aacaactacc accacgccca 7980

cgacgcctac ctgaacgccg tcgtgggaac cgccctgatc aaaaagtacc ctaagctgga 8040

aagcgagttc gtgtacggcg actacaaggt gtacgacgtg cggaagatga tcgccaagag 8100

cgagcaggaa atcggcaagg ctaccgccaa gtacttcttc tacagcaaca tcatgaactt 8160

tttcaagacc gagattaccc tggccaacgg cgagatccgg aagcggcctc tgatcgagac 8220

aaacggcgaa acaggcgaga tcgtgtggga taagggccgg gactttgcca ccgtgcggaa 8280

agtgctgtct atgccccaag tgaatatcgt gaaaaagacc gaggtgcaga caggcggctt 8340

cagcaaagag tctatcctgc ccaagaggaa cagcgacaag ctgatcgcca gaaagaagga 8400

ctgggaccct aagaagtacg gcggcttcga cagccccacc gtggcctatt ctgtgctggt 8460

ggtggccaaa gtggaaaagg gcaagtccaa gaaactgaag agtgtgaaag agctgctggg 8520

gatcaccatc atggaaagaa gcagcttcga gaagaatccc atcgactttc tggaagccaa 8580

gggctacaaa gaagtgaaaa aggacctgat catcaagctg cctaagtact ccctgttcga 8640

gctggaaaac ggccggaaga gaatgctggc ctctgccggc gaactgcaga agggaaacga 8700

actggccctg ccctccaaat atgtgaactt cctgtacctg gccagccact atgagaagct 8760

gaagggctcc cccgaggata atgagcagaa acagctgttt gtggaacagc acaaacacta 8820

cctggacgag atcatcgagc agatcagcga gttctccaag agagtgatcc tggccgacgc 8880

taatctggac aaggtgctga gcgcctacaa caagcacaga gacaagccta tcagagagca 8940

ggccgagaat atcatccacc tgtttaccct gaccaatctg ggagcccctg ccgccttcaa 9000

gtactttgac accaccatcg accggaagag gtacaccagc accaaagagg tgctggacgc 9060

caccctgatc caccagagca tcaccggcct gtacgagaca cggatcgacc tgtctcagct 9120

gggaggcgac gcctatccct atgacgtgcc cgattatgcc agcctgggca gcggctcccc 9180

caagaaaaaa cgcaaggtgg aagatcctaa gaaaaagcgg aaagtggacg gcattggtag 9240

tgggagcaac ggcagcagcg gatccgtgag caagggcgag gagctgttca ccggggtggt 9300

gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg tgcgcggcga 9360

gggcgagggc gatgccacca acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa 9420

gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag 9480

ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta 9540

cgtccaggag cgcaccatct ccttcaagga cgacggcacc tacaagaccc gcgccgaggt 9600

gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga 9660

ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaacttc aacagccaca acgtctatat 9720

cacggccgac aagcagaaga acggcatcaa ggcgaacttc aagatccgcc acaacgtcga 9780

ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc 9840

cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag cacccagtcc aagctgagca aagaccccaa 9900

cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg 9960

catggacgag ctgtacaagt agttaattaa tcaccgttgt gctcacttct caaatcgaca 10020

aaggaaacac acttcgtgca gcatgtgccc cattataaag aaactgagtt gttccgttgt 10080

ggcttgcagg tgtcacatcc acaaaaaccg gccgactcta aataggagtg tttcgcagca 10140

agcagcgaaa gtttatgact gggtccgaat ctctgaacgg atgtgtggcg gacctggctg 10200

atgttgatcg ccgtcgacac acgcgccaca tgggtcaata cacaagacag ctatcagttg 10260

ttttagtcga accggttaac acaattcttg cccccccgag ggggatccac tagttctaga 10320

gcggccgcca ccgcggtgga gct 10687

Claims

1.一种用于弓形虫基因编辑的CRISPR/Cas9载体的构建方法，所述的方法包括如下步骤：首先设计合成两条单链DNA寡核苷酸，通过退火两条单链DNA寡核苷酸形成双链寡核苷酸；利用T4 DNA连接酶将双链寡核苷酸连接到经Bae Ⅰ限制性核酸内切酶酶切的载体，转化大肠杆菌DH5α株感受态细胞，挑取单克隆培养后测序验证，确认后的重组质粒即为可用于弓形虫基因编辑的CRISPR/Cas9质粒。

2.根据权利要求1所述的用于弓形虫基因编辑的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

1)crRNA特异性寡核苷酸序列设计

2)酶切载体制备:

a、合成U6-Bae Ⅰ核酸片段，其序列如SEQ.No.4所示；使用正向引物SEQ.No.5和反向引物SEQ.No.6对其进行扩增得到扩增后片段Y1；使用正向引物SEQ.No.7和反向引物SEQ.No.8对pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT进行扩增得到扩增后片段Y2；使用正向引物SEQ.No.9和反向引物SEQ.No.10对pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT进行扩增得到扩增后片段Y3；使用正向引物SEQ.No.10和反向引物SEQ.No.11对pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT进行扩增得到扩增后片段Y4；

c、配置BaeⅠ内切酶反应体系，25℃孵育2h进行酶切反应，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收大片段目的带得到带有粘性末端的酶切载体；

3.根据权利要求2所述的用于弓形虫基因编辑的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，步骤1)中所述的crRNA序列SEQ.No.1所示，上链寡核苷酸序列如SEQ.No.2所示，下链寡核苷酸序列如SEQ.No.3所示。

4.根据权利要求2所述的用于弓形虫基因编辑的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，步骤1)中，所述的单链寡核苷酸在退火反应前使用双蒸水稀释到浓度200μM，所述的退火反应的体系组成为：上链寡核苷酸链5μL，下链寡核苷酸链5μL，双蒸水8μL，寡核苷酸退火缓冲液2μL，其退火反应程序为：将反应体系加热至95℃并保温4min，然后将反应混合物在5-10min冷却至25℃，短暂离心后混匀，使用双蒸水将混匀后溶液依次稀释100倍、100倍即可得到5nM的双链寡核苷酸。

5.根据权利要求2所述的用于弓形虫基因编辑的CRISPR/Cas9载体的构建方法，所述的无缝克隆连接反应的体系为2×ClonExpress Mix 5μL，片段Y1+Y2+Y3+Y4的体积为0.04*插入片段碱基对数/浓度，使用双蒸水加到10μL，所述的BaeⅠ内切酶反应体系的组成为DNA1μg，10×CutSmart Buffer5μL，Bae Ⅰ内切酶1.0μL，SAM to 20μM，Nuclease-free Water to50μL。

6.根据权利要求2所述的用于弓形虫基因编辑的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应的反应体系组成为：2×PCR buffer 23μL，2mM dNTPs10μL，10μM上游引物1μL，10μM下游引物1μL，KOD FX(1.0U/μL)1μL，Template DNA1μL，使用双蒸水加至50μL，所述的PCR扩增反应的反应程序为变性前94℃，2min；变性94℃，30s→退火55℃30s→延伸68℃，1min/kb，35个循环，延伸68℃，5min。