KR101246884B1

KR101246884B1 - 지방산 생합성 경로의 과발현용 형질전환 슈도모나스 에어루지노사 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR101246884B1
Application number: KR1020100037546A
Authority: KR
Inventors: 이진원; 이선희
Original assignee: 서강대학교산학협력단
Priority date: 2010-04-22
Filing date: 2010-04-22
Publication date: 2013-03-25
Also published as: KR20110118007A

Abstract

본 발명은 아세틸-CoA 카복실라제 카복실트랜스퍼라제 서브유닛 알파를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및/또는 말로닐-CoA-[아실운반단백질]트랜스아실라제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현벡터로 형질전환된 슈도모나스 에어루지노사 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 지방산 생합성 경로의 과발현용 형질전환 슈도모나스 에어루지노사는 유전적 안정성이 높고 지방산 생합성 경로 과발현 효과가 매우 뛰어나다.

Description

지방산 생합성 경로의 과발현용 형질전환 슈도모나스 에어루지노사 및 그의 제조방법{Transformed Pseudomonas Aeruginosa for Over-expression of Fatty Acid Biosynthesis Pathway and Method of Preparing the Same}

본 발명은 과발현용 형질전환 슈도모나스 에어루지노사 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

화석연료로부터 생산되어지는 화학제품들은 제조 공정 시 지구온난화 가스 및 폐기물을 대량생산하여 인류에게 심각한 환경적인 위기를 초래하게 되었다. 또한, 세계적 경제 성장에 따른 에너지 사용증가와 지속적인 가격상승을 보이는 석유, 가스 및 석탄 자원 등 화석원료의 한정성으로 인해 바이오에탄올(Bioethanol), 바이오디젤(Biodiesel), 바이오가스(Biohydrogen) 및 부탄올 등으로 대표되어지는 바이오에너지에 대한 관심이 증가하고 있다. 언급된 종류의 바이오에너지는 모두 전력생산이나 수송용 연료로 사용될 수 있으나, 실적용 및 생산 방법의 몇몇 단점으로 인해 새로운 신재생에너지 자원인 탄화수소 형태의 화합물에 대한 관심이 증가되고 있다. 이에 따라 장쇄 지방산을 대사산물로서 생성할 수 있는 재조합 균주에 대한 관심도 증대되고 있다.

슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)는 녹농균으로 1882년 Gessard에 의해 녹색의 농즙에서 발견되었으며, 녹색을 형성하는 관계로 녹농균이라 하였다. 녹농균은 자연계에 널리 분포되어 있으며, 농, 객담, 분변, 소변, 담즙, 자궁분비물, 혈액 및 척수액 등에서 자주 분리 되고 있다. 슈도모나스 에어루지노사 녹농균의 형태는 그람음성 막대균으로 그 크기는 0.5×1.0-1.5×3.0 ㎛이다. 보통 균체 끝 부분에 단극성의 편모가 2~3개 있어서 활발한 운동을 한다. 배양 시 협막과 유사한 세포외성의 다당질인 점질층이 형성된다. 협막과 유사한 세포외성의 다당질인 점질층이 형성된다. 임상검체에서 분리된 균은 흔히 섬모를 가지고 있어서 숙주세포에 부착을 용이하게 한다.

미생물 생체 내에서의 당으로부터 지방산합성은 아세틸-CoA(acetyl-CoA)에서 시작하여, 그 뒤 탄소원자가 한 번에 두 개의 원자씩 탄화수소사슬에 붙어 사슬이 길어지게 된다. 세포질에서 아세틸-CoA는 카복실화 되어서, 지방산 생합성에 있어 중요한 중간체가 되는 말로닐-CoA(malonyl-CoA)를 생산한다. 이 반응은 아세틸-CoA 카복실라아제 복합체에 의해 촉매되는데, 이 복합체는 세 개의 효소로 구성되어 있고, 효소 활성을 위해 ATP뿐만 아니라 Mn² ⁺과 바이오틴을 요구한다. 말로닐-CoA의 말로닐 그룹에 있는 세 개의 탄소원자 중 두 개가 생합성 반응의 각 단계마다 지방산 사슬에 더해진다. 이 반응은 말로닐-CoA 형성과 마찬가지로 세포질에 있고 막과 결합되어 있지 않는 다효소 복합체가 필요하다. 개별적인 효소들로 구성되어 있는 이 복합체는 지방산 합성효소를 말한다. 이러한 지방산 합성 효소 복합체의 일부인 아실 운반 단백질(acyl carrier protein: ACP)은 지방산의 탄소 수를 증가시키기 위한 결합에 관여한다.

미생물의 지방산 경로 대사흐름에서 아세틸-CoA, 말로닐-CoA의 과발현 목적에 해당하는 시도와 노력은 끊임없이 있어왔다. 특히, 대장균 효소 생산 시스템은 타 생물체에 비해 많은 대사정보가 알려져 있고, 유전자에 대한 정보가 거의 다 밝혀져 재조합 단백질 생산에 널리 이용되고 있다. 슈도모나스 에어루지노사 (Pseudomonas aeruginosa)는 문헌(A. J. Kutchma, T. T. Hoang and H. P. Schweizer. Characterization of a Pseudomonas aeruginosa Fatty Acid Biosynthetic Gene Cluster: Purification of Acyl Carrier Protein (APC) and Malonyl-Co enzymeA:ACP Transacylase (FabD). J. BACTERIOL 1999:5498-5504)에서 나타나고 있지만 대부분은 연구는 대장균으로 연구가 되어왔으며 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)의 지방산 생합성, 특히 탄소원으로부터 지방산 합성 경로에서 초기 단계의 연구가 수행되고 있지 못하다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 안정적이고 효과적으로 지방산 생합성 경로를 과발현 시킬 수 있는 형질전환 박테리아의 제조방법 개발을 위하여 예의 연구 노력하였고, 그 결과 아세틸-CoA 카복실라제 카복실트랜스퍼라제 서브유닛 알파 및/또는 말로닐-CoA-[아실운반단백질]트랜스아실라제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 발현벡터에 삽입시키고 상기 발현벡터로 슈도모나스 에어루지노사를 형질전환시키는 경우 효과적으로 지방산 생합성 경로가 과발현됨을 확인하여, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 지방산 생합성 경로의 과발현용 형질전환 슈도모나스 에어루지노사를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환된 슈도모나스 에어루지노사의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조한 형질전환된 슈도모나스 에어루지노사를 이용하여 지방산을 생합성하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 아세틸-CoA 카복실라제 카복실트랜스퍼라제 서브유닛 알파(acetyl-CoA carboxylase carboxytransferase subunit alpha)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현벡터로 형질전환된 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 말로닐-CoA-[아실운반단백질]트랜스아실라제(malonyl-CoA-[acyl-carrier-protein] transacylase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현벡터로 형질전환된 슈도모나스 에어루지노사를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 아세틸-CoA 카복실라제 카복실트랜스퍼라제 서브유닛 알파를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 말로닐-CoA-[아실운반단백질]트랜스아실라제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현벡터로 형질전환된 슈도모나스 에어루지노사를 제공한다.

아세틸-CoA 카복실라제 카복실트랜스퍼라제(acetyl-CoA carboxylase carboxytransferase)는 아세틸-CoA를 말로닐-CoA로 변환하는 과정에 관여하는 촉매이며, 두 개의 알파 서브유닛과 두 개의 베타 서브유닛으로 구성된 테트라머이다. 본 발명의 아세틸-CoA 카복실라제 카복실트랜스퍼라제 서브유닛 알파는 상기 서브유닛 중 하나이며, accA 유전자가 이를 코딩하는 유전자이다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 발현벡터에 포함되는 아세틸-CoA 카복실라제 카복실트랜스퍼라제 서브유닛 알파를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 슈도모나스 에어루지노사 PAO1의 아세틸-CoA 카복실라제 카복실트랜스퍼라제 서브유닛 알파를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 사용하며, 상기 슈도모나스 에어루지노사PAO1의 아세틸-CoA 카복실라제 카복실트랜스퍼라제 서브유닛 알파의 아미노산 서열은 서열목록 제1서열로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.

말로닐-CoA-[아실운반단백질]트랜스아실라제 (malonyl-CoA-[acyl-carrier-protein] transacylase)는 말로닐-CoA를 말로닐-ACP(acyl-carrier-protein)로 변환하는 과정에 관여하는 촉매이며, fabD 유전자가 이를 코딩하는 유전자이다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 발현벡터에 포함되는 말로닐-CoA-[아실운반단백질]트랜스아실라제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 슈도모나스 에어루지노사 PAO1의 말로닐-CoA-[아실운반단백질]트랜스아실라제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 사용하며, 상기 슈도모나스 에어루지노사PAO1의 말로닐-CoA-[아실운반단백질]트랜스아실라제의 아미노산 서열은 서열목록 제2서열로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.

상기 아세틸-CoA 카복실라제 카복실트랜스퍼라제 서브유닛 알파를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및/또는 말로닐-CoA-[아실운반단백질]트랜스아실라제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 발현 조절서열에 작동가능하게 연결되어 발현 벡터 내에 삽입될 수 있다. 상기에서 '작동 가능하게 연결된다(operably linked to)'는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 또한, '발현 조절 서열(expression control sequence)'이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 개시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

본 발명에 있어서, aceE 및 accA유전자를 암호화하는 핵산에 결합된 프로모터는 강력한 발현능력을 가지는 것을 사용하는 것이 바람직하다.

일 구현예에서, 본 발명의 발현 벡터는 프로모터서열, 상기 아세틸-CoA 카복실라제 카복실트랜스퍼라제 서브유닛 알파를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및/또는 말로닐-CoA-[아실운반단백질]트랜스아실라제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 터미네이터 서열을 포함하며, 상기 서열들이 5'-3' 순서대로 연결되는 것이 바람직하다. 이는 accA 및 fabD 유전자가 슈도모나스 에어루지노사의 염색체 내에서의 위치에 따른 발현 순서에 해당하는 것으로, 세포성장곡선에서 말로닐-CoA가 먼저 생산되어 소비되면서 말로닐-ACP가 생산되는 생합성 경로를 적용한 것이다.

다른 구현예에서, 상기 발현벡터는 lacI 유전자를 추가적으로 포함한다. lacI 유전자는 숙주 세포가 Lac 리프레서를 코딩하는 유전자를 포함하고 있는지 불문하고, 프로모터를 조절할 수 있도록 한다. 이 경우 상기 아세틸-CoA 카복실라제 카복실트랜스퍼라제 서브유닛 알파 및/또는 말로닐-CoA-[아실운반단백질]트랜스아실라제의 발현을 유도하기 위하여, IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 발현벡터는 accA 유전자 시퀀스 전체 및/또는 fabD 유전자 시퀀스 전체를 포함할 수도 있다. 그러나, 본 발명의 발현벡터에는 accA 및 fabD의 유전자가 효소의 과발현 기능을 포함하여 최소한의 길이를 가지도록 accA와 fabD RBS(ribosomal binding site) 및 효소발현에 꼭 필요한 부분을 포함하는 염기서열만을 서열로 정하여 삽입시키는 것이 숙주세포의 대사부담(metabolic burden)을 줄이는 측면에서 바람직하다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 fabD RBS를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 GGGA이며, 이는 accA 유전자와 fabD 유전자의 사이에 삽입되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 상기 accA 및 효소발현에 꼭 필요한 부분을 포함하는 염기서열은 서열목록 제3서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 다른 구현예에서, 상기 fabD 및 효소발현에 꼭 필요한 부분을 포함하는 염기서열은 서열목록 제4서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 또 다른 구현예에서, 상기 accA 와 fabD의 RBS(ribosomal binding site) 및 효소발현에 꼭 필요한 부분을 포함하는 염기서열은 서열목록 제3서열 및 제4서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 사용되는 발현벡터란 구조유전자를 암호화하는 핵산이 삽입될 수 있고, 숙주 세포 내에서 상기 핵산을 발현할 수 있는 당 분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 기타 매개체를 의미하며 바람직하게는 플라스미드 벡터일 수 있다.

상기 플라스미드로는 슈도모나스 에어루지노사에서 복제 및 발현이 가능한 운반체라면 당업계에 공지된 그 어떠한 것이라도 사용할 수 있으며, 바람직하게는 대장균-슈도모나스 셔틀벡터 pUCP19(ATCC 87110; Schweizer, 1991)를 사용할 수 있다. 대장균-슈도모나스 셔틀벡터 pUCP19는, pUC19 벡터로부터 유래된 것으로서 두가지 호스트-범위 플라스미드 벡터이며, 이에 대해서는 문헌(Schweizer H.P., Escherichia-Pseudomonas shuttle vectors derived from pUC18/19, Gene , 97(1):109-121(1991))에 자세히 기재되어 있다.

본 발명의 일 구현에에서, 상기 대장균-슈도모나스 셔틀벡터 pUCP19의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제5서열로 표시되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 발현벡터로 형질 전환되는 본 발명의 슈도모나스 에어루지노사 녹농균은 자연계에 적응력이 매우 강한 미생물이다. 이 균은 성장을 위한 영양요구가 매우 단순하다. 아주 다양한 80여 종의 유기화합물을 탄소원으로 또 암모니아를 질소원으로 이용할 수 있다. 따라서 아주 극소량의 유기물질이 있는 물속이나 습한 환경에서도 증식할 수 있다. 따라서 미생물 내에서 발효 가능한 탄소 공급원으로부터 탄화수소(C8~C16)를 생물학적으로 생산하는 지방산 생합성 경로의 과발현용 형질전환 박테리아를 제공하기 위한 본 발명에서 슈도모나스 에어루지노사를 이용한 것이다. 또한, 본 발명자들은 슈도모나스 에어루지노사는 내재적으로 지방산 생합성 경로를 가지고 있는 미생물로서 이를 지방산 생합성 경로의 과발현하도록 형질 전환 시키는 경우, 안정적이고 효과적으로 상기 경로가 과발현 됨을 확인하였다.

지방산 생합성 경로를 과발현하도록 형질전환시킬 숙주세포 슈도모나스 에어루지노사로는 산업 미생물로 적용가능하고 그 기능이 뛰어난 야생종을 선정한다. 박테리아 그람 음성인 슈도모나스 에어루지노사 속별 특징을 확인 및 비교하여 가장 그 기능이 뛰어난 야생종을 선정할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 슈도모나스 에어루지노사는 슈도모나스 에어루지노사 PA14인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 지방산 생합성 경로를 과발현을 위한 슈도모나스 에어루지노사 미생물은 내재적으로 지방산 생합성 경로를 가지고 있는 것이나, 지방산(fatty acid)를 생산하기 위한 효소를 코딩하는 뉴클레오타이드, 즉 아세틸-CoA 카복실라제 카복실트랜스퍼라제 서브유닛 알파를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및/또는 말로닐-CoA-[아실운반단백질]트랜스아실라제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 추가적으로 도입되고, 상기 지방산(fatty acid)를 생산하기 위한 효소를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 증폭, 즉 과발현되는 균주이다. 이와 관련하여, 용어 '증폭'은 예를 들어 강력한 프로모터를 사용하거나 활성이 높은 적절한 효소를 암호화하는 유전자를 사용하고 임의로 이들 수단을 함께 사용하여 유전자(들)의 카피수를 증가시킴으로써, 적합한 DNA에 의해 암호화되는 하나 이상의 효소의 세포 내 활성을 미생물 내에서 증가시키는 것을 기술한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 아세틸-CoA 카복실라제 카복실트랜스퍼라제 서브유닛 알파를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 말로닐-CoA-[아실운반단백질]트랜스아실라제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 발현벡터에 삽입시키는 단계; 및 (b) 상기 뉴클레오타이드 서열이 삽입된 발현벡터로 슈도모나스 에어루지노사를 형질전환시키는 단계를 포함하는 지방산 생합성 경로의 과발현용 형질전환 슈도모나스 에어루지노사의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 지방산 생합성 경로의 과발현용 형질전환 슈도모나스 에어루지노사의 제조방법은 상술한 형질전환 슈도모나스 에어루지노사를 생산하는 방법에 관한 것이므로 상술한 내용과 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 아세틸-CoA 카복실라제 카복실트랜스퍼라제 서브유닛 알파를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및/또는 말로닐-CoA-[아실운반단백질]트랜스아실라제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, CaCl₂ 완충액을 사용한 컴피턴트 세포를 만든 후 열충격(42℃) 방법에 의해 발현벡터를 숙주세포 내로 넣는 방법, 전기 충격에 의한 형질전환 방법, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기침공법(electroporation) 등에 의해 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 형질전환체의 안정적 제조와 효율을 높이기 위해서는 전기 충격에 의한 형질전환 방법을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상술한 본 발명의 형질전환 또는 공형질전환된 슈도모나스 에어루지노사를 배양하여 지방산을 생합성 하는 단계; 및 (b) 상기 생합성된 지방산을 수득하는 단계를 포함하는 지방산 생합성 방법을 제공한다.

아세틸-CoA 카복실라제 카복실트랜스퍼라제 서브유닛 알파를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및/또는 말로닐-CoA-[아실운반단백질]트랜스아실라제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 형질전환 또는 공형질전환된 형질전환 슈도모나스 에어루지노사의 배양은 당업계에 공지된 통상의 슈도모나스 에어루지노사 배양 방법에 의해 배양될 수 있다. 예를 들어, 공-형질전환된 슈도모나스 에어루지노사는 LB 배지에서 37℃에서 배양할 수 있다.

바람직하게는, 단계 (a)는 발현 유도제인 IPTG의 존재 하에서 실시된다.

상기 형질전환 또는 공형질전환된 슈도모나스 에어루지노사 내에서 생합성된 지방산을 분리하는 단계는 당업계에 공지된 통상의 분리 또는 정제 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: B. Aurousseau et al., Journal of the American Oil Chemists' Society, 57(3):1558-9331( 1980); Frank C. Magne et al., Journal of the American Oil Chemists' Society, 34(3):127-129(1957)).

상기 기술한 제조방법을 사용하여 제조한 공-형질전환된 슈도모나스 에어루지노사를 배양하는 경우 지방산 생합성 경로를 과발현하므로, 유익한 에너지 원으로 사용할 수 있는 지방산을 용이하게 얻을 수 있다.

따라서, 본 발명에서는 지방산 생합성 대사 경로(fatty acid biosynthesis pathway)의 상위단계의 물질들의 세포 내 생산 증대를 위해 특정 대사산물을 효율적으로 생산하는 균주를 개발하기 위해서 미생물의 게놈 정보와 대사 네트워크를 이해함과 동시에 야생형 슈도모나스 에어루지노사에 적용하여, 표적 유전자의 삽입을 통한 재조합 균주를 개발하여 본 발명이 완성되었다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 아세틸-CoA 카복실라제 카복실트랜스퍼라제 서브유닛 알파를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및/또는 말로닐-CoA-[아실운반단백질]트랜스아실라제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현벡터로 형질전환된 슈도모나스 에어루지노사 및 그 제조방법을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 지방산 생합성 경로의 과발현용 형질전환 슈도모나스 에어루지노사는 유전적 안정성이 높고 지방산 생합성 경로 과발현 효과가 매우 뛰어나다.

도 1은 슈도모나스 에어루지노사 생체 내에서 포도당에서부터 지방산까지의 지방산 생합성(FAS) 경로를 보여주는 도식이다.
도 2는 슈도모나스 에어루지노사 PAO1의 염색체를 주형으로 하여 accA 및 fabD 유전자를 PCR 수행 후 확인한 전기영동 사진이다.
레인 1: 사이즈 마커, 레인 2,3: accA, 레인 4,5: 공란, 레인 6,7: fabD
도 3는 슈도모나스 에어루지노사와 같은 박테리아용 발현벡터, 대장균-슈도모나스 셔틀벡터인 pUCP9에 accA 유전자가 삽입되어 있는 구조의 도식화이다.
도 4은 슈도모나스 에어루지노사와 같은 박테리아용 발현벡터, 대장균-슈도모나스 셔틀벡터인 pUCP9에 fabD 유전자가 삽입되어있는 구조의 도식화이다.
도 5는 슈도모나스 에어루지노사와 같은 박테리아용 발현벡터, 대장균-슈도모나스 셔틀벡터인 pUCP9에 accA와 fabD 유전자가 삽입되어있는 구조의 도식화이다.
도 6는 본 발명의 재조합 슈도모나스 에어루지노사의 생장곡선을 야생종(wild type) 슈도모나스 에어루지노사와 비교한 결과를 그린 그래프이다.
도 7은 본 발명의 재조합 슈도모나스 에어루지노사의 세포외에서 분석된 아세트산와 말론산의 양을 야생종(wild type) 슈도모나스 에어루지노사의 실험 결과와 비교한 결과이다.
도 8은 재조합 슈도모나스 에어루지노사의 세포내에서 분석된 지방산(fatty acid) 구성 차이를 야생종(wild type) 슈도모나스 에어루지노사의 실험 결과와 비교한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 이용한 accA 와 fabD 유전자를 발현하는 재조합 플라스미드의 제조

슈도모나스 에어루지노사 PAO1의 염색체(KTCT, 한국생물자원센터)를 주형으로 하여 말로닐-CoA와 말로닐-CoA:ACP의 생산을 효소를 암호화하는 accA와 fabD의 유전자서열(GenBank, NCBI)을 프라이머(primer)를 제작하여 중합효소연쇄반응(PCR, TaKaRa Korea) 방법을 통해 클로닝 하였다. 각각의 유전자가 코딩하는 효소의 종류는 하기 표 1에 정리하였고, 각각의 유전자를 증폭하기 위해 사용한 프라이머 및 증폭된 산물을 벡터에 도입하기 위해 사용한 제한효소는 하기 표 2에 정리하였다.

유전자	생산 효소
accA	acetyl-CoA carboxylase, carboxytransferase, alpha subunit
fabD	malonyl-CoA: ACP (acyl carrier protein) acyltransferase

유전자	프라이머 서열		제한 효소
accA	F	5‘-TCTAGACGACGGAAGCCTATGAACCCG-3'	XbaI
accA	R	5‘-GGATCCTTACGGCGCGCCGTAGCTCAT-3'	BamHI
fabD	F	5‘-GGTACCCAAGGGACCTATTCAATGTCTGC-3'	KpnI
fabD	R	5‘-GAGCTCTTCTCTCCTTTCTCTCTCTCA GG-3'	SacI

표 1의 유전자들은 타겟 유전자들만 특이적으로 증폭하도록 제작된 표 2에 기재한 프라이머를 사용하여 증폭하였다. accA 및 fabD 유전자는 도면 2에서 볼 수 있는 바와 같이 RBS(ribosome binding site)를 포함하여 각각 963 bp, 972 bp에서 증폭되었다.

각각의 중합효소연쇄반응은 통상적인 반응조건(10 mM Tris-HCl(pH9.0), 50 mM KCI, 0.1% Triton X-100, 2 mM MgSO₄, Taq DNA 중합효소(TaKaRa))에서 95℃/5분(denaturation), 60℃/1분(annealing), 72℃/1분(extension)로 1회 수행한 후, 95℃/1분(denaturation), 60℃/30초(annealing), 72℃/1분(extension)로 30회 반복 수행하였다. 마지막 단계로 안정적인 extension을 위해 95℃/1분(denaturation), 60℃/1분(annealing), 72℃/5분(extension) 반응시켰다. 중합효소연쇄반응 후 증폭된 DNA는 0.8% 아가로즈 젤 상에서 확인 후 정제하여 T-벡터 클로닝에 이용하였다. pGEM-T easy 벡터(TaKaRa)에 라이게이션을 수행하여 재조합 플라스미드인 pGEM::accA와 pGEM::fabD를 제작하였다. 상기 재조합 플라스미드들은 대장균(E. coli AG1 competent cell, Stratagene)에서 형질전환하여 균주를 제조하였다.

실시예 2: 재조합 플라스미드 pJS01 , pJS02 , 및 pJS03 의 제조

상기 실시예 1의 재조합 플라스미드(pGEM::accA 및 pGEM::fabD)와 대장균-슈도모나스 셔틀벡터를 표 2에 열거된 제한효소(XbaI, BamHI, KpnI 및 SacI)로 37℃ 항온수조에서 약 2시간 처리하였다. 각각의 DNA 절편들을 절단한 뒤 대장균-슈도모나스 셔틀벡터인 pUCP19 벡터(ATCC 87110; Schweizer, 1991)의 다중삽입부위(multicloning site)에 도 3,4 및 5에 개시된 것과 같이 라이게이션을 하여 재조합 플라스미드를 완성하였다. 각 단계마다 삽입된 유전자의 삽입여부를 확인하기 위해 대장균(E. coli AG1 competentcell, stratagene)에 형질 전환 시킨 후 플라스미드를 추출하여 이를 다시 원래 삽입부위의 제한효소로 처리하여 잘린 DNA 조작의 크기를 0.8% 아가로즈 젤 상에서 전기영동하여 비교하는 방법을 사용하였다.

증폭된 산물을 표 2에 열거된 제한효소(XbaI, BamHI, KpnI 및 SacI)를 이용하여 pUCP19 벡터에 도입하여 pJS01, pJS02 및 pJS03를 제조하였다. 상기 pJS01(accA 유전자 포함), pJS02(fabD 유전자 포함) 및 pJS103(accA 및 fabD 유전자 포함) 벡터의 지도를 각각 도 3,4 및 5에 나타내었다.

실시예 3: 슈도모나스 에어루지노사 형질전환체 SGJS01 , SGJS02 및 SGJS03 의 제조

본 발명에서는 형질전환체의 안정적 제조와 효율을 높이기 위해 전기충격에 의한 형질전환방법을 사용하였다. 상기 전기충격에 의한 형질전환방법을 위해 16시간동안 배양된 30 ㎕(0.1%)의 야생종 슈도모나스 에어루지노사 PA14(ATCC, GenBank NC_008463, Julia M. Plotnikova, et al., Plant Physiol, December 2000, Vol. 124, pp. 1766-1774; Nicole T. Liberati et al., PNAS 103(8):2833-2838(2006))의 배양액을 시험관에 들어있는 3 ㎖의 LB(10 g/L tripton, 10 g/L NaCl, 5 g/L yeast extract)배지에 접종하여 배양액의 흡광도(absorbance)가 600nm 파장에서 0.6에 이르렀을 때, 배양액 전체에 해당하는 3 ㎖의 배양액은 원심 분리(12000 rpm, 1분)하여 상등액과 세포를 분리하였다. 모아진 세포는 10% 글리세롤 1 ㎖로 1회 세척해준 후, 다시 원심분리(12000 rpm, 1분)하여 상등액과 세포로 나누어 주었다. 세포는 10% 글리세롤 80 ㎕로 현탁하였다. 현탁된 세포에 1 ㎕의 재조합 플라스미드(pJS01, pJS02 및 pJS03)를 넣어주었다.

상기의 플라스미드가 들어있는 분주된 80 ㎕의 액체는 전기천공법 큐벳에 담아 전기 충격(2500 v, 25 μF, 200 Ω)을 가하였다. 미리 준비해둔 1 ㎖ LB(10 g/L tripton, 10 g/L NaCl, 5 g/L yeast extract)를 첨가한 뒤 1시간동안 200 rpm, 37℃에서 진탕 배양하였다. 배양된 형질전환체는 슈도모나스 선택배지, 카베니실린(200 ㎍/㎖)이 첨가된 세트리미드 아가 베이스(Difco)에서 단일균체가 생성될 때까지 배양하였다. 이를 통해 재조합 플라스미드인 pJS01, pJS02 및 pJS03를 슈도모나스 에어루지노사 PA14 균주에 형질 전환한 재조합 균주, SGJS01, SGJS02 및 SGJS03를 제조하고 이를 하기 표 3에 정리하였다.

개발균주
SGJS01	Pseudomonas aeruginosa PA14::pUCP19::accA
SGJS02	Pseudomonas aeruginosa PA14::pUCP19::fabD
SGJS03	Pseudomonas aeruginosa PA14::pUCP19::accA::fabD

실시예 4: 슈도모나스 에어루지노사의 배양 및 재조합 균주로부터 단백질의 생산

슈도모나스 에어루지노사 PA14 균주(GenBank NC_008463)에 형질 전환한 재조합 균주들을 LB(카베니실린 200 ㎍/㎖ 포함) 배지에 16시간정도 배양시키고 그 배양액을 다시 LB(카베니실린 200 ㎍/㎖ 포함) 배지에 접종하여 흡광도가 600 nm에서 0.6-1.0 되었을 때 글리세롤 농도가 25%가 되게 보관용 균액으로 만든 다음 -80℃에서 배양실험 시까지 저장하였다.

상기에서 개발된 재조합 균주의 배양은 보관용 균액 30 ㎕을 10 ㎖ 버텀 튜브에 들어있는 카베니실린(200 ㎍/㎖)이 첨가된 3 ml의 LB에 16시간동안 배양한 후, 이를 다시 500 ml 플라스크에 들어있는 카베니실린(200 ㎍/㎖)이 첨가된 200 ㎖의 LB(10 g/L tripton, 10 g/L NaCl, 5 g/L yeast extract) 배지에 0.5%의 전기 배양액을 접종하여 37℃, 170 rpm상태에서 24시간동안 배양하였다. 재조합 균주와 비교하기 위한 야생종 슈도모나스 에어루지노사 PA14는 카베니실린이 들어있지 않은 LB에서 재조합 균주와 동일한 조건으로 실험을 실시하였다. 단백질 발현을 위해 배양액의 흡광도(absorbance)가 600nm파장에서 0.6에 이르렀을 때 유도물질인 IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside, sigma, USA)를 첨가(1 mM/㎖)하여 재조합 단백질의 발현을 유도하였다. 상기 예를 따라 배양된 재조합 슈도모나스 에어루지노사 3종과 야생종의 생장곡선은 도 6에 나타내었다.

본 발명에서 재조합 균주, SGJS01, SGJS02 및 SGJS03은 생장에서 야생종과 비교하여 큰 차이가 없었다. 유전자의 삽입이나 과발현에 의한 독성이나 저해는 없었던 것으로 사료된다. 이는 유전자의 암호화부분은 효소의 과발현 기능을 포함하여 최소한의 길이를 가지도록 RBS(ribosomal binding site) 및 효소발현에 꼭 필요한 부분을 포함하는 염기서열만을 서열로 정하여 유전자의 발현에 의한 숙주세포의 대사부담(metabolic burden)을 줄이고자 하였고 생산 경로에 맞춰 두 유전자의 순서가 순서대로 연결된 되게 개발하였기 때문이라고 예상된다.

실시예 5: 재조합 슈도모나스 에어루지노사 세포외로부터의 아세트산( acetic acid ) 및 말론산( malonic acid)의 측정

재조합 균주의 배양액 내의 아세트산과 말론산의 농도를 측정하기 위해 배양 중 일정시간마다 채취한 시료를 원심분리(12000 rpm, 10분) 후 상등액과 세포를 분리하여 -40℃에서 보관하였다. 상기 배양액로부터 분리된 상등액은 각각 1 ㎖씩 0.2 ㎛ 필터를 이용하여 정제한 후, 하기 표 4의 조건 하에서 고속액체크로마토그래피(HPLC) 정량 분석을 실시하였다.

품 목	조 건
HPLC 모델	(영린기기, Korea), UV730D (영린기기, Korea)
컬럼	Aminex HPX-87H(Biorad, USA)
유속	0.6 mi/min
주입부피	30ul
이동상	0.005N 황산
오븐 온도	50℃
작동 시간	30분
UV 검출파장	210nm

도 7에서 보여주듯이, 본 발명의 SGJS01, SGJS02 및 SGJS03은 야생종 슈도모나스 에어루지노사 PA14와 엑스트라셀룰라(extracellular)에서 분석되어지는 아세트산과 말론산의 생산량 경향에 차이를 보였다. 배양이 시작된 후 SGJS01은 accA 유전자에 의해 야생종과 비교하여 아세트산을 적게 생산하는 것으로 관찰되었으며,말론산은 관찰 시간 동안 많이 생산되는 것을 확인 할 수 있었다. 이를 통해 과발현으로 인해 더 많은 말론산을 생산할 수 있음을 알 수 있으며, 배양 4시간째에 0.6의 OD를 보여 IPTG(Biosesang)를 넣어주어 발현을 유도하였고 그로 인해 배양 9시간에 생산양이 상승한 것을 확인 할 수 있었다.

fabD 유전자가 포함되어 있는 SGJS02와 SGJS03는 시간 흐름에 따라 경향성이 두드러지지 않았다. 그러나 18시간 배양 이후 증가 경향을 보여 장시간 배양을 한다면 더 많이 생산되어 질 수 있음을 예상할 수 있었다.

실시예 6: 재조합 슈도모나스 에어루지노사 세포내로부터의 지방산( fatty acid ) 측정

실시예 5의 조건으로 배양한 배양액 중 IPTG를 첨가한 후 4시간 후와 24시간 동안 세포양이 충분해 졌을 때 세포 내에 있는 지방산(fatty acid)를 측정하기 위해서 지방산 추출을 다음과 같은 방법으로 진행하였다. 추출과정은 5 단계로 나누어지며 첫 번째 과정 배양단계로 배양액 5 ㎖를 원심분리(4500 rpm, 10분) 후 세포는 -80로 저장하였다. 두 번째 과정은 비누화(saponification)단계로 저장된 재조합 세포에 용액(NaOH 45g, MeOH 150 ㎖, deionized distilled water 150 ㎖) 1 ㎖을 넣고 5-10초 볼텍스 해주었다. 100℃에서 5분 동안 반응해준 뒤 다시 5-10초 동안 볼텍스 해주고 100℃, 25분 반응시켜 준 뒤 열을 식혀주었다. 세 번째 과정은 메틸화(methylation)단계로, 용액(6N HCl 325 ㎖, MeOH 275 ㎖) 2 ㎖을 넣고 5-10초 동안 볼텍스 해준 뒤 80℃에서 10분 동안 반응시켜주었다. 반응이 끝난 후에는 빨리 열을 식혀주도록 한다. 네 번째 단계는 추출(extration)단계로, 용액(Haxane/Methyl tert-Butyl Ester=1/1) 1.25 ㎖을 첨가하고 10분간 위아래로 흔들어 준 뒤 층이 분리 되면 아래층은 추출해서 버린다. 다섯 번째 단계는 GC로 분석을 용이하게 하기위해 세척단계로 앞 단계의 남은 상층액에 용액(NaOH 10.8 g, ddW 900 ㎖) 3 ㎖을 첨가해서 5분 동안 위아래로 흔들어 준 뒤 상층액을 추출하여 GC로 분석하였다.

본 발명에서 사용한 GC/MS는 5975 시리즈 MSD 및 Agilent 7890A이며 HP-5 컬럼(30m X 0.32 mm, film thickness 0.25 )을 사용하였다. 분석하기 위한 GC 온도프로그램 조건은 다음과 같았다: 40℃에서 5분간, 220℃까지 분당 3℃, 250℃까지 분당 3℃, 그리고 250℃에서 5분간. MS 내부 온도는 160℃이었다.

상기예를 따라 재조합 3종과 야생종의 지방산 추출결과 지방산 분포를 도 8에 나타내었다. 이 추출 방법으로 헥사데카노산(C16)과 옥타데카노산(C18)이 추출되고 분석됨을 알 수 있었다(도 8(a) 및 (b)). 도 8(c)는 IPTG 반응 후 4시간 경과시 지방산 추출 결과 재조합 균주들은 야생종보다 지방산, 헥사데카노산(C16) 및 옥타데카노산(C18)이 덜 생산 되는 것을 보여주고 있다. 그러나 도 8(d)의 24시간 배양에서는 야생종 보다 재조합 균주들의 생산량이 더 많음을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Industry-University Cooperation Foundation Sogang University <120> Transformed Pseudomonas Aeruginosa for Over-expression of Fatty Acid Biosynthesis Pathway and Method of Preparing the Same <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 316 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa PAO1 <400> 1 Met Asn Pro Asn Phe Leu Asp Phe Glu Gln Pro Ile Ala Asp Leu Gln 1 5 10 15 Ala Lys Ile Glu Glu Leu Arg Leu Val Gly Asn Asp Asn Ala Leu Asn 20 25 30 Ile Ser Asp Glu Ile Ser Arg Leu Gln Asp Lys Ser Lys Ala Leu Thr 35 40 45 Glu Asn Ile Phe Gly Asn Leu Ser Ser Trp Gln Ile Ala Gln Leu Ala 50 55 60 Arg His Pro Lys Arg Pro Tyr Thr Leu Asp Tyr Ile Gly Tyr Leu Phe 65 70 75 80 Ser Asp Phe Glu Glu Leu His Gly Asp Arg His Phe Ala Asp Asp Pro 85 90 95 Ala Ile Val Gly Gly Val Ala Arg Leu Asp Gly Ser Pro Val Met Val 100 105 110 Ile Gly His Gln Lys Gly Arg Glu Val Arg Glu Lys Val Arg Arg Asn 115 120 125 Phe Gly Met Pro Arg Pro Glu Gly Tyr Arg Lys Ala Cys Arg Leu Met 130 135 140 Glu Met Ala Glu Arg Phe Lys Met Pro Ile Leu Thr Phe Ile Asp Thr 145 150 155 160 Pro Gly Ala Tyr Pro Gly Ile Asp Ala Glu Glu Arg Gly Gln Ser Glu 165 170 175 Ala Ile Ala Trp Asn Leu Arg Val Met Ala Arg Leu Lys Thr Pro Ile 180 185 190 Ile Ala Thr Val Ile Gly Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ala Leu Ala Ile 195 200 205 Gly Val Cys Asp Gln Leu Asn Met Leu Gln Tyr Ser Thr Tyr Ser Val 210 215 220 Ile Ser Pro Glu Gly Cys Ala Ser Ile Leu Trp Lys Thr Ala Glu Lys 225 230 235 240 Ala Pro Glu Ala Ala Glu Ala Met Gly Ile Thr Ala Glu Arg Leu Lys 245 250 255 Gly Leu Gly Ile Val Asp Lys Val Ile Asp Glu Pro Leu Gly Gly Ala 260 265 270 His Arg Asp Pro Ala Ser Met Ala Glu Ser Ile Arg Gly Glu Leu Leu 275 280 285 Ala Gln Leu Lys Met Leu Gln Gly Leu Glu Met Gly Glu Leu Leu Glu 290 295 300 Arg Arg Tyr Asp Arg Leu Met Ser Tyr Gly Ala Pro 305 310 315 <210> 2 <211> 312 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa PAO1 <400> 2 Met Ser Ala Ser Leu Ala Phe Val Phe Pro Gly Gln Gly Ser Gln Ser 1 5 10 15 Leu Gly Met Leu Ala Glu Leu Gly Ala Gln Gln Ala Leu Val Arg Asp 20 25 30 Thr Phe Ala Glu Ala Ser Glu Ala Leu Gly Tyr Asp Leu Trp Ala Leu 35 40 45 Val Gln Asn Gly Pro Glu Glu Arg Leu Asn Gln Thr Asp Lys Thr Gln 50 55 60 Pro Ala Ile Leu Thr Val Ser Ile Ala Leu Trp Arg Leu Trp Leu Ala 65 70 75 80 Glu Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe Val Ala Gly His Ser Leu Gly Glu 85 90 95 Tyr Ser Ala Leu Val Ala Ala Glu Ser Leu Ala Phe Ala Asp Ala Val 100 105 110 Lys Leu Val Glu Arg Arg Gly Gln Leu Met Gln Gln Ala Val Pro Ala 115 120 125 Gly Gln Gly Gly Met Ala Ala Ile Leu Gly Leu Glu Asp Ala Asp Val 130 135 140 Leu Ala Ala Cys Ala Glu Ala Ala Gln Gly Glu Val Val Ser Ala Val 145 150 155 160 Asn Phe Asn Ala Pro Gly Gln Val Val Ile Ala Gly Ala Ala Ala Ala 165 170 175 Val Glu Arg Ala Ile Glu Ala Cys Lys Ala Arg Gly Ala Lys Arg Ala 180 185 190 Val Ala Leu Pro Val Ser Val Pro Ser His Cys Glu Leu Met Arg Pro 195 200 205 Ala Ala Glu Gln Phe Ala Ala Ser Val Glu Ser Leu Gln Trp Gln Ala 210 215 220 Pro Lys Ile Ser Leu Val Gln Asn Val Ser Ala Ala Val Pro Ala Asp 225 230 235 240 Leu Asp Thr Leu Arg Arg Asp Leu Leu Ala Gln Leu Tyr Ser Pro Val 245 250 255 Arg Trp Val Glu Ser Ile Gln Leu Leu Ala Glu Lys Gly Val Thr Glu 260 265 270 Leu Val Glu Cys Gly Pro Gly Lys Val Leu Ala Gly Leu Asn Arg Arg 275 280 285 Cys Ala Lys Gly Ile Asn Thr His Gly Leu Asp Gly Val Glu Ala Phe 290 295 300 Ala Ala Thr Arg Ala Ala Leu Ala 305 310 <210> 3 <211> 951 <212> DNA <213> Pseudomonas aeruginosa PAO1 <400> 3 atgaacccga actttcttga tttcgaacag ccgatcgccg acctgcaagc caagatcgaa 60 gagctgcgcc tggtgggcaa cgacaatgcg ctgaacatca gcgacgaaat ctcgcgtctg 120 caggacaaga gcaaggcgct caccgaaaac atcttcggca atctgtccag ttggcagatc 180 gcccagctcg cgcgccatcc caagcgtccc tataccctcg actacatcgg ctacctgttc 240 agcgatttcg aggaactgca cggcgaccgg catttcgccg acgacccggc gatcgtcggc 300 ggcgttgccc gcctcgacgg ttccccggtg atggtcatcg gccaccagaa gggccgcgaa 360 gtccgtgaga aggtccggcg caacttcggc atgccgcgtc cggaaggcta tcgcaaggcc 420 tgccgcctga tggaaatggc cgaacgcttc aagatgccga tcctcacctt catcgacacg 480 cccggcgcct acccggggat cgatgccgag gaacgcggcc agagcgaggc gatcgcctgg 540 aacctgcggg tgatggcgcg actgaagacg ccgatcatcg ccaccgtgat cggcgagggc 600 ggttccggcg gcgcgctggc catcggtgtc tgcgaccagt tgaacatgct gcaatactcc 660 acctattcgg tgatctcgcc ggaaggctgc gcctccatcc tctggaagac cgccgagaag 720 gcgccggaag ccgccgaggc catgggcatc accgccgagc gcctgaaagg cctgggcatc 780 gtcgacaagg tcatcgacga accgctgggc ggcgcccatc gcgatccggc gagcatggcc 840 gaatcgatcc gtggcgaact gctggcgcaa ctgaagatgc tccagggcct ggaaatgggt 900 gagttgctgg agcgtcgtta cgaccgcctg atgagctacg gcgcgccgta a 951 <210> 4 <211> 939 <212> DNA <213> Pseudomonas aeruginosa PAO1 <400> 4 atgtctgcat ccctcgcatt cgtcttccct ggccagggtt cgcaatccct cggcatgctg 60 gccgagctgg gcgcccagca ggcgctggtg cgcgatacct tcgccgaggc ctccgaggcg 120 ctcggttacg acctttgggc gctggtccag aatggtcctg aagagcgcct gaaccagacc 180 gacaagaccc agccggccat ccttacggtt tcgatcgcgc tctggcgcct ctggctggcc 240 gagggcggtg cgcgcccggc gttcgtcgcc gggcacagcc tgggcgaata ttccgcgctg 300 gtcgcggccg aaagcctggc gttcgccgat gcggtcaagc 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ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc 1920 tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat 1980 gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt 2040 ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg 2100 aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc 2160 tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt 2220 ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa 2280 gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta 2340 tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 2400 caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa 2460 ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt 2520 cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt 2580 ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat 2640 cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat 2700 gagattatca 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cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt 4440 tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat 4500 aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agacccc 4557

Claims

서열목록 제1서열로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 아세틸-CoA 카복실라제 카복실트랜스퍼라제 서브유닛 알파(acetyl-CoA carboxylase carboxytransferase subunit alpha)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현벡터로 형질전환된 지방산 과발현용 슈도모나스 에어루지노사 (Pseudomonas aeruginosa).
서열목록 제2서열로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 말로닐-CoA-[아실운반단백질]트랜스아실라제 (malonyl-CoA-[acyl-carrier-protein] transacylase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현벡터로 형질전환된 지방산 과발현용 슈도모나스 에어루지노사.
서열목록 제1서열로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 아세틸-CoA 카복실라제 카복실트랜스퍼라제 서브유닛 알파를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 서열목록 제2서열로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 말로닐-CoA-[아실운반단백질]트랜스아실라제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현벡터로 공동형질전환된(cotransformed) 지방산 과발현용 슈도모나스 에어루지노사.
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제 1 항에 있어서, 상기 발현벡터는 서열목록 제3서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 지방산 과발현용 슈도모나스 에어루지노사.
제 2 항에 있어서, 상기 발현벡터는 서열목록 제4서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 지방산 과발현용 슈도모나스 에어루지노사.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현벡터는 대장균-슈도모나스 셔틀벡터 pUCP19인 것을 특징으로 하는 지방산 과발현용 슈도모나스 에어루지노사.
제 8 항에 있어서, 상기 대장균-슈도모나스 셔틀벡터 pUCP19의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제 5 서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열인 것을 특징으로 하는 지방산 과발현용 슈도모나스 에어루지노사.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 슈도모나스 에어루지노사는 슈도모나스 에어루지노사 PA14인 것을 특징으로 하는 지방산 과발현용 슈도모나스 에어루지노사.
다음 단계를 포함하는 지방산 과발현용 형질전환 슈도모나스 에어루지노사의 제조방법:
(a) 서열목록 제1서열로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 아세틸-CoA 카복실라제 카복실트랜스퍼라제 서브유닛 알파를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 서열목록 제2서열로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 말로닐-CoA-[아실운반단백질]트랜스아실라제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 발현벡터에 삽입시키는 단계; 및
(b) 상기 뉴클레오타이드 서열이 삽입된 발현벡터로 슈도모나스 에어루지노사를 형질전환시키는 단계.
제 11 항에 있어서, 상기 슈도모나스 에어루지노사를 형질전환시키는 단계(b)는 전기충격 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 지방산 과발현용 형질전환 슈도모나스 에어루지노사의 제조방법.
(a) 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 슈도모나스 에어루지노사를 배양하여 지방산을 생합성 하는 단계; 및 (b) 상기 생합성된 지방산을 수득하는 단계를 포함하는 지방산 생합성 방법.