EA024979B1

EA024979B1 - Рекомбинантные бактерии и их применение для получения этанола

Info

Publication number: EA024979B1
Application number: EA201101627A
Authority: EA
Inventors: Жак Битон; Эстер Жербер
Original assignee: Деинов
Priority date: 2009-05-14
Filing date: 2010-05-12
Publication date: 2016-11-30
Also published as: US9034619B2; US9725741B2; US20150247167A1; EP2251415A1; CN102421890A; ZA201108288B; CN102421890B; AU2010247330A1; JP2012526537A; ES2642795T3; WO2010130806A1; EP2430150B1; EP2430150A1; AU2010247330B2; JP5766181B2; EA201101627A1; UA104467C2; BRPI1010810A2; CA2760727A1; DK2430150T3

Abstract

Изобретение относится к рекомбинантным бактериями и к их применению, в частности для получения этанола. Изобретение также относится к способам получения таких бактерий, а также к конструктам нуклеиновой кислоты, подходящим для такого получения. Изобретение в частности относится к бактериям, лишенным функционального гена ЛДГ и/или содержащим рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую ПДК и АДГ. Бактерии по настоящему изобретению могут быть получены из любых стрессоустойчивых бактерий.

Description

Изобретение относится к рекомбинантным бактериями и к их применению, в частности для получения этанола. Изобретение также относится к способам получения таких бактерий, а также к конструктам нуклеиновой кислоты, подходящим для такого получения. Изобретение конкретно относится к бактериям, утратившим функциональный ген ЛДГ (ЬЭН) и/или содержащим рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую ПДК (РИС) или АДГ (АЭН). Бактерии данного изобретения могут быть получены из любых стрессоустойчивых бактерий, особенно из штамма Оешососсик, включая экстремофильные штаммы, такие как, без ограничения перечисленным, Ό. гайюйитаик, Ό. деоШеттаПк, Ό. тиггауц Ό. се11и1окйуИсик или Ό. йекей.

Уровень техники

В уровне техники имеются сообщения о бактериях, обладающих способностью собирать заново свои геномы, разрушенные стрессом, таких как бактерии Эешососсик. Эешососсик является грамположительной бактерией, которая была выделена в 1956 году Аийегкои и соавторами. Этот экстремофильный организм устойчив к разрушению ДНК УФ и ионизирующими излучениями или перекрестносшивающим агентом (митомицином С) и переносит высыхание.

В νθ 01/023526 продемонстрирована необычная устойчивость Эешососсик к излучению и дополнительно предложены генно-инженерные модификации и применение в биоремедиации. В патентной заявке № νθ 2009/063079, не опубликованной до приоритетной даты настоящей заявки, показано, что бактерии Эешососсик могут противодействовать растворителям и могут трансформировать биомассу с образованием этанола.

Другие стрессоустойчивые бактерии раскрыты в патентной заявке № ЕР 09305041.7, в настоящее время не опубликованной, а также раскрыты способы их выделения и/или отбора и их способность продуцировать метаболиты, такие как антибиотики.

Генетически измененные грамположительные или штаммы СеоЬасШик были упомянуты в νθ 95/27064 и νθ 2006/131734. С промышленной точки зрения для этих штаммов не было раскрыто удовлетворительного продуцирования метаболитов. Более того, штаммы СеоЬасШик продуцируют споры, которые являются существенным недостатком для промышленного применения.

Изобретение демонстрирует, что геном стрессоустойчивых бактерий, особенно геном бактерий Эешососсик, можно модифицировать для улучшения их способности продуцировать этанол. Более конкретно, настоящее изобретение демонстрирует, что можно модифицировать метаболические пути в стрессоустойчивых бактериях, конкретно в бактериях Эешососсик для повышения эффективности продуцирования ими этанола.

Сущность изобретения

Объектом настоящего изобретения является рекомбинантная стрессоустойчивая бактерия, конкретно бактерия Эешососсик, с модифицированным геном, содержащим инактивированный ген Ьлактатдегидрогеназы (ЛДГ).

В конкретном воплощении ген ЛДГ удален, полностью или частично и не кодирует функциональный фермент лактатдегидрогеназу.

Рекомбинантная бактерия данного изобретения предпочтительно дополнительно содержит рекомбинантную молекулу кодирующую пируватдекарбоксилазу (ПДК) и/или алкогольдегидрогеназу (АДГ).

В связи с этим дополнительным объектом изобретения является рекомбинантная стрессоустойчивая бактерия, конкретно бактерия Эетососсик, которая содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту, предпочтительно плазмиду, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую пируватдекарбоксилазу и/или алкогольдегидрогеназу.

Бактерия изобретения может быть выбрана из различных видов стрессоустойчивых бактерий, таких как Эешососсик, ТерШтоиак, Тгиерега, РотрйугаЬас1ег, ИоуокрЫидоЬшт или ЕхщиоЬасЮгшт. Предпочтительными бактериями данного изобретения являются бактерии Эешососсик, такие как, без ограничения перечисленным, Ό. гаШойигаик, Ό. деойеттаПк, Ό тштауц Ό. сеПШокйуйсик или Ό. йекей, предпочтительно термофильная бактерия Эешососсик.

Дополнительный объект данного изобретения представляет собой способ получения биотоплива, особенно этанола, который включает культивирование определенной выше бактерии в присутствии соответствующего субстрата, и сбор биотоплива.

Изобретение также относится к применению определенной выше бактерии для получения этанола.

Изобретение также относится к способу получения рекомбинантной стрессоустойчивой бактерии, конкретно определенной выше бактерии Эешососсик, или ее предшественника, который включает обеспечение (родительской) стрессоустойчивой бактерии, конкретно бактерии Эешососсик; обработку бактерии для инактивации гена ЛДГ, и отбор бактерии, имеющей инактивированный ген ЛДГ.

Изобретение также относится к способу получения рекомбинантной стрессоустойчивой бактерии, конкретно определенной выше бактерии Эешососсик или ее предшественника, который включает обеспечение (родительской) стрессоустойчивой бактерии, конкретно бактерии Эетососсик, введение в указанную бактерию молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей

- 1 024979

ПДК и/или АДГ, и отбор бактерии, которая экспрессирует указанную нуклеиновую кислоту. Изобретение также относится к плазмидному конструкту, который реплицируется в бактерии Иешососсик и содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую ПДК и/или АДГ.

Перечень фигур

Фиг. 1 - конструкция и структура интегрируемого конструкта ρΌΚ-ΕΌΗάβΙ для частичной делеции ЛДГ. Вставку с гомологичными областями и кассетой хлорамфеникола синтезировали и клонировали в Ь1ТМи8281. Сат¹/ устойчивость к хлорамфениколу; Атр¹/ устойчивость к ампициллину; СОВ_1сгт85. предполагаемый терминатор траскрипции Иешососсик габюбигапк; Р Ό. габ., предполагаемый промотор Иешососсик габюбигапк; 5'ΗΚ, 5'-гомологичная область; 3'ΗΚ, З'-гомологичная область; Е. сой ΘΚΙ, точка начала репликации ЕксйейсЫа сой;

фиг. 2 - последовательности 5' (§ЕЦ ГО N0: 1) и 3' (§ЕЦ ГО N0: 2) гомологичных областей;

фиг. 3 - способ конструирования мутантов Эетососсик габюбигапк по Ь-лактатдегидрогеназе (1осик

ΌΚ_2364) с помощью гомологичной рекомбинации. Сат¹/ устойчивость к хлорамфениколу; Атр¹/ устойчивость к ампициллину; 5' ΗΚ, 5'-гомологичная область; 3' ΗΚ, 3'-гомологичная область; Е. сой 0ΚΙ, точка начала репликации ЕксйейсЫа сой;

фиг. 4 - нуклеотидные последовательности генов 2тРИС (§ЕЦ ГО N0: 3) и ΖιηΑΌΗ II (§ЕЦ ΙΌ N0: 4); фиг. 5 - конструирование и структура плазмид ρΙ3-ΌΒ-Ρ-Ρ0ί’-ΑΌΗ (а), ρΙ3-0Β-Ρ-Ρ0ί’1;·ι§-ΑΌΗΐ;·ι§ (Ь), ρΙ3-ΌΒ-Ρ-Ρ0ί’-Ρ-ΑΌΗ (с) и ρΙ3-ΌΒ-Ρ-ΡΟΟ;·ι§-Ρ-ΑΌΗΐ;·ι§ (б), КВ§ §гоЕ§Ь орегоп, участок связывания с рибосомой, расположенный выше оперона дгоЕ§Ь Иешососсик габюбигапк (Мета е1 а1, 2001) ; Атр^к, устойчивость к ампициллину; Сат¹/ устойчивость к хлорамфениколу; Е. сой 0ΚΙ, точка начала репликации ЕксйейсЫа сой ; Р1иГА, 432 п.о., расположенные выше предсказанного старт-кодона начала трансляции гена 1иГА; Р1иГВ, 234 п.о., расположенные выше предсказанного старт-кодона начала трансляции гена 1иГВ; ΖтΡ^С, ген пируватдекарбоксилазы Ζутотоηак тоЬШк; ΖтА^Η, ген алкогольдегидрогеназы II Ζутотопак тоЬШк; Тегт85, межгенная последовательность, расположенная между локусами ΌΚ_1184 и ΌΚ_1185, содержащая предполагаемый терминатор транскрипции; Тегт116, терминатор транскрипции Тегт116 (ЬесоШе е1 а1, 2004); Ό. габ. 0ΚΙ, точка начала репликации Иешососсик габюбигапк; Ρ Ό. габ., промотор Иешососсик габюбигапк;

фиг. 6 - активность алкогольдегидрогеназы в Ό. габюбигапк трансформированной рк3-0Р-Р-Р0С-РΑΌΗ (а) или р|3-|)Н-Р-Р1)С1ау-Р-А1)111ад (Ь);

фиг. 7 - модернизированный метаболический путь;

фиг. 8 - тройное лигирование продуктов ПЦР для создания мутанта ПДК+АДГ+ЛДГ. Сат¹/ устойчивость к хлорамфениколу; РШГА, 432 п.о., расположенные выше предсказанного старт-кодона начала трансляции гена 1иГА; РШГВ, 234 п.о., расположенные выше предсказанного старт-кодона начала трансляции гена ШГВ; ΖтΡ^С, ген пируватдекарбоксилазы Ζутотоηак тоЬШк; ΖιπΑΟΗ, ген алкогольдегидрогеназы II Ζутотопак тоЬШк; Тегт85, межгенная последовательность, расположенная между локусами ΌΚ_1184 и ΌΚ_1185, содержащая предполагаемый терминатор транскрипции; Тегт116, терминатор транскрипции Тегт116 (ЬесоиНе е1 а1, 2004); Р Ό. габ., предполагаемый промотор Иешососсик габюбигапк; 5' ΗΚ, 5'-гомологичная область; 3' ΗΚ, 3'-гомологичная область.

Табл. 1 - названия рекомбинантов, использованных для метаболического анализа.

Табл. 2-5 - рекомбинанты Иешососсик: продуцирование метаболитов в комплексной среде или среде определённого состава.

Подробное описание изобретения

Изобретение относится к рекомбинатным стрессоустойчивым бактериями и к их применению для получения биотоплива и других метаболитов.

В пределах контекста данного изобретения термин стрессоустойчивая бактерия означает более конкретно бактерию, обладающую способностью пересобирать свой геном, полностью или частично, при разрушении под действием стресса. Стресс может быть любым воздействием, разрушающим клетку и повреждающим ДНК, т.е. воздействием, которого достаточно для того, чтобы вызвать 90% или большую клеточную смерть в культуре бактерий Е. сой. Еще более предпочтительно, если воздействие, разрушающее клетку и повреждающее ДНК, является воздействием, достаточным для снижения бактериального титра в культуре Е. сой по меньшей мере на 2 логарифмические единицы. Примеры такого воздействия включают облучение, предпочтительно повторяющееся и непрерывное облучение УФ, и/или применение генотоксичных агентов. Предпочтительным стрессовой воздействием является воздействие УФ от 0,5 до 400 мДж/см², более предпочтительно от 1 до 200 мДж/см², как правило от 1 до 100 мДж/см², применяемое в течение периода времени от 5 с до 5 мин. Предпочтительным воздействием УФ является 4 мДж/см² в течение 30 с, которое может быть повторено в период времени от 1 до 8 ч, предпочтительно от 3 до 5 ч, а более предпочтительно около 4 ч. Конкретные стрессовые воздействия на клетки в соответствии с изобретением были описаны в неопубликованной патентной заявке № ЕР 09305041.7, которая включена в данный документ ссылкой.

Устойчивые к клеточному стрессу бактерии в соответствии с настоящим изобретением включают более конкретно бактерии Пешососсик, Тер1б1топак, Тгиерега, РогрйугаЬас1ег, ШуокрйтдоЬтт или Ех- 2 024979

1диоЬас1спит. Предпочтительными бактериями данного изобретения являются бактерии Пешососсик, такие как, без ограничения перечисленным, Ό. табюбигапк, Ό. деоШеттаБк, Ό тштауц Ό. се11и1окбу!1сик или Ό. бекетй, предпочтительно термофильная бактерия Пешососсик.

Было показано, что бактерии Пешососсик обладают способностью пересобирать свой геном, полностью или частично, при разрушении под действием стресса. Как упомянуто выше, эти бактерии, особенно Ό. табюбитаик, были предложены для биоремедиации. Способность бактерий Пешососсик производить продукты для биоэнергетики из биомассы раскрыта в \УО 2009/063079, не опубликованной на момент приоритетной даты настоящего изобретения. Настоящее изобретение в настоящее время демонстрирует, что эффективность стрессоустойчивых бактерий, таких как бактерии Пешососсик, может быть улучшено модификацией метаболических путей с помощью рекомбинантных технологий. Более конкретно, изобретение обеспечивает новые рекомбинантные стрессоустойчивые бактерии, имеющие модифицированный путь биосинтеза этанола.

В данном аспекте изобретатели разработали и создали новые биосинтетические пути в стрессоустойчивых штаммах бактерий, которые базируются на изменении пути конверсии пирувата. Более конкретно, авторы разработали новые рекомбинантные штаммы, в которых пируват эффективно используется в качестве субстрата для получения этанола. В связи с этим авторы вставили один или несколько ферментов (или соответствующих генов), которые вызывают или катализируют конверсию пирувата в этанол. Авторы также удалили эндогенный путь, который использует пируват для получения лактата, что, тем самым, увеличило количество пирувата, вовлеченного в путь синтеза этанола.

Задача изобретения, таким образом, относится к (рекомбинантной или генетически модифицированной) стрессоустойчивой бактерии, конкретно к бактерии Пешососсик, которая содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую ПДК.

Термин рекомбинантная бактерия обозначает бактерию, которая содержит модифицированный геном как результат или делеции и/или вставки гетерологичной (например, не присутствующего естественно в указанной бактерии) последовательности или молекулы нуклеиновой кислоты. Рекомбинантная нуклеиновая кислота, следовательно, означает нуклеиновую кислоту, которая была сконструирована и которая не встречается в бактериях дикого типа.

Другая задача изобретения, таким образом, относится к (рекомбинантной или генетически модифицированной) стрессоустойчивой бактерии, конкретно к бактерии Пешососсик, которая содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую АДГ.

В дополнительном предпочтительно воплощении, изобретение относится к (рекомбинантной или генетически модифицированной) стрессоустойчивой бактерии, конкретно к бактерии Пешососсик, которая содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую ПДК и АДГ.

Другая задача настоящего изобретения относится к (рекомбинантной или генетически модифицированной) стрессоустойчивой бактерии, конкретно к бактерии Пешососсик, которая имеет модифицированный геном, содержащий инактивированный ген лактатдегидрогеназы (ЛДГ).

Наиболее предпочтительная задача данного изобретения заключается в (рекомбинатной или генетически модифицированной) стрессоустойчивой бактерии, конкретно бактерии Пешососсик, которая имеет модифицированный геном, содержащий инактивированный ген лактатдегидрогеназы (ЛДГ), а также указанная бактерия содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую ПДК и/или АДГ.

Пируватдекарбоксилаза (ПДК, ЕС: 4.1.1.1) катализирует моноокислительное декарбоксилирование пирувата в ацетальдегид и диоксид углерода. Алкогольдегидрогеназа (АДГ, ЕС: 1.1.1.1) катализирует конверсию ацетальдегида в этанол.

В целях создания или улучшения данного метаболического пути молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую ПДК и/или АДГ клонировали и успешно интродуцировали в стрессоустйчивую бактерию, конкретно в штамм Пешососсик. Термин нуклеиновая кислота предпочтительно обозначает ДНК, хотя рекомбинантная нуклеиновая кислота может быть РНК. В зависимости от ситуации, молекула нуклеиновой кислоты может быть двух- или одноцепочечной.

Более конкретно, была получена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональную ПДК. Такая молекула нуклеиновой кислоты может содержать всю или часть последовательности естественного или синтетического или мутантного гена ПДК, при условии, что молекула нуклеиновой кислоты кодирует белок, который катализирует моноокислительное окисление пирувата в ацетальдегид и диоксид углерода.

ПДК присутствует в растениях, грибах и дрожжах, но является редкой в бактериях. ПДК не была найдена в геноме Ό. табюбитаик, который был полностью секвенирован. Гены ПДК были выявлены во множестве штаммов, таких как 2утотоиак тоЬШк (Вгаи апб Байт, 1986 ; Сотгау е! а1, 1987а ; №а1е е! а1, 1987), Асе!оЬас!ег рак!ешгапик (СепЬапк: ΆΕ368435) (Сйапбга е! а1, 2001), §атсша уеШпсиП (СепЬапк: ΆΕ354297) (йоге апб 2е1кик, 1992) и 2утоЬас!ет ра1тае (СепЬапк: ΆΕ474145) (Ка.) е! а1, 2002).

В предпочтительном воплощении нуклеиновая кислота ПДК содержит последовательность всего или части бактериального гена ПДК. В конкретном воплощении нуклеиновая кислота включает последовательность гена ПДК из 2утотопак тоЬШк (ΖιπΡΌΠ ΖΜΟ 1360). Последовательность гена ΖιπΡΌΟ.’ состоит из 1707 пар оснований и представлена на фиг. 4.

- 3 024979

Более того, для создания активности АДГ в стрессоустойчивых бактериях, таких как Пешососсиз, была подготовлена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный АДГ. Такая молекула нуклеиновой кислоты может содержать всю или часть последовательности естественного или синтетического или мутантного гена АДГ при условии, что молекула нуклеиновой кислоты кодирует белок, который катализирует конверсию ацетальдегида в этанол.

Гены АДГ были клонированы из различных организмов, включая, без ограничения перечисленным, Ζνιηοιηοη;·ΐ5 тоЬШз (1пдгат е! а1, 1987), ЬасЮЬасШиз Ьгеей (Пи е! а1, 2007) или ОеоЬасШиз з!еато!йегторййиз (ОепЬапк: Ζ25544) (Та1атюо е! а1, 2005). Предполагаемый ген АДГ (ΌΡ2279) также был обнаружен в геноме Ό. гайюйитапз. Однако отдельная его экспрессия, по всей видимости, не дает эффективного продуцирования этанола.

В предпочтительном воплощении нуклеиновая кислота АДГ содержит последовательность всего или части бактериального гена АДГ. В конкретном воплощении нуклеиновая кислота включает последовательность гена АДГ из Ζутοтοηа8 тоЬШз ^тАИН, ΖΜΟ1596). ΖιηΛΌΗ II состоит из 1152 пар оснований и его последовательность отображена на фиг. 4.

Эти нуклеиновые кислоты дополнительно могут содержать регуляторные последовательности или области, такие как, к примеру, промотор (например, промотор 1и1В) и терминатор. Промотор может быть эндогенным по отношению к хозяину (например, промотор из гена Оеиюсоссиз для клонирования рекомбинантной нуклеиновой кислоты изобретения в штамме Эешососсиз) или гетерологичным (например, другого происхождения, а именно, из другой бактерии, фага, синтетический или гибридный промотор и т.п.). Предпочтительными являются эндогенные промоторы. В связи с этим промоторы Эетососсиз изучали и применяли для генной экспрессии. Примеры таких промоторов включают Р!иТА и Р1и1В из Тигенов факторов элонгации трансляции !иТА (ΌΚ0309) и 1и1В (ΌΡ2050), промотор гена тезИ, кодирующий предполагаемую резольвазу, расположенную в р13, и промоторную область РдтоЕ§Ь оперона дтоЕ§Ь (Ьесош1е е! а1, 2004; Ме1та е! а1., 2001).

Нуклеиновые кислоты могут быть клонированы как отдельные сущности (например, в раздельных нуклеотидных конструктах) или в одном и том же конструкте под управлением различных промоторных областей или в опероне.

Примеры, представленные в настоящей заявке, раскрывают создание новых конструктов где ген ΖιηΡΌί’ и ген алкогольдегидрогеназы II из Ζутοтοηа8 тоЬШз ^тАИН) клонировали в одном и том же конструкте либо под управлением отдельных промоторов, либо в опероне. Эти конструкты с успехом были введены в штаммы Эешососсщ. что в результате дало продуцирование этанола указанными рекомбинантными штаммами, тогда как немодифицированный (родительский) штамм не продуцировал какоелибо количество этанола в тестируемых условиях.

Нуклеиновая(ые) кислота(ы) может быть вставлена в геном бактерии или вставлена в виде (автономно) реплицирующейся молекулы, например, в виде плазмиды, эписомы, искусственной хромосомы и т.п.

В типичном воплощении рекомбинантная нуклеиновая(ые) кислота(ы) клонирована в подходящий вектор, который может быть репликативным в Эешососсиз. Типичные плазмиды содержат в дополнение к клонированной вставке, селективный ген (например, устойчивости к антибиотику, краситель, и т.п.) и точку начала репликации, эффективную в Эетососсиз или позволяющую интегрировать в геном Пешососсиз. Плазмида (или рекомбинантные нуклеиновые кислоты) дополнительно может содержать регуляторные последовательности, такие как, например, промоторы, терминаторы и/или энхансеры.

Примеры таких векторов включают ρΜΌ66, р^, рРАО1 и рИЕ30. ρΜΌ66 является большим вектором (27 кЬ) для Ό. тайюйигапз и Е. сой, содержащим фрагмент р^, длиной 12 тыс. п.о. (Ла1у е! а1, 1994). р^ была описана Маз!егз и Мш!оп (1992). рРАО1 является Ό. тайюйитапз-Е. сой шаттл-плазмидой для Ό. Райюйитапз и Е. сой, содержащей минимальный репликон Ό. тайюйитапз (Ме1та апй Ыйзйот, 2000). рИЕ30 является эндогенной плазмидой, полученной из штамма Ό. тайюридпапз, которая способна реплицироваться в Эетососсиз (см. И82003/0175977).

Конкретная задача настоящего изобретения заключается в плазмидном конструкте, который реплицируется в стрессоустойчивой бактерии, конкретно в бактерии Пешососсиз, и содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую ПДК и/или АДГ. ПДК и АДГ, кодируемые нуклеиновыми кислотами могут находиться в опероне или в виде различных экспрессирующих единиц в одной и той же плазмиде или в разных плазмидах. Предпочтительные плазмиды данного изобретения кодируют ПДК и/или АДГ из Ζутοтопаз. Конкретными примерами плазмид данного изобретения являются рП-ОР-Р-РПС-АПН, рР3-0Р-РРПС1ад-АПН!ад, рП-Р-РПС-Р-АПН и рГ'-1)Р-Р-Р1)С1ау-Р-.А1)1 Над.

Рекомбинантная нуклеиновая кислота также может быть клонирована в интегрируемую кассету, подходящую для интеграции в геном бактерии Эешососсиз. Такая интегрируемая кассета содержит, как правило, рекомбинантную нуклеиновую кислоту, связанную (или фланкированную) одной или несколькими последовательностями, позволяющими интеграцию, предпочтительно сайт-направленную интеграцию. Такие последовательности могут быть, например, нуклеотидными последовательностями, гомологичными целевой области генома, что делает возможным интеграцию кроссинговером. В связи с этим конкретная бактерия изобретения содержит рекомбинантую нуклеиновую кислоту, кодирующую ПДК и/или АДГ интегрированную в геном, вместо всего или части эндогенного гена, кодирующего ЛДГ. В

- 4 024979 данном контексте термин часть гена ЛДГ означает любой сегмент гена, делеция которого достаточна для того, чтобы вызвать инактивацию гена в клетке.

Различные методы могут быть использованы для вставки рекомбинантной(ых) молекулы(ул) нуклеиновой кислоты в стрессоустойчивые бактерии, конкретно в Эешососсик. В частности, они могут быть вставлены естественной трансформацией (которая может быть дополнительно усилена в присутствии хлорида натрия) или электропорацией.

В связи с этим изобретение также относится к способу получения рекомбинантной стрессоустойчивой бактерии, конкретно определенной выше бактерии Эешососсик или ее предшественника, который включает обеспечение (родительской) стрессоустойчивой бактерии, конкретно бактерии Эеиюсоссих введение в указанную бактерию молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей

ПДК и/или АДГ, и отбор бактерии, которая экспрессирует указанную нуклеиновую кислоту. Рекомбинанты, содержащие вставки нуклеиновых кислот, могут быть отобраны в соответствии с известными методами, такими как устойчивость к антибиотикам.

Экспрессия соответствующих ПДК или АДГ может быть подтверждена количественной ПЦР, а продуцирование этих ферментов может быть подтверждено с помощью вестерн-блоттинг-анализа или с помощью ферментативных анализов, известных в данной области. Активность ПДК может быть измерена путем анализа восстановления ΝΑΌ+, а активность АДГ может быть измерена путем анализа восстановления ΝΑΌ+ или окисления ΝΑΌΗ, вследствие активности этих ферментов (Соигау е! а1, 1987а и Ь).

Как описано в примерах, были получены бактерии Эетососсик, содержащие рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую ПДК и АДГ. Эти бактерии, которые можно культивировать, жизнеспособны и стабильно содержат рекомбинантную нуклеиновую кислоту. Стабильность рекомбинантов предпочтительно является такой, что после 2 циклов роста более чем 95% трансформированных бактерий все еще содержат вектор. Результаты демонстрируют, что геномная вставка ПДК и АДГ стабильна даже после 2 циклов роста.

Эти бактерии продуцируют этанол и объединяют множество преимуществ в плане специфичности субстрата, условий культивирования и продуцирования метаболитов.

Кроме того, с целью дополнительного улучшения получения этанола, также были получены стрессоустойчивые бактерии, конкретно Эешососсик, в которых ген лактатдегидрогеназы становился неактивным.

Ген ЛДГ (лактатдегидрогеназы) вовлечен в превращение пирувата в лактат. Ген ЛДГ Ό. таФойитапк клонировали в 1996 Νήπιού и ^а!аиаЬе. Этот фермент представляет собой тетрамер, и его кристаллографическая структура была получена (С'осщеПе е! а1., 2007).

Авторы изобретения в настоящее время создали новую бактерию, в которой указанный фермент неактивен. В конкретном воплощении ген ЛДГ делетирован полностью или частично и не кодирует функциональный белок. Ген ЛДГ может быть инактивирован в указанной бактерии или в ее предшественнике путем гомологичной рекомбинации, заменой гена или направленным мутагенезом или с помощью любого другого метода, известного в данной области.

В предпочтительном воплощении ген ЛДГ инактивирован путем делеции по меньшей мере части указанного гена, который может быть заменен гетерологичной нуклеиновой кислотой (например, селективным маркером).

Ген ЛДГ состоит из 915 пар оснований. Он локализован между координатами 2362890 и 2363804 в геноме Эешососсик. Последовательность указанного гена доступна, например, под номером депе8ес|1799712. В предпочтительном воплощении бактерия по настоящему изобретению лишена указанного гена, предпочтительно, по меньшей мере, лишена его 100 последовательно расположенных нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 200, 300, 400 или 500. В примерах был получен дефектный штамм Эешососсик, который лишен 589 последовательно расположенных нуклеотидов гена ЛДГ. Этот штамм был получен путем двойного кроссинговера с использованием конкретного конструкта, содержащего маркерный ген, фланкированный двумя участками, гомологичными областям гена ЛДГ и (необязательно) областям участков, фланкирующих ген ЛДГ (см. фиг. 3). Типичные гомологичные участки должны быть достаточно длинными для того, чтобы была возможность гибридизации и кроссинговера, например, выше 200 нуклеотидов, предпочтительно более 300 нуклеотидов, как правило от 300 до 700. Такие конструкты представляют собой конкретную задачу настоящего изобретения (см. фиг. 1 и 2).

В этом отношении изобретение также относится к способу получения рекомбинантной стрессоустойчивой бактерии, конкретно определенной выше бактерии Эешососсик или ее предшественника, который включает обеспечение (родительской) стрессоустойчивой бактерии, конкретно бактерии Эешососсик; обработку бактерии для инактивации гена ЛДГ, и отбор бактерии, имеющей инактивированный ген ЛДГ.

Бактерию по настоящему изобретению можно культивировать и/или поддерживать в любой подходящей культуральной среде и в любом подходящем устройстве. Примеры такой среды включают ком- 5 024979 плексную среду с глюкозой или среду определенного состава, как описано в примерах, такую как, например, среду определенного состава с сахарозой, среду определенного состава с крахмалом. Подходящая среда также является коммерчески доступной.

Дополнительная задача настоящего изобретения относится к применению определенной выше бактерии при получении этанола или других метаболитов.

Изобретение также относится к способу получения биотоплива, конкретно этанола, причем способ включает культивацию определенной выше бактерии в присутствии соответствующего субстрата и сбор биотоплива.

Субстрат может представлять собой любую культуральную среду или различные типы биомассы или продукты, полученные из нее. В частности, биотопливо может быть получено из возобновляемых источников, особенно из растительной или животной биомассы, или из коммунально-бытовых и промышленных отходов.

Термин биотопливо согласно изобретению включает биотопливо первого поколения и/или биотопливо второго поколения. Биотоплива первого поколения получают из растительного и животного органического материала, предпочтительно из сахара, крахмала, растительного масла или из животных жиров. Главным источником для получения биотоплива первого поколения являются пищевые растения или их части. Биотопливо первого поколения включает растительное масло, биодизель, биоспирты, биогаз, синтетический газ и твердое биотопливо. Биоспирты включают этанол, пропанол и бутанол.

Биотопливо второго поколения получают предпочтительно из непищевых растений или из непищевых частей растений. Они включают непищевые зерновые культуры, отходы биомассы, стебли пшеницы, кукурузы и древесину.

Более предпочтительно, если способ по изобретению используется для получения этанола.

Способ по изобретению может быть осуществлен в реакторе для конверсии. Под термином реактор понимается соответствующий ферментационный чан или любое устройство или система для конверсии биомассы, специально разработанный для осуществления изобретения и, таким образом, в частности состоящий из биореакторов, биофильтров, дисковых биофильтров, и других газофазных и/или жидкофазных биореакторов, особенно таких, которые адаптированы для обработки биомассы или производных биомассы. Устройство, которое можно использовать в соответствствии с изобретением, может быть устройством непрерывной использования или устройством периодической загрузки.

В реакторе для осуществления способа по изобретению используется по меньшей мере одна бактерия по изобретению или бактериальный экстракт из нее, в то время как указанный реактор монтируется и оборудуется так, чтобы в нем были установлены и поддерживались такие физико-химические условия, при которых указанная бактерия является функциональной для обсуждаемого применения и при которых, необязательно был возможен бактериальный рост и предпочтительно возможно его стимулирование.

Способ может осуществляться в аэробных условиях, анаэробных или в микроаэробных условиях в зависимости от субстрата и бактерии. Преимущество изобретения относится к способности бактерий по изобретению противостоять стрессовым условиям, включающим присутствие этанола в культуральной среде. Способ по изобретению таким образом может осуществляться при температуре около 40°С или выше, конкретно при температуре в интервале 40-70°С; в условиях кислого рН, и/или в присутствии этанола.

Дополнительные аспекты и преимущества изобретения будут описаны в следующих примерах, которые следует рассматривать в качестве наглядных и которые не ограничивают объем притязаний данной заявки.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

Материалы и методы.

Бактериальные штаммы и условия роста.

Штаммы ЕксЬепсЫа соП (Е. соП) §08110, 1М109 или ΌΗ5α использовали для размножения плазмид. Их культивировали при 37°С и 200 об./мин в среде Бипа-ВеПаш (ЬВ) (на один литр: Триптон 10 г, дрожжевой экстракт 5 г, хлорид натрия 10 г). Твердую среду получали путем добавления агара 1,5%.

Иешососсик габюбигаик КТ (Ό. габюбигаик) культивировали при 30°С и при 200 об./мин. в ΤΟΥ или ΡΟΥ. Состав среды ΤΟΥ представлен ниже, на один литр: триптон (5 г), дрожжевой экстракт (1,5 г) и глюкоза (1 г). Состав твердой среды на один литр: триптон (5 г), дрожжевой экстракт (2,5 г), глюкоза (1 г) и агар (15 г). Состав среды ΡΟΥ представлен ниже, на один литр: пептон (10 г), дрожжевой экстракт (5 г) и глюкоза (1 г). Состав твердой среды на один литр: пептон (10 г), дрожжевой экстракт (5 г), глюкоза (1 г) и агар (15 г).

В среду БВ или ΤΟΥ добавляли, при необходимости, соответствующие антибиотики (хлорамфеникол в конечной концентрации 3 мкг/мл для трансформантов Ό. габюбигаик или ампициллин 100 мкг/мл для трансформантов Е. соИ).

Трансформация.

Трансформацию Е. соП проводили с использованием коммерческих компетентных клеток 8С8110 от §1га1адеие или 1М109 от Рготеда.

Для получения компетентных клеток Ό. габюбигаик свежую культуру в стационарной фазе разводили в 100 раз в 50 мл ΤΟΥ. Клетки выращивали до достижения ранней экспоненциальной фазы

- 6 024979 (ОЭ_600нм=0,3); осадок ресуспендировали в соответствующем объеме ледяного раствора 2хТСУ/10% об./об. Глицерин /30 мМ СаС1₂. Для трансформации целевое количество плазмидной ДНК добавляли к 100 мкл клеток. Смесь инкубировали 30 мин на льду перед тем, как переносить пробирки при 30°С. Через 90 мин инкубации при 30°С, к клеткам добавляли 900 мкл предварительно нагретой 2хТСУ. Трансформанты встряхивали при 200 об./мин и при 30°С в течение 20 ч. Их последовательно разводили и рассевали на соответствующие неселективные или селективные чашки с ΤΟΥ.

Манипуляции с ДНК.

Ь1ТМи8281 от Νονν Епд1апб Вю1аЪ8.

Минипрепаративное выделение плазмид из клеток Е. сой проводили с помощью набора реактивов системы очистки ДНК \У1/агб®Р1и5 δν тийргср® от Рготеда, а выделение средних масштабов проводили с использованием набора реактивов для очистки плазмидной ДНК №с1еоВопб® Хйа Μίάί Р1и8 ЕР от Масйетеу-№де1. Эти выделения осуществляли из 3-100 мл культуры Е. сой в стационарной фазе.

Для выделения плазмид из Ό. габюбитап8 50 мл клеток в стационарной фазе ресуспендировали в 0,5М ЭДТА и в 0,5М ЭДТА, насыщенном бутанолом. Через 15 мин инкубации при комнатной температуре осадок ресуспендировали в 0,5М ЭДТА и клетки помещали на 30 мин при 70°С. Осадок промывали дважды буфером для лизоцима (10 мМ ТЙ8 НС1, 5 мМ ЭДТА, 0,5М №С1) перед добавлением лизоцима в концентрации 5 мг/мл (в буфере для лизоцима). Образец инкубировали в течение 30 мин при 37°С перед добавлением РНКазы и протеиназы К. Смесь инкубировали в течение 1 ч при 56°С. Затем добавляли 200 мМ ΝηΘΗ к образцу, который переворачивали несколько раз для перемешивания; добавляли 3М ацетат калия к образцу, который переворачивали для перемешивания; смесь инкубировали в течение 10 мин на льду перед добавлением к надосадочной жидкости этанола; эту смесь инкубировали в течение 10 мин на льду и осадок промывали 70% этанолом. Высушенный осадок ДНК ресуспендировали в воде.

Проводили экстракцию геномной ДНК из Ό. габюбигап8 с помощью коммерческого набора реактивов Э№а8у® В1ооб апб Т188ие от Ц1адеп. Эти выделения осуществляли из 5 мл культур в стационарной фазе.

Олигонуклеотиды были синтезированы ЕигодеШес. Полимеразы, использованные для амплификации ПЦР, представляли собой ДНК-полимеразу ЭуУЛ/уте ЕХТ от Рит/уте8 или фермент Е\1еп8ог Н1-Р1бе1йу РСК Еп/уте от Тйетто Зшепййс. ПЦР-фрагменты очищали с помощью геля Χνί/агб δν Ое1 и системы очистки ПЦР-продуктов РСК С1еап-Ир δу8ΐет от Рготеда.

Т4 ДНК-лигазу (№ν Епд1апб Вю1аЪ8) применяли для лигирования ДНК.

Плазмидную ДНК или ПЦР-продукты гидролизовали ферментами рестрикции от №ν Епд1апб Вю1аЪ8.

Генетический материал (ПЦР-продукты или продукты гидролиза) разделяли электрофорезом в агарозном геле. ДНК оценивали количественно с помощью Вюрйо1оте1ег от ЕррепбогГ.

Синтезированные Оепеси81 Еигоре ДНК-вставки клонировали в соответствующий вектор.

Тест на активность алкогольдегидрогеназы.

мл парарозанилина ^1дта) в концентрации 2,5 мг/мл в абсолютном этаноле добавляли к 200 мл ЬВ-атара, содержащего 50 мг бисульфита натрия (Сопетау е1 а1, 1987Ъ). 2-суточные клетки Ό. габюбитап8, выращенные на чашках с ΤΟΥ-агаром (с добавлением, при необходимости, соответствующего антибиотика), рассевали на индикаторные чашки и инкубировали при 37°С в течение 2-3 ч.

Продуцирование метаболитов.

Этот метод дает возможность оценить способность генетически модифицированных микроорганизмов продуцировать представляющие интерес метаболиты из биомассы или из производного биомассы.

Тест проводили при 30°С.

Предварительные культуры (в стационарной фазе), полученные в комплексной среде с глюкозой (Сотр1е\ тебшт О1исо8е), высевали в 6мл обогащенной среды (высевали с плотностью 1% об./об.).

Проверенными обогащенными культуральными средами являются комплексная среда с глюкозой (Сотр1е\ Мебшт О1исо8е), среда определенного состава с сахарозой (Эейпеб Мебшт δис^08е), среда определенного состава с крахмалом (Эейпеб Мебшт δΕπΌι).

Комплексная среда с глюкозой содержит: пептон 2 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л и глюкозу 10 г/л в осмозированной воде: раствор стерилизовали автоклавированием (15 мин при 120°С). К этому раствору добавляли следующие растворы: буферный раствор МΟРδ (10х) рН7 [кислый МΟРδ 400 мМ, ΝΗ₄Ο 200 мМ, №ОН 100 мМ, КОН 100 мМ, СаС1₂ 5 мМ, №₂δΘ₄ 2,76 мМ, МдС1₂ 5,28 мМ]; микроэлементы (10000х) ^Н₄)₆(Мо₇)₂₄ 3 00 мМ, Н₃ВО₃ 4 мМ, СоС1₂ 0,3 мМ, ΟυδΘ₄ 0,1 мМ, МпС1₂ 2,5 мМ, Ζ^Θζ, 0,1мМ]; РеС1₃ (100х) 2 мМ в С₆Н₅№1₃,О- 20 мМ; К₂НРО₄ 1 г/л: растворы стерилизовали фильтрацией (0,2 мкм).

Среда с определенным составом содержит: источник углерода 10 г/л в осмозированной воде: раствор стерилизовали автоклавированием (15 мин при 120°С). К этому раствору добавляли следующие растворы.

Буферный раствор МΘРδ (10х) рН7 [кислый МΘРδ 400 мМ, N40 200 мМ, №ЮН 100 мМ, КОН 100 мМ, СаС1₂ 5 мМ, №₂δΘ₄ 2,76 мМ, МдС1₂ 5,28 мМ]; микроэлементы (10000Х) [(NН₄)₆(Мо7)₂₄ 3 00 мМ, Н₃ВО₃ 4 мМ, СоС1₂ 0,3 мМ, ΟυδΘ₄ ОД мМ, МпС1₂ 2,5 мМ, Ζ^Θζ, 0,1 мМ]; РеС1₃ (100х) 2 мМ в С<Ц₅№₃О7

- 7 024979 мМ; К₂НРО₄ 1 г/л: растворы стерилизовали фильтрацией (0,2мкм).

К этим культуральным средам за исключением сред для штаммов дикого типа перед рассеванием добавляли хлорамфеникол: 3 мкг/мл культуральной среды.

Культуры вели как в аэробных, так и в анаэробных условиях (Вютепеих, ОепЬад).

Культуры в аэробных условиях оставляли в инкубаторе при 30°С при перемешивании в течение 7 дней. Затем культуры центрифугировали в течение 10 мин при 4000 об./мин. Надосадочные жидкости фильтровали (0,2 мкм), переливали в другие пробирки и помещали на -80°С.

Культуры в анаэробных условиях оставляли в инкубаторе при 30°С в течение 4 недель. Культуры затем центрифугировали в течение 10 мин при 4000 об./мин. Надосадочные жидкости фильтровали (0,2 мкм), переливали в другие пробирки и помещали на -80°С.

Газовая хроматография с пламенно-ионизационным детектором (Оак СйготаЮдгарйу РГО апа1ук1к) (Уапап С.'Р-\УАХ 57 СВ колонка 25 мх0,32 мм) использовали для количественной оценки спиртов. Органические кислоты оценивали количественно с помощью капиллярного электрофореза (5 мМ 2,6пиридиндикарбоновая кислота 0,5 мМ, цетилтриметиламмоний бромид; буферы с регуляцией рН до 5,6/61 см длина, 50 мкм диаметр капилляра ЛдПеШ). Остаточную глюкозу оценивали количественно с помощью ВЭЖХ, совмещенной с рефрактометрией (Рйепотепех ΩυΝΑ 3 мкм ΝΗ₂ 100А колонка 150x4,6 мм, подвижная фаза ацетонитрил/Н₂О 85:15).

Пример 1. Делеционные мутанты Эешососсщ табюбитапк К1 по Ь-лактатдегидрогеназе (ЛДГ).

ЛДГ-Мутанты из Эеиюсоссщ табюбитапк К1 (Ό. табюбитапк) дикого типа получали следующим образом.

a. Конструкт для делеции ЛДГ (рПК-ЬПНбе1).

Заявители создали новый конструкт, названный рПК-ЬПНбе1, для частичной делеции гена ЛДГ (ΩΚ_2364) в диком типе Ω. табюбитапк (см. фиг. 1). Для этого заявители использовали каркас плазмиды Ь1ТМи8281, которая реплицируется в Е. сой, но не реплицируется в Ό. табюбитапк. Синтезированную ДНК-вставку клонировали в ЫТМи8281; эту вставку получали из кассеты, содержащей ген устойчивости к хлорамфениколу (Сат^К) (1344 нуклеотида) и из 5'- и 3'-фланкирующих гомологичных участков (537 нуклеотидов и 615 нуклеотидов), помещенных, соответственно, в 5' и в 3'-области данной кассеты (фиг. 2). Конструкт рПК-ЬПНбе1 получали путем замены 589 нуклеотидов гена ЛДГ (некоторые из этих 589 нуклеотидов кодируют остатки, вовлеченные в катализ) на кассету Сат^К.

b. Создание мутантов, дефицитных по ЛДГ.

Ό. табюбитапк дикого типа трансформировали плазмидой рПК-ЬПНбе1 согласно процедуре, описанной в материалах и методах, для создания нокаутных мутантов. Трансформанты отбирали на среде ТОУ с добавлением хлорамфеникола.

Замену части гена ЛДГ на кассету с геном устойчивости к хлорамфениколу (фиг. 3) контролировали ПЦР с соответствующими праймерами, которые отжигаются на участке кассеты с геном устойчивости к хлорамфениколу. Два клона с двойным кроссинговером, названных 03-04/8-1 и 03-04/11-2, отбирали для анализа метаболитов (табл. 1).

При гомологичной рекомбинации полученная в результате бактерия содержала делецию из 589 нуклеотидов, которые были заменены на кассету Сат^К. Геномные участки 03-04/8-1 и 03-04/11-2, бывшие частью гена ЛДГ, замененной на кассету Сат^К, были частично секвенированы.

Пример 2. Продуцирование пируватдекарбоксилазы и алкогольдегдрогеназы в Ό. Кабюбитапк.

Штаммы Ό. табюбитапк, продуцирующие пируватдекарбоксилазу (2тРЭС) и алкогольдегидрогеназу (2тАЭН) из 2утотопак тоЬШк, создавали следующим образом.

а. Создание конструктов, несущих гены, ответственные за продуцирование этанола.

Было создано четыре конструкта для продуцирования этанола в клетках Ω. табюбитапк (см. фиг. 2).

Для первого конструкта под названием р13ГОК-Р-РПС-АПН ген пируватдекарбоксилазы (УтРЭС. ΖΜΟ1360) и ген алкогольдегидрогеназы II (2тАЭН, ΖΜΟ1596) из Ζутотоηак тоЬШк киЬкр. МоЬШк ΖΜ4 (фиг. 4) помещали в оперон и клонировали по сайтам ВатН1 и §аЛ репликативной в Ό. табюбитапк плазмиды р13 (Мак1етк апб Мш!оп, 1992) (см. фиг. 5). Вектор р13 придает устойчивость к хлорамфениколу в Ό. табюбитапк. Участок из 432 пар оснований, расположенный выше старт-кодона начала трансляции фактора элонгации Ти 1иГА (ΩΡ_0309) и содержащий промоторную активность (Ьесош1е е1 а1, 2004), помещали перед опероном Ζη^ΩΤ^-ΑΩ^ Между генами Ζη^Ωί.’ и ΖιηΑΩΒ присутствует спейсер в виде рибосомной связывающей последовательности (КВ§) из оперона дгоЕЗЬ Ω. табюбитапк (Мета е1 а1, 2001), помещенного перед кодоном инициации трансляции ΖιηΑΩΒ. Терминатор транскрипции Тегт116 Ω. табюбитапк (Ьесош1е е1 а1, 2004) помещали в 3'-области по отношению к гену ΖιηΑΩΒ. Создавали второй конструкт, полученный из рI3-^К-Р-Р^С-Α^Н, который назвали рI3-^К-Р-Р^Сΐад-Α^Нΐад. В этом конструкте Ык-фрагмент (6 гистидинов) помещали в С-конец ΖтР^С и с-тус-фрагмент (ΕρΚΡΙδΕΕΩΡ) помещали в С-конец ΖιηΑΩΒ (фиг. 5).

Для конструкта рI3-^К-Р-Р^С-Р-Α^Н участок, содержащий предполагаемый терминатор транскрипции, названный Тегт85, помещали ниже гена Ζη^ΩΟ а 234 нуклеотида, расположенные выше старт-кодона начала трансляции фактора элонгации Ти 1иГВ (ΩΚ 2050) (который соответствует промо- 8 024979 торному участку 1иГВ, Ьесош1е с1 а1, 2004), помещали между Тегт85 и геном ΖιηΑΌΗ (фиг. 5). Последний конструкт получали из ρΙ3-Ρ-ΡΌΟ-Ρ-ΑΌΗ и давали название ρΙ3-ΌΚ-Ρ-ΡΌθ3§-Ρ-ΑΌΗία§; в этом векторе, Ык-фрагмент (6 гистидинов) помещали в С-конец гена ΖιηΡΌί'.’ и с-тус-фрагмент (ЕЦКиЗЕЕПЬ) помещали в С-конец гена ΖтΑ^Η (фиг. 5).

Ъ. Создание штаммов Ό. тайюйигаик, продуцирующих ΖιηΡΌί'.’ и ΖтΑ^Η.

Компетентные клетки Ό. тайюйигапк трансформировали различными конструктами, несущими гены ΖιηΡΌί'.' и ΖтΑ^Η. Трансформанты отбирали по устойчивости к хлорамфениколу. Присутствие плазмиды контролировали амплификацией ПЦР со специфичными праймерами или с помощью ферментативного гидролиза конструкта, выделенного из клонов Ό. тайюйигапк. Для каждого из 4 конструктов по два клона использовали для метаболических исследований (табл. 1).

Пример 3. Создание интегративных ЛДГ-мутантов Эешососсик тайюйигаик, продуцирующих ΖιηΡΌί'.’ и ΖιιιΑΙΙΙ I.

589 нуклеотидов гена ЛДГ (ЭК_2364) заменяли в клетках Ό. тайюйигапк дикого типа на кассету с геном устойчивости к хлорамфениколу, за которой следуют гены ΖιηΡΌί'.' и ΖтΑ^Η, соответственно, под контролем промоторов ΡΐιιΓΑ и ΡΐιιΓΒ.

С целью создания данного мутанта ПДК+ЛДГ+ЛДГ- 3 следующие нуклеотидные последовательности амплифицировали с помощью ПЦР

5'-фланкирующую гомологичную область, за которой следует кассета с геном устойчивости к хлорамфениколу, амплифицировали с помощью праймеров ЕС31Р и ЕС32К (см. список ниже) с использованием рЭК-РЭНйе1 в качестве матрицы.

Последовательность Ρ-ΡΌί.’-Ρ-ΑΌΗ амплифицировали с помощью праймеров ЕС33Р и ЕС34К (см. список ниже) с использованием ρΙ3-Ρ-ΡΌί'.'-Ρ-ΑΌΗ в качестве матрицы 3'-фланкирующую гомологичную область амплифицировали с помощью праймеров ЕС35Р и ЕС36К (см. список ниже) с использованием рЭК-РЭНйе1 в качестве матрицы.

Список праймеров

Е031Р	5Εζ>ΙϋΝΟ:5	5-ТТССССОССТОООТАТСАСОТС-З'
ЕО32К.	5Ε<3η>ΝΟ:6	5-СТСООАТССТТСАСАСТТСТССОСССССТСС-З’
ЕОЗЗР	δΕί^ΙΟΝΟ :7	5' -ОАООаАТССОТСОООТаТСОАОСАТССТОАТС-З'
ЕС34Я	$Е(ЗЯЖО:8	5'-ССТССТ<ЗСАОТТСТПТТССААТАААСАААААСАААААААССССС-3’
ЕО35Р	ЗЕрГОЪЮ :9	З'-ОАОАСТОСАОТОСААСОАОСАООТОСОСОСС-З¹
ЕО36К	8Ер ΙΒΝΟ:10	5-АСОСОТОАОСАААОООСООСО^'

Продукт лигирования этих трех ампликонов использовали для трансформации Ό. тайюйигапк для получения мутанта ПДК+АДГ+ЛДГ- (фиг. 8). Трансформанты отбирали по устойчивости к хлорамфениколу. Частично делетированный ген ЛДГ, геномную вставку гена устойчивости к хлорамфенколу и гены ΖιηΡΌί'.' и ΖтΑ^Η контролировали с помощью ПЦР с использованием соответствующих праймеров. Два клона с двойным кроссинговером, названные 18-06/1-1 и 18-06/1-3, отобрали для анализа метаболитов (табл. 1 и 4).

Пример 4. Рекомбинанты Эешососсик тайюйитапк К1. Активность алкогольдегидрогеназы.

Продуцирование альдегида и активность АДГ с помощью колориметрического теста согласно Соп\уау и соавторам (1987Ъ) заявители определяли в различных рекомбинантах, трансформированных плазмидами, содержащими гены ΖιηΡΌί'.' и ΖтΑ^Η. Этот тест основан на образовании фиолетового основания Шиффа после взаимодействия ацетальдегида, продуцируемого АДГ из этанола, и лейкокрасителя. Как показано на фиг. 6, рекомбинанты по настоящему изобретению окрашивались в фиолетовый цвет через 2-3 ч инкубации при 37°С на чашках с ЬВ-агаром с добавлением этанола, парарозанилина и бисульфита натрия. Это окрашивание демонстрирует активность АДГ в каждом клоне рекомбинантнов, трансформированных плазмидой ρΙ3-ΌΚ-Ρ-ΡΌ^Ρ-ΑΌΗ или ρI3-^К-Ρ-Ρ^Сίад-Ρ-Α^Ηΐад. В этих рекомбинантах транскрипция гена ΖιηΑΌΗ контролировалась промотором 1и£В.

Пример 5. Рекомбинанты Эешососсик тайюйигапк К1: продуцирование метаболитов.

Анализировали метаболиты, продуцируемые рекомбинантами по изобретению.

Заявители смогли детектировать изменение в метаболитах, продуцируемых рекомбинантами по настоящему изобретению (например, клонами 24-03/4-2, 03-04/4-1, 03-04/4-2), по сравнению с дикими типом или с контрольным рекомбинантом, трансформированным пустым вектором ρΙ3 (см. табл. 2-5). В частности, обнаружили продуцирование этанола при различных условиях культивации, в то время как родительский штамм не продуцирует этанол.

- 9 024979

Таблица 1. Название рекомбинантов

Трансформированный штамм	Репликативный или интегративный конструкт	Название клона
Л. гаЗюЗигапй К.1	без конструкта	24-03/1-2 03-04/1-1 20-04/1-2
О, гайюЛигапз К.1	рЛК-ЬЛНЗе!	03-04/8-1 03-04/11-2
О. гаЗюдигапб К1	р!3	24-03/2-2 03-04/2-1 20-04/3-1
ϋ. гасНобигапз К1	р13-ЛК-Р-РЛСИё-АЛН1а§	24-03/4-2 24-03/5-2
Л. гаЗюЗигапз К1	р13-ЛК-Р-РЛС-АЛН	20-04/4-3 20-04/5-4
Л. га<Ио<1цгапЕ К1	р13-ОК-Р-РОСИ8-Р-АОН1ае	03-04/5-1 03-04/6-1
ϋ. гасИодигапз К1	р13-ЛК-Р-РПС-Р-АЛН	03-04/4-1 03-04/4-2
Л. га31о3игап8 К1	Продукты РСК	18-06/1-1 18-06/1-3

Таблица 2. Рекомбинанты Оетососсик габ1обигапк К1: продуцирование метаболитовв комплексной среде с глюкозой (Сотр1ех Мебшт СШсоке. СМ) в условиях аэробной культивации

Штамм	Клон
		Продуцирование кислоты (г/л) .......
		сукцинат	ацетат	лактат	этанол (%)*	потребленная глюкоза (г/л)
ЛгаЗ И \УТ	24- 03/1-2	0,43	0,21	0	0	0
ЛгаЗ К1 р!3	24- 03/2-2	0,43	0,23	0	0	0,6
Эгас1 ΚΙ р13 ϋΚ-ΡРОС1а£- АПН 1ад	24- 03/4-2	0,31	0,17	0	0,005	1,2
ЛгаЗИ ΨΤ	03- 04/1-1	0,42	0,2	0	0	0
ЛгаЗ К1 р!3	03- 04/2-1	0,37	0,2	0	0	0,9
ЛгаЗ И р13 ЛР-РРЛС-Р- АЛН	03- 04/4-1	0,25	0,14	0	0,016	0,2
ЛгаЗ Р1 р!3 ПР-Р-	03-	0,27	0,14	0,02	0,016	0,2

РПС-Р- АПН	04/4-2
Бгай ΚΙ р13 ЭК-РРОС(а£- Р-АВРЙац	03- 04/5-1	0,29	0,11	0	0,006	0,4
Огад ΚΙ р13 ΏΚ.-ΡРОСтая- Р-АЭН1а£	03- 04/6-1	0,33	0,14	0	0,006	0,3
ЛгаЗ К1 рПР-ЛЛНЗе1		0,28	0,18	0	0	0,4
ЛгаЗ К1 рЛР-ЬЛНЗе!		0,33	0,39	0	0	0

* % этанола обозначает количество грамм этанола на 1 г культуральной среды (т.е.. как правило. 1% этанол это 1 г этанола/100г среды = 10 г этанола/л). Для каждого клона культивацию проводили трехкратно. Таблица 3. Рекомбинанты Оетососсик габюбигаик К1: продуцирование метаболитов в комплексной среде с глюкозой (Сотр1ех Мебшт С1исо8е. СМ) в условиях аэробной культивации

Продуцирование кислоты (г/л)

	Я я я ЬЙ о	ё £	\| К	этанол	ю о £ с
Огад К1 дикий тип	0,66	0,64	0	0	3,13
ЛгаЗ К1 р13 (пустая плазмида)	0,53	0,41	0	0	1,77
ЛгаЗР1 р13 ЛР-Р-РЛС-АЛН	0,46	0,51	0	0,005	1,8
ЛгаЗК! р13 ЛК-Р-РЛС-АЛН	0,49	0,5	0	0,006	1,85

Для каждого клона культивацию проводили трехкратно.

- 10 024979

Таблица 4. Интегративные рекомбинанты Оешососсик габюбигапк К1: продуцирование метаболитов в комплексной среде с глюкозой (Сотр1ех Мебшт С1исоке. СМ) в условиях аэробной культивации

Продуцирование кислоты £ (г/л) СТ Ж 'ц

Пга<1К1 Дикий тип	0,44	0,53	0,32	0	0,55
Огаб К1 СатК
рос+Аон+иэн-	0,46	0,55	0	0,026	0,6
Ога<1 К.1 СатК
РОС+АОН+ЬОН-	0,4	0,4	0	0,026	1,08

Для каждого клона культивацию проводили трехкратно

Таблица 5. Рекомбинанты Оетососсик габюбигапк К1: продуцирование метаболитов в среде определенного состава с сахарозой (Оейпеб Мебшт §исгоке. ΌΜ) в условиях аэробной культивации

Продуцирование кислоты (г/л) А

Ига4К1 Ά’Τ	0,02	0,11	0,03	0,04	0
Игай К1 р13	0,02	0Д1	0,03	0,04	0
Игай ΚΙ р13 ГЖ-Р-РПС-Р-
ΑϋΗ	0	0	0	0	0,009
Игай К1 р13 ОК-Р-РОС-Р-
АОН .	0,02	0,13	0	0	0,012
ИгайК.1 р!3 ОК-Р-РОС1аг-Р-
АОНгае	0,01	0,17	0,07	0	0,007
Игай К1 р13 ОК-Р-РЦОав-Р-
АИЙае	0	0,05	0	0	0,007

Данные результаты демонстрируют. что продуцирование этанола может быть индуцировано или увеличено в стрессоустойчивых бактериях путем создания новых метаболических путей. Результаты дополнительно демонстрируют. что дефектные по ЛДГ штаммы являются жизнеспособными и что инактивация этого гена дополнительно увеличивает продуцирование этанола в бактериях по изобретению. Кроме того. результаты демонстрируют. что штаммы могут использовать различные типы субстратов и могут расти в различных типах культуральных сред. продуцируя этанол.

Рекомбинантные штаммы по настоящему изобретению. таким образом. объединяют преимущества стрессоустойчивости. условий культивации. приемлемости субстрата и продуцирования метаболита.

Список литературы

Апбегкоп А.А.. Ыогбои Н.С.. Саш К.Р.. РагпкН С.. Эиддап Ό. (1956). §1иб1ек оп а габюгек1к1ап1 шюгососсик. I. 1ко1айоп. тогрНо1оду. си11ига1 сНагас1ег1кйск. апб гек1к1апсе 1о датта габ1а1юп. Рооб Тес1то1. 10. 575-578.

Вгаи В. апб 8аНт Н. (1986). С1отпд апб ехргеккюп оГ Не к!гис1ига1 депе Гог ругиуа!е бесагЬоху1аке оГ 2утотопак тоЬШк ш ЕксНепсЫа соП. АгсН МсгоЬю1. 144. 296-301.

СНапбга Ка.) К.. 1пдгат Ь.О.. Маирш-Еиг1оте ТА. (2001). Ругиуа1е бесагЬоху1аке: а кеу еп/уте Гог Ше ох1баИуе те!аЬо11кт оГ 1асбс ашб Ьу Асе1оЬас1ег рак1еийапик. АгсН М1сгоЫо1. 176.443-451.

Соптеау Т.. Октап У.А.. Коппап 1.1.. Нойтапп Е.М.. 1пдгат Ь.О. (1987а). Ргото1ег апб пис1еойбе кес.|иепсек оГ Ше 2утотопак тоЬШк ругиуа!е бесагЬоху1аке. 1 Вас1ейб 169. 949-954.

Соптеау Т.. §етее11 С.А.. Октап У.А.. Шдгат Ь.О. (1987Ь). С1отпд апб кециепсшд оГ Ше а1со1о1 беНубгодепаке II депе йот 2утотопак тоЬШк. 1 Вас1ейо1. 169. 2591-2597.

Социейе N.. ЕюгауапО Е.. Ае1к М.. УеШеих Е.. Мабет Ό. (2007). Асйуйу. к!аЬШ1у апб к1гис1ига1 кШб1ек оГ 1ас1а1е беНубгодепакек абар!еб 1о ехйете Шегта1 епν^^оитепΐк. 1 Мо1 Вю1 374. 547-562.

Эа1у М.Т. Оиуапд Ь.. Еис1к Р.. Мт1оп К.А. (1994). 1п у1уо батаде апб гесА-берепбеп1 гераи оГ р1акт1б апб сНготокота1 ^NА ш Ше габ1айоп-гек1к1ап1 Ьас1ейит Эетососсик габюбигапк. 1 Вас1ейо1. 176. 3508-3517.

Шдгат Ь.О.. Соптеау Т.. С1агк Ό.Ρ.. §етее11 С. А.. Ргек1оп ТЕ. (1987). Сепейс епдтеейпд оГ еШапо1 ргобисйоп т ЕксНепсЫа сой. Арр1 Епуиоп МюгоЬю1. 53. 2420-2425.

Еесот1е Е.. Сок1е С.. §оттег 8.. Вабопе А.. (2004). Уес1огк Гог геди1а1еб депе ехргеккюп Ш Ше габюгекМап) Ьас1ейит Эетососсик габюбигапк. Сепе 336.25-35.

Ьш 8.. П1еп В.8.. №сНо1к Ν.Ν.. ВксНоГГ К.М.. НидНек 8.К.. Сойа М.А. (2007). Соехргеккюп оГ ругиуа!е бесагЬоху1аке апб а1со1о1 беНубгодепаке депек ш ЬасШЬасШик Ьге\ак. ЕЕМ8 МюгоЬю1 ЬеИ. 274. 291297.

Ьотее 8.Е. апб 2е1кик ТС. (1992). Рипйсайоп апб сНагаОеп/аОоп оГ ругиуа!е бесагЬоху1аке Ггот 8агсша уепШсий. 1 Сеп МсгоЪю1. 138. 803-807.

Мак1егк С.1. апб Мт1оп К.А. (1992). Ргото1ег ргоЬе апб кНиШе р1акт1бк Гог Эетососсик габюбигапк. Р1акт1б 28. 258-261.

- 11 024979

Ме1ша И. апб Ыбзйот М.Е. (2000). СНагасЮп/аПоп оГ Ше ш1П1ша1 герНсоп оГ а сгурйс Бетососсиз габюбигапз 8АНК р1азпиб апб бесе1ортеп1 оГ уегзаШе ЕзсЬепсЫа сой-Б. габюбигапз зНпШе уес!огз. Арр1 ЕпУ1гоп М1сгоЫо1. 66, 3856-3867.

Ме1та И., НоШГпзз Н.М., С!е\ут Ь., 1лбз1гот М.Е. (2001). Ргото1ег с1оптд т Ше габюгез1з1ап1 Ьас1епит Бетососсиз габюбигапз. I Вас1епб. 183, 3169-3175.

Ыагит1 I. апб Ша1апаЬе Н. (1996). 8ецпепсе апа1уз1з оГ Ше Ь-1ас1а1е бейубгодепазе-епсобтд депе оГ Бетососсиз габюбигапз, а зибаЫе тезорЫНс соип1еграг! Гог ТНегтпз. Оепе 172,117-119.

Ыеа1е А.Б., 8сорез И.К., ШеНепНа11 И.Е., Ноодепгааб N.1. (1987). Ыис1еоНбе зецпепсе оГ 1Не ругауа!е бесагЬоху1азе депе Ггот Уутотопаз тоЬШз. №ю1ею Ас1бз Иез. 15, 1753-1761.

На) К.С., Та1апсо Ь.А., 1пдгат Ь.О., Маирт-1'Тг1о\у РА. (2002). С1отпд апб сНагасЮп/аПоп оГ 1Не /утоЬасЮг ра1тае ругиуа!е бесагЬоху1азе депе (рбс) апб сотрапзоп 1о Ьас1епа1 Ното1одпез. Арр1 ЕпУ1гоп МюгоЬю1. 68, 2869-2876.

Та1апсо Ь.А., ОН М.А., Уотапо Ь.Р., 1пдгат Ь.О., Маирт-1^;иг1о\у РА. (2005). СопзНисНоп апб ехргеззюп оГ ап еШапо1 ргобисНоп орегоп т Огат-розШуе Ьас1епа. МтсгоЫоР 151,4023-4031.

Список последовательностей <110> ΟΕΙΝΟΫΕ <120> КесотЬтпапХ Ьасхеп'а апд хКе ивез ХНегеоГ Гог ргойистпд ехНапо!

<130> В881РС <160> 10 <170> рахепхт νβΓδίοη 3.3 <210> 1 <211> 537 <212> ϋΝΑ <213> агхтНспа! зечиепсе <220>

<223> й. га01ос1игап5 К1 депоте_ Зечиепсез оГ 5' <400> 1 ххссссдссх дддхахсасд хссссдссад адссдсхсхд хассххсддд дсахдассса 60 дсссдхххсх хсддххсссд дсхсххсссх ххссддсдса ддххххсадс дасхдсхддх 120 сдддахсдах ххсхсдсссх сдхсдххдса сдсссххдаа дхддсдсдда сссдсхххсс 180 сддсдсдсдд схдсддсхсд сссасдхдас сдасдсссдс дсддхддсдд схсссдасдх 240 ддхдддсддс дхсасдссда хсахдсссда сссддддсхд схдсааасдс хсдаадасдс 300 сдаххссаас сддсхсхсдд ддсхдахссд сдасддхдад дааадсдадс Хдсхсдхсдд 360 сдахсссахс асддддсхдс хсдасдсддс ссдддсдхдд ддсдсддасс хдахсдхддх 420 сддсасссас ссдсадддсд сдсхддааса схххххсахс ддсадсадсд ссдадаадсх 480 ддхдддссдс адсдсддхдс сддхдсхдхд сдхдсссхсд ддадсасаса дахдааа 537 <210> 2 <211> 615 <212> ΟΝΑ <213> агхНПста! зедиепсе

<22О>
<223> О. ι	*а01ос1игап5	К1 депоте_	Зедиепсез оГ 3’
<400> 2 хддаасдадс	аддхдсдсдс	саааахсдах	дадддсассс	дсаасдссдс	сдссадсахс	60
ахсдадддса	адсдддссас	схасхасддс	ахсддсдсдд	сдсхсдсссд	сахсассдад	120
дссдхдсхдс	дхдассдссд	сдссдхссхд	ассдхсадхд	сдссдасссс	сдаахасддс	180
дхдадссхса	дссхдссдсд	хдхсдхдддс	сдхсаддддд	хдсхдхссас	ссхдсасссс	240
аадсХдассд	дсдасдадса	асадаадсхд	даасададхд	ссддддхдсх	дсдсддсххс	300
аадсадсадс	хсддссхдхд	асдссдасдс	хссадассдх	схасддсдад	дсдсадссдс	360
хсдасхддсх	дхдссхсдсс	ссссассссд	асдасдссда	аахсддсдсд	ддсддсасдс	420
хдахссддсх	ддсдсаддсд	ддссдддсад	хддддаххсх	ддаасхсасд	сдсддхдааа	480
адддсассса	ддддасдссс	дссдадсддс	аддссдадхд	сдхддсддсд	дсссдссхда	540
хддассхдад	схддсдсддс	саасхсдддс	ХдсссдаХдд	ддаасхсдсс	дасасдссдс	600

- 12 024979 ссхххдсхса сдсдх 615 <210> 3 <211> 1707 <212> ϋΝΑ <213> агХтГтста) зеяиепсе <220>

<223> Νυείβιο астс! зециепсе οί 2тР0С деле <400> 3

ахдадххаха	схдхсддхас	схахххадсд	дадсддсххд	ХссадаХХдд	хсхсаадсах	60
сасххсдсад	хсдсдддсда	схасаассхс	дхссххсххд	асаассхдсх	хххдаасааа	120
аасахддадс	аддхххаххд	схдхаасдаа	схдаасхдсд	дхххсадхдс	адааддххах	180
дсхсдхдсса	ааддсдсадс	адсадссдхс	дххассхаса	дсдхсддхдс	дсхххссдса	240
хххдахдсха	хсддхддсдс	схахдсадаа	аассххссдд	ххахссхдах	схссддхдсх	300
ссдаасааса	ахдахсасдс	хдсхддхсас	дхдххдсахс	асдсхсххдд	саааассдас	360
хахсасхахс	адххддааах	ддссаадаас	ахсасддссд	ссдсхдаадс	дахххасасс	420
ссддаадаад	схссддсхаа	аахсдахсас	дхдаххаааа	схдсхсххсд	хдадаадаад	480
ссддхххахс	хсдааахсдс	ххдсаасахх	дсххссахдс	ссхдсдссдс	хссхддассд	540
дсаадсдсах	хдххсаахда	сдаадссадс	дасдаадсхх	схххдаахдс	адсддххдаа	600
дааасссхда	ааххсахсдс	саассдсдас	ааадххдссд	хссхсдхсдд	садсаадсхд	660
сдсдсадсхд	дхдсхдаада	адсхдсхдхс	ааахххдсхд	ахдсхсхсдд	хддсдсадхх	720
дсхассахдд	схдсхдсааа	аадсххсххс	ссадаадааа	асссдсахха	сахсддсасс	780
хсахддддхд	аадхсадсха	хссдддсдхх	даааадасда	хдааадаадс	сдахдсддхх	840
ахсдсхсхдд	схссхдхсхх	саасдасхас	хссассасхд	дххддасдда	хаххссхдах	900
ссхаадааас	хддххсхсдс	хдаассдсдх	хсхдхсдхсд	ххаасддсах	хсдсххсссс	960
адсдхссахс	хдааадасха	хсхдасссдх	ххддсхсада	аадхххссаа	даааассддх	1020
дсаххддасх	хсххсааахс	ссхсаахдса	ддхдаасхда	адааадссдс	хссддсхдах	1080
ссдадхдсхс	сдххддхсаа	сдсадааахс	дсссдхсадд	хсдаадсхсх	хсхдассссд	1140
аасасдасдд	ххаххдсхда	аассддхдас	хсххддххса	ахдсхсадсд	сахдаадсхс	1200
ссдаасддХд	сХсдсдХХда	аХаХдаааХд	садхддддхс	асаХХддХХд	дХссдХХссХ	1260
дссдссххсд	дххахдссдх	сддхдсхссд	даасдхсдса	асахссхсах	ддххддхдах	1320
ддххссххсс	адсхдасддс	хсаддаадхс	дсхсадахдд	ххсдссхдаа	асхдссддхх	1380
ахсахсххсх	хдахсаахаа	схахддххас	ассахсдаад	ххахдахсса	хдахддхссд	1440
Хасаасааса	хсаадаасхд	ддаххахдсс	ддхсхдахдд	аадхдххсаа	сддхаасддх	1500
ддххахдаса	дсддхдсхдд	хаааддссхд	ааддсхаааа	ссддхддсда	асхддсадаа	1560
дсхахсаадд	ххдсхсхддс	ааасассдас	ддсссаассс	хдахсдаахд	сххсахсддх	1620
сдхдаадасх	дсасхдаада	аххддхсааа	хддддхаадс	дсдххдсхдс	сдссаасадс	1680
сдхаадссхд	ХХаасаадсХ	ссхсхад				1707

<210> 4 <211> 1152 <212> ΟΝΑ <213> аП1Яс1а1 зеяиепсе <220>

<223> (ЧисТетс аспд зеяиепсе οί ζσίΑΟΗ II депе <400> 4

ахддсххсхх	саасххххха	хаххссхххс	дхсаасдааа	хдддсдаадд	ххсдсххдаа	60
ааадсаахса	аддахсххаа	сддсадсддс	хххааааахд	сдсхдахсдх	ххсхдахдсх	120
ххсахдааса	аахссддхдх	хдхдаадсад	дххдсхдасс	хдххдааадс	асадддхахх	180
ааххсхдсхд	хххахдахдд	сдххахдссд	аасссдасхд	ххассдсадх	хсхддааддс	240
сххаадахсс	хдааддахаа	сааххсадас	ххсдхсахсх	сссхсддхдд	хддххсхссс	300
сахдасхдсд	ссааадссах	сдсхсхддхс	дсаассаахд	дхддхдаадх	сааадасхас	360
дааддхахсд	асааахсхаа	дааассхдсс	схдссхххда	хдхсаахсаа	сасдасддсх	420
ддхасддсхх	схдааахдас	дсдхххсхдс	ахсахсасхд	ахдаадхссд	хсасдххаад	480
ахддссаххд	ххдассдхса	сдххассссд	ахддхххссд	Хсаасдахсс	хсхдххдахд	540
дххддхахдс	сааааддссх	дассдссдсс	ассддхахдд	ахдсхсхдас	ссасдсаххх	600
даадсххахх	сххсаасддс	адсхасхссд	ахсассдахд	сххдсдсххх	дааадсадсх	660
хссахдахсд	схаадаахсх	даадассдсх	Хдсдасаасд	дхааддахах	дссддсхсдх	720
даадсхахдд	сххахдссса	аххссхсдсх	ддхахддссх	хсаасаасдс	ххсдсххддх	780
хахдхссахд	схахддсхса	ссадххдддс	ддххасхаса	ассхдссдса	хддхдхсхдс	840
аасдсхдххс	хдсххссдса	хдххсхддсх	хахаасдссх	схдхсдххдс	хддхсдхсхд	900
ааадасдххд	дхдххдсхах	дддхсхсдах	ахсдссаахс	хсддхдахаа	адааддсдса	960
даадссасса	ххсаддсхдх	хсдсдахсхд	дсхдсххсса	ххддхаххсс	адсааассхд	1020
ассдадсХдд	дхдсхаадаа	адаадахдхд	ссдсххсххд	схдассасдс	хсхдааадах	1080
дсххдхдсхс	хдассаассс	дсдхсадддх	дахсадааад	аадххдаада	асхсххссхд	1140
адсдсхххсх	аа					1152

<210> 5 <211> 22 <212> ΟΝΑ <213> агттЯс1а! зеяиепсе <220>

<223> ЕС31Р <400> 5 ххссссдссх дддхахсасд хс 22 <210> б <211> 31 <212> ϋΝΑ

- 13 024979 <213> агп'Гтста! зециепсе <220>

<223> ЕС32К <400> б схсддагссг гсасадггсг ссдсссссгс с 31 <210> 7 <211> 32 <212> ϋΝΑ <213> агктГтста! зечиепсе <220>

<223> ЕСЗЗР <400> 7 дадддагссд гсдддгдгсд адсагсдгда (с 32

<210>	8
<211>	45
<212>	ΟΝΑ
<213>	аггт Гт ст а! зечиепсе
<220>
<223>	с<з34Р,
<400>	8

ссгсстдсад гтдккхгкдс аагааасааа аасааааааа ссссс 45 <210> 9 <211> 31 <212> ΟΝΑ <213> аггтГтста1 зечиепсе <220>

<223> ЕС35Р <400> 9 дадасгдсад гддаасдадс аддгдсдсдс с 31 <2Ю> Ю <211> 21 <212> ΟΝΑ <213> аггтГтста! зечиепсе <220>

<223> ЕСЗбК <400> 10 асдсдгдадс ааадддсддс д 21

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Рекомбинантная бактерия I )етососсик, продуцирующая этанол, которая содержит рекомбинантную нуклеотидную конструкцию, кодирующую пируватдекарбоксилазу (ПДК) и/или алкогольдегидрогеназу (АДГ), где ПДК- и АДГ-кодирующие последовательности помещены в оперон под контролем одиночного промотора в указанной конструкции и где указанная конструкция интегрирована в геном бактерии.
2. Бактерия по п.1, в которой ПДК- и АДГ-кодирующие последовательности происходят из 7утотопак.
3. Бактерия по любому из пп.1 и 2, которая имеет модифицированный геном, содержащий инактивированный ген лактатдегидрогеназы (ЛДГ).
4. Бактерия по любому из пп.1 и 2, в которой ген ЛДГ удален, полностью или частично, и не кодирует функциональный белок.
5. Бактерия по п.3, в которой ген ЛДГ инактивирован путем вставки рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную пируватдекарбоксилазу (ПДК) и алкогольдегидрогеназу (АДГ).
6. Бактерия по любому из предшествующих пунктов, которая выбрана из Ώ. габюбигаик, Ώ. деоШегтаЛк, Ώ. тиггауц Ώ. се11и1окЛуЯсик или Ώ. бекегЛ.
7. Бактерия по любому из предшествующих пунктов, которая представляет собой термофильную бактерию Оетососсик.
8. Способ выработки этанола, включающий культивирование бактерии по любому из пп.1-7 в присутствии соответствующего субстрата, и сбор этанола.
9. Способ по п.8, в котором культивирование осуществляют при температуре около 40°С или выше.
10. Способ по п.8 или 9, в котором культивирование осуществляют в условиях с кислым значением р^Н.
11. Применение бактерии по любому из пп.1-7 для выработки этанола.
12. Применение по п.11 при температуре около 40°С или выше.
13. Применение по п.11 или 12, в котором бактерию используют в условиях с кислым значением р^Н.
14. Способ получения рекомбинантной бактерии по любому из пп.1-7, который включает получение бактерии Оетососсик;

введение в выбранную бактерию нуклеотидной конструкции, кодирующей ПДК и/или АДГ, где ПДК- и АДГ-кодирующие последовательности помещены в оперон под контролем одиночного промотора в указанной рекомбинантной нуклеотидной конструкции и где указанную рекомбинантную нуклеотидную конструкцию интегрируют в геном бактерии.
15. Способ по п.14, который дополнительно включает обработку бактерии для инактивации гена ЛДГ и отбор бактерии, содержащей инактивированный ген ЛДГ.