JP2005261421A - ペントース発酵性ザイモバクター属形質転換微生物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 キシロース代謝系酵素生産性微生物をDNA供与体とし、そのDNA断片をベクターに結合させた組換えDNA及び該組換えDNAをZymobacter属微生物に導入して得られた形質転換微生物。
【選択図】 なし
Description
を用いて処理し、SSC緩衝液に対して透析し、精製された供与体微生物の染色体DNA液を得る。
Zymobacter palmaeはキシロース発酵性をもたない。その原因としては、キシロースをキシルロースに変換する酵素であるキシロースイソメラーゼ、キシルロースのリン酸化反応を触媒するキシルロキナーゼ、さらに、変換されたキシルロースリン酸をペントースリン酸経路を経てエタノール生合成へと効率よく導くためのキー酵素となるアルドースレダクターゼおよびトランスケトラーゼの欠損またはその微弱な活性が挙げられる。従って、これら酵素遺伝子を導入して発現させることによりキシロースからのエタノール生産能を付与することが可能になる(図1)。
ZGX1:5’-CGGAATTCGTTCGATCAACAACCCGAATCCTATCG-3’
ZGX2:5’-TACTGGAATAAATGGTCTTCGTTATGCAAGCCTATTTTGACCAGCCTCGAT-3’
ZGX3:5’-ATCGACTGGTCAAAATAGGCTTGCATAACGAAGACCATTTATTCCAGTA-3’
EX4: 5’-CGGAATTCATGCATAGTTGCCAAAAGTTGCTGTCA-3’
一次PCRとして、Zymomonas mobilis菌体から調製したゲノムDNAをテンプレートにプライマーZGX1とZGX3を用いて、プロモーターとキシロースイソメラーゼ遺伝子のN末部位を含む約300bpDNA断片を増幅した。一方、大腸菌ゲノムDNAをテンプレートにプライマーZGX2とEX4を用いて、プロモーター遺伝子の一部とキシロースイソメラーゼ遺伝子とキシルロキナーゼ遺伝子を含む約3.0kbpDNA断片を増幅した。
大腸菌ゲノムDNA上ではトランスアルドラーゼ遺伝子とトランスケトラーゼ遺伝子はオペロンを構成せず、お互いに離れた位置に配座している。そのため、トランスアルドラーゼとトランスケトラーゼを個々にクローニングした後に、Zymomonas mobilis由来のGAPプロモーター制御下になるように連結した。そのため、既知のZymomonas mobilis由来のグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素遺伝子配列と既知の大腸菌由来トランスアルドラーゼ遺伝子(Nucleic Acids Res., Vol.20, 3305-3308, 1992)に基づき、以下の4種のPCRプライマーを設計した:
ZGT1:5’-CGCGGATCCGTTCGATCAACAACCCGAATCCTATC-3’
ZGT2:5’-CTTAATAAGTTAGGAGAATAAACATGACGGACAAATTGACCTCCCTTCGT-3’
ZGT3:5’-ACGAAGGGAGGTCAATTTGTCCGTCATGTTTATTCTCCTAACTTATTAAG-3’
ETA4:5’-CATTTTGACTACCAGATCTAGATTACAGCAGATCGCCGATCATTTTTTCC-3’
一次PCRとして、Zymomonas mobilis菌体から調製したゲノムDNAをテンプレートにプライマーZGT1とZGT3を用いて、プロモーターとトランスアルドラーゼ遺伝子のN末部位を含み、そのプロモーター遺伝子上流末端にBamHI制限酵素切断部位を付加した約300bpDNA断片を増幅した。一方、大腸菌ゲノムDNAをテンプレートにプライマーZGT2とETA4を用いて、プロモーター遺伝子の一部とトランスアルドラーゼ遺伝子を含み、そのトランスアルドラーゼ遺伝子のC末端にXbaI制限酵素切断部位を付加した約1.2kbpDNA断片を増幅した。
ETK1:5’-CGGAATTCTCGAGCTCCAGTTACTCAATACGTAACAATAA-3’
ETK2:5’-CGGCATGCCTCGAGGCAAACGGACATTATCAAGGTAATAAAAAAGGTCGC-3’
一次PCRとして、大腸菌の菌体から調製したゲノムDNAをテンプレートにプライマーETK1とETK2を用いて、トランスケトラーゼ遺伝子のN末端上流にXbaI制限酵素切断部位とそのC末端下流にSphI制限酵素切断部位を付与した約2.1kbpDNA断片を増幅させた。このDNA断片の両末端を平滑化反応後、大腸菌用ベクタープラスミドDNA、pUC118のHincII制限酵素切断片と混合してT4リガーゼにより連結させて組換えプラスミドDNAを作製した。
4種のキシロース代謝系酵素遺伝子をZymobacter palmaeに導入して発現させるために、これら遺伝子を広宿主域性プラスミドベクターに挿入して組換えプラスミドを作製した。
大腸菌内で構築した組換えプラスミドpMFY31-xtをZymobacter palmae(ATCC 51623)に形質転換した。
組換え菌Zymobacter palmae FERM P-19451(FERM BP-10048)をバイオマス部分糖化液由来のグルコースおよびキシロースを炭素源としたGX培地(2.0%グルコース、2.0%キシロース、1.0%酵母エキス、1.0%KH2PO4、0.2%(NH4)2SO4、0.05%MgSO4・7H2O、pH6.0)に植菌し、2日間静置培養を行い、前培養液とした。本培養は前述のGX培地を用い、本培養用GX培地に対し10%の割合で前培養液を植菌し、30℃で緩やかに攪拌培養を行った。菌体の生育度、グルコース濃度、キシロース濃度およびエタノール濃度を経時的に測定したところ、3日間の培養でキシロースをほぼ消費し、理論収率に近いエタノールを生産した(図6)。
廃木材の硫酸糖化により調製した糖液(12%グルコース、3%キシロース)に酵母エキスを1.0%、KH2PO4を1.0%、 (NH4)2SO4を0.2%、MgSO4・7H2Oを0.05%になるようにそれぞれ添加し、pHを6.0に調整した培地を用いて連続発酵を行った。組換えZymobacter palmaeFERM P-19451(FERM BP-10048)は光硬化性樹脂ENTG-3800(関西ペイント社製)を用いて包括固定化した。連続発酵にはドラフトチューブ型バイオリアクター(流動層型)を用い、固定化担体を充填率20%でリアクターに投入した後、上記培地をリアクター下部から連続的に注入した。さらに、発酵によって生じる炭酸ガスを一旦捕集した後、リアクター下部から再度供給することで流動床を形成させた。30℃、希釈率D=0.1h-1で連続発酵を行ったところ、糖消費率99%以上かつエタノール収率95%以上で1ヶ月以上安定して連続発酵を行うことができた。
稲わらの硫酸糖化により調製した糖液(8%グルコース、3%キシロース)に酵母エキスを1.0%、KH2PO4を1.0%、 (NH4)2SO4を0.2%、MgSO4・7H2Oを0.05%になるようにそれぞれ添加し、pHを6.0に調整した培地を用いて連続発酵を行った。中空円筒型(2mmφ×3mm)ポリプロピレン製担体を菌体懸濁液中に投入することにより、組換えZymobacter palmae FERM P-19451(FERM BP-10048)の付着固定化を行った。連続発酵には固定床バイオリアクター(充填層型)を用い、固定化担体を充填率80%でリアクターに投入した後、上記培地をリアクター下部から連続的に供給した。30℃、希釈率D=0.2h-1で連続発酵を行ったところ、糖消費率99%以上かつエタノール収率95%以上で1ヶ月以上安定して連続発酵を行うことができた。
実施例7の連続発酵装置において、固定床バイオリアクターを2つ直列につなぎ、実施例3と同様の試験を行った。その結果、希釈率D=0.2h-1の条件でも糖消費率99%以上かつエタノール収率95%以上で1ヶ月以上安定して連続発酵を行うことができた。
Claims (11)
- キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼから選ばれる少なくとも1種の酵素をコードする外来遺伝子が導入されたZymobacter属のペントース発酵性形質転換微生物。
- キシロース代謝系酵素生産性菌株由来の、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼから選ばれる少なくとも1種の酵素をコードする遺伝子を含有するDNA断片をベクターに結合させてなる組換えDNA。
- キシロース代謝系酵素生産性菌株が、Escherichia属、Xanthomonas属、Klebsiella属、Rhodobacter属、Flavobacterium属、Acetobacter属、Gluconobacter属、Rhizobium属、Abrobacterium属、Salmonella属またはPseudomonas属に属する微生物である請求項2に記載の組換えDNA。
- キシロース代謝系酵素生産性菌株がEscherichia coliである請求項2に記載の組換えDNA。
- 請求項2〜4のいづれかに記載の組換えDNAが導入されている請求項1に記載の形質転換微生物。
- 導入された組換えDNAのすべてあるいは一部がZymobacter属の宿主細胞のゲノム中に取り込まれた請求項5に記載の形質転換微生物。
- 導入された組換えDNAのすべてあるいは一部がベクター上に存在する請求項5記載の形質転換微生物。
- キシロースを含む糖化原料を、請求項1に記載のペントース発酵性形質転換微生物を用いて発酵させ、得られる発酵液からエタノールを回収することを特徴とするエタノールの製造方法。
- 請求項1に記載のペントース発酵性形質転換微生物を固定化した固定化担体。
- 請求項9に記載の固定化担体を備えたバイオリアクター。
- 請求項9に記載の固定化担体を用いてキシロースを含む糖化原料を連続的に発酵させることを特徴とするエタノールの製造方法。
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