CN107699535B - 一种诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用，所述重组芽孢杆菌是通过诱导表达枯草芽孢杆菌168的糖转运蛋白基因，并表达外源岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因得到的。本发明通过强化丙酮酸到草酰乙酸的反应，增加流向草酰乙酸的碳通量，增强了细胞膜对岩藻糖的运输，增加了胞内岩藻糖的浓度，促进了鸟苷二磷酸岩藻糖的合成。本发明重组枯草芽孢杆菌的构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。

Description

一种诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌及其构 建方法与应用

技术领域

本发明属于遗传工程的技术领域，具体涉及一种诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

母乳中含有重要营养成分，生物活性物质，刺激肠道菌群生长的因子。其中，母乳寡糖(Human Milk Oligosacchrides,hMOs)在许多生理功能上起到了关键的作用，例如促进双歧杆菌生长，病原体感染的抑制作用，和提高免疫反应。母乳寡糖中的藻糖基化的寡糖(FOSs)由于其生理功能如其作为肠道致病菌的受体类似物的能力、促进免疫调节的能力和减少炎症的能力，已经获得了极大的关注。因为藻糖基化的寡糖是由岩藻糖基转移酶催化进行糖类岩藻糖基化而成，这就需要鸟苷二磷酸岩藻糖(GDP-L-fucose)作为岩藻糖基的供体。随着岩藻糖基化的寡糖的热度越来越高，许多制药公司试图通过化学方法和生物方法合成充足的GDP-L-fucose。在化学合成中，GDP-L-fucose以L-岩藻吡喃糖基四乙酸为起始原料，由HBr、Ag2CO3、N-四丁铵磷酸二甲苯酯等物质引发的化学反应。GDP-L-fucose是可拉酸的前体，可拉酸是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，因此，一些肠道细菌如大肠杆菌和沙门氏菌能在体内合成GDP-L-岩藻糖。在生物中发现了两种合成GDP-L-fucose的代谢途径：补救途径和从头途径。

补救途径是在人类的代谢途径中发现的，外源的岩藻糖转移到胞内，由岩藻糖激酶消耗ATP磷酸化(EC2.7.1.52)形成岩藻糖-1-磷酸(Fuc-1-P)。Fuc-1-P结合鸟苷三磷酸(GTP)在岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶(L-fucose-1-phosphate guanylyltransferase)(EC2.7.7.30)的催化下生成GDP-L-岩藻糖。从头合成途径普遍存在于原核生物和真核生物中，其中GDP-L-fucose是由GDP-甘露糖通过甘露糖脱氢酶(GMD，EC4.2.1.47)和GDP-岩藻糖合成酶(WCAG，EC1.1.1.271)催化合成的。其中有代表性的反应方案如下所示：

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。

因此，如何利用枯草芽孢杆菌，通过生物方法高效合成鸟苷二磷酸岩藻糖，仍是本领域亟待解决的问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用，构建的重组枯草芽孢杆菌可以高效合成鸟苷二磷酸岩藻糖。

具体的，一方面，本发明提供了一种诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌，所述重组芽孢杆菌是通过诱导表达枯草芽孢杆菌168的糖转运蛋白基因，并表达外源岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因得到的。

枯草芽孢杆菌168的糖转运蛋白基因是不表达的，通过诱导表达枯草芽孢杆菌168的糖转运蛋白基因，并表达外源岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因，提高了外源岩藻糖转移至胞内的效率，增加了胞内岩藻糖的浓度，促进了鸟苷二磷酸岩藻糖的合成。

其中，将枯草芽孢杆菌168的糖转运蛋白基因的启动子替换为诱导型启动子Pgrac，来诱导表达枯草芽孢杆菌168的糖转运蛋白基因。诱导型启动子Pgrac强化了丙酮酸到草酰乙酸的反应，增加流向草酰乙酸的碳通量，增强了细胞膜对岩藻糖的运输，提高了胞内岩藻糖浓度，促进了鸟苷二磷酸岩藻糖的积累。

所述糖转运蛋白基因如NCBI中GeneID:936346所示。

优选的，所述岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因为脆弱拟杆菌9343的fkp基因。所述脆弱拟杆菌9343的fkp基因如NCBI上GenBank:AY849806.1所示。

第二方面，本发明还提供了一种所述的诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，该构建方法包括以下步骤：

(1)构建包含糖转运蛋白基因的上下游序列、Pgrac启动子和博来霉素抗性基因序列的替换框，将构建好的替换框转化重组枯草芽孢杆菌168，通过验证，确认糖转运蛋白基因诱导表达成功，得到重组枯草芽孢杆菌BIG；

(2)构建包含岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因的重组质粒，将构建好的重组质粒转化枯草芽孢杆菌BIG，通过验证，确认岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶表达成功，得到重组枯草芽孢杆菌BIGF。

优选的，步骤(1)中，替换框的序列如SEQ ID NO.1所示。

步骤(2)中，重组质粒的序列如SEQ ID NO.2所示。

第三方面，本发明还提供了一种所述重组枯草芽孢杆菌的应用，使用所述重组枯草芽孢杆菌发酵生成鸟苷二磷酸岩藻糖。

优选的，所述发酵是将重组芽孢杆菌种子液以OD值为0.1-0.3的接种量接入发酵培养基中，同时加入0.2mM IPTG，在35-40℃、200-250rpm条件下培养20-25h。

本发明的有益效果为：

本发明的重组枯草芽孢杆菌，是在枯草芽孢杆菌168的基础上诱导表达了糖转运蛋白基因，并在此基础上表达岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因得到的。本发明通过强化了丙酮酸到草酰乙酸的反应，增加流向草酰乙酸的碳通量，增强了细胞膜对岩藻糖的运输，提高了胞内岩藻糖浓度，促进了鸟苷二磷酸岩藻糖的积累，增加了胞内岩藻糖的浓度，促进了鸟苷二磷酸岩藻糖的合成。本发明重组枯草芽孢杆菌的构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例3得到的鸟苷二磷酸岩藻糖的气质联用色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细的解释说明。

实施例1

诱导表达糖转运蛋白基因glcP

根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168购自美国典型微生物保藏中心，ATCC No.27370)的糖转运蛋白基因glcP的上下游序列、Pgrac启动子以及博来霉素抗性基因的序列，构建序列如SEQ ID NO.1所示的替换框。

将构建好的替换框电转化枯草芽孢杆菌168的感受态细胞，替换框添加量为100-300ng，电转化条件：电压2.5kV，电击试剂5ms，37℃复苏5h涂布终浓度为10μg/mL博来霉素抗性的LB平板，37℃厌氧培养48h，挑选单克隆若干。

将构建好的替换框转化重组枯草芽孢杆菌168，由于替换框中存在糖转运蛋白基因glcP的上下游序列，与枯草芽孢杆菌168的转运蛋白基因同源，通过同源重组，替换框中的博来霉素抗性基因zeo和Pgrac启动子游替换枯草芽孢杆菌168糖转运蛋白基因glcP的启动子。

通过博来霉素抗性平板筛选，菌落PCR验证，测序后确认糖转运蛋白基因(glcP)是否强化表达成功，博来霉素抗性呈阳性的为替换框转化成功的枯草芽孢杆菌，菌落PCR验证有特殊条带的，且测序结果与理论结果一致的为替换框转化重组成功的枯草芽孢杆菌，即糖转运蛋白基因(glcP)诱导表达成功的枯草芽孢杆菌。

确认糖转运蛋白基因(glcP)强化表达成功后，得到重组枯草芽孢杆菌BIG。

实施例2

外源表达脆弱拟杆菌外源基因

根据NCBI上公布的脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis，ATCC No.25285)的岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因fkp的序列，通过基因fkp和质粒pP43NMK的限制性酶切位点的酶切及连接，构建序列如SEQ ID NO.2所示的重组质粒pP43-Fkp。

将构建好的重组质粒电转化重组枯草芽孢杆菌BIG的感受态细胞，重组质粒的添加量为50-300ng，电转化条件：电压2.5kV，电击试剂5ms，37℃复苏5h涂布终浓度为10μg/mL卡那霉素抗性的LB平板，37℃厌氧培养48h，挑选单克隆若干。

通过卡那霉素抗性平板筛选，菌落PCR验证，测序后确认藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因是否表达成功，卡那霉素抗性呈阳性的为转化成功的枯草芽孢杆菌，菌落PCR验证有特殊条带的，且测序结果与理论结果一致的为转化重组成功的枯草芽孢杆菌，即岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶表达成功。

确认脆弱拟杆菌的岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶表达成功，得到重组枯草芽孢杆菌BIGF。

实施例3

发酵生产鸟苷二磷酸岩藻糖

将上述重组枯草芽孢杆菌BIGF制成种子液，种子液培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl10g/L；种子液制作方法为：挑取新鲜平板上的单菌落在种子培养基中，培养8-10h。

以OD值为0.1的接种量将种子液接入到发酵培养基中，发酵培养基的配方为：初始甘油20g/L、蛋白胨6g/L、酵母粉12g/L、(NH₄)SO₄6g/L,K₂HPO₄·3H₂O 12.5g/L、KH₂PO₄ 2.5g/L、CaCO₃ 5g/L、微量元素10ml/L；微量元素溶液按g/L计含有：MnSO₄·5H₂O 1.0、CoCl₂·6H₂O0.4、NaMoO₄·2H₂O 0.2、ZnSO₄·7H₂O 0.2、AlCl₃·6H₂O 0.1、CuCl₂·H₂O 0.1、H₃BO₄0.05，5MHCl，同时加入诱导剂0.2mM IPTG，于35℃、200rpm条件下培养20h。

发酵结束时，使用气质联用色谱仪测定发酵上清液中的鸟苷二磷酸岩藻糖的含量，鸟苷二磷酸岩藻糖的气质联用色谱图如图1所示，测定的鸟苷二磷酸岩藻糖的含量达到62mg/L。

实施例4

发酵生产鸟苷二磷酸岩藻糖

将上述重组枯草芽孢杆菌BIGF制成种子液，种子液培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L；种子液的制作方法为：挑取新鲜平板上的单菌落在种子培养基中，培养8-10h。

以OD值为0.3的接种量将种子液接入到发酵培养基中，发酵培养基的配方为：初始甘油20g/L、蛋白胨6g/L、酵母粉12g/L、(NH₄)SO₄6g/L,K₂HPO₄·3H₂O 12.5g/L、KH₂PO₄ 2.5g/L、CaCO₃ 5g/L、微量元素10ml/L；微量元素溶液按g/L计含有：MnSO₄·5H₂O 1.0、CoCl₂·6H₂O0.4、NaMoO₄·2H₂O 0.2、ZnSO₄·7H₂O 0.2、AlCl₃·6H₂O 0.1、CuCl₂·H₂O 0.1、H₃BO₄ 0.05、5M HCl，同时加入诱导剂0.2mM IPTG，于40℃、250rpm条件下培养25h。

发酵结束时，发酵上清液中鸟苷二磷酸岩藻糖含量达到60mg/L。

对比例1

根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168购自美国典型微生物保藏中心，ATCC No.27370)的糖转运蛋白基因glcP的上下游序列、Pgrac启动子以及博来霉素抗性基因的序列，构建序列如SEQ ID NO.1所示的替换框。

将构建好的替换框转化重组枯草芽孢杆菌168，由于替换框中存在糖转运蛋白基因glcP的上下游序列，与枯草芽孢杆菌168的转运蛋白基因同源，通过同源重组，替换框中的Pgrac启动子替换枯草芽孢杆菌168糖转运蛋白基因glcP的启动子。

通过博来霉素抗性平板筛选，菌落PCR验证，测序后确认糖转运蛋白基因(glcP)是否强化表达成功，博来霉素抗性呈阳性的为替换框转化成功的枯草芽孢杆菌，菌落PCR验证有特殊条带的，且测序结果与理论结果一致的为替换框转化重组成功的枯草芽孢杆菌，即糖转运蛋白基因(glcP)强化表达成功的枯草芽孢杆菌。

确认糖转运蛋白基因(glcP)强化表达成功后，得到重组枯草芽孢杆菌BIG。

用重组枯草芽孢杆菌BIG发酵生产鸟苷二磷酸岩藻糖，发酵结束时，离心收集获得细胞，超声破碎获得胞内可溶性混合液，其中未检测到鸟苷二磷酸岩藻糖。

对比例2

根据NCBI上公布的脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis，ATCC No.25285)的岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因fkp的序列，构建序列如SEQ ID NO.2所示的重组质粒。

将构建好的重组质粒转化枯草芽孢杆菌168。

通过卡那霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证，测序后确认藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因是否表达成功，卡那霉素抗性呈阳性的为转化成功的枯草芽孢杆菌，菌落PCR验证有特殊条带的，且测序结果与理论结果一致的为替换框重组成功的枯草芽孢杆菌，即岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶表达成功。

确认脆弱拟杆菌的岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶表达成功，得到重组枯草芽孢杆菌BIF。

用重组枯草芽孢杆菌BIF发酵生产鸟苷二磷酸岩藻糖，发酵结束时，离心收集获得细胞，超声破碎获得胞内可溶性混合液，其中未检测到鸟苷二磷酸岩藻糖。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 光明乳业股份有限公司

<120> 一种诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3022

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 1

ttgtgaaaac tttcggcggg aagtcatttg aaaacgtaga tgaactaatt gatgcctcag 60

aaggtttaat tgtagcatca ccaaactttt gccataaaga acatgctttg caagcattag 120

gaaaacataa gcatgtatta tgtgaaaagc ctatggctat ttctcttgaa gaagcaagca 180

taatgaaaga tactgctgaa aggttgagcg taagagccag tatgggattt aattatagat 240

atttatctta cgtaaatatc ttaaaaagct taattatcaa taatgaacta ggtaacatac 300

tgtccataaa agtacacttc aagaaaaata gtgcacttag acgtaagaag tttacttgga 360

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ttgacatggt atggtatttg ttcgagagtg atttcatcac agaatcagta agggcaaaga 480

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ggaatttact ttcctgcttt ttcatatagg ggtgtaatga tacccgggga tcctctagag 1020

ataccgttcg tatagcatac attatacgaa gttatcttga tatggctttt tatatgtgtt 1080

actctacata cagaaaggag gaactaaaca tggccaagtt gaccagtgcc gttccggtgc 1140

tcaccgcgcg cgacgtcgcc ggagcggtcg agttctggac cgaccggctc gggttctccc 1200

gggacttcgt ggaggacgac ttcgccggtg tggtccggga cgacgtgacc ctgttcatca 1260

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aatacagcca ttgaacatac ggttgattta ataactgaca aacatcaccc tcttgctaaa 1620

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ggtttactta tttttttgcc aaggctgtaa tggctgaaaa ttcttacatt tattttacat 1740

ttttagaaat gggcgtgaaa aaaagcgcgc gattatgtaa aatataaagt gatagcaaag 1800

gaggtgaaat gtacacatgt taagagggac atatttattt ggatatgctt tcttttttac 1860

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agtattaatc gcacctttaa tgattaagaa atacagtcat tttaggacac ttactttagc 2040

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caaagcatca aaaacacagt ag 3022

<210> 2

<211> 9577

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 2

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

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tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt ccttaaggaa cgtacagacg 420

gcttaaaagc ctttaaaaac gtttttaagg ggtttgtaga caaggtaaag gataaaacag 480

cacaattcca agaaaaacac gatttagaac ctaaaaagaa cgaatttgaa ctaactcata 540

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atgtgtttta aagtattgaa aacccttaaa attggttgca cagaaaaacc ccatctgtta 780

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tattttatta aagagtagtt caacaaacgg gccagtttgt tgaagattag atgctataat 1860

tgttattaaa aggattgaag gatgcttagg aagacgagtt attaatagct gaataagaac 1920

ggtgctctcc aaatattctt atttagaaaa gcaaatctaa aattatctga aaagggaatg 1980

agaatagtga atggaccaat aataatgact agagaagaaa gaatgaagat tgttcatgaa 2040

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acacatggtc aatttttctc tattttgccg atttatgatt caggtggata cttagagaaa 2340

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ttattgctgg tactgctagt tgccgcattg aagtagaggg aattgatgaa ttatatcaac 3240

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cgaaagacaa taaaaatttt attcttgctg agtctggctt tcggtaagct agacaaaacg 3540

gacaaaataa aaattggcaa gggtttaaag gtggagattt tttgagtgat cttctcaaaa 3600

aatactacct gtcccttgct gatttttaaa cgagcacgag agcaaaaccc ccctttgctg 3660

aggtggcaga gggcaggttt ttttgtttct tttttctcgt aaaaaaaaga aaggtcttaa 3720

aggttttatg gttttggtcg gcactgccgc gcctcgcaga gcacacactt tatgaatata 3780

aagtatagtg tgttatactt tacttggaag tggttgccgg aaagagcgaa aatgcctcac 3840

atttgtgcca cctaaaaagg agcgatttac atatgagtta tgcagtttgt agaatgcaaa 3900

aagtgaaatc agctggacta aaaggcatgc aatttcataa tcaaagagag cgaaaaagta 3960

gaacgaatga tgatattgac catgagcgaa cacgtgaaaa ttatgatttg aaaaatgata 4020

aaaatattga ttacaacgaa cgtgtcaaag aaattattga atcacaaaaa acaggtacaa 4080

gaaaaacgag gaaagatgct gttcttgtaa atgagttgct agtaacatct gaccgagatt 4140

tttttgagca actggatcct gataggtggt atgttttcgc ttgaactttt aaatacagcc 4200

attgaacata cggttgattt aataactgac aaacatcacc ctcttgctaa agcggccaag 4260

gacgctgccg ccggggctgt ttgcgttttt gccgtgattt cgtgtatcat tggtttactt 4320

atttttttgc caaagctgta atggctgaaa attcttacat ttattttaca tttttagaaa 4380

tgggcgtgaa aaaaagcgcg cgattatgta aaatataaag tgatagcggt accgagctca 4440

aaggaggtga aatgtacaca tgcaaaagtt actgtctctc ccatctaact tagtccagag 4500

ctttcatgaa ttagaaagag taaatcggac tgactggttt tgcacatccg acccggtcgg 4560

aaaaaagctt ggcagtggcg gtggcacatc atggctgctc gaggaatgct ataatgaata 4620

ctctgacggc gcaactttcg gagagtggct cgaaaaagag aaaagaatac tgctccacgc 4680

cggtgggcag tcccgccgtt tgccgggtta cgctcctagt ggtaagatcc ttacgccggt 4740

cccagtattt cgctgggaaa gaggacagca cctgggccag aaccttttga gtttacagct 4800

tccactttat gagaaaataa tgagcttagc tcctgacaag cttcataccc ttatcgccag 4860

cggagatgtc tatatacgct ctgaaaaacc gttgcagtcc atacctgagg ccgacgttgt 4920

ttgttacggg ctgtgggtcg acccttcctt ggcgacgcac catggggtat tcgccagtga 4980

ccgcaaacat ccggagcagc tcgacttcat gctccagaag ccttctttgg cagaacttga 5040

aagtctctct aagactcatc ttttcctgat ggacataggg atttggttat tgtccgatcg 5100

cgcggtagag attttgatga agcggtccca taaggagtcc tctgaagaat tgaaatacta 5160

tgatctttac agcgactttg ggcttgccct gggcacccac ccacggatag aagatgagga 5220

agtgaatact ctctcagttg caattctgcc tctcccgggc ggggagtttt atcattacgg 5280

tactagcaaa gagctgattt cctccaccct gtcagtccag aataaggttt atgaccaacg 5340

ccggatcatg catagaaagg tcaaaccgaa ccctgccatg tttgtccaaa atgcggtagt 5400

acgtatccca ctgtgcgctg agaacgcaga cctctggatt gaaaactcac atataggtcc 5460

gaagtggaag atagcgagcc ggcatattat tactggggtg ccggagaacg actggagttt 5520

agcagtgcca gcaggggtat gtgtcgacgt tgtcccgatg ggtgataaag gttttgtggc 5580

acggccttac gggctggacg atgtatttaa aggagacctg agagattcaa aaaccacttt 5640

gaccggaatc ccattcggtg aatggatgtc caaacgggga ctctcctaca ctgatctgaa 5700

aggtcggact gacgaccttc aagccgtgag cgtgtttccg atggtcaatt ccgttgagga 5760

attgggcctc gtactccgct ggatgctttc agaacctgag ttggaagagg gtaagaacat 5820

ctggcttcgc tccgagcact tctctgcgga tgaaataagc gctggagcga acctgaagcg 5880

cctctatgct caacgggaag aattccggaa ggggaactgg aaagcattag ccgttaacca 5940

tgagaagtcc gtattttacc aactcgattt ggccgatgcg gcggaggatt tcgtacggtt 6000

gggactcgac atgcctgaat tactccctga ggacgccctg cagatgagtc gcatccataa 6060

tagaatgctt cgcgctcgca tcctcaagct cgacggcaaa gattaccggc ctgaggaaca 6120

ggcagcgttc gatctgctgc gcgacggttt gctcgatgga atctctaacc gtaaaagcac 6180

accaaagctg gacgtttatt ctgaccaaat agtgtggggc cggagcccag tacggattga 6240

tatggccggc ggctggaccg acaccccacc ttatagctta tattccggag gcaatgttgt 6300

gaaccttgcg attgaattaa atggtcaacc tccattgcag gtatacgtta agccgtgtaa 6360

ggacttccat atcgtcctgc ggtccattga catgggggct atggagatag tctcaacttt 6420

tgacgagctg caagactaca aaaagatcgg ttccccgttt tccataccaa aagccgctct 6480

ctctcttgct ggattcgccc cggcatttag cgctgtgtca tatgcatcat tggaggaaca 6540

gttgaaagat tttggagctg gtattgaggt tacgttatta gccgccattc cggctggttc 6600

tggtcttggt acatcatcaa tactggcttc cacagtgctc ggggcaatta atgatttttg 6660

tggactcgca tgggacaaaa atgaaatttg tcagagaaca ttagttttag agcaactgct 6720

gactacggga ggaggctggc aggaccagta cggcggggtc ttgcaaggtg ttaagcttct 6780

gcagaccgag gccgggttcg cgcaatcccc attagttaga tggctgccag accacctctt 6840

tacgcaccct gaatacaagg actgccattt gttatattac acaggaatta cgcgtacggc 6900

aaagggaata ctggcggaga tcgtctctag catgtttctc aatagtagcc tgcacctgaa 6960

tttactctca gaaatgaaag cgcatgccct cgacatgaac gaggctatac agcgcggctc 7020

ctttgttgag ttcggtcgcc ttgtcggaaa gacatgggag caaaacaagg cactcgacag 7080

tggtaccaac ccaccagcag tcgaagccat aatcgactta attaaggatt atacattagg 7140

gtataaactc ccaggggctg gaggaggcgg gtacctctac atggttgcta aagatccgca 7200

ggcagcagtg cgcatccgca aaattttaac agagaacgcg ccaaaccctc gtgcccggtt 7260

tgtggaaatg actctgtccg acaaaggctt tcaagtaagt cggtcctaaa ctagtgattg 7320

ctagctctag actgcagaag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat 7380

tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg 7440

ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag 7500

tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt 7560

ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 7620

ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 7680

gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 7740

gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 7800

cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 7860

ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 7920

tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg 7980

gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 8040

tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 8100

ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 8160

ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct 8220

ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 8280

accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 8340

tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 8400

cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat 8460

taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac 8520

caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt 8580

gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt 8640

gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag 8700

ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct 8760

attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt 8820

gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc 8880

tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt 8940

agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg 9000

gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg 9060

actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct 9120

tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc 9180

attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt 9240

tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt 9300

tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg 9360

aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat 9420

tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg 9480

cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta 9540

acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtc 9577

Claims (6)

1.一种诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组芽孢杆菌是通过将枯草芽孢杆菌168的糖转运蛋白基因的启动子替换为诱导型启动子Pgrac，来诱导表达枯草芽孢杆菌168的糖转运蛋白基因，并表达外源岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因得到的；其中所述糖转运蛋白基因如NCBI中Gene ID:936346所示；所述岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因为来源于脆弱拟杆菌9343的fkp基因，且所述脆弱拟杆菌9343的fkp基因如NCBI上GenBank:AY849806.1所示。

2.一种权利要求1所述的诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，该构建方法包括以下步骤：

(1)构建包含糖转运蛋白基因的上下游序列、Pgrac启动子和博来霉素抗性基因序列的替换框，将构建好的替换框转化重组枯草芽孢杆菌168，通过验证，确认糖转运蛋白基因诱导表达成功，得到重组枯草芽孢杆菌BIG；

(2)构建包含岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因的重组质粒，将构建好的重组质粒转化枯草芽孢杆菌BIG，通过验证，确认岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶表达成功，得到重组枯草芽孢杆菌BIGF。

3.根据权利要求2所述的诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，替换框的序列如SEQ ID NO.1所示。

4.根据权利要求2所述的诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，重组质粒的序列如SEQ ID NO.2所示。

5.权利要求1所述的诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于，使用所述重组枯草芽孢杆菌发酵生成鸟苷二磷酸岩藻糖。

6.根据权利要求5所述的诱导合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述发酵是将重组芽孢杆菌种子液以OD值为0.1-0.3的接种量接入发酵培养基中，同时加入0.2mM IPTG，在35-40℃、200-250rpm条件下培养20-25h。

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