CN106591371A

CN106591371A - Cd16a/gpc3双抗慢病毒表达载体及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN106591371A
Application number: CN201611066874.2A
Authority: CN
Inventors: 李陶; 曹领改; 刘佳; 李玉花; 周建华; 邢小平
Original assignee: Harbin Baiyisheng Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Harbin Baiyisheng Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2016-11-25
Filing date: 2016-11-25
Publication date: 2017-04-26

Abstract

本发明公开了CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体及其构建方法和应用，属于肿瘤免疫治疗领域。本发明CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体包含抗人GPC3单克隆抗体的可变区基因序列、CD16A的抗体基因序列、真核表达必须序列和linker序列；将上述序列连接在一起后装入慢病毒过表达质粒载体的位点，即得本发明CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体。本发明进一步用所述的双抗慢病毒表达载体制备得到了高效表达CD16A/GPC3双抗的NK细胞。本发明所制备的NK细胞能有效杀灭肝癌细胞、抑制肝癌肿瘤体积增加的能力、延长肝癌患者的生存期，对于肝癌治疗具有重要的意义。

Description

CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体，尤其涉及CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体的构建方法，本发明进一步涉及所述慢病毒载体在治疗肝癌的应用，属于肿瘤免疫治疗领域。

背景技术

目前对于癌症治疗，主要采用了手术、放疗和化疗等多种治疗方法。然而，在特定的癌症和患者的情况下，有些治疗方法难以应用而且癌症复发的可能性很大。肝细胞癌(HCC)是世界第五大最常见癌症和第三大最常见癌症死亡原因。目前，手术是HCC最有效的治疗方法。然而，根治性肝脏切除术后肿瘤的复发率很高，5年生存率只有10％。此外，因为大多数的HCC患者是在疾病后期阶段才被诊断，因此根治性治疗，包括化疗、化疗栓塞、切除和质子束疗法，通常可能是无效的。

免疫治疗联合传统的肿瘤治疗是今后提高肿瘤治疗效果的重要研究和应用方向。因此，利用患者的免疫功能的肿瘤免疫疗日益受到关注，肿瘤免疫治疗是应用现代生物技术及其产品进行肿瘤防治的新疗法，基于通过具有各种功能的免疫细胞之间的复杂的相互作用来去除肿瘤。这些免疫细胞主要包括自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，将抗原呈递至这些效应细胞的免疫细胞包括树突细胞(DC)或B细胞。其他实例包括分泌各种细胞因子的辅助性T细胞(Th细胞)、调节性T细胞(Treg细胞)等。在这些免疫细胞中，NK细胞是最快速起效且高效的免疫细胞。

NK细胞是一群不同于T、B淋巴细胞的大颗粒淋巴细胞。由于NK细胞的杀伤活性无MHC限制，不依赖抗体，因此称为自然杀伤细胞。其主要来源于骨髓CD34⁺的淋巴细胞，具有识别与溶解肿瘤细胞和产生免疫调节性细胞因子两大主要功能，是人体抗感染和防止细胞恶性转化的重要免疫调节细胞。

抗体依赖性细胞毒性(ADCC)是抗体的一种重要的效应功能。当抗体与肿瘤细胞结合以后，抗体的Fc端可通过Fc受体(CD16A)与NK细胞结合并激活NK细胞，后者通过释放颗粒酶及穿孔素将靶细胞杀死。

GPC3是硫酸乙酰肝素(HS)蛋白聚糖glypican家族的一员，可通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚，附着在细胞表面。GPC3在细胞生长、分化和迁移过程中发挥重要的作用。有多项研究表明，GPC3是一种有吸引力的肝癌特异性靶标，因为它在肝细胞癌中高表达，但是在正常组织中表达有限。

因此，构建CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体，应用于制备治疗肝癌的药剂或药物，有效地消除HCC细胞，为HCC提供了一种很有前途的治疗手段。

发明内容

本发明的目的之一是提供CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体及携带该慢病毒载体的NK细胞；

本发明的目的之二是提供上述慢病毒载体和NK细胞的构建方法；

本发明的目的之三是将上述慢病毒载体和NK细胞应用于治疗肝癌的试剂或药物中；

本发明达到上述目的是通过以下技术方案实现的：

本发明首先提供了一种CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体，由IgG的前导序列基因，抗CD16A VL基因，第一链接linker，抗GPC3 VH基因，第二链接linker，抗GPC3 VL基因，第三链接linker，抗CD16A VH基因，铰链序列基因，hIgG1 CH2基因以及hIgG1 CH3基因依次连接在一起后装入到慢病毒过表达质粒载体的位点，即得。

其中，IgG的前导序列基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示；抗CD16A VL基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示；第一链接linker所编码的氨基酸序列为SEQID No.3所示；抗GPC3 VH基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.4所示；第二链接linker所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.5所示；抗GPC3 VL基因所编码的氨基酸序列为SEQ IDNo.6所示；第三链接linker所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.7所示；抗CD16A VH基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.8所示；铰链序列基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.9所示；hIgG1 CH2基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.10所示；hIgG1 CH3基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.11所示。

本发明进一步提供了一种慢病毒基因表达系统，包含：上述慢病毒过表达载体质粒、慢病毒穿梭质粒和慢病毒辅助质粒。

本发明还公开了所述CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体的构建方法，包括：将IgG的前导基因，抗CD16A VL基因，第一链接linker，抗GPC3 VH基因，第二链接linker，抗GPC3 VL基因，第三链接linker，抗CD16A VH基因，铰链序列基因，hIgG1 CH2基因以及hIgG1 CH3基因依次连接在一起后得到融合基因；将融合基因插入到慢病毒过表达质粒载体的位点，即得。

优选的，将融合基因插入到慢病毒过表达质粒载体pGreenPuro^TM的XbaI/DraIII位点。

本发明进一步提供了携带上述慢病毒表达载体的细胞，优选的为免疫细胞，更优选的为NK细胞。

上述细胞是将上述慢病毒表达载体和包装质粒分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染包装细胞，更换完全培养基，收集上清液，浓缩病毒后感染细胞，即得。其中，所述包装质粒为慢病毒穿梭质粒和慢病毒辅助质粒；所述包装细胞为293T细胞。

本发明通过对BALB/c小鼠进行免疫、细胞融合、高通量筛选，获得了分泌抗人GPC3抗体的杂交瘤细胞，提取总RNA，反转录形成cDNA，利用VH和VL引物扩增VH片段和VL片段。将pGEM-T载体与PCR产物(VH或VL)连接、转化、筛选、鉴定、测序，获得抗人GPC3单克隆抗体可变区基因序列。将获得的抗人GPC3单克隆抗体可变区基因序列、NK细胞表面抗原CD16A的抗体基因序列、NK信号肽序列、真核表达必须序列通过linker连接起来，装入慢病毒过表达质粒载体。制备慢病毒穿梭质粒、其辅助质粒和表达载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6h更换为完全培养基，浓缩病毒后得到NK细胞制品。

本发明还提供了所述CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体或携带所述慢病毒载体的细胞在治疗制备肝癌试剂或药物中的应用

本发明对高效表达的自分泌抗CD16A/GPC3抗体的NK细胞(BsAb-NK细胞)进行体内和体外有效性的验证。体外有效性分析结果表明：相同效靶比时，未修饰的NK细胞的杀瘤活性低于BsAb-NK细胞，在E:T＝5:1时BsAb-NK细胞杀瘤活性最大。高表达GPC3的肝癌细胞系和低表达GPC3的肝癌细胞系，BsAb-NK细胞分泌细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2均高于未修饰的NK细胞。体内有效性分析结果表明：在GPC3小鼠模型中，随着NK及BsAb-NK细胞的注射治疗，小鼠的肿瘤体积相对对照组增长缓慢、体重下降缓慢，且BsAb-NK细胞组>NK细胞组>对照组。BsAb-NK细胞组、NK细胞组、对照组中位生存期分别为：前两者大于60天，BsAb-NK细胞组中位生存期大于NK细胞组；对照组为40天。

本发明技术方案与现有技术相比具有以下有益效果：

本发明携带有CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体的细胞能有效消除肝癌细胞、抑制肝癌肿瘤体积增加的能力、延长肝癌患者的生存期，对于HCC治疗具有重要的意义。

附图说明

图1 Anti-CD16A/GPC3双抗基因的连接示意图。

图2 慢病毒过表达质粒载体pGreenPuro^TM的图谱。

图3 CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体的示意图。

图4 SDS-PAGE检测抗人GPC3 mAb纯度；1：蛋白marker；2：#1-2-3mAb；3：#5-2-2mAb；4：#9-3-1mAb；5：#14-1-3mAb；6：#20-1-1。

图5 间接ELISA法检测抗人GPC3 mAb的效价。

图6 高效表达CD16A/GPC3抗体的NK细胞(BsAb-NK细胞)体外杀瘤试验。

图7 BsAb-NK对小鼠模型的肿瘤体积、小鼠体重及生存率的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实验例1 CD16A/GPC3抗体的NK细胞(BsAb-NK细胞)的制备及有效性分析

1.实验方法

1.1 动物的免疫

取30μg人GPC3抗原与等剂量IFA混合进行充分乳化，BALB/c小鼠背部多点、腋下及腹股沟进行免疫。第14天、第28天，均以同样方法再次免疫。第38天时取小鼠尾部血清，用间接ELISA方法检测血清效价。融合前3天，取30μg人GPC3抗原进行腹部加强免疫。

1.2 细胞融合与筛选

小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞与免疫人GPC3抗原后小鼠的脾脏细胞，按1:5的比例混匀，在加入细胞融合剂PEG，1min内无血清培养基终止PEG作用，离心弃上清，将融合细胞重悬于HAT选择性培养基中。将其加到96孔细胞培养板中，放置于37℃、5％CO₂培养箱中培养10天左右，取细胞上清，使用间接ELISA进行高通量筛选，将确定为阳性的杂交瘤细胞进行培养基转换，将其由HAT选择性培养基换至HT选择性培养基再换至10％含血清培养基最后换至无血清培养基。得到的杂交瘤细胞进行亚克隆获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。

1.3 anti-GPC3单抗的纯化

将亚克隆后的细胞以10⁵个/mL的密度加入到含无血清培养基的体积为1L的细胞培养瓶中，放置于37℃、5％CO₂培养箱中进行扩大培养20天左右，离心收集细胞上清液。用蛋白A亲和层析方法纯化细胞上清液中的anti-GPC3单抗。

1.4 anti-GPC3单抗的鉴定

纯度鉴定：使用SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化后所得的mAb纯度。

效价鉴定：使用间接ELISA检测mAb的效价。

亚型鉴定：利用亚型鉴定试剂盒对筛选到的抗体进行亚型鉴定。

1.5 抗人GPC3单克隆抗体可变区基因克隆和序列分析

提取杂交瘤的总RNA，反转录形成cDNA，利用VH和VL引物扩增VH片段和VL片段。将pGEM-T载体与PCR产物(VH或VL)连接、转化、筛选、鉴定、测序，获得抗人GPC3单克隆抗体可变区基因序列。

1.6 CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体的构建和检测

将IgG的前导基因，抗CD16A VL基因，第一链接linker，抗GPC3 VH基因，第二链接linker，抗GPC3 VL基因，第三链接linker，抗CD16A VH基因，铰链序列基因，hIgG1 CH2基因以及hIgG1 CH3基因依次连接在一起后(图1)装入到慢病毒过表达质粒载体pGreenPuro^TM(pGreenPuro^TM的图谱见图2，其全长核苷酸序列为SEQ ID No.12所示)的XbaI/DraIII位点，得到慢病毒表达载体质粒(图3；其中Anti-CD16A/GPC3双抗基因的插入位点如图3所示，利用限制性内切酶XbaI/DraIII，取代载体上copGFP和puro位置。将慢病毒表达载体质粒、慢病毒穿梭质粒及其辅助质粒分别进行高纯度无内毒素抽提后，共转染293T细胞，转染后6h更换为完全培养基，浓缩病毒后感染NK细胞。

1.7 高效表达CD16A/GPC3抗体的NK细胞(BsAb-NK细胞)有效性分析

BsAb-NK细胞对体外肿瘤细胞的杀伤：BsAb-NK细胞为效应细胞，以低表达GPC3的肝癌细胞系作为靶细胞，检测BsAb-NK细胞的杀伤作用。细胞因子的分泌：取对数生长期癌细胞系(低表达GPC3的肝癌细胞系和高表达GPC3的肝癌细胞系)，以效靶比5:1的浓度共同培养4小时，收集上清液，用ELISA试剂盒检测BsAb-NK细胞分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2水平。BsAb-NK细胞对小鼠体内肿瘤细胞的杀伤：取6周龄雌性裸鼠30只，每只裸鼠右腋下皮下注射1×10⁷人GPC3阳性肿瘤细胞系，随机分成3组进行尾静脉注射治疗：生理盐水对照组、NK细胞组和BsAb-NK细胞组。计算肿瘤体积、称量小鼠重量。并统计每天死亡数，绘制移植瘤模型鼠的生存率曲线。

2 实验结果

2.1 抗人GPC3 mAb的获得

细胞融合后，筛选到4株阳性信号较强且生长状态良好的杂交瘤细胞，细胞亚克隆后，将这4株杂交瘤细胞分别命名为#1-2-3、#5-2-2、#9-3-1和#14-1-3。将其扩大培养后，收集细胞上清液，通过蛋白A纯化后，即可获得4株mAb。

2.2 抗体的纯度鉴定

用SDS-PAGE凝胶电泳检测4株mAb(图4)。第1泳道是蛋白质分子Marker，后边5个泳道分别是抗体#1-2-3、#5-2-2、#9-3-1、#14-1-3和#20-1-1，分别在25kD、50kD处各有1条清晰的条带，这两处正是轻链与重链的位置，其他位置没有出现杂带，说明这4株抗人GPC3mAb的纯度均在95％以上。

2.3 抗体的效价鉴定

利用间接ELISA检测纯化后的5株抗体的效价(图5)。mAb效价如下：#1-2-3为3.8×10^-8g/mL，#5-2-2为1.3×10^-8g/mL，#9-3-1为1.4×10^-7g/mL，#14-1-3为1.5×10^-7g/mL，#20-1-1为1.6×10^-8g/mL。其中#5-2-2mAb的效价最高。

2.4 抗体的亚型鉴定

筛选到的4株mAb的轻链均为κ链，重链#1-2-3为IgG2a、#5-2-2为IgG2b、#9-3-1与#14-1-3为IgG3(表1)。

表1 mAb的亚型鉴定

2.5 获得GPC3可变区序列

通过反转录PCR后获得#5-12-2抗GPC3单抗的可变区序列，优化linker后，共计370aa，结果如下：

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYEMHWVRQAPGQGLEWMGALDPKTGDTAYSQKFKGRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSCPPCPGGGGSDVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPPTFGQGTKLEIKGGGGSQVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVGWIRQPPGKALEWLAHIWWDDDKRYNPALKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARINPAWFAYWGQGTLVTVSS。

2.6 高效表达CD16A/GPC3抗体的NK细胞(BsAb-NK细胞)体外有效性

相同效靶比时，未修饰的NK细胞的杀瘤活性低于BsAb-NK细胞，在E:T＝5:1时BsAb-NK细胞杀瘤活性最大。高表达GPC3的肝癌细胞系和低表达GPC3的肝癌细胞系，BsAb-NK细胞分泌细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2均高于未修饰的NK细胞(图6)。

2.7 高效表达CD16A/GPC3抗体的NK细胞(BsAb-NK细胞)体内有效性

在GPC3小鼠模型中，随着NK及BsAb-NK细胞的注射治疗，小鼠的肿瘤体积相对对照组增长缓慢、体重下降缓慢，且BsAb-NK细胞组>NK细胞组>对照组(图7)。BsAb-NK细胞组、NK细胞组、对照组中位生存期分别为：前两者大于60天，BsAb-NK细胞组中位生存期大于NK细胞组；对照组为40天。

SEQUENCE LISTING

<110> 哈尔滨百伊生生物科技有限公司

<120> CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体及其构建方法和应用

<130> HLJ-3004-160542A

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acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120

cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180

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tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 300

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ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 420

cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 480

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gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 600

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tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 2040

agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 2100

tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 2160

aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc 2220

gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct ccatagaaga ttctagacgc 2280

caccatggag agcgacgaga gcggcctgcc cgccatggag atcgagtgcc gcatcaccgg 2340

caccctgaac ggcgtggagt tcgagctggt gggcggcgga gagggcaccc ccaagcaggg 2400

ccgcatgacc aacaagatga agagcaccaa aggcgccctg accttcagcc cctacctgct 2460

gagccacgtg atgggctacg gcttctacca cttcggcacc taccccagcg gctacgagaa 2520

ccccttcctg cacgccatca acaacggcgg ctacaccaac acccgcatcg agaagtacga 2580

ggacggcggc gtgctgcacg tgagcttcag ctaccgctgc gaggccggcc gcgtgatcgg 2640

cgacttcaag gtggtgggca ccggcttccc cgaggacagc gtgatcttca ccgacaagat 2700

catccgcagc aacgccaccg tggagcacct gcaccccatg ggcgataacg tgctggtggg 2760

cagcttcgcc cgcaccttca gcctgcgcga cggcggctac cacagcttcg tggtggacaa 2820

ccacatgcac ttcaagagcg ccatccaccc cagcatcctg cagaacgggg gccccatgtt 2880

cgccttccgc cgcgtggagg agctgcacag caacaccgag ctgggcatcg tggagtacca 2940

gcacgccttc aagaccccca tcgccttcgc cagatcccgc gctcagtcgt ccaattctgc 3000

cgtggacggc accgccggac ccggctccac cggatctcgc gagggcagag gaagtcttct 3060

aacatgcggt gacgtggagg agaatcccgg ccctatgacc gagtacaagc ccacggtgcg 3120

cctcgccacc cgcgacgacg tccccagggc cgtacgcacc ctcgccgccg cgttcgccga 3180

ctaccccgcc acgcgccaca ccgtcgatcc ggaccgccac atcgagcggg tcaccgagct 3240

gcaagaactc ttcctcacgc gcgtcgggct cgacatcggc aaggtgtggg tcgcggacga 3300

cggcgccgcg gtggcggtct ggaccacgcc ggagagcgtc gaagcggggg cggtgttcgc 3360

cgagatcggc ccgcgcatgg ccgagttgag cggttcccgg ctggccgcgc agcaacagat 3420

ggaaggcctc ctggcgccgc accggcccaa ggagcccgcg tggttcctgg ccaccgtcgg 3480

cgtctcgccc gaccaccagg gcaagggtct gggcagcgcc gtcgtgctcc ccggagtgga 3540

ggcggccgag cgcgccgggg tgcccgcctt cctggagacc tccgcgcccc gcaacctccc 3600

cttctacgag cggctcggct tcaccgtcac cgccgacgtc gaggtgcccg aaggaccgcg 3660

cacctggtgc atgacccgca agcccggtgc ctgaaatcaa cctctggatt acaaaatttg 3720

tgaaagattg actggtattc ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg gatacgctgc 3780

tttaatgcct ttgtatcatg ctattgcttc ccgtatggct ttcattttct cctccttgta 3840

taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga gttgtggccc gttgtcaggc aacgtggcgt 3900

ggtgtgcact gtgtttgctg acgcaacccc cactggttgg ggcattgcca ccacctgtca 3960

gctcctttcc gggactttcg ctttccccct ccctattgcc acggcggaac tcatcgccgc 4020

ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtt 4080

gtcggggaag ctgacgtcct ttccatggct gctcgcctgt gttgccacct ggattctgcg 4140

cgggacgtcc ttctgctacg tcccttcggc cctcaatcca gcggaccttc cttcccgcgg 4200

cctgctgccg gctctgcggc ctcttccgcg tctccgcctt cgccctcaga cgagtcggat 4260

ctccctttgg ccgcctcccc gcctggtacc tttaagacca atgacttaca aggcagctgt 4320

agatcttagc cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa gggctaattc actcccaacg 4380

atgtcaagaa ttggaacgct gacgtcatca acccgctcca aggaatcgcg ggcccagtgt 4440

cactaggcgg gaacacccag cgcgcgtgcg cctggcagga agatggctgt gagggacagg 4500

ggagtggcgc cctgcaatat ttgcatgtcg ctatgtgttc tgggaaatca ccataaacgt 4560

gaaatgtctt tggatttggg aatcttataa gttctgtatg agaccacttg gatcctctga 4620

attcttcgat tctgcttttt gcttctactg ggtctctctg gttagaccag atctgagcct 4680

gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag 4740

tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg taactagaga tccctcagac 4800

ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtagtagttc atgtcatctt attattcagt 4860

atttataact tgcaaagaaa tgaatatcag agagtgagag gaacttgttt attgcagctt 4920

ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac 4980

tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tggctctagc 5040

tatcccgccc ctaactccgc ccatcccgcc cctaactccg cccagttccg cccattctcc 5100

gccccatggc tgactaattt tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct cggcctctga 5160

gctattccag aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta gacttttgca gagacggccc 5220

aaattcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc 5280

acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta 5340

actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca 5400

gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc 5460

cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc 5520

tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat 5580

gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt 5640

ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg 5700

aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc 5760

tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt 5820

ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa 5880

gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta 5940

tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 6000

caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa 6060

ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt 6120

cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt 6180

ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat 6240

cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat 6300

gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc 6360

aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc 6420

acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta 6480

gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga 6540

cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg 6600

cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc 6660

tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat 6720

cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag 6780

gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat 6840

cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa 6900

ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa 6960

gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga 7020

taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg 7080

gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc 7140

acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg 7200

aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact 7260

cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat 7320

atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt 7380

gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtat 7440

cacgaggccc tttcgtctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca 7500

gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca 7560

gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg catcagagca 7620

gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa 7680

ataccgcatc aggcgccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt 7740

gcgggcctct tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag 7800

ttgggtaacg ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgccaagct 7860

g 7861

Claims

1.一种CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体，其特征在于：由IgG的前导基因，抗CD16A VL基因，第一链接linker，抗GPC3 VH基因，第二链接linker，抗GPC3 VL基因，第三链接linker，抗CD16A VH基因，铰链序列基因，hIgG1 CH2基因以及hIgG1 CH3基因依次连接在一起后装入到慢病毒过表达质粒载体的位点，即得；

其中，所述IgG的前导基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示；所述抗CD16A VL基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示；所述第一链接linker所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.3所示；所述抗GPC3 VH基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.4所示；所述第二链接linker所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.5所示；所述抗GPC3 VL基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.6所示；所述第三链接linker所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.7所示；所述抗CD16A VH基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.8所示；所述铰链序列基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.9所示；所述hIgG1 CH2基因所编码的氨基酸序列为SEQ IDNo.10所示；所述hIgG1 CH3基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.11所示。

2.一种慢病毒基因表达系统，其特征在于，包含：慢病毒过表达质粒载体、慢病毒穿梭质粒和慢病毒辅助质粒，其中所述慢病毒过表达质粒载体为权利要求1所述的CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体。

3.携带权利要求1所述的CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体的细胞。

4.按照权利要求3所述的细胞，其特征在于：所述的细胞为免疫细胞，优选为NK细胞。

5.构建权利要求1所述的CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：将IgG的前导基因，抗CD16A VL基因，第一链接linker，抗GPC3 VH基因，第二链接linker，抗GPC3 VL基因，第三链接linker，抗CD16A VH基因，铰链序列基因，hIgG1 CH2基因以及hIgG1 CH3基因依次连接在一起后得到融合基因；将融合基因插入到慢病毒过表达质粒载体的位点，即得；

优选的，将融合基因插入到慢病毒过表达质粒载体pGreenPuro^TM的XbaI/DraIII位点；

所述IgG的前导基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示；所述抗CD16A VL基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示；所述第一链接linker所编码的氨基酸序列为SEQID No.3所示；所述抗GPC3 VH基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.4所示；所述第二链接linker所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.5所示；所述抗GPC3 VL基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.6所示；所述第三链接linker所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.7所示；所述抗CD16A VH基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.8所示；所述铰链序列基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.9所示；所述hIgG1 CH2基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.10所示；所述hIgG1 CH3基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.11所示。

6.构建权利要求3或4所述的细胞的方法，其特征在于：将权利要求1所述的CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体和包装质粒分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染包装细胞，更换完全培养基，收集上清液，浓缩病毒后感染细胞，即得。

7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：所述包装质粒为慢病毒穿梭质粒和慢病毒辅助质粒。

8.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：所述包装细胞为293T细胞。

9.权利要求1所述的CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体在制备治疗肝癌的试剂或药物中的用途。

10.权利要求3或4所述的细胞在制备诊断或治疗肝癌的试剂或药物中的用途。