CN109652381A - 基于碱基编辑靶向cd133的car-t细胞制备方法及应用 - Google Patents

基于碱基编辑靶向cd133的car-t细胞制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于碱基编辑制备PD‑1基因敲除且靶向CD133的CAR‑T细胞制备方法及应用。通过BE‑Plus系统进行基因敲除的同时将表达白细胞分化抗原CD133‑CAR的质粒载体导入T细胞的制备方法，所得CAR‑T细胞可应用于制备抗肿瘤药物。本发明公开的PD‑1基因敲除且靶向CD133的CAR‑T细胞制备工艺简单，在肿瘤的细胞治疗中拥有较高的应用价值。

Description

基于碱基编辑靶向CD133的CAR-T细胞制备方法及应用
技术领域
本发明涉及免疫学领域，具体涉及免疫治疗领域，尤其涉及一种敲除PD-1基因且表达CD133-CAR的T细胞的制备方法及其应用。
背景技术
CD133是一种细胞表面抗原标志，属prominin家族成员之一，也被称为prominin-1，在人类中是由PROM1基因编码的糖蛋白。其属于跨膜蛋白的一员，特异定位于细胞突起。当嵌入细胞膜时，在细胞膜中prominin-1的膜拓扑结构使N端延伸到胞外空间，C端位于胞内腔室。CD133在造血干细胞、内皮祖细胞、胶质母细胞瘤、神经元和胶质干细胞、各种小儿脑肿瘤、以及成人肾、乳腺、气管、唾液腺、子宫、胎盘、消化道、睾丸等细胞类型中表达。其分子结构较为独特，同时表达呈组织依赖性。有文献报道，CD133阳性细胞和肿瘤发生、转移、侵袭、耐药及复发均关系密切。
CD133最初被描述为人类造血干细胞和祖细胞(HSPCs)的表面抗原，是最常用的肿瘤干细胞(CSC)分离的标记物，主要来自各种胶质瘤和癌细胞。另外CD133作为混合系白血病MLL-AF4的关键靶点，并在发生MLL重排的B-ALL中均有表达。在CD133和消化系肿瘤的相关报道中，国内对胃癌组织采用RT-PCR技术测得CD133在癌旁和原发组织间的差异具有统计学意义，提示CD133和胃癌产生密切相关。
CAR-T是一种通过把患者自己的防御细胞（T细胞）取出来，人工（依靠基因技术）加上一种能够识别癌症细胞的部件（癌细胞识别抗原受体），并大量复制，再给回患者，从而激发患者自身防御细胞的杀伤功能杀死癌症细胞。嵌合抗原受体（CAR）是CAR-T的核心部件，使得免疫细胞HLA具有非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力。CAR分子的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原结合区（Single chain antibody Fragment，ScFv），一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号转导区。其中scFv段的设计对于CAR的特异性、有效性以及基因改造免疫细胞自身的安全性是关键的决定因素。
将患者T细胞制作成CAR-T细胞，然后经过体外扩增后，回输到患者体内进行抗肿瘤治疗，与传统肿瘤治疗方法相比，该方法为细胞靶向性治疗，副作用小，而且经过基因修饰的T细胞可在其表面稳定的表达抗原结合域，识别靶抗原的同时，无MHC限制性，提高了肿瘤的治疗效果。已有报道表明CD133特异性的CAR-T细胞或NK细胞，可杀死来源于病患的神经胶质瘤干细胞或卵巢癌干细胞。在一个晚期胆管癌患者中，CD133特异性CAR-T细胞治疗获得了持续4.5个月的部分响应。
在实体瘤的免疫治疗方面，CAR-T细胞的活性易受多种因素影响，比如缺乏肿瘤特异性抗原，或者难以到达肿瘤部位，以及易受肿瘤微环境影响丧失功能或活性。肿瘤微环境的免疫逃逸机制主要是通过PD-1/PD-L1抑制通路，导致T细胞不能杀伤肿瘤细胞。通过靶向敲除PD-1基因，可以解除PD-1/PD-L1的抑制通路，有助于改良靶向CD133的CAR-T细胞的功效。此外，将CAR-T细胞进行PD-1基因敲除，使其免受肿瘤微环境的抑制，可能提高靶向杀伤能力。
中国专利201710793243.9已公开了一种PD-1基因沉默的靶向CD133的CAR T细胞及制备方法，其是通过将CRISPR-Cas9和PiggyBac转座子系统同时导入PBMC中敲除靶向CD133的CAR T细胞中的PD-1基因而获得，其结果显示PD-1基因敲除且靶向CD133的CAR-T细胞对U251 CD133-OE靶细胞在不同效靶比条件下杀伤效率均高于未敲除组。但是，CRISPR-Cas9介导的基因编辑存在严重的脱靶效应，使其在临床应用上存在一定的安全隐患。
现有免疫药物制备过程复杂，成本昂贵，因此本领域技术人员致力于开发能够简化、优化制备过程、降低制备成本的技术方案。本发明提供了一种具有更高效率制备目的免疫细胞的技术方案。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供PD-1基因敲除且表达CD133-CAR的T细胞，该T细胞能够免受肿瘤微环境的抑制，特别是PD-1通路介导的免疫抑制，且具有超越一般靶向CD133的CAR-T细胞的杀伤能力。
本发明要解决的技术问题之二是提供一种PD-1基因敲除且表达CD133-CAR的T细胞的制备方法，该方案基于碱基编辑技术，制备工艺简单、编辑效率高。
本发明要解决的技术问题之三是提供PD-1基因敲除且表达CD133-CAR的T细胞在制备抗肿瘤的细胞治疗药物中的应用。
为解决以上问题，本发明采用如下技术方案：
为了提高基因编辑效率以实现在体基因编辑，本发明采用基于CRISPR/Cas9技术的碱基编辑器（base editor,BE）。BE-PlUS系统优势在于：第一，与CRISPR-Cas9相比，BE-PLUS具有更高的编辑效率，较低的插入突变率以及更低的脱靶率；第二，与Cas9核酸酶介导的基因编辑相比，BEs可以高效修改点突变基因，是在体基因编辑的良好工具。BE-Plus双质粒系统（ScFv-APOBEC-UGI,GCN4-D10A），在D10A的N端接10个GCN4，APOBEC N端接一个scFv。这样GCN4-D10A可以招募10个scFv-APOBEC，使突变的机率增大。Work window由4-8 扩为4-16，使得效率更高。
BE-Plus双质粒系统基本原理为：BE Plus系统携带大鼠胞嘧啶脱氨酶APOBEC1的Cas9，可将胞嘧啶（C）转变为尿嘧啶（U），尿嘧啶DNA糖基酶抑制剂UDI抑制碱基切除修复机制，使UG配对得以保留，并在后续复制过程中，U替换成T，突变产物理论上可达50%。再通过dCas9和MMR机制，以UG中的U为模板，将UG替换修复成UA，后续复制变为TA，产率在15%~75%之间。使用的基因敲除方法为Istop，在基因编码区内，将正常氨基酸密码子突变为终止密码子，使翻译过程提前终止。对CAR-T细胞进行PD-1基因的定点突变，使其免受肿瘤微环境的抑制，可能提高靶向杀伤能力。
本发明采用来源于鳞翅目昆虫的PiggyBac转座子，在哺乳动物宿主中活性较高，而且携带片段较大。另外，采用的质粒系统，制备工艺相对简单，通过转座酶将外源基因整合入基因组，操作简单而且整合效率相对较高。
在本发明的第一方面，提供PD-1基因敲除且表达CD133-CAR的T细胞。
作为本发明优选的技术方案，所述PD-1基因敲除且表达CD133-CAR的T细胞，采用的基因敲除方法是通过BE-Plus系统或Cas9、ZFN、TALEN基因敲除方法来实现。
作为本发明优选的技术方案，所述的基因敲除方法是通过BE-Plus系统来实现，BE-Plus系统中PD1-sgRNA寡核苷酸的设计和构建，具体步骤为：①明确待PD-1基因的编码区（CDs）20bp-NGG目标序列（PAM序列），使其包含完整的目标密码子CAA、CAG、CGA；②目标单碱基C位于目标序列的（左端）第1-16位，效率不一样，优选为第4-16位；并且目标密码子的上游紧邻碱基最好不能为G；③目标单碱基T位于目标序列的（左端）第1-16位，效率不一样，优选为第4-16位；并且目标密码子的上游紧邻碱基最好不能为G；④按照选定的特异性靶序列，分别合成正向具有5’- N20-NGG-3’特征的寡核苷酸链及与其互补的反向寡核苷酸链，通过退火获得互补寡核苷酸双链片段；⑤对pGL3-U6-sgRNA质粒进行线性化，向反应体系中加入BsaⅠ内切酶进行酶切反应；⑥将步骤④和⑤中所获得双链sgRNA寡核苷酸与线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒进行混合，并向体系中加入T4 DNA连接酶，进行连接；⑦将步骤⑥中所获得的连接产物转化DH5α感受态细胞并涂Amp+平板（50μg/ml），并挑取克隆测序。通过对人PD-1基因序列进行分析，选定待敲除PD-1的编码区，设计靶点序列sgRNA，共设计出3条靶点序列，具体序列如下：
sgRNA1-F：5’-GGGGTTCCAGGG CCTGTCTG-3’（SEQ ID NO.3）
sgRNA1-R：5’-CAG ACAGGCCCTGGA ACCCC-3’（SEQ ID NO.4）
sgRNA2-F：5’-CGACTGGCCAGGGCGCCTGT-3’（SEQ ID NO.5）
sgRNA2-R：5’-ACAGGCGCCCTGGCCAGTCG-3’（SEQ ID NO.6）
sgRNA3-F：5’- ACCGCCCAGACGACTGGCCA-3’（SEQ ID NO.7）
sgRNA3-R：5’- TGGCCAGTCGTCTGGGCGGT-3’（SEQ ID NO.8）
作为本发明优选的技术方案，靶点序列优选为sgRNA1，具体序列为：SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示。
所获的sgRNA核苷酸序列可用于质粒载体上，慢病毒载体上，或用于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或其他类型载体上。
作为本发明优选的技术方案，CD133嵌合抗原受体（在本发明中命名为CD133 -CAR），包含有靶向CD133的ScFv序列。
在本发明中，术语CD133-CAR指CD133嵌合抗原受体，包含有靶向CD133的scFv序列。
scFv：全称single-chain antibody fragment，即单链抗体片段。
在本发明中，术语CD133-ScFv指抗CD133单链抗体片段，密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的第二方面，提供一种PD-1基因敲除且表达CD133-CAR的T细胞的制备方法。包括如下步骤：
（1）从供者提供的外周血中分离外周血单个核细胞（perpheral blood mononuclearcell，PBMC）；
（2）密码子优化，准备CD133嵌合抗原受体（CD133-CAR），将scFv片段送交公司进行密码子优化，使之更易于在人体细胞内表达，密码子优化后地序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
（3）分别准备或制备表达CD133-CAR的质粒、转座酶质粒、BE Plus双质粒、靶向PD-1的sgRNA质粒；
（4）在转染体系中，将步骤（3）所得的表达CD133-CAR的质粒、转座酶质粒、BE Plus双质粒、靶向PD-1的sgRNA质粒共同转染入PBMC细胞，获得转染后的细胞；
（5）将转染后的细胞进行体外培养并大量扩增；
（6）用CD3抗体刺激步骤（5）得到的细胞，以获得PD-1基因敲除且表达CD133-CAR的T细胞；
（7）收集PD-1基因敲除且表达CD133-CAR的T细胞，并对其进行检测。
作为本发明优选的技术方案，步骤（3）中表达CD133-CAR的质粒载体为PiggyBac-transposon载体依次串联人EF1α启动子、信号肽、胞膜外抗原结合区、铰链区、胞内信号传导区和T2A短肽连接的抗性基因puromycin制备而成的。
作为本发明优选的技术方案，其中所述胞膜外抗原结合区优选为经过密码子优化的，可结合CD133蛋白的CD133单链抗体，依次串联flag表位标记、CD8 Hinge嵌合受体铰链、CD8 Transmembrane嵌合受体跨膜区，CD8核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
作为本发明优选的技术方案，步骤（3）中靶向PD-1的sgRNA质粒的制备为：将本发明第一方面内容中所述的sgRNA导入pGL3-U6-sgRNA质粒所得。
作为本发明优选的技术方案，步骤（3）中表达CD133-CAR的质粒载体中的胞内信号传导区包含编码共刺激因子区域，该共刺激因子区域选自4-1BB、CD28、CD27、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LIGHT、B7-H3、特异性结合CD83的配体、ICAM-1、HVEM(LIGHTR)、CD160、淋巴细胞功能相关的抗原-1（LFA-1）、IL2Rα、CD103、CD11b、CD11c、TRANCE/RANKL、SLAMF4(CD244,2B4)、CD69、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)中的一种或多种的任意组合。胞内信号传导区可介导外源基因在宿主细胞内高效整合，并高效稳定表达。
作为本发明优选的技术方案，所述胞内信号传导区为CD28-4-1BB-CD3ζ，其中CD28核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，4-1BB核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，CD3ζ核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
本发明中转染的方式可以通过电转和lipo2000，lipo3000脂质体转染。
作为本发明优选的技术方案，步骤（4）中所述转染优选为电转方式，即通过电转将准备好的质粒导入分选出的PBMC细胞中。
在本发明的第三方面，提供PD-1基因敲除且表达CD133-CAR的T细胞在制备抗肿瘤的细胞治疗药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下所示：
（1）本发明选用PiggyBac转座子系统提高了转染效率和转基因的表达效率和减少时间，简化了CAR-T的制备程序，增强了系统的负载量。
（2）本发明采用的质粒系统，制备工艺相对简单，通过转座酶将外源基因整合入基因组，操作简单而且整合效率相对较高。相对于逆转录病毒系统更安全。
（3）本发明基于BE-PLUS基因编辑系统，具有更高的编辑效率，较低的插入突变率以及更低的脱靶率。
（4）对氨基酸密码子进行人源优化，使其更易于在人体细胞内表达。
附图说明
图1为本发明实施例2中CD133-scFv序列密码子优化后的质粒示意图；
图2为本发明实施例2中PB-CD133-CAR-BBZ-puro的载体图谱；
图3为本发明实施例3中pST1374-scfv-APOBEC-UGI-GB1的载体图谱；
图4为本发明实施例3中pST1374-N-NLS-GCN4-D10A的载体图谱；
图5 为本发明实施例3中PD-1基因的敲除凝胶电泳图；
图6为本发明实施例3中CAR-T细胞流式检测结果图。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明做进一步的说明，具体说明发明的实施例不应解释为限制本分明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。
下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照制造商所建议的条件。除非另有说明，否则百分比按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
虽然在本发明的实施例中可以使用与本发明所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处列举优选的材料和方法。
实施例1：PBMC细胞制备。
取人外周血15 mL，抗凝剂（EATA或肝素）处理，室温15分钟，室温350×g离心5分钟，吸出血浆待用。
血细胞中加入1倍体积PBS buffer稀释混匀，取15mL离心管，加入5 mL淋巴细胞分离液 Ficoll，于上层缓慢加入5mL稀释血细胞，此步骤必须缓慢，防止Ficoll与血细胞混合。
慢升慢降，室温 450×g 离心25分钟，血细胞从上至下依次分成血小板层，白细胞层（白膜），聚蔗糖（Ficoll）层及红细胞层，吸取血小板层（2mL），将白细胞层（白膜层，约3mL）转移至新的15 mL离心管中。
加入10 mL PBS buffer，300*g离心10分钟，弃上清，沉淀重悬于10 mL PBSbuffer 中，170×g 离心 10 分钟后弃上清，将沉淀重悬于 10 mL PBS buffer中，细胞计数后300×g离心10分钟后再弃上清，冻存细胞时将细胞密度调整至2×107 cell/mL。
实施例2：密码子优化。
（1）准备CD133嵌合抗原受体（CAR），即CD133-CAR，对scFv片段送交公司进行密码子优化，使之更易于在人体细胞内表达，密码子优化后地序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
（2）合成目的片段，使用In-Fusion技术将合成片段融合到PB-133CAR-puro载体上，制作PB-CD133-CAR-BBZ-puro质粒（如图2所示），DNA序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
合成引物Primer-F:CGGCGCCTACTCTAGATGCTGCTGCTGGTGACCTCTCTGC和Primer-R：GGGGACGAACAGATCAGATCCGGCTGCAGCGGC。使用PCR扩增合成的CD133优化序列，回收CD133PCR产物。
使用Xba Ⅰ和BglⅡ限制性内切酶双酶切原始PB-CD19 CAR-puro载体，按照TaKaRaIn-Fusion试剂盒的步骤，模板为酶切后的载体和CD133 PCR回收产物，进行连接实验。
连接产物转化DH5α感受态细胞，涂板挑单菌落测序，选择正确的连接产物菌进行大量扩增，并提取质粒DNA，获得PB-CD133-CAR-BBZ-puro质粒。
实施例3：利用BE-Plus系统制备靶向CD133 且敲除PD-1基因的CAR-T细胞
基于BE-Plus介导的单碱基编辑的高效性，设计基因敲除策略：通过CT突变引入终止密码子，例如将CAA、CAG、CGA突变成终止密码子TAA、TAG、TGA，终止编码基因的翻译，从而实现基因敲除。亦或者反向的CT突变，将CCA密码子突变为TCA、CTA，其反向互补密码子TGG则突变为TGA、TAG，BE-Plus双质粒系统（pST1374-scfv-APOBEC-UGI-GB1（如图3所示），pST1374-N-NLS-GCN4-D10A（如图4所示）），在D10A的N端接10个GCN4，APOBEC N端接一个scFv。这样GCN4-D10A可以招募10个scFv-APOBEC，使突变的机率增大。Work window由4-8 扩为4-16，使得效率变高。
选定待敲除基因PD-1的编码区（CDS区）的20bp –NGG目标序列 （PAM序列），使其包含完整的目标密码子CAA、CAG或CGA；其中目标单碱基C位于目标序列的（左端）第4~16位，并且目标密码子的上游紧邻碱基（H）不能为G；所述sgRNA序列为与目标序列互补对应的20bp序列。
选择sgRNA为反向sgRNA，优选为sgRNA1（CCA为目标密码子，GGG为PAM序列）。
合成单向核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，退火使之结合成双链黏性末端产物，导入pGL3-U6-sgRNA质粒（优宝生物，Cat：VT8203），制备质粒pGL3- hPD1 sgRBE。另准备转座酶Transposase质粒（淼灵生物，Cat：P0179）、PB-CD133 CAR-BBZ-puro质粒（实施例2制备所得）、BE-Plus双质粒等。
（1）将PBMC用含10% FBS的RPMI 1640 培养基培养1小时后，300×g离心 8分钟，完全去上清；将pGL3- hPD1 sgR BE、BE-Plus双质粒、PB-CD133 CAR-BBZ- puro质粒和转座酶Transposase五个质粒共20μg，82 µL电转缓冲液和18 µL supplement 1混匀得质粒电转缓冲液混合物；
（2）将（1）配好的质粒电转缓冲液混合物重悬PBMC细胞，并转移至电转杯中，使用细胞电转仪器Lonza 2B，U-014程序进行电转，电转后的细胞迅速转移至提前预热的培养基中，37℃培养箱培养两个小时，以 5 µg/mL 的 DNase 1 消化清除电转中死细胞释放的 DNA；
（3）30分钟后，将细胞计数并换液，用含 300 IU/mL IL-2、10%FBS的AIM-V 培养基（完全培养基）培养在 24 孔板中，其中每孔2 mL，细胞培养密度为1.5×106 个/mL；
（4）电转24小时后加入CD3抗体至终浓度50 ng/mL，继续培养，每隔一天补加300 IU/mLIL-2，培养15天后即可得到利用单碱基敲除系统制备PD-1基因敲除且表达CD133-CAR的CAR-T细胞；
（5）提取（4）制得的CAR-T细胞基因组DNA，并用提前设计好的检测on-target引物进行PCR扩增目的片段，纯化回收；使用T7EN1酶切检测突变体，3%的琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切，并将PCR产物连接进T载体中，转化进DH5α细菌，随机挑取21个单菌落进行测序，评估碱基突变效率，结果显示PD-1基因突变率达到均在85%以上（见图5）；
（6）检测T细胞的分化状态，我们还检测了其CD45RO和CD62L的表达量（见图6）。CD45RO和CD62L双阳性被认为是中枢记忆细胞的标志之一，其细胞所占的比例反映了T细胞的分化程度与持久力，也是临床进行ACT治疗时进行编辑或者回输时的一项指标。我们可以看到，敲除组和未敲除组的双阳性细胞均在50%上，具备很好的活性。符合临床要求后可用于后续试验。
序列表
<110> 苏州茂行生物科技有限公司
<120> 基于碱基编辑靶向CD133的CAR-T细胞制备方法及应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgctgctgc tggtgacctc tctgctgctc tgcgaactgc ctcacccagc ctttctgctg 60
atccctcagg tgcagctgca gcagtcagga gcagaactcg tgagaccagg agcctcagtg 120
aagctgtctt gcaaggccag cggctacacc ttcagcgact tcgagatgca ttgggtgaag 180
cagacaccag tgcacggcct cgagtggatt ggcgatatcg acccaggcac aggcgataca 240
gcctacaacc tgaagttcaa gggcaaggcc accctgacca ccgataagag cagcagcacc 300
gcctacatgg agctgagaag cctgaccagc gaggacagcg ccgtgtacta ttgcaccctg 360
ggagccttcg tgtattgggg acagggcaca ctggtgacag tgtccgccgc taaaaccacc 420
cctaagctgg aggagggcga gtttagcgag gctagagtgg acgtggtggt gacacagacc 480
cctctgtctc tgccagtgtc cttcggcgat caggtgtcca tctcttgccg gagctctcag 540
agcctggcca acagctacgg caacacctac ctgtcttggt acctgcacaa gcccggacag 600
agccctcagc tgctgatcta cggcatctcc aaccggttca gcggcgtgcc agacagattc 660
agcggaagcg gcagcggcac agacttcacc ctgaagatca gcaccatcaa gcccgaggac 720
ctgggcatgt actattgcct gcagggcacc caccagcctt atacctttgg cggaggcacc 780
aagctggaga tcaagagagc cgacgccgct gcagccggat ct 822
<210> 2
<211> 7857
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata 60
catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa 120
agtgccacct aaattgtaag cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa 180
atcagctcat tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa 240
tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca gtttggaaca agagtccact attaaagaac 300
gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa 360
ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct 420
aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa 480
gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc 540
gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg ccgctacagg gcgcgtccca ttcgccattc 600
aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg 660
gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca 720
cgacgttgta aaacgacggc cagtgagcgc gcctcgttca ttcacgtttt tgaacccgtg 780
gaggacgggc agactcgcgg tgcaaatgtg ttttacagcg tgatggagca gatgaagatg 840
ctcgacacgc tgcagaacac gcagctagat taaccctaga aagataatca tattgtgacg 900
tacgttaaag ataatcatgt gtaaaattga cgcatgtgtt ttatcggtct gtatatcgag 960
gtttatttat taatttgaat agatattaag ttttattata tttacactta catactaata 1020
ataaattcaa caaacaattt atttatgttt atttatttat taaaaaaaac aaaaactcaa 1080
aatttcttct ataaagtaac aaaactttta tgagggacag ccccccccca aagcccccag 1140
ggatgtaatt acgtccctcc cccgctaggg ggcagcagcg agccgcccgg ggctccgctc 1200
cggtccggcg ctccccccgc atccccgagc cggcagcgtg cggggacagc ccgggcacgg 1260
ggaaggtggc acgggatcgc tttcctctga acgcttctcg ctgctctttg agcctgcaga 1320
cacctggggg gatacgggga aaaggcctcc acggccaagg atctgcgatc gctccggtgc 1380
ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg 1440
caattgaacg ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg atgtcgtgta 1500
ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag tagtcgccgt 1560
gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag ctgaagcttc gaggggctcg 1620
catctctcct tcacgcgccc gccgccctac ctgaggccgc catccacgcc ggttgagtcg 1680
cgttctgccg cctcccgcct gtggtgcctc ctgaactgcg tccgccgtct aggtaagttt 1740
aaagctcagg tcgagaccgg gcctttgtcc ggcgctccct tggagcctac ctagactcag 1800
ccggctctcc acgctttgcc tgaccctgct tgctcaactc tacgtctttg tttcgttttc 1860
tgttctgcgc cgttacagat ccaagctgtg accggcgcct actctagagc caccatgctg 1920
ctgctggtga cctctctgct gctctgcgaa ctgcctcacc cagcctttct gctgatccct 1980
caggtgcagc tgcagcagtc aggagcagaa ctcgtgagac caggagcctc agtgaagctg 2040
tcttgcaagg ccagcggcta caccttcagc gacttcgaga tgcattgggt gaagcagaca 2100
ccagtgcacg gcctcgagtg gattggcgat atcgacccag gcacaggcga tacagcctac 2160
aacctgaagt tcaagggcaa ggccaccctg accaccgata agagcagcag caccgcctac 2220
atggagctga gaagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actattgcac cctgggagcc 2280
ttcgtgtatt ggggacaggg cacactggtg acagtgtccg ccgctaaaac cacccctaag 2340
ctggaggagg gcgagtttag cgaggctaga gtggacgtgg tggtgacaca gacccctctg 2400
tctctgccag tgtccttcgg cgatcaggtg tccatctctt gccggagctc tcagagcctg 2460
gccaacagct acggcaacac ctacctgtct tggtacctgc acaagcccgg acagagccct 2520
cagctgctga tctacggcat ctccaaccgg ttcagcggcg tgccagacag attcagcgga 2580
agcggcagcg gcacagactt caccctgaag atcagcacca tcaagcccga ggacctgggc 2640
atgtactatt gcctgcaggg cacccaccag ccttatacct ttggcggagg caccaagctg 2700
gagatcaaga gagccgacgc cgctgcagcc ggatctgaac agaaactgat ttccgaggaa 2760
gatctgttcg tccccgtgtt cctgcctgcc aagccaacaa ctacccctgc tccacgacca 2820
cctactccag cacctaccat cgcaagtcag cccctgtcac tgcgacctga ggcttgccgg 2880
ccagcagctg gaggagcagt gcacacccga ggcctggact tcgcatgcga tatctacatt 2940
tgggcaccac tggctggaac ctgtggggtc ctgctgctga gcctggtcat caccctgtat 3000
tgtaaccaca gaaataggag caaacgctcc cgactgctgc attccgacta catgaacatg 3060
acacctcgga gaccaggccc cactagaaag cattaccagc catatgcccc acccagggat 3120
ttcgcagcct atcggagccg gttcagcgtc gtgaaaaggg ggcgcaagaa actgctgtac 3180
atcttcaagc agccttttat gcgcccagtg cagacaactc aggaggaaga cggatgctct 3240
tgtcggttcc cagaggagga ggaaggaggc tgcgagctga gagtgaagtt cagccggagc 3300
gccgatgcac cagcatatca gcagggacag aatcagctgt acaacgagct gaatctgggc 3360
aggcgcgagg aatatgacgt gctggataag cgacgaggac gggaccccga aatgggagga 3420
aaacccagaa ggaagaaccc tcaggagggg ctgtataatg aactgcagaa agacaagatg 3480
gctgaggcat acagcgaaat tggaatgaaa ggagagcgcc gacgggggaa gggacacgat 3540
gggctgtacc agggactgtc aaccgccact aaagatacct acgacgcact gcacatgcag 3600
gctctgcccc caagagaatt cgaaggatcc gcggccgctg agggcagagg aagtcttcta 3660
acatgcggtg acgtggagga gaatcccggc ccttccggga tgaccgagta caagcccacg 3720
gtgcgcctcg ccacccgcga cgacgtcccc agggccgtac gcaccctcgc cgccgcgttc 3780
gccgactacc ccgccacgcg ccacaccgtc gatccggacc gccacatcga gcgggtcacc 3840
gagctgcaag aactcttcct cacgcgcgtc gggctcgaca tcggcaaggt gtgggtcgcg 3900
gacgacggcg ccgcggtggc ggtctggacc acgccggaga gcgtcgaagc gggggcggtg 3960
ttcgccgaga tcggcccgcg catggccgag ttgagcggtt cccggctggc cgcgcagcaa 4020
cagatggaag gcctcctggc gccgcaccgg cccaaggagc ccgcgtggtt cctggccacc 4080
gtcggcgtct cgcccgacca ccagggcaag ggtctgggca gcgccgtcgt gctccccgga 4140
gtggaggcgg ccgagcgcgc cggggtgccc gccttcctgg agacctccgc gccccgcaac 4200
ctccccttct acgagcggct cggcttcacc gtcaccgccg acgtcgaggt gcccgaagga 4260
ccgcgcacct ggtgcatgac ccgcaagccc ggtgcctgaa tctaggtcga caatcaacct 4320
ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc tccttttacg 4380
ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcgt taactaaact tgtttattgc 4440
agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt 4500
ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggaa 4560
ttgactcaaa tgatgtcaat tagtctatca gaagctcatc tggtctccct tccgggggac 4620
aagacatccc tgtttaatat ttaaacagca gtgttcccaa actgggttct tatatccctt 4680
gctctggtca accaggttgc agggtttcct gtcctcacag gaacgaagtc cctaaagaaa 4740
cagtggcagc caggtttagc cccggaattg actggattcc ttttttaggg cccattggta 4800
tggctttttc cccgtatccc cccaggtgtc tgcaggctca aagagcagcg agaagcgttc 4860
agaggaaagc gatcccgtgc caccttcccc gtgcccgggc tgtccccgca cgctgccggc 4920
tcggggatgc ggggggagcg ccggaccgga gcggagcccc gggcggctcg ctgctgcccc 4980
ctagcggggg agggacgtaa ttacatccct gggggctttg ggggggggct gtccctgata 5040
tctataacaa gaaaatatat atataataag ttatcacgta agtagaacat gaaataacaa 5100
tataattatc gtatgagtta aatcttaaaa gtcacgtaaa agataatcat gcgtcatttt 5160
gactcacgcg gtcgttatag ttcaaaatca gtgacactta ccgcattgac aagcacgcct 5220
cacgggagct ccaagcggcg actgagatgt cctaaatgca cagcgacgga ttcgcgctat 5280
ttagaaagag agagcaatat ttcaagaatg catgcgtcaa ttttacgcag actatctttc 5340
tagggttaat ctagctgcat caggatcata tcgtcgggtc ttttttccgg ctcagtcatc 5400
gcccaagctg gcgctatctg ggcatcgggg aggaagaagc ccgtgccttt tcccgcgagg 5460
ttgaagcggc atggaaagag tttgccgagg atgactgctg ctgcattgac gttgagcgaa 5520
aacgcacgtt taccatgatg attcgggaag gtgtggccat gcacgccttt aacggtgaac 5580
tgttcgttca ggccacctgg gataccagtt cgtcgcggct tttccggaca cagttccgga 5640
tggtcagccc gaagcgcatc agcaacccga acaataccgg cgacagccgg aactgccgtg 5700
ccggtgtgca gattaatgac agcggtgcgg cgctgggata ttacgtcagc gaggacgggt 5760
atcctggctg gatgccgcag aaatggacat ggataccccg tgagttaccc ggcgggcgcg 5820
cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc 5880
acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta 5940
actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca 6000
gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc 6060
cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc 6120
tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat 6180
gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt 6240
ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg 6300
aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc 6360
tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt 6420
ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa 6480
gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta 6540
tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 6600
caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa 6660
ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt 6720
cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt 6780
ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat 6840
cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat 6900
gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc 6960
aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc 7020
acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta 7080
gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga 7140
cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg 7200
cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc 7260
tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat 7320
cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag 7380
gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat 7440
cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa 7500
ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa 7560
gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga 7620
taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg 7680
gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc 7740
acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg 7800
aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcat 7857
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggggttccag ggcctgtctg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagacaggcc ctggaacccc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgactggcca gggcgcctgt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acaggcgccc tggccagtcg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
accgcccaga cgactggcca 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tggccagtcg tctgggcggt 20
<210> 9
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttcgtccccg tgttcctgcc tgccaagcca acaactaccc ctgctccacg accacctact 60
ccagcaccta ccatcgcaag tcagcccctg tcactgcgac ctgaggcttg ccggccagca 120
gctggaggag cagtgcacac ccgaggcctg gacttcgcat gcgatatcta catttgggca 180
ccactggctg gaacctgtgg ggtcctgctg ctgagcctgg tcatcaccct gtattgtaac 240
cacagaaat 249
<210> 10
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aggagcaaac gctcccgact gctgcattcc gactacatga acatgacacc tcggagacca 60
ggccccacta gaaagcatta ccagccatat gccccaccca gggatttcgc agcctatcgg 120
agc 123
<210> 11
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cggttcagcg tcgtgaaaag ggggcgcaag aaactgctgt acatcttcaa gcagcctttt 60
atgcgcccag tgcagacaac tcaggaggaa gacggatgct cttgtcggtt cccagaggag 120
gaggaaggag gctgcgagct g 141
<210> 12
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agagtgaagt tcagccggag cgccgatgca ccagcatatc agcagggaca gaatcagctg 60
tacaacgagc tgaatctggg caggcgcgag gaatatgacg tgctggataa gcgacgagga 120
cgggaccccg aaatgggagg aaaacccaga aggaagaacc ctcaggaggg gctgtataat 180
gaactgcaga aagacaagat ggctgaggca tacagcgaaa ttggaatgaa aggagagcgc 240
cgacggggga agggacacga tgggctgtac cagggactgt caaccgccac taaagatacc 300
tacgacgcac tgcacatgca ggctctgccc ccaagatga 339

Claims (11)

1.一种PD-1基因被敲除的CAR-T细胞，其特征在于，PD-1基因敲除且表达CD133-CAR的T细胞，采用的基因敲除方法是通过BE-Plus系统或Cas9、ZFN、TALEN基因敲除方法来实现。
2.如权利要求1所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述的基因敲除通过BE-Plus系统来实现，具体为：选定基因敲除的位点，设计靶点序列sgRNA，随后筛选出靶点序列，具体如下所示：
sgRNA1-F：如SEQ ID NO.3所示；
sgRNA1-R：如SEQ ID NO.4所示；
sgRNA2-F：如SEQ ID NO.5所示；
sgRNA2-R：如SEQ ID NO.6所示；
sgRNA3-F：如SEQ ID NO.7所示；
sgRNA3-R：如SEQ ID NO.8所示；
所示靶点序列可用于质粒载体上，慢病毒载体上，或用于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或其他类型载体上。
3.如权利要求2所示的CAR-T细胞，其特征在于，所述选出的靶点序列为如下序列：
sgRNA1-F：如SEQ ID NO.3所示；
sgRNA1-R：如SEQ ID NO.4所示。
4.如权利要求1-3任一项所述的CD133-CAR包含CD133-scFv，CD133-scFv用于识别CD133抗原，该CD133-scFv序列如SEQ ID NO.1所示。
5.如权利要求4所述的PD-1基因被敲除的表达CD133-CAR的T细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）从供者提供的外周血中分离PBMC；
（2）在转染体系中，将表达CD133-CAR质粒、转座酶质粒、BE Plus双质粒、靶向PD-1的sgRNA质粒共同转染步骤（1）PBMC细胞，获得转染后的细胞，并进行体外培养、大量扩增；
（3）用CD3抗体刺激步骤（2）得到的细胞，以获得PD-1基因敲除且表达CD133-CAR的T细胞，并对所获得T细胞进行后续检测。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，表达CD133-CAR的质粒为PiggyBac-transposon载体依次串联启动子、信号肽、CD133-scFv序列、铰链区、跨膜区、胞内信号传导区和T2A短肽连接的抗性基因puromycin制备而成的，其中CD133-ScFv序列为优化后的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述胞内信号传导区包含编码共刺激因子区域，该共刺激因子区域选自4-1BB、CD28、CD27、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LIGHT、B7-H3、特异性结合CD83的配体、ICAM-1、HVEM(LIGHTR)、CD160、淋巴细胞功能相关的抗原-1（LFA-1）、IL2Rα、CD103、CD11b、CD11c、TRANCE/RANKL、SLAMF4(CD244,2B4)、CD69、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)中的一种或多种的任意组合。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述启动子为人EF1α启动子，所述胞内信号传导区为CD28-4-1BB-CD3ζ，铰链区为CD8 Hinge嵌合受体铰链，跨膜区为CD8Transmembrane嵌合受体跨膜区。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，其步骤（2）中所述转染的方法为电转转染方法，将构建好的多个质粒通过电转的方式转染入分选的细胞中。
10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述靶向PD-1的sgRNA质粒是通过将靶点序列退火获得的互补寡核苷酸双链片段导入pGL3-U6-sgRNA质粒所得。
11.如权利要求1-3任一项所述的PD-1基因被敲除的CAR-T细胞的用途，其特征在于，用于制备抗肿瘤的细胞治疗药物，特别是靶向CD133阳性的肿瘤干细胞的细胞治疗药物。
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