JP4801151B2 - 不活性化された乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を有する改変微生物 - Google Patents

Description

本発明は、細菌発酵産物としてのエタノールの生産に適用されうる微生物の同定に関する。特に、本発明は、好熱性細菌によるエタノール生産に関する。

細菌の代謝は、細菌の種及び環境条件に依存して様々な異なるメカニズムを通して起こりうる。全ての病原菌を含む従属栄養細菌は、有機化合物の酸化からエネルギーを獲得する。最も一般的に、炭水化物(特にグルコース)、脂質、及びタンパク質が酸化される化合物である。細菌によるこれらの有機化合物の生体酸化は、化学エネルギー源としてＡＴＰの合成をもたらす。当該過程はまた、細菌細胞により生体合成反応に必要とされるより単純な有機化合物(前駆体分子）の生成を可能にする。細菌が適切な基質を代謝するところの一般的な方法は、解糖であり、解糖はグルコースをピルビン酸へと変換してＡＴＰの生成をもたらす一連の反応である。代謝エネルギーの生成において、ピルビン酸の運命は、微生物及び周囲条件に依存して変化する。ピルビン酸の三つの主な反応が存在する。

第一に、好気条件下では、多くの微生物は、クエン酸回路を用いてエネルギーを生成し、そしてピルビン酸のアセチル補酵素Ａへの変換は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(ＰＤＨ)により触媒される。

第二に、嫌気条件下では、特定のエタノール生産生物は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ(ＰＤＣ)により触媒されるピルビン酸のアセトアルデヒドへの脱炭酸、そして続いて、アルコールデヒドロゲナーゼ(ＡＤＨ)により触媒されるＮＡＤＨによるアセトアルデヒドのエタノールへの還元によって、アルコール発酵を行うことができる。

第三の過程は、乳酸デヒドロゲナーゼ(ＬＤＨ)による触媒反応を通して生じるピルビン酸の乳酸への変換である。

もともと嫌気発酵を行う微生物を用いるか、又はピルビン酸デカルボキシラーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を取り込んだ組換え微生物の使用を通して、エタノールを生産するために微生物を使用することにかなりの関心がある。これらの微生物を用いることによりエタノール生産においていくらかの成功を収めてきたが、特に微生物が低レベルのエタノール抵抗性しか有さない場合、高濃度のエタノールによって発酵にしばしば障害が生じる。

好熱性細菌はエタノール生産に推奨されており、そして好熱性細菌の使用は、高温で発酵が行われうるという利点を有する。高温での発酵は、産生されたエタノールが５０℃より高い温度において蒸気として取り除かれることを可能にする。これは、高い糖濃度を用いて発酵を行うことを可能にする。しかしながら、エタノールを効率よく産生できる適切な好熱性細菌を発見することが問題である。

WO01/49865号は、ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする異種遺伝子で形質転換され、かつ野生型のアルコールデヒドロゲナーゼ機能を有するエタノール生産用のグラム陽性細菌を開示する。細菌は、好熱性バチルスであり、そして当該細菌は、トランスポゾン挿入を用いて、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を不活性化することにより改変されうる。WO01/49865号に開示される細菌は、すべてバチルスＬＬＤ-Ｒ株、つまり培養から自然発生的に生じる胞子形成欠損株に由来し、そしてここでｌｄｈ遺伝子は、自然発生突然変異により又は化学的突然変異誘導により不活性化された。ＬＮ株及びＴＮ株が、ＬＬＤ-Ｒ株の改変された誘導株として開示される。しかしながら、全ての株は、ＨａｅＩＩＩ型制限システムを含み、これは、プラスミド形質転換を妨げ、その結果、非メチル化ＤＮＡ内への形質転換を妨げる。

WO01/85966は、制限問題を克服するために、in vivoメチル化により調製される微生物を開示する。これは、ヘモフィルス・アエジプチウス(Haemophilus aegyptius)由来のＨａｅＩＩＩメチルトランスフェラーゼを、ＬＬＤ-Ｒ、ＬＮ、及びＴＮ株へと形質転換することを必要とする。しかしながら、ＬＬＤ-Ｒ、ＬＮ、及びＴＮ株は、不安定な変異株であり、そして、特に低ｐＨ及び高い糖濃度において、乳酸産生野生型株へと自然発生的に戻ってしまう。これにより、発酵産物がエタノールから乳酸へと変化し、当該株はエタノール生産に適さなくなる。

WO02/29030は、ＬＬＤ-Ｒ株及びその誘導株が、ｌｄｈ遺伝子のコード領域において天然の挿入エレメント(ＩＥ)を含むということを開示する。ＩＥのｌｄｈ遺伝子への(そして当該遺伝子からの)転移、及びそれに続く遺伝子不活性化は不安定であり、復帰が生じる。これについての提案される解決法は、プラスミドＤＮＡをＩＥ配列に組込むことであった。

その結果、当該技術分野において、エタノール生産用の微生物の生産は、実験室で生産された化学的に突然変異を誘導されたバチルス微生物を改変すること、これらの微生物をｉｎ ｖｉｖｏメチル化方法で処理すること、そしてさらに、プラスミドＤＮＡをＩＥ配列へと組込むように当該微生物を改変することに依存している。当該方法は複雑であり、不確かであり、そして当該株がどのように使用できるかについての調節の問題がある。

その結果、エタノール生産用の改良微生物についての必要性が存在する。

本発明の第一態様では、ＮＣＩＭＢ番号第４１２７７、４１２７８、４１２７９、４１２８０及び４１２８１号のいずれかと名づけられた好熱性微生物は、高いエタノール産生を可能にするように改変され、この改変は、野生型好熱性微生物の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の不活性化である。

本発明の第二態様では、エタノール生産方法は、Ｃ₅又はＣ₆糖が存在する適切な条件下で、上の定義に従った微生物を培養することを含む。

本発明の第三態様では、エタノール生産を高めるために微生物を改変する方法は、ＮＣＩＭＢ受託番号第４１２７７号、４１２７８号、４１２７９号、４１２８０号、及び４１２８０号のいずれかとして定義される好熱性微生物を得ること、そして当該微生物から乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を欠失させることを含む。

本発明は、所望のエタノール生産性を有する野生型微生物を同定すること、そして乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を損なわせるために当該野生型好熱性微生物を改変することに基く。

乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を不活性化することは、ピルビン酸の乳酸への分解を妨げるのに役立ち、その結果、(適切な条件下で)ピルビン酸デカルボキシラーゼとアルコールデヒドロゲナーゼを用いて、又は同等の酵素経路を用いたピルビン酸のエタノールへの分解を促進する。

本発明の野生型微生物は、ＮＣＩＭＢ番号第４１２７７号、第４１２７８号、第４１２７９号、第４１２８０号、及び第４１２８１号で寄託された好熱性微生物のいずれかでありうる。

改変用に選択された微生物は、「野生型」と呼ばれており、つまり、当該微生物は、実験室で生産された突然変異体ではない。当該微生物は、好熱菌を含む環境サンプルから単離された。単離された野生型微生物は、エタノールを産生するその驚くべき能力のため選択された。しかしながら、未改変の場合、乳酸が主要な発酵産物となるようである。単離株は、高温でヘキソース及び/又はペントース糖での増殖能力について選択される。

本発明の微生物は、当該微生物の発酵過程における使用を可能にするある望ましい特性を有する。当該微生物は、制限系を有しておらず、それによりｉｎ ｖｉｖｏメチル化についての必要性を避けることができる。さらに、当該微生物は、少なくとも３％エタノールで安定であり、そして基質として、セルビオース及びスターチを含むＣ₅及びＣ₆糖を利用する能力を有する。当該微生物は高頻度で形質転換可能でもある。さらに、当該微生物は、０.３ｈ^-1超の連続培養における増殖割合を有する。

当該微生物は好熱性であり、そして４０℃〜８５℃の温度範囲で増殖する。好ましくは、当該微生物は、５０℃〜７０℃の温度範囲で増殖する。さらに、当該微生物は、ｐＨ６.５以下の条件、特にｐＨ４.５〜ｐＨ６.５の条件で増殖する。

乳酸デヒドロゲナーゼの核酸配列が現在知られている。当該配列を用いて、当業者は、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を標的として、様々なメカニズムを介して当該遺伝子の不活性化を達成することができる。乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が、トランスポゾンの挿入により、又は好ましくは、遺伝子配列又は遺伝子配列の一部が欠失することにより不活性化される場合が好ましい。欠失が好ましい。なぜなら、欠失は、遺伝子配列の再活性化についての問題を避けることができ、この問題はトランスポゾンによる不活性化が使用される場合にしばしば生じるからである。好ましい実施態様では、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、温度感受性プラスミド(プラスミドｐＵＢ１９０-ｌｄｈ；ＮＣＩＭＢ受託番号第４１２７６号)の組込みにより不活性化される。当該プラスミドは、プラスミドと微生物染色体との自然発生的相同組換え又は組込み(natural homologous recombination or integration)を達成する。染色体組込み体は、抗菌剤(例えばカナマイシン)への組込み体の抵抗性に基づいて選択できる。乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子への組込みは、一重交差相同組換え(single crossover recombinant)又は二重(又はそれより多くの)交差組換え(double (or more) cross recombinant)により生じてもよい。二重交差組換えが好ましい。得られた変異体は抗生物質選別をせずに安定である。

本発明で使用される微生物は、ＮＣＩＭＢ番号第４１２７７、４１２７８、４１２７９、４１２８０、及び４１２８１号として寄託された(NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Scorland)。

本発明の微生物は、選択された好熱性微生物に依存して、慣用される培地条件下で培養されうる。基質、温度、ｐＨ、及び他の増殖条件の選択は、既知の培地要件に基づいて選択できる。例えば、WO01/49865及びWO01/85966を参照のこと。

本発明は、一例として、添付の図面を参照して、以下の実施例において記載されている。ｌｄｈ遺伝子への改変を調節するために使用された微生物は、ゲオバチルス１１９５５であるが、本明細書に開示される方法は、実施例５に記載される様に、本明細書に定義される任意の微生物について使用するのに適している。

ＬＤＨ遺伝子の不活性化
実施例１-一重交差突然変異誘導
ＬＤＨノックアウトベクターの開発
約８００ｂｐのｌｄｈ遺伝子断片の一部を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩを用いて温度感受性デリバリーベクターｐＵＢ１９０にサブクローニングして、７.７ｋｂのｐＵＢ１９０-ｌｄｈプラスミド(図１及び配列番号１)を得た。１０個の推定の大腸菌ＪＭ１０９形質転換体(ｐＵＢ１９０-ｌｄｈ)を制限酵素分析により確認し、そして２個の培養物を用いて形質転換用のプラスミドＤＮＡを得た。ｐＵＢ１９０ｌｄｈをＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで切断することにより、予期されたｌｄｈ断片が放出される。

ゲオバチルス サーモグルコシダシウス(Geobacillus thermoglucosidasius)１１９５５をｐＵＢ１９０-ｌｄｈで形質転換した
カナマイシン選別を用いて、５４℃で２４〜４８時間後に、３個全ての被験プラスミドを用いて形質転換体を得た。ｌｄｈ形質転換体を、ゲオバチルス サーモグルコシダシス(Ｇｔ)１１９５５から単離し、そしてＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩを用いて制限酵素分析により確かめた。

ＬＤＨ遺伝子ノックアウト
温度感受性プラスミドを染色体上のｌｄｈ遺伝子中に組込むことにより、遺伝子ノックアウトを行った。
プラスミドｐＵＢ１９０-ｌｄｈは、Ｇｔ１１９５５において５４℃で複製されるが、６５℃では複製されなかった。選別を、カナマイシン(ｋａｎ)(１２μｇ/ｍｌ)を用いて維持した。次に増殖温度を６５℃に増加させた(プラスミドはもはや複製されなかった)。自然の組替え又は組込みは、プラスミドと染色体との間で生じる。染色体への組込み体をカナマイシンに対する組込み体の抵抗性について選別した。相同配列がプラスミド上に存在するので、組込みがｌｄｈ遺伝子に対してされる。ｌｄｈ遺伝子への標的組込みは、一重交差組換えとして知られる方法により生じた。プラスミドは、ｌｄｈ遺伝子に取込まれて、不活性ｌｄｈ遺伝子をもたらす。タンデムの繰り返しは、数コピーのプラスミドが組み込まれる場合に生じうる。

方法論及び結果
２個の異なる方法が組込み体を得るために試みられた：
方法１：
４×５０ｍｌのＴＧＰ(ｋａｎ)培養物を５４℃で１２〜１８時間増殖させた。細胞を遠心によりペレット化し、そして１ｍｌのＴＧＰに懸濁する。懸濁液をＴＧＰ(ｋａｎ)プレート上に撒き(５×２００ｍｌ)そして一晩６８℃でインキュベートした。組込み体を拾い上げ、そして新たなＴＧＰ(ｋａｎ)プレート上の５０平方グリッド上に撒き、そして６８℃で一晩インキュベートした。

方法２：
１×５０ｍｌのＴＧＰ(ｋｍ)培養物を５４℃で１２〜１８時間増殖させた。１ｍｌの培養物を用いて、５０ｍｌの新たなＴＧＰ(ｋａｎ)培養液に植菌し、当該培養物を６８℃で１２〜１８時間増殖させた。次の日当該培養物を５０ｍｌの新たなＴＧＰ(ｋａｎ)培養液上で前培養し、そして６８℃でさらに１２〜１８時間増殖させた。培養物をＴＧＰ(Ｋｍ)プレート上に撒き、そして６８℃で一晩インキュベートした。プレート上でコンフルエントにまで増殖させた。単一のコロニーを、新たなＴＧＰ(ｋａｎ)プレートの５０平方グリッド上に撒き、そして一晩６８℃でインキュベートした。

スクリーニング
推定の組込み体を、以下のアッセイを用いて、ｌｄｈ遺伝子ノックアウトについてスクリーニングした。
１)プレート選別
６８℃で、ＳＡＭ２プレート(ｋａｎを伴う)上に数百の組込み体をレプリカプレートする。乳酸陰性細胞は、少ない酸しか産生せず、そして緩衝液を伴わない発酵培地中で野生型に対して増殖利得を有するであろう。
２)ＰＣＲ選別
コロニーＰＣＲを用いて、プラスミドがｌｄｈ遺伝子中に組み込まれたかを決定する。組込み部位に隣接するプライマーを選択することにより、ｌｄｈ遺伝子組込みが生じたかを決定することができる(インサートについてのＰＣＲ断片が増幅されない)。
３)乳酸アッセイ
このアッセイは、組込み体が、６８℃でＳＡＭ２(ｋａｎ)中で一晩増殖したときに、乳酸を産生するかを決定する。この培養上清を、乳酸決定用のＳｉｇｍａ乳酸試薬を用いて乳酸濃度を試験した。乳酸陰性組込み体をさらに、ＰＣＲにより特徴決定し、そして発酵容器内での安定性について評価した。

ゲオバチルス サーモグルコシダシス ＮＣＩＭＢ １１９５５についての電気穿孔プロトコル
ＴＧＰ培地中で一晩培養物を増殖させ(５５℃２５０ｒｐｍ、２５０ｍｌコニカルフラスコ中に５０ｍｌの体積、ＯＤ₆₀₀)、等量の２０％グリセロールを加え、そして１ｍｌの一定量へと分け、そして-８０℃でクリオチューブ中で貯蔵することにより、ＮＣＩＭＢ１１９５５の凍結ストックを作成した。２５０ｍｌコニカルフラスコ中の５０ｍｌＴＧＰに植菌するために、１ｍｌの当該ストックを使用し、培養物がＯＤ₆₀₀１.４に達するまで、５５℃２５０ｒｐｍでインキュベートした。

フラスコを氷上で１０分間インキュベートし、次に培養物を２０分間４℃４０００ｒｐｍで遠心した。ペレットを５０ｍｌ氷冷電気穿孔培地中に懸濁し、そして２０分間４０００ｒｐｍで遠心した。さらに３回洗浄を行い(１×２５ｍｌ及び２×１０ｍｌ)、次にペレットを１.５ｍｌ氷冷電気穿孔培地中に懸濁し、そして６０μｌの一定量に分ける。

電気穿孔のために、１〜２μｌのＤＮＡを、氷上に維持されたエッペンドルフチューブ中の６０μｌのエレクトロコンピテント細胞に加え、そしてゆっくり混合した。この懸濁液をあらかじめ冷却された電気穿孔キュベット(１ｍｍ間隙)に移し、そして２５００Ｖ、１０μＦの容量及び６００Ωの抵抗で電気穿孔した。

パルスをかけたすぐ後に、１ｍｌのＴＧＰを加え、混合し、そして懸濁液をスクリュー式の蓋のチューブに移し、そして５２℃で１時間、振盪水浴中でインキュベートした。インキュベート後、懸濁液は、直接撒かれるか(例えば２×０.５ｍｌ)又は４０００ｒｐｍで２０分間遠心され、２００μｌ〜５００μｌのＴＧＰで懸濁し、そして適切な抗生物質を含むＴＧＰアガー上に撒かれた。

ＬＤＨ遺伝子の不活性化
二重交差突然変異
利用可能な１１９５５ＬＤＨ配列に基づきプライマーを設計した。ノックアウト戦略は、２つのアプローチによりＬＤＨ遺伝子内で内部欠失を作成することに基づく。

戦略１では、欠失を作り出すためにＬＤＨコード配列の中間付近の２個の固有制限部位を用いた。利用可能なＬＤＨ配列の大部分をカバーするゲノムＤＮＡから１の大きいＰＣＲ産物を作成し、そしてｐＵＣ１９のマルチプルクローニングサイトのＳｍａＩ部位にクローニングした。次にｐＵＣ１９クローンをＢｓｔＥＩＩ及びＢｓｒＧＩで順次切断し、そしてクレノー切断後に再ライゲーションして、ＬＤＨ遺伝子内にＢｓｔＥＩＩとＢｓｒＧＩとの間の内部欠失を作成した。

戦略２(実施例２を参照のこと)：ＬＤＨ遺伝子を２個のＰＣＲ産物としてクローニングし、オリゴヌクレオチドプライマーにＮｏｔＩ部位を導入して、２個のＰＣＲ産物が一緒にｐＵＣ１９にライゲーションすることを可能にし、ＬＤＨ配列の中間に欠失を作り出した。内部欠失を有する２個のＬＤＨ遺伝子を、ゲオバチルス用の潜在的な３個のデリバリーシステムにサブクローニングした。

デリバリーベクターは、電気穿孔により１１９５５に形質転換された。

遺伝的戦略情報：相同組替えについてのデリバリーシステムの開発
ノックアウトを作成するために、突然変異された遺伝子を標的生物へとデリバリーし、そして標的「野生型」遺伝子と相同組換えをすることによりゲノムへと組込むように選択される効率的なシステムが必要とされる。原理的に、当該効率的なシステムは、グラム陽性レプリコンを伴わないが、グラム陰性選択マーカーを有する大腸菌ベクター上に当該ＤＮＡを導入することによって達成できる。これは、高い形質転換効率を必要とする。ゲオバチルス１１９５５用に開発された電気穿孔方法は、ｐＮＷ３３Ｎを用いて、１μｇのＤＮＡあたり３×１０⁴形質転換体を作成する。グラム陽性レプリコンは、ＢＧＳＣカタログのｐＢＣ１から得られ、そして配列データベース中のｐＴＨＴ１５から得られる。

ｐＮＷ３３Ｎ上のｃａｔ遺伝子は、大腸菌とゲオバチルスの両方において選別のために使用される。プラスミドをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＸＬ１ｒ ｅｄ 突然変異誘発株を通して継代することにより、ｐＮＷ３３Ｎの温度感受性突然変異体を作成した。

実施例２
遺伝子置換によるＬＤＨ突然変異体の作成
遺伝子置換により、ゲオバチルス サーモグルコシダシウスＮＣＩＭＢ １９５５において、ＬＤＨ遺伝子の安定した突然変異を作成するためにさらなる戦略を設計した。当該戦略は、コード配列の中央部付近の４２ｂｐ欠失を作成し、そしてこの位置に新規のＮｏｔ１制限酵素切断部位を導入する７ｂｐを挿入することに関した。この挿入された配列は、下流のフレームシフト突然変異を引き起こすことを意図した。

当該戦略は、２個のＰＣＲ断片を用い、新規のＮｏｔＩ部位を導入するオリゴプライマーを用いて、欠失を作成することに関した。プライマーは、１１９５５由来のＬＤＨコード領域の配列の一部に基づくように設計された。使用されるプライマーの配列は以下に示される。
断片１：
プライマー１(フォワード);GGAATTCCCTTATGAACCAAGGAATAGCA(下線を引いた配列は、新たなＥｃｏＲ１部位を作成するために導入された塩基を指す；配列番号３)；
プライマー２(リバース);GCGGCCGCACCCGCTCTTTCGGTAACCCGCT(下線を引いた配列は、新たなＮｏｔＩ部位を作成するために導入された塩基を指す；配列番号４)；
断片２：
プライマー３(フォワード)；GCGGCCGCTTGCTAAGTGAATATTTTCAAGT(下線を引いた配列は、新たなＮｏｔＩ部位を作成するために導入された塩基を指す；配列番号５)
プライマー４(リバース)；CTGCAGCGTCAATTCCATCACTTCACGA(下線を引いた配列は、新たなＰｓｔＩ部位を作成するために導入された塩基を指す；配列番号６)

ゲノムＤＮＡの調製
ゲノムＤＮＡを１１９５５から調製して、ＰＣＲについてのテンプレートとして用いた。５２℃でＴＧＰ培地中で増殖した１１９５５の２０ｍｌの一晩培養した培養物から得た細胞を、４０００ｒｐｍで２０分間遠心することにより回収した。細菌ペレットを５ｍｌのＳＴＥ緩衝液（ｐＨ８.０に調節し、２.５ｍｇのライソザイム及び５０μｌの１ｍｇ／ｍｌリボヌクレアーゼＡを含む０.３Ｍスクロース、２５ｍＭトリス塩酸及び２５ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁した。これを、３０℃で１時間インキュベートし、次に５ｍｇのプロテイナーゼＫを加え、そして５０μｌの１０％ＳＤＳを加え、１時間３７℃でインキュベートした。溶解した培養物を次に連続的に等体積のフェノール／クロロホルムで抽出し、続いてクロロホルムで抽出し、次にイソプロパノールで沈殿させた。氷冷７０％エタノールで２回洗浄した後に、ＤＮＡペレットを０.５ｍｌＴＥ緩衝液中に再溶解した。

ＬＤＨ欠失コンストラクトの作成
Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ９６(Stratagene)を用いてＰＣＲを行った。そして反応条件は以下の通りである：サイクル１；９５℃で５分間変性、４７℃で１分間アニーリング、７２℃で２分間伸張、サイクル２-３０回；９５℃で１分間変性、４７℃で１分間アニール、７２℃で２分間伸張、そしてさらに７２℃で５分間インキュベート。使用される酵素は、Ｐｆｕポリメラーゼ(Promega)及びＴａｑポリメラーゼ(New England Biolabs, NEB)の等量混合物であった。使用される緩衝液及びｄＮＴＰ組成及び濃度は、販売元によりＰｆｕについて推奨されているものであった。ＮＣＩＭＢ１１９５５由来のゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて得られたＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動により精製され、そして、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ(Qiagen)を用いることによりアガロースゲルから溶出される。精製されたＰＣＲ産物を、前もってＳｍａＩで切断されたｐＵＣ１９(New England Biolabs)にライゲーションし、そしてライゲーション混合物を、大腸菌ＤＨ１０Ｂ(Invitrogen)を形質転換するために使用した。アンピシリン耐性のコロニーを選別し、そして含まれたプラスミドを単離し、そして制限酵素分析により特徴決定し、そしてインサートの向きを確認した。

ｐＵＣ１９に挿入された断片２を有するプラスミド(ｐＴＭ００２)(ｐＵＣ１９のマルティプルクローニングサイト(ｍｃｓ)中のＰｓｔＩ部位の最も近くにプライマー４上に導入された新規のＰｓｔＩ部位を有する)をＮｏｔＩ及びＰｓｔＩで切断した。得られた断片(約０.４ｋｂ)を、プラスミドを直線化するためにＮｏｔＩ及びＰｓｔＩで切断された断片１(ｐＵＣ１９のｍｃｓのＥｃｏＲ１歳とに最も近いオリゴ１上に導入された新たなＥｃｏＲ１部位を有する)を有するｐＵＣ１９プラスミド(ｐＴＭ００１)にライゲーションした。このライゲーション混合物を大腸菌ＤＨ１０Ｂを形質転換するために使用した。アンピシリン抵抗性のコロニーを選択し、そして含まれるプラスミドを単離し、そして制限酵素分析により特徴決定した。所望されるコンストラクト(ＬＤＨコード領域は欠失と導入されたＮｏｔＩ部位有する)についての予期される制限酵素パターンを有するプラスミド(ｐＴＭ００３)を同定し、そしてＭ１３ｍｐ１８リバース及びフォワードプライマーを用いてシーケンスをすることにより確かめた。

突然変異されたＬＤＨ遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩでの切断により、ｐＴＭ００３から切り出し、そしてアガロースゲル電気泳動により精製し、続いてＱＩＡｑｕｉｃｋゲル切り出しキットを用いてアガロースから(約０.８ｋｂ断片として)溶出した。当該断片を、クレノーポリメラーゼ(NEB、製品説明書に従う)で処理して、平滑末端を作成し、そしてｐＵＢ１９０ベクターに導入した。これは、ＸｂａＩで切断し、次にクレノー処理し、続いて上で記載されるようにゲル精製することにより直線化されたｐＵＢ１９０と平滑末端ライゲーションすることにより達成された。ライゲーション混合物は、大腸菌ＳＣＳ１１０(Stratagene)を形質転換するために使用した。アンピシリン耐性コロニーを選別し、そして含まれるプラスミドを単離し、そして制限酵素分析により特徴決定した。切断コンストラクトについて予期される制限酵素パターンを有するプラスミド(ｐＴＭ０１４)を同定し、そして実施例１に記載されるように電気穿孔プロトコルを用いて電気穿孔することにより、ＮＣＩＭＢ１１９５５を形質転換するために使用した。

二重交差による遺伝子置換ＬＤＨ突然変異体の作成と特徴決定
この様式で得られたｐＴＭ０１４の推定の第一組込み体(primary integrant)を用いて二重組換え体を得た(遺伝子置換)。これは、ＴＭ１５をカナマイシンを含まないＴＧＰ培地中で連続的に継代することにより達成された。５回の継代振盪培養物を用い、５４℃で８時間から５２℃で１６時間に変更し、２５０ｒｐｍで５ｍｌのＴＧＰを入れた５０ｍｌチューブ(Falcon)を用い、各段階で１％を移した。これらの５回の継代の後に、得られた培養物をＴＧＰ中で連続的に希釈し、そして５４℃でインキュベートするために１００μlのサンプルをＴＧＰアガープレートに撒いた。１２μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＴＧＰアガー上に得られたコロニーをレプリカ-プレートを用いて、カナマイシン感受性のコロニーを同定した。精製するためにアガー上に単一のコロニーをストリーキングしたのちに、これらのカナマイシン感受性誘導株を、乳酸産生について試験し、そして予期されるように、ＬＤＨ⁺及びＬＤＨ^-の混合物であることが証明された。１のＬＤＨ^-誘導株であるＴＭ８９は、さらにＰＣＲ及びサザンブロットにより特徴決定された。

ゲノムＤＮＡをＴＭ１５(第一組込み体)及びＴＭ８９(推定の二重組換え体ＬＤＨ^-)から製造し、そして上で記載される条件を用いて、プライマー１及び４を使用してＰＣＲ用のテンプレートとして使用した。１１９５５由来のゲノムＤＮＡを対照として用いた。ＰＣＲ産物(約０.８ｋｂバンドを全ての３個のテンプレートから得た)をアガロースゲル電気泳動により精製し、そしてＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いてアガロースゲルから溶出した。サンプルをＮｏｔＩで切断し、そして０.７％アガロースゲル上で電気泳動して生成物を可視化した。１１９５５のＰＣＲ産物は、予期される様にＮｏｔＩ切断の証拠を示さない一方、ＴＭ８９のＰＣＲ産物は、０.４ｋｂ付近の２個のバンドを与え、突然変異されたアレルを有する野生型の遺伝子の置換を指す。第一の組み込み体であるＴＭ１５のＰＣＲ産物のＮｏｔＩ切断は、主に、ＴＭ８９で見られる２個のバンドと、微量の未切断バンド(０.８ｋｂ)についてのバンドを与える。これは、ＴＭ１５ゲノムＤＮＡのサザンロットで得られる結果により説明できる。

１１９５５のゲノムＤＮＡ、ＴＭ１５及びＴＮ８９をＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ及びＮｏｔＩ、並びにＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩで切断し、そしてアガロースゲル電気泳動にかけた。ＤＮＡを正に荷電されたナイロン膜(Roche)に転写し、そしてＤＩＧ標識プローブとハイブリダイズさせた。当該ＤＩＧ標識プローブは、製品説明書(Roche Molecular Biochemicals DIG 増幅マニュアル)に従ってプライマー１及び４をＤＩＧ標識ｄＮＴＰと供に用いて１１９５５ＬＤＨ遺伝子をＰＣＲすることにより作成された。ハイブリッドを形成したバンドを、市販される検出キットを用いて可視化した(Roche)。サザンブロットにより、ＴＭ１５をＮｏｔＩで切断した際の約７.５ｋｂの多く増幅されたバンド、ＴＭ１５をＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ及びＰｓｔＩ／ＮｏｔＩで切断した際の約７及び０.４ｋｂの同様に増幅されたバンドの証拠が示され、第一組込み体におけるＬＤＨ位に組み込まれたｐＴＭ０１４の複数のタンデムコピーの組込みを指し示す。３種の制限酵素切断の全てについて、ＴＭ８９は、１１９５５に比べて追加されたハイブリッド形成バンドを示す異なる制限酵素パターンを示し、遺伝子置換と一致した。

実施例３
野生型好熱菌によるエタノール生産
再現性のある増殖及び生成物の生産は、野生型好熱菌について、流加培養(fed batch)及び連続培養で達成された。表１、２、及び３は、発酵過程において使用される条件を示す。

実施例４
好熱菌によるエタノール生産の増加
好熱菌から標的エタノール収率及び生産力を達成するために、ｌｄｈ遺伝子の不活性化によるＬ-乳酸デヒドロゲナーゼ(ＬＤＨ)のノックアウトを通して乳酸産生を最小化した。ｌｄｈ遺伝子を不活性化するために２つのアプローチが取られた：マーカーＤＮＡの染色体のｌｄｈ領域への一重交差組換えを行って転写を防止すること、又はｌｄｈ遺伝子への相同領域への二重組換えを行って、遺伝子領域内に突然変異を作成して遺伝子を機能しないものとすることである。

一重交差アプローチは、野生型株と比べた場合、エタノール生産の増加を示すＬＤＨ陰性突然変異体を迅速に作成した。

ＬＤＨ突然変異体によるエタノール生産の改善
ＬＤＨ活性のノックアウトから得られるエタノール生産の増加を計測するために作られた最小培地中で、ＬＤＨ陰性突然変異体を流加培養で増殖させた。ＬＤＨ突然変異体の代謝プロファイルの変化が表５に示され、野生型株の最適エタノール生産と比較される。表６は、ＬＤＨ活性のノックアウトにより引き起こされるエタノール生産の増加を示す。

ＬＤＨ変異体は、野生型好熱菌に比べて有意に高いエタノール収量を産生し、これらの好熱菌の代謝をうまく経路変更したことを示す。ＬＤＨ突然変異株についての培養条件と培地内容物の更なる最適化は、高いエタノール収率をもたらすであろう。

実施例５
実施例２に説明される方法を用いて、ｌｄｈ変更を単離体ＮＣＩＭＢ４１２７７に行った。同じ形質転換プロトコルを用いたが、形質転換効率は、(実施例２では５２℃でインキュベートされるのに対して)リカバリーにおいて５５℃でインキュベートすることにより最適化された。第一組み込み体を連続継代を２ＴＹ培地で行って、ｌｄｈ-陰性の表現系を有する二重交差突然変異体を得た。安定したノックアウト株４１２７７ＫＯ４を流加培養及び連続発酵において特徴決定した。結果を表７に示す。変異体４１２２７ＫＯ４は、野生型代謝に比べて有意に高いレベルのエタノール生産レベルを有した。変異体は、培養物中で安定であり、そして野生型に戻ることはなかった。

野生型単離株の全てについてのエタノールデータを表８に示し、単離株がエタノールを野生型形態で産生することを示す。これは、このタイプの多くの野生型微生物がエタノールを産生しないので予期しないことである。

本発明は添付の図面を参照して記載される。

図１は、ｐｕＢ１９０及びｐｕＢ１９０-ｌｄｈについてのプラスミドマップの図である。

Claims (5)

1. ＮＣＩＭＢ番号第４１２７７号、第４１２７８号、第４１２７９号、第４１２８０号及び４１２８１号で寄託された微生物であって、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を不活性化するように改変された、前記微生物。
2. 前記乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が欠失された、請求項１に記載の微生物。
3. エタノール生産における、請求項１又は請求項２に記載の微生物の使用。
4. エタノール産生を増加させるための微生物の改変方法であって、ＮＣＩＭＢ受託番号第４１２７７号、第４１２７８号、第４１２７９号、第４１２８０号、及び４１２８１号で寄託された好熱性微生物のいずれかを取得し、そして乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を不活性化することを含む、前記方法。
5. エタノール生産方法であって、請求項１又は請求項２に記載される微生物を、Ｃ５又はＣ６糖が存在する適切な条件下で培養することを含む、前記方法。

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