CN101223271B

CN101223271B - 具有失活的乳酸脱氢酶基因的修饰微生物

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Publication number: CN101223271B
Application number: CN2006800203480A
Authority: CN
Inventors: A·阿特金森; R·克里普斯; A·汤普森; K·埃利; M·泰勒; D·利克; B·拉德; S·贝克
Original assignee: TMO BIOTEC Ltd
Current assignee: TMO BIOTEC Ltd
Priority date: 2005-06-07
Filing date: 2006-06-07
Publication date: 2012-11-14
Anticipated expiration: 2026-06-07
Also published as: KR20080023699A; ZA200710499B; EA014228B1; EA200702430A1; AU2006256606A1; NZ563878A; WO2006131734A1; AU2006256606B2; CA2610201A1; EP1891211B1; EP1891211A1; JP4801151B2; US20090197314A1; MX2007015618A; JP2008541775A; CN101223271A; US8541222B2; GB0511602D0; NO20080074L; BRPI0611182A2

Abstract

修饰微生物是通过失活内源乳酸脱氢酶基因来制备的。所述微生物保藏于NCIMB，保藏号为41277、41278、41279、41280和41281。

Description

具有失活的乳酸脱氢酶基因的修饰微生物

技术领域

本发明涉及鉴定适用于以细菌发酵产物的形式来生产乙醇的微生物。特别是，本发明涉及利用嗜热细菌的乙醇生产。

背景技术

根据细菌种类和环境条件，细菌代谢可通过各种不同的机制进行。异养菌，包括所有的病原体，通过氧化有机化合物获得能量，碳水化合物(特别是葡萄糖)、脂质和蛋白质是最常被氧化的化合物。细菌对这些有机化合物的生物氧化会导致合成ATP作为化学能量来源。该过程也会生成更简单的有机化合物(前体分子)，这些化合物是细菌细胞进行生物合成反应所需的。细菌代谢适合底物的一般过程是糖酵解，糖酵解是一系列将葡萄糖转化为丙酮酸并生成ATP的反应。代谢能生成过程中丙酮酸的命运会根据微生物和环境条件而变化。有三种主要的丙酮酸反应。

其一，在有氧条件下，许多微生物将利用柠檬酸循环和将丙酮酸转化为乙酰辅酶A来产生能量，由丙酮酸脱氢酶(PDH)催化。

其二，在无氧条件下，某些产乙醇生物能够通过如下过程进行乙醇发酵：将丙酮酸脱羧为乙醛，由丙酮酸脱羧酶(PDC)催化；随后用NADH将乙醛还原为乙醇，由乙醇脱氢酶(ADH)催化。

第三种反应是将丙酮酸转化为乳酸，所述反应由乳酸脱氢酶(LDH)催化。

人们对使用微生物进行乙醇生产非常感兴趣，使用天然地进行厌氧发酵的微生物或者使用整合了丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶基因的重组微生物。尽管在使用这些微生物生产乙醇方面获得了某些成功，但是发酵通常由于乙醇浓度的增加而受到损害，特别是当所述微生物具有低水平的乙醇耐受性时。

已经提出将嗜热细菌用于乙醇生产，使用嗜热细菌的好处在于可以在高温下进行发酵，所述高温可以使得所生产的乙醇在高于50℃的温度下以蒸汽形式被移出；这也使得可以使用高糖浓度来进行发酵。然而，找到能有效地生产乙醇的适合的嗜热细菌尚成问题。

WO01/49865公开了一种被转化了编码丙酮酸脱羧酶的异源基因并且具有天然的乙醇脱氢酶功能的革兰氏阳性细菌，用于乙醇生产。所述细菌为嗜热的杆菌属(Bacillus)且该细菌可通过利用转座子插入的乳酸脱氢酶基因失活来被修饰。WO01/49865中公开的细菌全部来源于杆菌属菌株LLD-R，一种自发地从培养物中长出的孢子形成缺陷菌株，且在该菌株中ldh基因已经被自发突变或化学诱变所失活。所公开的菌株LN和TN是LLD-R菌株的改良过的衍生菌株。然而，全部的菌株都含有Hae III型限制性系统，所述限制性系统妨碍质粒转化并因此阻止非甲基化DNA中的转化。

WO01/85966公开了通过体内甲基化克服限制性问题而制备的微生物。这要求将HaeIII甲基转移酶从埃及嗜血杆菌(Haemophilusaegyptius)转化到LLD-R、LN和TN菌株中。然而，LLD-R、LN和TN菌株是不稳定的突变体并且会自发地回复为产乳酸的野生型菌株，特别是在低pH和高糖浓度的环境中。这会导致发酵产物从乙醇变为乳酸，使得所述菌株不适合用于乙醇生产。

WO02/29030公开了LLD-R菌株及其衍生菌株在ldh基因编码区包括一个天然存在的插入元件(IE)。将该插入元件转入(转出)ldh基因的转座以及随后的基因失活都是不稳定的，导致回复。对此给出的解决方案是将质粒DNA整合到所述IE序列中。

因此，在本领域中，用于乙醇生产的微生物的产生依赖于修饰实验室产生的化学诱变过的杆菌属微生物、用体内甲基化方法处理这些微生物和进一步修饰所述微生物以便将质粒DNA整合到所述IE序列中。所述方法是复杂和不确定的，且也存在如何使用所述菌株的管理问题。

因此需要改良过的用于乙醇生产的微生物。

发明内容

根据本发明的第一方面，对本文标明为NCIMB编号41277、41278、41279、41280和41281的任一种嗜热微生物进行修饰以使得乙醇产量增加，所述修饰为失活野生型嗜热微生物的乳酸脱氢酶基因。

根据本发明的第二方面，一种用于乙醇生产的方法，包括在存在C5或C6糖的适合的条件下，培养根据上述提供的定义的微生物。

根据本发明的第三方面，一种用于修饰微生物以增加乙醇产量的方法，包括获得NCIMB编号41277、41278、41279、41280和41281的任一个所限定的嗜热微生物，并且从微生物中缺失乳酸脱氢酶基因。

附图说明

参照附图描述本发明，其中：

图1为puB190和puB190-ldh的质粒图谱的示意图。

具体实施方式

本发明是基于鉴定具有所需产乙醇性质的野生型微生物和修饰所述野生型嗜热微生物以阻止乳酸脱氢酶基因的表达。

失活乳酸脱氢酶基因有助于防止丙酮酸降解为乳酸，并因此利用丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶或相当的酶促路径来促进(在适当的条件下)丙酮酸降解为乙醇。

本发明的野生型微生物可以是保藏于NCIMB保藏号为41277、41278、41279、41280和41281的嗜热微生物的任一种。

选定用于修饰的微生物被称为“野生型”，即它不是实验室产生的突变体。所述微生物分离自包含嗜热生物的环境样品。选择所分离的野生型微生物是由于它有惊人的产乙醇能力。然而，对于未修饰的微生物，乳酸可能是主要的发酵产物。还根据在高温下能依靠己糖和/或戊糖生长的能力来选择分离株。

本发明的微生物具有某些能使得所述微生物被用于发酵过程的所需特征。所述微生物不具有限制性系统，因此避免了体内甲基化的需要。此外，所述微生物在至少3％的乙醇中是稳定的且具有利用C5和C6糖作为底物的能力，包括纤维二糖和淀粉。所述微生物也可以高频率转化。此外，所述微生物在连续培养中生长率高于0.3小时^-1。

所述微生物为嗜热生物并且在40℃-85℃的温度范围内生长。优选地，所述微生物在50℃-70℃的温度范围内生长。此外，所述微生物在pH 6.5或更低的条件下生长，特别是pH 6.5-pH 4.5。

乳酸脱氢酶的核酸序列现在是已知的。使用这一序列，技术人员能靶向乳酸脱氢酶基因以通过不同机制来实现对该基因的失活。优选地，乳酸脱氢酶基因是通过插入转座子来失活的或者是通过缺失该基因序列或基因序列的一部分来失活的。优选缺失，因为缺失避免了基因序列再活化的难题，所述基因序列再活化在使用转座子失活时会经常遇到。在一个优选的实施方案中，通过整合一个温敏质粒(质粒pUB190-ldh；保藏号为NCIMB 41276)来失活乳酸脱氢酶基因，这实现了质粒与微生物染色体之间的天然同源重组或整合。根据染色体的整合体对抗菌剂(卡那霉素)的抗性来对其进行选择。乳酸脱氢酶基因的整合可通过单次交换重组事件或通过两次(或多次)交换重组事件来实现。优选两次交换事件。所得的突变体是稳定的且没有抗生素选择性。

本发明所用的微生物已经保藏为NCIMB 41277、41278、41279、41280和41281(NCIMB Ltd，Ferguson Building，Craibstone Estate，Bucksburn，Aberdeen，AB21 9YA，苏格兰)。

根据所选择的嗜热微生物，可在常规的培养条件下培养本发明的微生物。根据已知的培养要求来选择底物、温度、pH和其它生长条件，如参见WO01/49865和WO01/85966。

本发明将在下述实施例中以实例方式并参照附图来加以描述。用于说明ldh基因修饰的微生物为土芽孢杆菌(Geobacillus)11955，但是本文所公开的方法适用于本文所限定的任何微生物，如实施例5所示。

LDH基因的失活

实施例1-单次交换突变

LDH敲除载体的开发

将大约800bp的部分ldh基因片段用HindIII和XbaI亚克隆到温敏运载体pUB190中，获得一个7.7kb的质粒pUB190-ldh(图1和SEQID NO.1)。用限制性分析和2种用来生产用于转化目的质粒DNA的培养物来对10个假定的E.coli JM109(pUB190-ldh)转化体进行验证。用HindIII和XbaI消化pUB190-ldh释放出了预期的ldh片段。

使用pUB190-ldh转化热葡糖苷酶土芽孢杆菌(Geobacillusthermoglucosidasius)11955

在54℃下用卡那霉素选择对全部三种质粒测试24-48小时后，获得了转化体。利用热葡糖苷酶土芽孢杆菌(Gt)11955纯化ldh转化体，并且通过利用HindIII和XbaI的限制性分析对其进行验证。

LDH基因敲除

通过将热敏质粒整合到染色体上的ldh基因中来进行基因敲除。

在Gt11955中，质粒pUB190-ldh在54℃复制而在65℃下不能复制。用卡那霉素(kan)(12μg/ml)维持选择。然后将生长温度提高到65℃(此时质粒不再复制)。在质粒和染色体之间发生天然重组或整合。根据染色体的整合体对卡那霉素的抗性来对其进行选择。由于同源序列位于质粒上，所以整合定位到ldh基因。靶向ldh基因的整合是通过已知为单次交换重组的方法进行的。质粒掺入到ldh基因，得到了失活的ldh基因。如果整合了几个拷贝的质粒就可能发生串联重复。

方法和结果

尝试了两种不同的方法来进行整合：

方法1：4×50ml TGP(kan)培养物在54℃下生长12-18小时。细胞通过离心沉淀并重悬于1ml TGP中。将悬浮液(5x200ml)涂布于TGP(kan)板上并在68℃下培养过夜。挑取整合体并涂布于新鲜的TGP(kan)板上的50-方格网中并在68℃下培养过夜。

方法2：1×50ml TGP(km)培养物在54℃下生长12-18小时。用1ml所述培养物来接种在68℃下生长了12-18小时的50ml新鲜TGP(kan)培养物中。在第二天将其传代培养到50ml新鲜TGP(kan)培养物中并在68℃下再生长12-18小时。将所述培养物平铺到TGP(km)板上并在68℃下培养过夜。在平板上培养至汇合生长。将单克隆涂布于新鲜的TGP(kan)板上的50-方格网中并在68℃下培养过夜。

筛选

使用下述方法筛选可能的ldh基因敲除整合体：

1)平板筛选

在68℃下将几百个整合体影印培养到SAM2平板(用kan)上。乳酸阴性细胞产生较少的酸，并且在不合缓冲液的发酵培养基中比野生型更有生长优势。

2)PCR筛选

使用克隆PCR来确定所述质粒是否被整合到ldh基因中。通过选择整合位点侧翼的引物，能够确定ldh基因整合是否发生(对于插入的整合体，没有PCR片段会被放大)

3)乳酸测定法

该方法能测定当在68℃下在SAM2(kan)中过夜生长时，所述整合体能否产生乳酸。利用用于乳酸测定的Sigma乳酸试剂来测试培养物上清的乳酸浓度。乳酸阴性整合体用PCR来进一步表征并且评估其在发酵罐中的稳定性。

用于热葡糖苷酶土芽孢杆菌NCIMB 11955的电穿孔方案

NCIMB 11955冻存储液通过下述方法制备：在TGP培养基中生长过夜培养物(55℃下250rpm，250ml锥形瓶中的50ml体积，OD₆₀₀)，加入等体积的20％甘油并将其分为1ml的等分，在-80℃下存储于冻存管中。使用1ml的储液来接种250ml锥形瓶中50ml TGP，在55℃下以250rpm培养至培养物达到OD₆₀₀1.4。

将所述烧瓶在冰上冷却10分钟，然后将所述培养物在4℃以4000rpm离心20分钟。将沉淀重悬于50ml冰冷的电穿孔培养基中并以4000rpm离心20分钟。再冲洗三次，1×25ml和2×10ml，然后将所述沉淀重悬于1.5ml冰冷的电穿孔培养基中并分为60μl等分。

为了进行电穿孔，将1-2μl DNA加到保存在冰上的离心管中的60μl电感受态细胞中并轻轻混合。将悬浮液转移到预冷的电击杯(1mm间距)中并在2500V、10μF电容和600Ω电阻下电穿孔。

在脉冲后立即加入1ml TGP并混合，将悬浮液转移到螺旋盖管中并在52℃下在摇动水浴中培养1小时。培养后，将悬浮液直接涂板(例如2×0.5ml)或4000rpm离心20分钟，重悬于200μl-500μl TGP中并涂布于含有适合的抗生素的TGP琼脂上。

LDH基因的失活

双交换突变

根据已有的11955 LDH序列设计引物。所述敲除策略是基于在LDH基因中用两种方式来生成内部缺失。

在策略1中，利用接近LDH编码区中心的两个已经存在的单一限制性位点来产生缺失。根据包括大部分的现有的LDH序列的基因组DNA来生成一个大的PCR产物，并将其克隆到pUC 19的多克隆位点的SmaI位点中。然后将所述pUC 19克隆用BstEII和BsrGI连续消化，在Klenow消化后重新连接，以便在BstEII和BsrGI之间的LDH基因中产生一个内部缺失。

在策略2中(参见实施例2)，所述LDH基因被克隆为2个PCR产物，在寡核苷酸引物上引入NotI位点以使得所述2个PCR产物在pUC 19中被连接起来，在LDH序列中产生一个缺失。

将两个具有内部缺失的LDH基因亚克隆到3个潜在的土芽孢杆菌运载系统中。

质粒详述

pCU1 4.94kb，基于pC194的穿梭载体，携带cat&bla。

pBT2 6.97kb，源自pE194的ts突变体的穿梭载体，携带cat

和bla。

pTVOmcs 4.392kb，源自pE194ts，携带cat(无革兰氏阴性复制子)。

通过电穿孔将所述运载体转化到11955中。

遗传策略信息：用于同源重组的运载系统的开发

为产生敲除，需要有效的系统来将突变的基因运载到靶生物中并选择出通过与靶“野生型”基因同源重组而与基因组完成了整合的生物。通常，这可以通过引入不含革兰氏阳性复制子但含革兰氏阴性选择标记的E.coli载体上的DNA来实现。这要求高的转化效率。所开发的用于土芽孢杆菌11955的电穿孔方法利用pNW33N产生了3×10⁴转化体/μg DNA。所述革兰氏阳性复制子来源于BGSC产品目录中的pBC1和序列数据库中的pTHT 15。

使用pNW33N上的cat基因来在E.coli和土芽孢杆菌中进行选择。pNW33N的温敏突变体可通过将所述质粒转化到Statagene XL1r ed突变菌株中来产生。

实施例2

通过基因置换来产生LDH突变体

设计了另一种策略来通过基因置换在热葡糖苷酶土芽孢杆菌NCIMB 11955中产生稳定的LDH基因突变。该策略包括产生接近编码序列中间的42bp的缺失，且在该位置的7bp的插入片段引入了一个新的NotI限制性位点。这一插入序列意在引起一个下游移码突变。

所述策略包括利用2个PCR片段的缺失，用寡核苷酸引物引入新的NotI位点。根据11955的LDH编码区的部分序列来设计引物。所用的引物序列如下所示。

片段1

引物1(正向)：GGAATTCCCTTATGAACCAAGGAATAGCA(下划线序列标明了所引入的用于产生新的EcoRI位点的碱基；SEQ IDNO.3)。

引物2(反向)：GCGGCCGCACCCGCTCTTTCGGTAACCCGCT(下划线序列标明了所引入的用于产生新的NotI位点的碱基；SEQ IDNO.4)。

片段2：

引物3(正向)：GCGGCCGCTTGCTAAGTGAATATTTTCAAGT(下划线序列标明了所引入的用于产生新的NotI位点的碱基；SEQ IDNO.5)。

引物4(反向)：CTGCAGCGTCAATTCCATCACTTCACGA(下划线序列标明了所引入的用于产生新的PstI位点的碱基；SEQ ID NO.6)。

基因组DNA的制备

从11955制备基因组DNA来作为PCR模板。以4000rpm离心20分钟来收集在52℃下的TGP培养基中生长的20ml 11955过夜培养物细胞。将细胞沉淀重悬于5ml STE缓冲液中，所述缓冲液含有0.3M蔗糖、25mM Tris HCl和25mM EDTA，调至pH 8.0，并含有2.5mg溶菌酶和50μl 1mg/ml的核糖核酸酶A。在30℃下将其培养1小时，然后加入5mg蛋白酶K和50μl 10％的SDS，然后在37℃下培养1小时。用等体积的苯酚/氯仿，然后用氯仿来连续地提取裂解的培养物，然后再用异丙醇沉淀。用冰冷的70％乙醇冲洗两次后，将所述DNA沉淀重溶于0.5ml TE缓冲液中。

LDH缺失构建体的产生

用Robocycler Gradient 96(Stratagene)来进行PCR，且反应条件如下：循环1：在95℃下变性5分钟，在47℃下退火1分钟，在72℃下延伸2分钟；循环2-30：在95℃下变性1分钟，在47℃下退火1分钟，在72℃下延伸2分钟并且在72℃下孵育5分钟。所用的酶为Pfu聚合酶(Promega)和Taq聚合酶(New England Biolabs，NEB)的等量混合物。所用的缓冲液和dNTP组合物和浓度为供应商推荐的适用于Pfu的组合物和浓度。利用NCIMB 11955的基因组DNA作为模板所获得的PCR产物是利用琼脂糖凝胶电泳纯化的，并利用QiAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)来从琼脂糖凝胶中洗脱出来。将纯化的PCR产物连接到预先用SmaI消化的pUC19(New England Biolabs)上，并且用所述连接混合物来转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH10B(Invitrogen)。选择氨苄青霉素抗性克隆，分离所含的质粒并通过限制性分析来表征，确定插入片段的方向。

具有插入到pUC19(具有由引物4在pUC19的多克隆位点(mes)中接近PstI的位点引入的新的PstI位点)的片段2的质粒(pTM002)用NotI和PstI来消化。将所得的片段(接近0.4kb)连接到含有片段1(具有由寡核苷酸1在pUC19的多克隆位点(mes)中接近EcoRI的位点引入的新的EcoRI位点)的pUC19质粒(pTM001)中，用NotI和PstI来消化以线性化所述质粒。用连接混合物来转化E.coli DH10B。选择氨苄青霉素抗性克隆，分离所含的质粒并通过限制性分析来表征。鉴定具有所需构建体(LDH编码区具有缺失并引入NotI位点)的预期的限制图谱的质粒(pTM003)，并且通过使用M13mp18反向和正向引物的测序来对其验证。

通过利用HindIII和EcoRI的消化来将突变的LDH基因从pTM003中切出，并通过琼脂糖凝胶电泳来纯化，然后利用QiAquick凝胶提取试剂盒来将其从琼脂糖凝胶中洗脱出来(约0.8kb片段)。用Klenow聚合酶(NEB，按照生产商说明书)来处理该片段以产生平端并引入到pUB190载体中。这可以通过与pUB190的平端连接来实现，其中pUB190已经用XbaI消化以线性化，然后用Klenow处理，之后与前面一样用凝胶纯化。用连接混合物来转化E.coli SCS110(Stratagene)。选择氨苄青霉素抗性克隆，分离所含的质粒并通过限制性分析来表征。鉴定具有所需构建体的预期的限制图谱的质粒(pTM104)并通过实施例1所述的电穿孔方法来用它转化NCIMB11955。

通过双交换来产生和表征基因置换的LDH突变体

使用以该方式获得的pTM104的推定原代整合体(菌株TM15)来获得双重组体(基因置换)。这可以通过在不含卡那霉素的TGP培养基中连续的传代培养TM15来实现。使用5次连续的振荡培养物，交替在54℃下培养8小时和在52℃下培养16小时，使用以250rpm振荡的装在50ml试管(Falcon)中的5ml TGP，每一阶段转移1％。5次传代后，在TGP中连续地稀释所得的培养物并且将100μl样品涂布于TGP琼脂板上在54℃下孵育。通过将所得克隆影印接种到含12μg/ml卡那霉素的TGP琼脂上来鉴定卡那霉素敏感型克隆。经过琼脂上划线至单菌落来纯化之后，测试这些卡那霉素敏感型衍生物的乳酸产量，并如预期的那样提供了LDH⁺和LDH^-的混合物。通过PCR和DNA印迹来进一步表征一种LDH^-衍生物，TM89。

利用TM15(原代整合体)和TM89(推定的双重组LDH^-)来制备基因组DNA，并将其用作使用引物1和4的PCR的模板，使用如上所述的条件。使用来自11955的基因组DNA作为对照。PCR产物(从所有3个模板中获得了大约0.8kb的条带)通过琼脂糖凝胶电泳来纯化，并利用QiAquick凝胶提取试剂盒来从琼脂糖凝胶中洗脱出来。样品用NotI消化并用0.7％的琼脂糖凝胶上电泳以显示产物。如预期的那样，11955的PCR产物没有示出NotI消化的证据，而TM89的PCR产物给出两条约0.4kb的条带，表明突变的等位基因置换了野生型基因。TM15(原代整合体)的PCR产物的NotI消化主要给出了两条如TM89一样的条带，伴随一条微弱的未切割(0.8kb)条带。这可以用TM15基因组DNA的DNA印迹所得的结果来解释。

用NotI、PstI和NotI以及HindIII和NotI来消化11955、TM15和TM89的基因组DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳。将所述DNA转移到正电性尼龙膜(Roche)上并与DIG标记探针杂交，所述探针是通过使用引物1和4以及DIG标记dNTP的11955 LDH基因的PCR来产生的，按照供应商的说明书(Roche Molecular Biochemicals DIGapplication manual)。用所提供的检测试剂盒(Roche)来显影杂交的条带。DNA印迹示出了TM15的NotI消化产物中的一条约7.5kb的放大条带，以及TM15的HindIII/NotI和PstI/NotI消化产物中的约7kb和0.4kb的类似的放大条带，说明在该原代整合体的LDH位整合了多个串联的pTM014的拷贝。在全部3种限制性消化中，TM89示出了一种不同的限制图谱，所述图谱表明与11955相比有一条额外的杂交条带，与基因置换吻合。

实施例3

用野生型嗜热生物生产乙醇

可重现的生长和产物的形成是通过对所述野生型嗜热生物的分批加料培养和连续培养来实现的。表1、2和3示出了发酵过程中所用的条件。

表1

表2

硫酸盐微量元素储液

表3

发酵罐条件

表4

实施例4

使用嗜热生物增加乙醇产量

为了用所述嗜热生物实现预期的乙醇产率和产量，通过失活ldh基因来敲除L-乳酸脱氢酶(LDH)活性以使乳酸产量最小。有两种失活ldh基因的方式：在染色体的ldh区单次交换重组标记DNA，阻止其转录；或是在ldh基因中双交换重组DNA同源区以在所述基因区产生突变，使其失去功能。

单次交换重组方式能快速产生LDH-阴性突变体，所述突变体与野生型菌株相比能快速增加乙醇产量。

用LDH突变体提高乙醇产量

通过分批加料培养来培养LDH-阴性突变体，在所建立的最小培养基中测定LDH活性敲除导致的乙醇产量的增加。LDH突变体的代谢物情况的变化如表5所示，与使用野生型菌株的最佳乙醇产量相比较。表6示出了由LDH活性敲除导致的乙醇产量增加。

表5

表6

所述LDH突变体的乙醇产率明显高于野生型嗜热生物，说明成功地变更了这些嗜热生物的代谢途径。进一步优化LDH突变体菌株的培养条件和培养基组成将会增加乙醇产率。

实施例5

当使用实施例2所描述的方法时，进行ldh修饰来分离NCIMB41277。使用相同的转化方案，但是在回收时通过在55℃下孵育来优化转化效率(与实施例2的52℃相反)。在2TY培养基中对原代整合体进行连续的传代培养以获得具有ldh-阴性表型的双交换体。在分批加料发酵和连续发酵时对稳定的敲除菌株41277KO4进行表征。结果如表7所示。这表明与野生型微生物相比，所述突变体41277KO4能明显地增加乙醇的产量水平。所述突变体在培养物中也是稳定的且不会回复成野生型。

表7

NCIMB41277和41277KO4之间的比较

所有野生型分离株的乙醇数据如表8所示，说明了所述分离株以野生型形式生产乙醇的能力。由于大多数该类型的野生型微生物不能生产乙醇，所以数据是无法预料的。

表8

分离株的乙醇数据

序列表

<110>TMO可再生能源有限公司

<120>具有失活的乳酸脱氢酶基因的修饰微生物

<130>JWJ01149WO

<150>GB0511602.5

<151>2005-06-07

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>6744

<212>DNA

<213>热葡糖苷酶土芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)

<400>1

gaattcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc 60

acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta 120

actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca 180

gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc 240

cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc 300

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<210>2

<211>7673

<212>DNA

<213>热葡糖苷酶土芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)

<400>2

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caataataga aaatccatct tcatcggctt tttcgtcatc atctgtatga atcaaatcgc 6360

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<210>3

<211>29

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<213>人工的

<220>

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ggaattccct tatgaaccaa ggaatagca 29

<210>4

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>寡核苷酸引物

<400>4

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<210>5

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<223>寡核苷酸引物

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<210>6

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

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<223>寡核苷酸引物

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Claims

1.一种微生物，所述微生物保藏于NCIMB保藏号为41277、41278、41279、41280或41281，并且经过修饰以失活内源乳酸脱氢酶基因。

2.如权利要求1所定义的微生物，其中所述乳酸脱氢酶已经被缺失。

3.根据权利要求1或权利要求2的微生物在乙醇生产中的用途。

4.一种修饰微生物以增加乙醇产量的方法，包括获得保藏于NCIMB保藏号为41277、41278、41279、41280和41281的嗜热微生物的任一种，并且失活乳酸脱氢酶基因。

5.一种生产乙醇的方法，包括在存在C5或C6糖的适合的条件下，培养根据权利要求1或权利要求2的微生物。