KR101254401B1 - 잔탄 생산능 및 생산성이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용하여 잔탄을 대량 생산하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 잔탄 생산능 및 생산성이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용하여 잔탄을 대량 생산하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 야생형 미생물의 내재적 활성에 비해 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제(Glucose 6-phosphate dehydrogenase)의 활성이 약화되어 잔탄 생산능이 향상된 재조합 미생물, 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제의 활성이 약화된 반면 포스포프룩토키나제 활성은 강화되어 잔탄 생산능 및 잔탄 생산성이 향상된 재조합 미생물, 및 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 배양액으로부터 잔탄을 회수하는 단계를 포함하는 잔탄의 대량 생산방법에 관한 것이다. 본 발명은 야생형 미생물의 내재적 활성에 비하여 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제 활성은 약화되고 포스포프룩토키나제 활성은 강화되어 잔탄 생산능 및 생산성이 향상된 재조합 미생물을 제공함에 따라 고수율 및 고효율로 잔탄을 대량 생산할 수 있으며, 이와 같이 생성된 잔탄은 식품산업, 생명공학 산업 등에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

잔탄 생산능 및 생산성이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용하여 잔탄을 대량 생산하는 방법{Recombinant microorganism having enhanced xanthan productivity and method of producing xanthan using the same}

본 발명은 잔탄 생산능 및 생산성이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용하여 잔탄을 대량 생산하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 야생형 미생물의 내재적 활성에 비해 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제(Glucose 6-phosphate dehydrogenase)의 활성이 약화되어 잔탄 생산능이 향상된 재조합 미생물, 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제의 활성이 약화된 반면 포스포프룩토키나제(Phosphofructokinase, PFK) 활성은 강화되어 잔탄 생산성이 향상된 재조합 미생물, 및 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 배양액으로부터 잔탄을 회수하는 단계를 포함하는 잔탄의 대량 생산방법에 관한 것이다.

잔탄(xanthan)은 3당류 측쇄 및 β-1,4-연결된 D-글루코스 백본(backbone) 구조의 5당류 반복 단위로 구성된 엑소폴리사카라이드(exopolysaccharide, EPS) 로서, 상기 측쇄는 백본 내 글루코스 잔기 2개 당 1 개에 상기 측쇄가 α-1,3 연결에 의하여 결합되어 있다. 측쇄 당분자는 특정 부위에서 다양한 정도로 아세틸화 및 피루빌화(pyruvylated) 될 수 있다.

잔탄은 잔탄검의 형태로 점성화제, 안정화제, 에멀젼화제 또는 겔화 제로서 생명공학 및 식품 산업에서 매우 다양한 상업적 용도를 가진다. 구체적으로 잔탄검은 천연점증제의 일종으로서, 소스, 드레싱, 시럽, 주스, 음료, 두유, 유제품, 요구르트, 푸딩, 휘핑크림, 아이스크림, 빙과류, 제과, 제빵, 베이커리 필링, 냉동식품, 레토르트식품 등을 포함한 식품, 시럽, 현탁액, 정제류 등을 포함하는 제약 제품 그리고 치약, 샴푸, 화장품 등을 포함하는 생활용품 등에 광범위하게 사용되고 있다.

산업적으로 유용한 잔탄검에 대하여 국내외적으로 많은 연구들이 이루어지고 산업적 개발도 진행되어 많은 특허출원도 이루어졌다. 구체적으로, 1992년 대만에서는 양배추의 엽소병 원인균인 잔토모나스 캄페스트리스 (Xanthomonas campestris) 균주에 xps 유전자를 클로닝하여 잔탄의 생산을 증가시킨 바 있었고, 2000년 스페인에서도 잔탄검의 생산, 회수 및 특성 연구가 진행되었다. 또한, 2003년 인도에서 다양한 기질 최적화를 이용한 잔탄검의 발효 과정을 연구하여 그 생산성을 향상시킨 것을 보고하였다. 이외에도, 미국에서 유기산을 이용한 발효 과정을 이용하여 잔탄검을 생산하는 방법을 개발하여 특허출원한 바 있다(US4245046 참조). 또한, 잔토모나스 캄페스트리스 균주를 사용하여 다양한 발효방법으로 잔탄검을 생산하는 것에 대하여 특허출원된 바 있다(US5279961 참조). 또한, 배지 조성을 조절하여 잔탐검을 생산하는 돌연변이 잔토모나스 캄페스트리스 균주를 개발하여 보고한 바도 있다(EP0481785 참조). 잔토모나스 캄페스트리스 균주를 유전공학적으로 변형하여 잔탄 검의 질을 개선하기 위한 시도도 있었다(US2003/0036176).

현재 국내외적으로 잔탄검 (xanthan gum) 생산 및 생산 증대를 위한 연구 개발의 대상은 잔토모나스 캄페스트리스 (Xanthomonas campestris) 균주에 국한되어 있고 또한 잔탄검 생산의 효율을 높이기 위한 방법도 배양 조건 (배양 배지 및 온도 등) 및 발효 조건 등과 같은 생산 공정을 달리하는 방법에 국한되어 있었다.

한편 본 발명자들은 기존의 연구 개발 대상이었던 잔토모나스 캄페스트리스 균주와 상이한 잔토모나스 오리자이(Xanthomonas oryzae)의 wxoD(putative O-antigen acetylase) 유전자를 돌연변이화하여 유전공학적 방법에 의해 잔탄의 생성을 증가시키는 기술에 대하여 특허 출원한 바 있다(KR공개 10-2010-0008715).

잔탄은 세포 내에서 당 뉴클레오티드 전구체로부터 합성될 수 있고, 잔탄 생합성은, 글리코실트랜스퍼라제(glycosyltransferase)에 의하여 당 뉴클레오티드로부터 단당류가 순차적으로 전이되고 5당류 반복 단위로 중합되어 배출되는 과정을 통하며, 세포막 내 폴리프레놀 포스페이트(polyprenol phosphate) 캐리어에 결합된 5당류 반복 단위가 조립되는 과정을 포함한다.

세포 내 대사 경로는 복잡한 네트워크로 이루어져있어, 어떤 하나의 단계에서의 효소 활성의 조절이 전체 대사 경로에 미치는 효과를 예측하는 것은 용이하지 않다. 본 발명자들은 다수의 병목을 포함할 수 있는 복잡한 잔탄 생합성 반응 네트워크를 이해하고 글루코스 6-포스페이트(glucose 6-phosphate)가 글루코스 대사를 위한 여러 가지 경로의 분지점에 존재한다는 점에 착안하여, 세포 내 당-포스페이트의 이용가능성이 잔탄 생산에 영향을 미칠 수 있음을 밝혀내었다. 또한, 잔토모나스(Xanthomonas) 속 균주를 비롯한 많은 잔탄 생산 미생물이 당분해(glycolysis)에 필수적인 포스포프룩토키나제(PFK) 활성이 부족하고, 글루코스 대사를 위한 5탄당 인산 경로(pentose phosphate pathway)의 수용력이 불충분하므로, 5탄당 인산 경로 및 엔트너 도도로프(Entner-Doudoroff, ED) 경로를 포함하는 중심 탄소 대사의 활성을 조절함에 의하여 글루코스 6-포스페이트의 세포 내 이용가능성에 영향을 미칠 수 있다는 것을 밝혀내었다.

이러한 배경 하에서 본 발명자들은 잔탄을 고효율로 수득하기 위한 방법을 찾기 위해 예의 노력한 결과, 기존의 야생형 잔탄 생산 미생물에서 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제(glucose-6-phosphate dehydrogenase)의 활성을 약화시켜 중심 탄소 대사 경로의 활성을 유전적으로 변형시킴으로써 글루코스 6-포스페이트 생산을 증가시키고, 그로 인해 잔탄 생산량을 증가시킬 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 야생형 잔탄 생산 미생물의 내재적 활성에 비하여 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH) 활성이 약화되어 잔탄 생산능이 향상된 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 야생형 잔탄 생산 미생물의 내재적 활성에 비하여 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제(G6PDH)의 활성은 약화된 반면, 포스포프룩토키나제(phosphofructokinase, PFK) 활성은 강화되어, 잔탄 생산성이 향상된 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 잔탄 생산능 및 생산성이 향상된 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 배양액으로부터 잔탄을 회수하는 단계를 포함하는, 잔탄의 대량 생산방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 야생형 잔탄 생산 미생물의 내재적 활성에 비하여 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제(G6PDH) 활성이 약화되어 잔탄 생산능이 향상된 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명에서, "잔탄"이란, 3당류 측쇄 및 β-1,4-연결된 D-글루코스 백본(backbone) 구조의 5당류 반복 단위로 구성된 엑소폴리사카라이드(exopolysaccharide, EPS) 로서, 상기 측쇄는 백본 내 글루코스 잔기 2개 당 1개에 상기 측쇄가 α-1,3 연결에 의하여 결합되어 있는 폴리사카라이드를 말한다. 상기 측쇄는 만노스-(β-1,4)-글루쿠론산-(β-1,2)-만노스로 구성될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에서,"글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제(EC 1.1.1.49)(G6PDH)"란, 5탄당 인산 경로(pentose phosphate pathway)내의 세포질 효소로서, 글루코스 6-포스페이트를 6-포스포글루코노-δ-락톤으로 전환시키며 5탄당 인산 경로의 율속 효소이다. G6PDH는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)의 농도를 유지시킴으로써 세포에 환원 에너지를 공급하는데 작용한다. 생합성을 담당하는 조직 내 NADPH/NADP+ 비율은 약 100/1인데, 생합성을 위한 NADPH의 이용이 증가하면 NADP+의 농도가 급격히 증가하고 그 결과 NADPH를 더 생산하도록 G6PDH가 자극된다.

본 발명의 구체적 실시예에서, 본 발명자들은 G6PDH의 활성 수준이 글루코스 6-포스페이트의 농도에 영향을 미치고, 세포가 글루코스 상에서 배양될 때 증가된 글루코스 6-포스페이트 농도가 잔탄 생산에 현저한 영향을 미친다는 것을 확인하였다. 이는, 호기적으로 배양된 세포에서 에너지 공급에 PFK가 제역할을 하지 못하는 상태에서, G6PDH 활성 약화로 인한 NADPH의 부족을 보충하기 위하여 더 많은 탄소가 NADP(+)-의존성 UDP 글루코스 디하이드로게나제 (UGD) 경로를 통하게 되므로, 야생형 미생물에 비하여 탄소 플럭스(flux)가 글루코스 6-포스페이트 분지점에서 잔탄 생합성 방향으로 재분배되기 때문으로 생각된다.

본 발명에서, "내재적 활성"이란 야생형 미생물이 천연의 상태로 가지고 있는 효소의 활성 상태를 의미한다.

본 발명에서 "야생형 잔탄 생산 미생물의 내재적 활성에 비하여 G6PDH 활성이 약화" 되었다는 것은, G6PDH를 코딩하는 염색체상의 유전자의 결손 또는 돌연변이에 의해 G6PDH가 정상적으로 작용하지 않아 야생형 미생물이 천연의 상태로 가지고 있는 G6PDH 활성이 약해지거나 불활성화된 상태를 의미한다. 바람직하게는 G6PDH를 코딩하는 유전자가 결실, 치환 또는 삽입에 의하여 돌연변이 되거나 이의 발현 조절 서열이 돌연변이 되어, G6PDH가 정상적으로 작용하지 않는 상태를 의미한다.

본 발명의 구체적 실시예에서, G6PDH는 zwf 유전자(서열번호 1)로부터 코딩되며, 이 유전자의 인프레임 결실을 포함하는 zwf 돌연변이 유전자로 구성된 재조합 벡터를 제작하고, 이를 잔탄 생산 미생물에 형질도입하여 상동 염기서열 사이의 재조합을 유도함으로써 야생형 잔탄 생산 미생물의 G6PDH 내재적 활성에 비해 G6PDH 활성이 약화됨과 동시에 잔탄 생산능이 향상된 재조합 미생물을 제조할 수 있다. 본 발명에서 "잔탄 생산능"이란, 단위 잔탄 생산 미생물이 생합성하는 잔탄의 농도를 의미한다. 바람직하게는, 상기 인프레임 결실을 포함하여 약화된 활성의 G6PDH를 코딩하는 zwf 돌연변이 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 zwf 유전자의 471번 염기 내지 905번 염기까지의 코딩 영역이 결실된 것이고, 더욱 바람직하게는 서열번호 16의 염기서열을 갖는다. 서열번호 1의 염기서열을 갖는 zwf 유전자의 471번 염기 내지 905번 염기까지의 코딩 영역을 인프레임 결실시키기 위하여 제한효소 인식부위를 포함하는 프라이머를 이용하여 PCR 증폭된 DNA 단편을 제한효소로 절단 및 연결(ligation)한 결과, 서열번호 16의 염기서열은 프라이머 ZWFR1 및 ZWFF2에 삽입시킨 제한효소 부위(aagctt)를 포함한다.

본 발명에서, "재조합 벡터"란 적당한 숙주세포 염색체 상의 유전자 염기서열과 유전자 삽입물의 상동 재조합이 가능하도록 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 바람직하게 본 발명에서는 서열번호 16의 염기서열을 갖는 zwf 돌연변이 유전자를 포함하는 도 3a의 개열지도로 표시되는 재조합 벡터를 사용할 수 있다.

상기 재조합 벡터를 도입하는 모균주로는 잔탄을 생산할 수 있는 미생물이라면 제한없이 사용할 수 있다. 본 발명에서, "야생형 잔탄 생산 미생물"이란, 천연의 상태로 잔탄을 생물체로부터 생산할 수 있는 미생물 균주로서, 본 발명에 따른 조작에 의해 잔탄을 축적할 수 있는 균주를 말한다. 예를 들어, 시엘라(Xylella) 속 또는 잔토모나스 속 균주일 수 있고, 더욱 구체적으로는 시엘라 파스티디오사(Xylella fastidiosa), 잔토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris), 잔토모나스 악소노포디스(Xanthomonas axonopodis), 잔토모나스 오리자이 (Xanthomonas oryzae), 잔토모나스 알빌리네안스(Xanthomonas albilineans), 잔토모나스 아르보리콜라(Xanthomonas arboricola), 잔토모나스 브로미(Xanthomonas bromi), 잔토모나스 캇사바이(Xanthomonas cassavae), 잔토모나스 시트리(Xanthomonas citri), 잔토모나스 코디아이(Xanthomonas codiaei), 잔토모나스 쿠쿠르비타이(Xanthomonas cucurbitae), 잔토모나스 시나라이(Xanthomonas cynarae), 잔토모나스 프라가리아이(Xanthomonas fragariae), 잔토모나스 가르드네리(Xanthomonas gardneri), 잔토모나스 호르토룸(Xanthomonas hortorum), 잔토모나스 히아신티(Xanthomonas hyacinthi), 잔토모나스 멜로니스(Xanthomonas melonis), 잔토모나스 피시(Xanthomonas pisi), 잔토모나스 포풀리(Xanthomonas populi), 잔토모나스 사카리(Xanthomonas sacchari), 잔토모나스 테이콜라(Xanthomonas theicola), 잔토모나스 트란스루첸스(Xanthomonas translucens), 잔토모나스 바시콜라(Xanthomonas vasicola) 및 잔토모나스 베시카토리아(Xanthomonas vesicatoria)로 구성된 군으로부터 선택된 균주일 수 있으며, 바람직하게는 잔토모나스 오리자이 pv 오리자이(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 잔토모나스 오리자이 pv 오리자이 KACC 10859 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae KACC 10859)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

구체적 실시예에 따르면, 잔탄 생산 미생물 내에서 복제되지 않고 표적 유전자의 마커-프리 결실(marker-free deletion)을 수행하는 기능이 있는 pK18mobsacB 벡터(Schafer et al., Gene 145: 69-73, 1994)를 이용함으로써 유전자 결실을 수행하였다. 즉, 상기 pK18mobsacB 벡터에 zwf 돌연변이 유전자와 항생제 마커 및 레반수크레아제 유전자(SacB)를 포함하도록 재조합 벡터를 제작한 후, 당업계에 알려진 임의의 방법으로 상기 재조합 벡터를 미생물에 형질도입 및 염색체 내 상동 재조합시킴으로써, G6PDH 활성이 약화된 재조합 미생물을 제조하였다. 본 발명의 구체예에서, zwf 돌연변이 유전자는 잔토모나스 오리자이 pv 오리자이 KACC 10859의 염색체 DNA 주형, 프라이머 ZWFF1 (서열번호 3, XbaI 제한효소 인식부위 포함)/ZWFR1 (서열번호 4, HindIII 제한효소 인식부위 포함) 및 프라이머 ZWFF2 (서열번호 5, HindIII 제한효소 인식부위 포함)/ZWFR2 (서열번호 6, XbaI 제한효소 인식부위 포함)를 이용하여 PCR 증폭하여 제작하였다. 증폭된 DNA 단편을 각각의 제한효소로 절단 및 연결(ligation)하고, pK18mobsacB 벡터의 XbaI 제한효소 부위에 클로닝함으로써 재조합 벡터 pSJ2004를 완성하였다. 이를 잔토모나스 오리자이 pv 오리자이 KACC 10859 균주에 형질도입하여 zwf 유전자가 결손된 재조합 미생물을 제조하여 SJ3001이라고 명명하였다.

또한 본 발명에서는 잔탄 생산을 더욱 증가시키기 위해, 추가적으로 포스포프룩토키나제(PFK) 활성이 야생형 잔탄 생산 미생물의 내재적 활성에 비하여 강화된 재조합 미생물을 제공한다. 본 발명에서 "야생형 잔탄 생산 미생물의 내재적 활성에 비하여 강화" 되었다는 것은, 해당 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자가 과발현되어 미생물이 천연의 상태로 가지고 있는 단백질 활성이 증가된 상태를 의미한다. 목적 유전자의 과발현은 상기 유전자의 프로모터 부위 및/또는 5'-UTR 지역의 염기서열을 변형시킴으로써 단백질 발현을 증진시킬 수 있고, 목적 유전자를 염색체상에 추가 도입함으로써 발현을 강화시킬 수 있으며, 목적 유전자를 벡터 상에 자가 프로모터 또는 강화된 별개의 프로모터와 함께 도입하여 균주에 형질도입함으로써 단백질의 발현량을 강화시킬 수 있고, 목적 유전자의 ORF(open reading frame) 지역에 돌연변이를 도입함으로써 목적 유전자의 과발현을 유도할 수 있다.

잔탄 생산 미생물은 당분해에 필요한 포스포프룩토키나제 활성이 부족한 것으로 알려진 바 있다. 이에 본 발명자들은 포스포프룩토키나제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 외래 유전자를 잔탄 생산 미생물에 형질도입함에 의하여 상기 단백질의 활성이 강화되어 잔탄 생산능 및 잔탄 생산성이 향상된 재조합 미생물을 제조하였다. 본 발명에서 "잔탄 생산성"이란, 단위 시간동안 잔탄 생산 미생물이 생합성하는 잔탄의 농도 (잔탄 생산 속도(g g^-1 h^-1))를 의미한다. 야생형 잔탄 생산 미생물의 G6PDH 내재적 활성에 비해 G6PDH 활성이 약화된 미생물에 포스포프룩토키나제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 외래 유전자를 형질도입하면 성장속도가 향상되어 단위 시간동안 잔탄 생산 미생물이 생합성하는 잔탄의 농도가 향상된다.

본 발명의 구체예에서는, 이종 미생물로부터 유래된 포스포프룩토키나제 코딩 유전자(pfk)를 갖는 유전자 발현 벡터를 잔탄 생산 미생물에 형질도입함에 의하여 상기 단백질의 활성을 강화시킨다. 본 발명에서, "유전자 발현 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. pfk 유전자는 다양한 미생물 종들로부터 얻어질 수 있고, 그 예로, 이에 제한은 없지만, Escherichia coli (E. coli )로부터 얻어질 수 있다. E. coli 유래 pfkA유전자를 사용할 수 있고, 바람직하게는 E. coli 유래 pfkA유전자의 코딩 영역을 포함하는 유전자 단편(서열번호 2)을 사용할 수 있다. 구체적 실시예에서, 양 말단에 야생형 잔탄 생산 미생물, 바람직하게는 잔토모나스 오리자이 pv 오리자이 KACC 10859 pfk 유전자의 프로모터 및 터미네이터 영역이 존재하고 그 사이에 E. coli 유래 pfkA 코딩 영역을 포함하는 유전자 단편은 서열번호 17의 염기서열을 갖는다. 본 발명의 구체적 실시예에서는, E.coli pfkA 유전자를 과발현하는 재조합 미생물을 제조하기 위하여, 야생형 잔탄 생산 미생물의 pfk 프로모터 영역 및 터미네이터 영역과 융합된 E. coli pfkA 유전자 단편을 수득한 후 이를 pKEB27 셔틀벡터에 삽입하여 pSJ2202 유전자 발현 벡터를 제작한 후 이를 잔탄 생산 미생물에 형질도입하여 pfk 유전자 과발현 돌연변이 균주를 제조한다. 본 발명의 구체적 실시예에서는 잔토모나스 오리자이 pv 오리자이 KACC10859의 염색체 DNA 주형, 프라이머 XPFKF1 (서열번호 7, XbaI 제한효소 인식부위 포함)/XPFKR1 (서열번호 8, NdeI 제한효소 인식부위 포함), 및 프라이머 XPFKF2 (서열번호 11, HindIII 제한효소 인식부위 포함)/XPFKR2 (서열번호 12, BamHI 제한효소 인식부위 포함)을 이용하여 PCR 증폭한 DNA 단편을 각각의 제한효소로 절단하고, 프로모터 영역의 5'말단 및 터미네이터 영역의 3'말단을 각각 Klenow 처리하였다. 그리고, E. coli K-12 W3110(GenBank ID AP009048)의 염색체를 주형으로 하고 프라이머 EPFKF1 (서열번호 9, NdeI 제한효소 인식부위 포함)/EPFKR1 (서열번호 10, HindIII 제한효소 인식부위 포함)을 이용하여 PCR 증폭한 DNA 단편을 각각의 제한효소로 절단하였다. 상기 3개의 DNA 단편을 pKEB27 벡터의 EcoRV 제한효소 부위에 클로닝 하여 pSJ2202 유전자 발현 벡터를 제작하였다.

또 하나의 양태로서 본 발명은, 1) 상기 잔탄 생산능 및/또는 생산성이 향상된 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 2) 배양액으로부터 잔탄을 회수하는 단계를 포함하는 잔탄의 대량 생산방법을 제공한다.

본 발명에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명에서 잔탄 생산 미생물을 이용하여 잔탄을 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 잔토모나스 속 균주에 대한 배양 배지는 공지되어 있다 (예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). 사용될 수 있는 당원으로는 글루코스, 사카로스, 락토스, 프락토스, 말토스, 전분, 셀룰로스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유해야 한다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양은 잔탄의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 160 시간에서 달성된다. 잔탄은 배양 배지 중으로 배출되거나, 세포 중에 포함되어 있을 수 있다.

본 발명의 잔탄을 생산하는 방법은, 세포 또는 배양 배지로부터 잔탄을 회수하는 단계를 포함한다. 세포 또는 배양 배지로부터 잔탄을 회수하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있다. 상기 잔탄 회수 방법에는, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 야생형 잔탄 생산 미생물의 내재적 활성에 비하여 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제 활성은 약화되고 포스포프룩토키나제 활성은 강화되어 잔탄 생산능 및 생산성이 향상된 재조합 미생물을 제공함에 따라 고수율 및 고효율로 잔탄을 대량 생산할 수 있으며, 이와 같이 생성된 잔탄은 식품산업, 생명공학 산업 등에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 야생형 잔탄 생산 균주 및 돌연변이 균주를 0.4%(w/v) 글루코스로 보충된 XOL 배지에서 배양한 결과를 나타낸다. (A), ■은 야생형 잔탄 생산 균주; ●은 zwf 돌연변이 균주; (B), ■은 pKEB27 벡터를 포함하는 야생형 잔탄 생산 균주; □는 pSJ2202 유전자 발현 벡터를 포함하는 야생형 잔탄 생산 균주; ●는 pKEB27 벡터를 포함하는 zwf 돌연변이 균주; ○는 pSJ2202 유전자 발현 벡터를 포함하는 z wf 돌연변이 균주, OD₆₀₀는 600 nm에서의 광학 밀도.
도 2는 야생형 잔탄 생산 균주에서 수행된 pfk 유전자 전사체의 RT-PCR 분석 결과를 나타낸다. 레인 1은 DNA 사이즈 마커; 레인 2는 양성 대조군, 게놈 DNA를 대조군으로 사용한 경우 표적 부위가 증폭된 것으로부터 상기 증폭이 프라이머 특이적으로 이루어졌음을 확인할 수 있다; 레인 3은 음성 대조군, DNase I으로 처리되고 역전사되지 않은 총 RNA가 주형으로 사용되었을 때 아무 증폭이 일어나지 않은 것으로부터, 총 RNA 시료가 게놈 DNA에 의해 오염된 것이 아니라는 것을 확인할 수 있다; 레인 4는 RT 프라이머를 이용하여 획득한 cDNA를 PFKF-PFKR 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 반응한 것이다.
도 3은 부위 특이적 유전자 결실에 의한 zwf 돌연변이 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pSJ2004 (A) 및 E. coli 유래 pfkA 유전자 단편을 포함하는 유전자 발현 벡터 pSJ2202 (B)의 개열지도이다.

이하 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 잔탄 생산능이 향상된 재조합 미생물의 제조

본 발명의 실시예에서는 야생형 잔탄 생산 미생물로서, 잔토모나스 오리자이 균주인 잔토모나스 오리자이 pv 오리자이 KACC 10859를 사용하였다. 본 발명의 실시예에서 제작된 프라이머 서열은 표 1에 기재되어 있다.

프라이머	서열(5' to 3')*	타겟
ZWFF1	gctctagaGCATCCAGATTGGACAGC (XbaI) (서열번호 3)	X. oryzae zwf (2448841 - 2448858)
ZWFR1	cccaagcttATCGCCAGATAGCTCACG (HindIII)(서열번호 4)	X. oryzae zwf (2450082 - 2450099)
ZWFF2	cccaagcttGGTCAAGGTACTGCGTGC (HindIII)(서열번호 5)	X. oryzae zwf (2450535 - 2450552)
ZWFR2	gctctagaCGGTGGATGTTGACCAGG (XbaI)(서열번호 6)	X. oryzae zwf (2451815 - 2451832)
XPFKF1	gctctagaCGCTAGTCGCAGTATCCC (XbaI)(서열번호 7)	X. oryzae pfk (996609 996626)
XPFKR1	ggaattccatatgGGGACGGGCTCCTCA (NdeI)(서열번호 8)	X. oryzae pfk (995672 995689)
EPFKF1	gctctagacatatgATTAAGAAAATCGGTGTG (NdeI)(서열번호 9)	E. coli pfkA (3528170 3528187)
EPFKR1	cccaagcttAATACAGTTTTTTCGCGCA (HindIII)(서열번호 10)	E. coli pfkA (3529109 3529129)
XPFKF2	cccaagcttCCCCAGTGCGGGC (HindIII)(서열번호 11)	X. oryzae pfk (994398 994417)
XPFKR2	cgggatccTGTCGGGTAGCTCACTCC (BamHI)(서열번호 12)	X. oryzae pfk (993493 993510)
RT primer	GTTCTGGATGCCTTCGCT(서열번호 13)	X. oryzae pfk (995141 995158)
PFKF	GATCAAGGTACTGGCTGC(서열번호 14)	X. oryzae pfk (994513 994530)
PFKR	CCGACTTTGTCCACTACC(서열번호 15)	X. oryzae pfk (995104 995121)

*밑줄친 서열은 괄호 안의 제한효소에 대한 제한 부위를 나타냄. 대문자로 표기된 부분이 박테리아 유전자 서열을 나타냄

<1-1> zwf 유전자가 결실된 돌연변이 균주의 제조

부위 특이적 유전자 결손(site specific gene disruption)을 수행하기 위하여 박테리아 내에서 복제되지 않고 표적 유전자의 마커-프리 결실을 가능하게 하는 pK18mobsacB(oriT sacB Km^R 포함)(Schafer et al., Gene 145: 69-73, 1994)을 이용하여, 결실된 zwf 유전자를 가지는 재조합 벡터를 제작하고(도 3a), 이를 pSJ2004로 명명하였다.

pSJ2004는 잔토모나스 오리자이 pv 오리자이 KACC 10859 염색체 DNA 주형, ZWFF1 (서열번호 3, XbaI 제한효소 인식부위 포함)/ZWFR1 (서열번호 4, HindIII 제한효소 인식부위 포함) 프라이머 쌍 및 ZWFF2 (서열번호 5, HindIII 제한효소 인식부위 포함)/ZWFR2 (서열번호 6, XbaI 제한효소 인식부위 포함) 프라이머 쌍을 이용한 PCR 및 제한효소 절단을 통하여 생성된 내부 HindIII 단편 인프레임 결실을 포함하는 zwf 유전자의 2,557bp XbaI 단편을 pK18mobsacB 벡터 상에 포함하는 재조합 벡터이다(도 3a). 본 발명의 실시예에서 사용된 야생형 잔탄 생산 미생물의 zwf 유전자의 핵산 서열은 서열번호 1이다.

상기와 같이 제작한 결실된 zwf 돌연변이 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pSJ2004를 전기천공법으로 (van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999) 야생형 잔탄 생산 미생물 균주에 형질도입하여 공지된 방법에 따라 돌연변이 균주를 제조하고, SJ3001로 명명하였다.

상기 돌연변이 균주를 제조하는 방법을 상술하면 다음와 같다. 재조합 백터 pSJ2004를 전기천공법으로 야생형 잔탄 생산 미생물 균주에 형질도입한 후, 카나마이신(kanamycin) 내성을 나타내는 콜로니(colony)들을 선발하였다. 선발된 콜로니들의 수크로오스 민감성(sucrose sensitivity)을 확인하고 카나마이신 내성 및 수크로오스 민감성 콜로니들로부터 게놈 DNA를 추출하였으며, 진단-PCR (diagnostic-PCR)을 통해 유전자 특이 재조합 (1^st 재조합)을 확인하였다. 확인된 콜로니들을 비선택(non-selection) 조건의 글루코오스 배지에서 배양한 후, 수크로오스 배지에서 선발함으로써 야생형 잔탄 생산 미생물 균주의 염색체 상에서 zwf 유전자 염기서열 간의 2차 재조합 발생된 것을 선발하였다. 선발된 콜로니들의 카나마이신 내성 여부를 확인한 후, 카나마이신 민감성 콜로니들로부터 게놈 DNA를 추출하고, 진단-PCR을 통해 유전자 특이 재조합 (2^nd 재조합)을 확인함으로써, 435bp가 인프레임 결실된 zwf 돌연변이 유전자(서열번호 16)를 가지는 돌연변이 균주를 선별하였다. 상기 획득된 돌연변이 균주(Xanthomonas oryzae SJ3001)는 국립농업과학원 농업유전자원센터(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 2010년 11월 18일자로 기탁번호 KACC91606P로 기탁하였다.

<1-2> pfk 유전자가 과발현된 돌연변이 균주의 제조

또한, E. coli pfkA 유전자를 과발현하는 균주를 제조하기 위하여, pKEB27 셔틀 벡터에 야생형 잔탄 생산 미생물의 pfk 프로모터 영역 및 터미네이터 영역과 융합된 E. coli pfkA 코딩 영역을 포함하는 유전자 단편을 삽입하여 유전자 발현 벡터 pSJ2202를 제작하였다(도 3b).

pSJ2202 유전자 발현 벡터를 제작하는 방법을 상술하면 다음과 같다. 야생형 잔탄 생산 미생물, 특히 잔토모나스 오리자이 pv 오리자이 KACC 10859의 pfk 코딩 영역의 업스트림에 있는 955bp의 둔단(blunt ended) XbaI-NdeI 단편 및 다운스트림에 있는 922bp의 HindIII-둔단(blunt ended) BamHI 단편으로 둘러싸인 E. coli pfkA 유전자의 963bp NdeI-HindIII 단편을 pKEB27 벡터 상에 포함하는 유전자 발현 벡터이다(도 3b). 본 발명의 실시예에서 사용된 E. coli pfkA 의 코딩 영역 핵산서열은 서열번호 2이고, 상기 E. coli pfkA 의 코딩 영역 핵산서열 양 말단에 잔토모나스 오리자이 pv 오리자이 KACC 10859 pfk 유전자의 프로모터 및 터미네이터 영역을 포함하는 핵산 서열은 서열번호 17의 염기서열을 갖는다.

pSJ2202 는 잔토모나스 오리자이 pv 오리자이 KACC10859의 염색체 DNA 주형, 프라이머 XPFKF1 (서열번호 7, XbaI 제한효소 인식부위 포함)/XPFKR1 (서열번호 8, NdeI 제한효소 인식부위 포함) 및 프라이머 XPFKF2 (서열번호 11, HindIII 제한효소 인식부위 포함)/XPFKR2(서열번호 12, BamHI 제한효소 인식부위 포함)을 이용하여 PCR 증폭한 DNA 단편을 각각의 제한효소로 절단하고, 프로모터 영역의 5′말단과 터미네이터 영역의 3′말단을 각각 Klenow 처리 하였다. 그리고, E. coli K-12 W3110(GenBank ID AP009048)의 염색체 DNA 주형과 프라이머 EPFKF1(서열번호 9, NdeI 제한효소 인식부위 포함)/EPFKR1(서열번호 10, HindIII 제한효소 인식부위 포함)을 이용하여 PCR 증폭한 DNA 단편을 각각의 제한효소로 절단하였다. 상기 3개의 DNA 단편을 pKEB27 벡터의 EcoRV 제한효소 부위에 클로닝 함으로써 pSJ2202 유전자 발현 벡터의 제작을 완성하였다.

상기와 같이 제작한 E. coli 유래 pfkA 유전자 단편을 포함하는 pfkA 유전자 발현 벡터 pSJ2202를 전기천공법으로 (van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999) 야생형 잔탄 생산 미생물 균주에 형질도입하여 공지된 방법에 따라 돌연변이 균주를 제조하고, SJ3502로 명명하였다.

<1-3> zwf 유전자 결실 및 pfk 유전자 과발현 변이주의 제조

실시예 <1-1>에서 제조된 zwf 유전자가 결실된 돌연변이 균주 SJ3001에 실시예 <1-2>에서 제조된 유전자 발현 벡터 pSJ2002를 전기천공법으로 형질도입하여 zwf 유전자는 결실된 반면 pfkA 유전자는 과발현되는 돌연변이 균주 SJ3504를 야생형 잔탄 생산 미생물로부터 제조하였다. 상기 획득된 돌연변이 균주(Xanthomonas oryzae SJ3504)는 국립농업과학원 농업유전자원센터(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에 2010년 11월 18일자로 기탁번호 KACC91607P로 기탁하였다.

실시예 2: 효소 활성 및 이에 따른 세포 내 글루코스 6-포스페이트 농도 측정

야생형 및 돌연변이 잔탄 생산 미생물 균주를 공지된 방법(Yoon and Cho 2007)에 따라 XOL 배지에 접종하고 200 rpm 및 28℃ 의 회전 진탕기에서 48 시간동안 배양하였다. 600 nm (OD₆₀₀)에서 광학 밀도를 측정하여 성장정도를 관찰하였다.

(1) 효소 활성 분석

야생형 및 돌연변이 잔탄 생산 미생물 균주를 XOL 배지에서 배양하고 지수증식기(exponential phase)에 원심분리를 통하여 수확한 후 100 mM Tris/HCl 완충액(pH 7.5)으로 세척하였다. 상기 세포들을 유리 비드로 파쇄하고 획득한 균질액(homogenate)을 원심분리하여 조 무세포추출물(crude cell-free extract)을 획득하였다. 모든 처리는 4℃에서 수행하였다. 모든 효소 어세이는 공지된 최적의 조건 하에서 25℃에서 수행하였다. 대조군은 완충액, 조인자(cofactor) 및 기질을 포함하고 상기 조 무세포추출물은 포함하지 않았다.

PFK 활성은 피루베이트키나제(pyruvate kinase) 및 락테이트 디하이드로게나제(lactate dehydrogenase, LDH)와의 반응에서 NADH 산화로 인한 340nm에서의 흡광도 변화로서 분석하였다(Storey (1976)). 조 무세포추출물 내에서의 G6PDH의 활성은 공지된 방법(Sugimoto and Shiio 1987)에 따라 340nm에서 NADPH가 형성되는 것을 분광광도 분석으로 측정하였다. 글루코네이트 키나제(Gluconate kinase, GntK)의 활성은 공지된 방법(Frunzke et al. 2008)에 따라 6-포스포글루코네이트 디하이드로게나제(phosphogluconate dehydrogenase, 6PGD)의 coupled enzymatic assay를 이용하여 조 무세포추출물에서 측정하였다. 효소 활성의 단위는 25℃ 에서 1분당 1 μmol 의 생성물을 생산하는 데 필요한 효소의 양으로 정의하였다.

(2) 세포 내 글루코스 6-포스페이트 농도의 결정

세포 내 글루코스 6-포스페이트를 추출하기 위하여 Lebloas et al.(1993)에 의하여 공지된 대사의 빠른 불활성화 절차(procedure of rapid inactivation of metabolism)에 기초한 방법을 사용하였다. 5 밀리리터의 배양액 시료를 취하고 액체 질소에서 급속 냉각시킨 후 -80℃ 에 저장하였다. 정량의 세포(표준 시료)를 2 ml의 퍼클로르산(25%)에 첨가하였다. 3회의 동결융해(freeze-thaw) 후, 세포를 원심분리로 제거하고, 이후 추출물을 50℃에서 8분간 반응한 후 15M KOH를 이용하여 pH 7-8로 중화시킨 후 즉시 G6PDH 활성 분석을 하여 세포 내 글루코스 6-포스페이트 농도를 결정하였다. NADPH 흡광도는 340 nm 에서 측정하였고, 시료 및 표준시료에 대하여 관찰되는 흡광도의 증가를 이용하여 대사체의 농도를 계산하였다. 건조 세포 중량은 1 OD₆₀₀=0.3 g (건조 세포 중량) l^-1의 상관관계에 기초하여 계산되었다.

실시예 3: RT-PCR 분석

RT-PCR 실험을 위하여, 핫 페놀(hot phenol) 방법을 이용하여 XOL 배지에서 후기-지수증식기의(late-exponentially) 야생형 잔탄 생산 미생물 균주로부터 총 RNA를 추출하고, 추출된 RNA를 DNase I으로 처리하였다. DNase I으로 처리된 RNA 시료를 RNeasy^? 칼럼(Qiagen)을 이용하여 정제하고, 정제된 DNase I 처리 RNA 시료를 RT 프라이머(서열번호 13) 및 200 단위의 역전사 효소와 함께 30분 동안 42℃에서 반응하였다. 역전사된 RNA 시료를 프라이머 쌍 PFKF-PFKR (서열번호 14 및 15) 및 PCR 혼합물에 첨가하였다. PCR은 95℃에서 30초, 56℃에서 30초, 및 72℃에서 30초를 40사이클 수행하였다. PCT 생성물을 2% 아가로스 젤 상에서 전기영동으로 분석하였다.

실시예 4: 잔탄 분석

야생형 및 돌연변이 잔탄 생산 미생물을 XOL 배지에 접종한 다음, 28℃ 및 200 rpm의 회전 진탕기에서 48시간 동안 배양하였다. 5탄당 및 6탄당 당분자를 추정하는 비색분석법에 의해 상층액 중 잔탄의 양을 측정하고 일정량의 잔탄을 사용하여 제작된 표준 곡선으로 산술하였다. 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다. 결과는 3개의 배양액의 평균 ± 표준편차로 나타내었으며, ND는 검출되지 않음을 의미한다.

결과

탄소원으로 글루코스를 포함하는 XOL 배지에서 배양된 야생형 잔탄 생산 미생물 균주는 다른 잔토모나스 종과 같이 PFK 활성을 보이지 않았다. 이로써 야생형 잔탄 생산 미생물 균주에서 당분해작용의 EMP경로(Embden-Meyerhof-Parnas pathway)가 글루코스 이화작용에 대해서는 작용하지 않고, G6PDH가 글루코스 이화작용의 주 경로라는 것을 확인하였다. 야생형 잔탄 생산 미생물 균주에서 zwf 유전자(locus tag XOO2314)를 불활성화하여 G6PDH의 활성을 조절함으로써 글루코스 6-포스페이트의 이용가능성을 변화시킬 수 있는지를 확인하였다. 효소 활성 분석 결과 zwf 돌연변이 균주의 G6PDH 활성이 야생형 균주의 27%라는 것을 확인하였다(표 2). 활성 수치는 3회 이상의 독립적 실험 결과의 평균값이고, 표준편차는 10% 미만이었다. ND는 활성이 측정되지 않음을 의미한다.

X. oryzae 균주	유전자형	효소 활성 (U μg of protein-1)a
		G6PDH	GntK
KACC10859	야생형	5.74	ND
SJ3001	zwfΔ	1.56	0.39

글루코스가 탄소원으로 사용될 때 zwf 돌연변이 균주는, 야생형 잔탄 생산 미생물 균주에 비하여 성장속도가 낮았다(도 1). 그러나, 글루코스 1몰당 바이오매스의 수율은 거의 동일하였다(야생형 잔탄 생산 미생물 균주는 글루코스 1몰당 112.0 g [건조중량], zwf 돌연변이 균주는 글루코스 1몰당 123.3 g [건조중량]). 이러한 결과는 잔탄 생산 미생물 균주가 산화적 5탄당 인산 경로의 중간생성물인 6-포스포글루코네이트의 생합성을 위하여 2가지 경로, 즉 G6PDH 및 GntK 경로를 가지고 있을 수 있다는 것을 의미한다. 그러나 본 발명의 실시예에서 사용된 야생형 잔탄 생산 미생물 균주는 G6PDH 활성을 나타내고 GntK 활성은 나타내지 않았다(표 2). 놀랍게도 야생형 잔탄 생산 미생물 균주에서 zwf 유전자를 결실시킨 결과 GntK 활성이 유도되었다.

zwf 돌연변이 균주에서의 잔탄 생합성 패턴을 조사하기 위하여, 0.4% 글루코스로 보충된 XOL 배지에서 배양된 돌연변이 균주의 잔탄 생산량을 측정하였다(표 3). zwf 돌연변이 균주는 야생형 균주보다 현저히 많은 양의 잔탄을 생산하였다. 이는 G6PDH의 불활성화가 글루코스 6-포스페이트의 축적을 야기했기 때문으로 보인다. 실제로, 글루코스 6-포스페이트의 농도는 야생형 잔탄 생산 미생물 균주에서 0.01 mM 인 것임에 반하여, zwf 돌연변이 균주에서 0.09 mM 까지 증가한 것으로 나타났다. 수치는 3회 이상의 독립적 실험 결과의 평균값이고, 표준편차는 10% 미만이었다. ND는 활성이 측정되지 않음을 의미한다. 성장 속도는 지수증식기 동안 측정된 최대 성장속도이다.

X. oryzae 균주	벡터	특성	성장 속도 (h-1)a	잔탄 농도 (g l-1)	잔탄 수율 (g g-1)	잔탄 생산 속도 (g g-1 h-1)
KACC10859 (야생형)	pKEB27	야생형	0.202	1.40	0.35	0.014
KACC10859 (야생형)	pSJ2202 (PFK)	pfk 강화	0.202	1.41	0.35	0.014
SJ3001 (zwf 돌연변이 균주)	pKEB27	zwf 약화	0.107	2.48	0.62	0.013
SJ3001 (zwf 돌연변이 균주)	pSJ2202 (PFK)	zwf 약화 및 pfk 강화	0.153	2.39	0.59	0.017

탄소원으로서 글루코스를 포함하는 XOL 배지에서 배양된 zwf 돌연변이 균주에서 pfk-특이적 전사가 RT-PCR 분석에 의하여 탐지되었지만, PFK 활성은 관찰되지 않았다 (도 2). 이러한 결과는 PFK의 ATP-의존적 알로스테릭 억제 조절작용의 존재에 기인한 것으로 보인다. PFK 활성을 복원하기 위하여 zwf 돌연변이 균주를 야생형 잔탄 생산 미생물의 pfk 프로모터로부터 전사되는 E. coli pfkA 유전자를 포함하는 유전자 발현 벡터 pSJ2202를 이용하여 형질도입시켰다. Coupling enzyme assay 방법을 사용하여 조 무세포추출물 내에서 PFK 활성을 측정함으로써 유전자 발현 벡터 pSJ2202를 포함하는 돌연변이 균주 내에서 E. coli PFK의 성공적인 발현을 확인하였다. 유전자 발현 벡터 pSJ2202를 포함하는 zwf 돌연변이 균주 내에서 PFK의 특이적 활성은 E. coli 내에서 측정된 PFK 활성에 비해서는 낮았으나 대조군 균주에 비하여 당분해 플럭스(flux)가 증가하여 글루코스 상에서 바이오매스 수율 및 세포 성장 속도(142.9%)가 현저하게 증가하였다(표 3, 도 1b). 또한, pfk 유전자 발현 벡터 pSJ2202를 포함하는 zwf 돌연변이 균주에서의 잔탄 생산 속도(g g^-1 h^-1)는 대조균 균주에 비하여 현저하게 높았다(표 3). 반면, 야생형 잔탄 생산 미생물 균주에서는 E. coli PFK 활성을 증가시켜도 성장 및 잔탄 생산에 현저한 변화를 야기하지 않았다.

농업생명공학연구원 KACC91607 20101118 농업생명공학연구원 KACC91606 20101118

<110> SANGJI UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Recombinant microorganism having enhanced xanthan productivity and method of producing xanthan using the same <130> PA100648/KR <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1575 <212> DNA <213> Xanthomonas oryzae <400> 1 ttgggcgtca gcgtcccccc cccccccccc ccccgctgcg cgcacgcaag tgtcgctcag 60 gaacagacgt accgaccgcc ggccatccgg cgcctttccg acaagctgct gataacgatg 120 tctccagaat ctgaaacgcg gtccatgcac aacaccctga tcctgtttgg cgccaccggc 180 gatcttgccc agcgctacct gttcccctcc ctgctgcgtc tgtacatcga tggcctgctg 240 ccggaggact tccgcatccg tgcgctggcg ctgtcgccgc acgacaccga ggcattccgt 300 gacgtgctgc ggccgcgtct gaccgaagcg ctgccgatcg ccacgcccga acagatccag 360 gcgctgctgc agcgcgttga ctaccgctcg gtggacctgc gcaatgccga gtcggtggcc 420 gatgcggtcc gcgagcttgc gtcccgccag atcgtgagct atctggcgat cccgccaggc 480 ctgtacatca gcacctgcca aggcctggcg ctaggtggcg cgttggcggc accgcatcgt 540 ttgatgctgg aaaagccgat cggccacgac tcggacagcg cccgcgacat cctgcagtcg 600 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Claims (16)

1. 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제 활성이 야생형 잔탄 생산 잔토모나스 오리자이(Xanthomonas oryzae)의 내재적 활성에 비하여 약화되어, 향상된 잔탄 생산능을 갖는 재조합 미생물로서, 상기 미생물은 잔토모나스 오리자이인 것인, 재조합 미생물.
2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 zwf 유전자의 결실 또는 돌연변이에 의하여 상기 단백질의 활성이 약화된 것인, 재조합 미생물.
3. 제2항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 zwf 유전자의 471번 염기 내지 905번 염기까지의 코딩 영역이 결실된 zwf 돌연변이 유전자를 포함하는 것인, 재조합 미생물.
4. 제3항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 서열번호 16의 염기서열을 갖는 zwf 결실 돌연변이 유전자를 포함하는 것인, 재조합 미생물.
5. 제4항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 서열번호 16의 염기서열을 갖는 zwf 결실 돌연변이 유전자를 포함하고 도 3a의 개열지도로 표시되는 재조합 벡터가 도입되어 글루코스 6-포스페이트 디하이드로게나제 활성이 약화된 것인, 재조합 미생물.
6. 제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 추가로 포스포프룩토키나제 활성이 야생형 잔탄 생산 미생물의 내재적 활성에 비하여 강화된 것인, 재조합 미생물.
7. 제6항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 이종 유래 포스포프룩토키나제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 pfk 유전자를 도입하여 과발현시킴으로써 상기 단백질의 활성이 강화된 것인, 재조합 미생물.
8. 제7항에 있어서, 상기 포스포프룩토키나제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 pfk 유전자가 E.coli으로부터 유래된 것인, 재조합 미생물.
9. 제8항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 E. coli 유래 pfkA 유전자의 코딩 영역을 포함하는 재조합 단편이 도입된 것인, 재조합 미생물.
10. 제9항에 있어서, 상기 재조합 단편은 양 말단에 야생형 잔탄 생산 미생물의 프로모터 및 터미네이터 영역이 위치하고 그 사이에 서열번호 2의 염기서열을 갖는 E. coli 유래pfkA 유전자의 코딩 영역을 포함하는 것인, 재조합 미생물.
11. 제10항에 있어서, 상기 미생물은 서열번호 17의 염기서열을 갖는 E. coli 유래 pfkA 유전자의 재조합 단편을 포함하는 것인, 재조합 미생물.
12. 제11항에 있어서, 상기 미생물은 서열번호 17의 염기서열을 갖는 E. coli 유래 pfkA 유전자의 재조합 단편을 포함하고 도 3b의 개열지도로 표시되는 유전자 발현 벡터가 형질도입되어 포스포프룩토키나제 활성이 강화된 것인, 재조합 미생물.
13. 삭제
14. 제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 기탁번호 KACC91606P로 기탁된 미생물인, 재조합 미생물.
15. 제6항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 기탁번호 KACC91607P로 기탁된 미생물인, 재조합 미생물.
16. 1) 제1항 내지 제12항 및 제14항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물을 배양하는 단계: 및
    2) 배양된 세포 또는 배양액으로부터 잔탄을 회수하는 단계를 포함하는, 잔탄의 대량 생산방법.

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