WO2015076279A1 - ２，３－ブタンジオールの製造方法 - Google Patents

２，３－ブタンジオールの製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2015076279A1
WO2015076279A1 PCT/JP2014/080571 JP2014080571W WO2015076279A1 WO 2015076279 A1 WO2015076279 A1 WO 2015076279A1 JP 2014080571 W JP2014080571 W JP 2014080571W WO 2015076279 A1 WO2015076279 A1 WO 2015076279A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
butanediol
fermentation
microorganism
pentose
sugar
Prior art date
Application number
PCT/JP2014/080571
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
匡平 磯部
健司 澤井
河村　健司
山田　勝成
英司 簗瀬
Original Assignee
東レ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP2014215075A external-priority patent/JP2016077262A/ja
Application filed by 東レ株式会社 filed Critical 東レ株式会社
Priority to ES14864767T priority Critical patent/ES2742418T3/es
Priority to BR112016011487-6A priority patent/BR112016011487B1/pt
Priority to CN201480063541.7A priority patent/CN105793429B/zh
Priority to SG11201604094VA priority patent/SG11201604094VA/en
Priority to EP14864767.0A priority patent/EP3072974B1/en
Priority to US15/037,735 priority patent/US10072275B2/en
Publication of WO2015076279A1 publication Critical patent/WO2015076279A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing 2,3-butanediol by microbial fermentation.
  • 2,3-butanediol (hereinafter sometimes referred to as “2,3-BDO”) is an intermediate material for pharmaceuticals and cosmetics, ink, perfume, liquid crystal, insecticide, softening reagent, explosive, plasticizer, etc. As a specific example, it can be a raw material for methyl ethyl ketone (Non-Patent Document 1) and 1,3-butadiene (Non-Patent Document 2). 2,3-BDO is industrially produced by a method of hydrolyzing 2-butene oxide in an aqueous perchloric acid solution.
  • Enterobacteria such as Klebsiella pneumoniae (Non-patent Document 3) and Klebsiella oxytoca (Non-patent Document 4) are known as microorganisms that efficiently fermentatively produce 2,3-butanediol. Since these microorganisms do not require specific vitamins or amino acids for fermentation, there is an advantage that the number of steps required when isolating and purifying 2,3-butanediol from the fermentation broth is reduced. However, these microorganisms are pathogenic and are known to cause respiratory infections and the like. Therefore, in order to cultivate these fermentation bacteria in large quantities for the purpose of industrial 2,3-butanediol production, facilities for strict management are required, leading to an increase in cost.
  • 2,3-butanediol-fermenting microorganisms that are biologically safe and have high fermentation efficiency include methods using Bacillus bacteria such as Bacillus licheniformis (Non-patent Document 5) and Bacillus amyloliquefaciens (Non-patent Document 6). It is disclosed. However, in 2,3-butanediol fermentation by Bacillus licheniformis, it is necessary to use an expensive animal extract as a nutrient source for promoting fermentation.
  • 2,3-butanediol fermentation by Bacillus amyloliquefaciens uses ammonium citrate to promote fermentation, but citric acid has a boiling point close to that of 2,3-butanediol, so if it remains in the culture medium In this case, it is difficult to isolate and purify 2,3-butanediol.
  • sugars derived from non-edible biomass are attracting attention in addition to sugars derived from conventional edible biomass.
  • sugars derived from non-edible biomass are attracting attention in addition to sugars derived from conventional edible biomass.
  • sugars derived from non-edible biomass are decomposed into sugars by saccharifying enzymes.
  • saccharifying enzymes not only hexose sugars such as glucose are used.
  • pentose sugars such as xylose can be obtained simultaneously. Therefore, development of an efficient fermentation technology for raw materials containing pentose is required.
  • Non-patent Document 3 Enterobacteria such as Klebsiella oxytoca (Non-patent Document 3) are known as microorganisms that efficiently fermentatively produce 2,3-butanediol from pentose sugars. Since these microorganisms do not require specific vitamins or amino acids for fermentation, there is an advantage that the number of steps required to purify 2,3-butanediol from the fermentation broth is reduced. However, these microorganisms are pathogenic and are known to cause respiratory infections and the like. Therefore, in order to cultivate these fermentation bacteria in large quantities for the purpose of industrial 2,3-butanediol production, facilities for strict management are required, leading to an increase in cost.
  • Bacillus bacteria such as Bacillus licheniformis (Non-patent Document 9)
  • Paenibacillus polymyxa. examples of microorganisms that are biologically safe and ferment pentose to 2,3-butanediol
  • auxiliary materials such as yeast extract and animal protein hydrolyzate are used, which increases costs.
  • Patent Document 1 Patent Document 2
  • Patent Document 2 Patent Document 2
  • Patent Document 2 Although it is described in Patent Documents 1 and 2 that this transformed microorganism has ethanol productivity, there is no description or suggestion about the ability to ferment pentose to 2,3-butanediol. .
  • Nilegaonkar Potential of Bacillus licheniformis for the production of 2, 3-butanediol. Journal of Fermentation and Bioengineering Volume 82, Issue 4, 1996, Pages 408-410 Yang T, Optimization and scale-up of 2,3-butanediol production by Bacillus amyloliquefaciens B10-127. World J Microbiol Biotechnol. 2012 Apr; 28 (4): 1563-74 Okamoto T, Zymobacter palmae gen. Nov. , Sp. Nov. , A new ethanol-fermenting peritrichous battery isolated from palm sap. Arch Microbiol. 1993; 160 (5): 333-7.
  • an object of the present invention is to establish a method for producing 2,3-butanediol by microbial fermentation using biologically safe microorganisms. It is another object of the present invention to establish an economical method for producing 2,3-butanediol from fermentation raw materials containing pentose as a carbon source by microbial fermentation using biologically safe microorganisms.
  • a genus Zymobacter which has not been known as a 2,3-butanediol-fermenting microorganism, has been capable of fermenting 2,3-butanediol.
  • the present invention has been completed. It was also found that 2,3-butanediol can be produced from a pentose sugar by using a bacterium belonging to the genus Zymobacter, which has the ability to assimilate the pentose sugar.
  • the present invention is as follows (1) to (15).
  • a step of culturing a microorganism belonging to the genus Zymobacter in a fermentation raw material containing a carbon source (Step A), and a step of purifying 2,3-butanediol from the culture solution obtained in the step (Step B) And a process for producing 2,3-butanediol.
  • the microorganism is a transformed microorganism belonging to the genus Zymobacter into which a foreign gene encoding at least one enzyme selected from xylose isomerase, xylulokinase, transaldolase and transketolase has been introduced (1) to ( The method according to 7). (9) The method according to (8), wherein the microorganism is a Zymobacter transformed microorganism into which a foreign gene encoding xylose isomerase, xylulokinase, transaldolase, and transketolase has been introduced. (10) The method according to any one of (7) to (9), wherein the pentose contained in the fermentation raw material of Step A is xylose.
  • 2,3-butanediol in a method for producing 2,3-butanediol from fermentation raw materials by microbial fermentation, 2,3-butanediol can be obtained safely and economically as compared with the prior art. Even when the fermentation raw material contains pentose as a carbon source, 2,3-butanediol can be obtained from the pentose safely and economically.
  • Step A 2,3-butanediol fermentation step
  • a bacterium belonging to the genus Zymobacter is used as a 2,3-butanediol (hereinafter sometimes referred to as “2,3-BDO”) fermentation microorganism.
  • the microorganism to be used may be isolated from the natural environment, or may be partially modified by mutation or genetic recombination.
  • Zymobacter palmae is preferably used from the viewpoint of 2,3-BDO fermentation ability.
  • the fermentation raw material is preferably an ordinary liquid medium containing an assimilable carbon source, an assimilable nitrogen source, inorganic salts, and if necessary, organic micronutrients such as amino acids and vitamins. Moreover, you may contain an antifoamer suitably for the purpose of performing fermentation efficiently.
  • assimilable carbon sources include sugars such as glucose, mannose, galactose, fructose, sucrose, starch, molasses, starch, organic acids such as citric acid, succinic acid and acetic acid, alcohols such as glycerol and ethanol.
  • saccharides are preferably used.
  • the concentration of saccharides in the medium is usually 15 g / L or more, preferably 20 g / L or more in order to efficiently carry out the subsequent purification step of 2,3-butanediol.
  • the total sugar concentration in the fermentation raw material that is a medium is usually 15 to 500 g / L, preferably 20 to 300 g / L. If the total sugar concentration is 15 g / L or less, the effect of improving the yield from the carbon source may decrease. In addition, when the total sugar concentration is low, the production efficiency of 2,3-BDO also decreases.
  • assimilable nitrogen sources include ammonia gas, aqueous ammonia, ammonium salts, urea, nitrates, amino acids, and other organic nitrogen sources used as supplements, such as oil cakes, soybean hydrolysates, casein hydrolysates. Decomposed products, animal tissue hydrolysates, corn steep liquor, yeast or yeast extract, meat extract, various fermented cells and hydrolysates thereof are used. Among these, as the organic nitrogen source, soybean hydrolyzate or corn steep liquor is preferable, and corn steep liquor is more preferable. The concentration of the corn steep liquor contained in the fermentation raw material is not particularly limited.
  • the solid content contained in the corn steep liquor is usually 2.5 g / L to 35 g / L, preferably 5 g / L to 25 g / L. Preferably, it is 10 g / L to 20 g / L.
  • the method for measuring the solid content in corn steep liquor is not particularly limited. For example, the weight difference before and after drying in heat drying is used as the water content, and the remainder obtained by subtracting the water content from the weight before drying is obtained as the solid content. Can do.
  • inorganic salts phosphates, magnesium salts, calcium salts, iron salts, manganese salts, and the like can be appropriately added and used.
  • nicotinic acid may be appropriately added to the medium depending on the growth of microorganisms, and an antifoaming agent may be appropriately added and used.
  • the culture temperature is not particularly limited as long as microorganisms grow, but the temperature is usually 20 to 50 ° C, preferably 25 to 40 ° C.
  • the culture time may be a time during which a purifiable amount of 2,3-BDO accumulates in the medium, and the concentration of carbon source in the medium or the generated 2,3-BDO concentration should be monitored over time. However, it is usually 1 hour to 300 hours, preferably 4 hours to 150 hours.
  • the culture medium pH at the time of culture is usually maintained within the range of pH 4 to 8 by inorganic or organic acid, alkaline substance, urea, calcium carbonate, ammonia gas, etc., but is adjusted to pH 5 to 7 and cultured. It is preferable that pH is 5 or more and less than 6.
  • the aeration in the present invention means that a gas containing oxygen flows into the culture tank.
  • gas_flowing which replaces the air layer on a culture solution with the gas containing oxygen other than the method of allowing the gas containing oxygen to pass through in a culture solution is also included.
  • the culture fluid is stirred in an open atmosphere to generate an air flow over the culture fluid, so that oxygen is introduced into the culture fluid.
  • a method of supplying is also included.
  • aeration is preferably performed by a method of allowing a gas containing oxygen to pass through the culture solution.
  • Conditions for supplying oxygen to the culture medium in the culture of microorganisms can be set as appropriate by combining aeration and agitation.
  • the oxygen transfer capacity coefficient kLa (h ⁇ 1 ) (hereinafter referred to as 30 ° C. water at normal pressure) Simply abbreviated as kLa).
  • kLa indicates the ability to move dissolved oxygen from the gas phase to the liquid phase per unit time during aeration stirring, and is defined by the following formula (1). (Biotechnological Experiments, Japan Biotechnology Society, Bafukan, p. 310 (1992)).
  • dC / dt kLa ⁇ (C * ⁇ C) (1)
  • C dissolved oxygen concentration DO (ppm) in the culture solution
  • C * dissolved oxygen concentration DO (ppm) in equilibrium with the gas phase when oxygen is not consumed by microorganisms
  • KLa in the present invention is a numerical value measured by a gas displacement method (dynamic method).
  • gas displacement method dynamic method
  • water is put into an aeration and agitation culture apparatus into which a dissolved oxygen concentration electrode is inserted, and oxygen in these liquids is replaced with nitrogen gas to reduce the oxygen concentration of the liquid,
  • This is a method of calculating kLa by switching the nitrogen gas to compressed air and measuring the rising process of dissolved oxygen under a predetermined aeration rate, stirring rate and temperature.
  • the kLa set at the time of culturing in the present invention is not particularly limited, but is preferably 9 h ⁇ 1 or more.
  • the upper limit of kLa is not particularly limited, but is preferably 200 h ⁇ 1 or less.
  • the fermentation raw material contains pentose as an assimilable carbon source, and cultivates a microorganism belonging to the genus Zymobacter having the ability to assimilate the pentose, thereby obtaining the pentose as a raw material.
  • a microorganism belonging to the genus Zymobacter having the ability to assimilate the pentose, thereby obtaining the pentose as a raw material.
  • 2,3-butanediol can be produced.
  • the zymobacter genus bacterium used may be isolated from the natural environment, or may be partially modified by mutation or genetic recombination.
  • Zymobacter palmae is preferably used from the viewpoint of 2,3-butanediol fermentation ability.
  • Zymobacter palme normally does not assimilate pentose, but can be granted by introducing a gene involved in assimilation of pentose.
  • an enzyme gene that isomerizes aldopentose to ketopentose can be used.
  • examples of the gene to be used include pentose isomerase, pentose reductase and / or pentol dehydrogenase.
  • Pentose isomerase is defined as an enzyme that catalyzes the isomerization of aldopentose and ketopentose, which are structural isomers of pentose.
  • the pentose isomerase used in the present invention is not particularly limited as long as it has an activity of catalyzing the direct isomerization of pentose.
  • xylose isomerase EC 5.3.1.5
  • arabinose isomerase EC 5. 3.1.3
  • xylose isomerase is an enzyme that catalyzes the direct isomerization of xylose (aldopentose) to xylulose (ketopentose) and / or vice versa, also known as xylose ketoisomerase.
  • Direct isomerization refers to isomerization in one step catalyzed by pentose isomerase, as opposed to two-step conversion via sugar alcohol intermediates catalyzed by pentose reductase and pentol dehydrogenase.
  • the pentose reductase is one of the reductases and means an enzyme having an activity of converting aldopentose into a sugar alcohol using NADH or NADPH as a coenzyme.
  • xylose reductase corresponds to, for example, EC 1.1.1.307 and EC 1.1.1.21, and is an enzyme that converts xylose into xylitol.
  • the arabinose reductase corresponds to EC1.1.1.21, for example, and is an enzyme that converts arabinose into arabitol.
  • it is not the enzyme classified by said EC number if it is an enzyme which has the said activity, it will be contained in the pentose reductase in this invention.
  • Pentol dehydrogenase is one of dehydrogenases and is an enzyme that converts pentol into ketopentose using NAD + as a coenzyme.
  • xylitol dehydrogenase corresponds to, for example, EC 1.1.1.9 or EC 1.1.1.10, and is an enzyme that converts xylitol into xylulose.
  • the arabitol dehydrogenase corresponds to, for example, EC 1.1.1.11 or EC 1.1.1.12. It is an enzyme that converts arabitol into ribose.
  • Even an enzyme that is different from pentol dehydrogenase in terms of classification is included in the pentol dehydrogenase in the present invention as long as it has the above activity.
  • the reaction catalyzed by pentose reductase and pentol dehydrogenase isomerizes aldopentose into ketopentose, similar to pentose isomerase.
  • pentose pentose isomerase can be preferably used, and xylose isomerase can be more preferably used.
  • the xylose isomerase gene used is not particularly limited and may be genomic DNA, cDNA, or the like. Further, it may be derived from any organism such as animals, plants, fungi (yeasts, molds, etc.) and bacteria. Information on such genes can be easily obtained by searching a database published on the web such as NCBI. For example, the base sequence of the Escherichia coli xylose isomerase gene that can be preferably used in the present invention is described in, for example, GenBank Accession No. NC — 007779 REGION: 3909650..3910972.
  • the activity of xylose isomerase can be confirmed by performing an enzymatic reaction in the presence of xylose and measuring isomerized xylulose using HPLC or the like.
  • the xylose isomerase activity can be measured by, for example, a method disclosed in JP 2008-79564.
  • Examples of organisms to be donors of xylose isomerase include Enterobacteriaceae such as Enterobacter genus, Escherichia genus, Klebsiella genus, Erwinia genus, Salmonella genus, etc.
  • Actinoplanes genus Actinoplanes genus, Arthrobacter genus, Streptomyces genus actinomycetes, or Bacillus genus, Paenibacillus genus, Lactobacillus genus, Lactobacillus The genus of Staphylococcus, Thermoanaerobacter (Thermoa) Aerobacter, Thermus, Xanthomonas, Rhizobium, Pseudomonas, Clostridium, Bacteroides, Bacteroides can be used, Bacteroides A microorganism belonging to the genus Escherichia, more preferably Escherichia coli.
  • an enzyme gene having an activity of catalyzing phosphorylation of ketopentose can also be used.
  • the enzyme having an activity of catalyzing ketopentose phosphorylation include xylulokinase (EC 2.7.1.17) and librokinase (EC 2.7.1.16). Can be preferably used.
  • the xylulokinase gene used is not particularly limited and may be genomic DNA, cDNA, or the like. Further, it may be derived from any organism such as animals, plants, fungi (yeasts, molds, etc.) and bacteria. Information on such genes can be easily obtained by searching a database published on the web such as NCBI. For example, the base sequence of the Escherichia coli xylulokinase gene that can be preferably used in the present invention is described in, for example, GenBank Accession No.NC_007779 REGION: 3911044..3912498.
  • xylulokinase The activity of xylulokinase is measured by measuring the phosphorylated xylulose-5-phosphate using HPLC or by using an auxiliary enzyme reaction in the presence of xylulose.
  • auxiliary enzyme reaction for example, Feldmann SD, Sahm H, Springer GA. Cloning and expression of the genes for xyrose isomerase and xylukinase from Klebsiella pneumoniae 1033 in Escherichia coli K12. Mol Gen Genet. 1992 Aug; 234 (2): 201-10. Can be measured by the method disclosed in.
  • Examples of organisms to be donors of xylulokinase include Enterobacteriaceae such as Enterobacter genus, Escherichia genus, Klebsiella genus, Erwinia genus, Salmonella genus, etc.
  • Bacteria Bacteria, lactic acid bacteria such as Bacteroides genus, Lactobacillus genus, Actinoplanes genus, Arthrobacter genus, Streptomyces genus Streptomyces genus Bacillus fungi, Bacillus genus, Paenibacillus genus, Staphylococcus (Staphyll)
  • a microorganism belonging to the genus Coscus, the genus Thermoanaerobacter, the genus Xanthomonas, the genus Rhizobium, the genus Pseudomonas, and the genus Clostridium can be used. And more preferably Escherichia coli.
  • Transketolase is a reaction that converts xylulose-5-phosphate and erythrose-4-phosphate to fructose-6-phosphate and glyceraldehyde-3-phosphate, and vice versa, and / or ribose 5- Defined as an enzyme that catalyzes the reaction of converting phosphate and xylulose 5-phosphate to sedoheptulose-7-phosphate and glyceraldehyde-3-phosphate and vice versa.
  • the transketolase used in the present invention is not particularly limited as long as it has the above-mentioned catalytic activity. For example, EC 2.2.1.1 is applicable.
  • the transketolase and / or transaldolase gene used is not particularly limited and may be genomic DNA, cDNA, or the like. Further, it may be derived from any organism such as animals, plants, fungi (yeasts, molds, etc.) and bacteria. Information on such genes can be easily obtained by searching a database published on the web such as NCBI.
  • the base sequence of the Escherichia coli transketolase gene that can be preferably used in the present invention is described in, for example, GenBank Accession No.NC_007779 REGION: complement (3078300..3080291).
  • the transketolase activity can be determined by performing an enzymatic reaction in the presence of xylulose-5-phosphate and erythrose-4-phosphate and measuring the resulting glyceraldehyde-3-phosphate using HPLC or the like. This can be confirmed by measuring the decrease in NADH using a typical enzyme reaction.
  • a typical enzyme reaction For example, Sprenger GA, Schorken U, Spranger G, Sahn H. et al.
  • Transaldolase is defined as an enzyme that catalyzes the reaction of converting sedheptulose 7-phosphate and glyceraldehyde 3-phosphate into erythrose-4-phosphate and fructose-6-phosphate and vice versa.
  • the transketolase used in the present invention is not particularly limited as long as it has the above-mentioned catalytic activity. For example, EC 2.2.1.2 is applicable.
  • Transaldolase activity can be determined by conducting an enzymatic reaction in the presence of fructose-6-phosphate and erythrose-4-phosphate and measuring the resulting glyceraldehyde-3-phosphate using HPLC or the like. Can be confirmed by measuring a decrease in NADH using a simple enzyme reaction, for example, GA. Springer, U., et al. Schorken, G.M. Springer & H.C. Sahm TransololaseB of Escherichia coli K-12: cloning of its genes, talB, and charactarization of the enzyme from recombinant strains. J. et al. Bacteriol. 1995, 177: 20: 5930-6).
  • transaldolase and / or donor of transaldolase examples include, for example, Enterobacter genus, Escherichia genus, Klebsiella genus, Erwinia genus, Salmonella genus, etc.
  • the microorganism belonging to the genus Zymobacter may be introduced with at least one of the above genes, but (1) xylose isomerase, (2) xylulokinase and (3 (1) a gene into which a foreign gene encoding at least one of transaldolase and transketolase has been introduced, and (1) a xylose isomerase gene, (2) xylulokinase, and (3) a transaldolase and transketase. Those into which a foreign gene encoding both trase is introduced are preferred.
  • the gene to be introduced may be a combination of different donor genes.
  • these genes may be incorporated into genomic DNA in the host genus Zymobacter or may be present on a vector.
  • the method for introducing a gene is not particularly limited, but as a method for introducing a gene present on a vector, for example, methods disclosed in Patent Document 1 and Patent Document 2 can be used. That is, each gene is inserted into a multicloning site of a commercially available cloning plasmid vector for Escherichia coli (for example, pUC118), and a transformant that transforms Escherichia coli to produce a product of each gene is grown. From the grown transformant, the plasmid was recovered, the region containing each introduced gene was excised, and a broad host range vector plasmid (for example, pMFY31 (Agric. Biol.
  • a broad host range vector plasmid for example, pMFY31 (Agric. Biol.
  • a Zymobacter genus transformant having the ability to assimilate pentose can be produced by transforming Zymobacter bacterium with a recombinant plasmid vector inserted into the multiple cloning site.
  • a commercially available one can also be used, and the transformation method itself is well known, for example, as described in Patent Document 1 and Patent Document 2, a T medium containing magnesium ions ( 2.0 wt% glucose, 1.0 wt% Bacto-yeast extract, 1.0 wt% potassium dihydrogen phosphate, 0.2 wt% ammonium sulfate, 0.05 wt% magnesium sulfate
  • the cells can be transformed into competent cells by culturing in a medium such as um heptahydrate (pH 6.0), etc., and then transformed by a conventional method such as electroporation.
  • the transformant can be obtained by culturing and selecting the transformed bacteria in a medium containing xylose as the sole carbon source.
  • the fermentation raw material may contain hexose in addition to pentose.
  • the pentose has five carbons constituting the sugar, and is also called pentose.
  • aldopentose include xylose, arabinose, ribose, and lyxose.
  • ketopentose include ribulose and xylulose.
  • the pentose used in the present invention may be any pentose as long as it can assimilate microorganisms, but is preferably xylose or arabinose, more preferably from the viewpoint of the natural ratio or availability. Is xylose.
  • the hexose has 6 carbons constituting the sugar, and is also called hexose.
  • aldose include glucose, mannose, galactose, allose, growth, and talose.
  • ketose include fructose, psicose, and sorbose.
  • the hexose used in the present invention may be any as long as it can assimilate microorganisms, but from the viewpoint of the natural ratio, availability, etc., preferably glucose, mannose, galactose, More preferred is glucose.
  • the cellulose containing biomass origin sugar liquid known to contain both hexose sugar and pentose sugar is used preferably.
  • the cellulose-containing biomass include plant biomass such as bagasse, switchgrass, corn stover, rice straw, and straw, and woody biomass such as trees and waste building materials.
  • Cellulose-containing biomass contains cellulose or hemicellulose, which is a polysaccharide obtained by dehydrating and condensing sugar, and a sugar solution that can be used as a fermentation raw material is produced by hydrolyzing such a polysaccharide.
  • the method for preparing a cellulose-containing biomass-derived sugar solution is well known, and any method may be used.
  • Such a sugar is produced by acid hydrolysis of biomass using concentrated sulfuric acid to produce a sugar solution.
  • a method of producing a sugar solution by hydrolyzing biomass with dilute sulfuric acid and then treating with an enzyme such as cellulase A. Aden et al., “Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Optimized Co-Current Dirty Acidic Prehydrology and Enzymological Hydrology.” orn Stover "NREL Technical Report (2002)).
  • a method not using an acid a method of hydrolyzing biomass using subcritical water at about 250 to 500 ° C. to produce a sugar solution (Japanese Patent Laid-Open No.
  • the weight ratio of the pentose and hexose contained in the mixed sugar is not particularly limited, but the weight ratio of the pentose and hexose in the mixed sugar is expressed as (pentose): (hexose). And 1: 9 to 9: 1 are preferred. This is a sugar ratio when a cellulose-containing biomass-derived sugar solution is assumed as a mixed sugar.
  • the concentration of hexose contained in the fermentation raw material used in the present invention is not particularly limited in the range of the above total sugar concentration and the ratio of pentose and hexose, but the method for producing 2,3-BDO of the present invention Can be used to obtain a good yield even in a mixed sugar solution containing hexose at a concentration of 5 g / L or more.
  • the fermentation raw material contains a pentose sugar
  • the fermentation raw material includes, in addition to the sugar, an assimilable carbon source that preferably acts on fermentation of 2,3-butanediol-fermenting microorganisms, Nitrogen sources that can be assimilated, inorganic salts, and if necessary, organic micronutrients such as amino acids and vitamins may be appropriately contained.
  • an antifoamer suitably for the purpose of performing fermentation efficiently.
  • nitrogen sources that can be assimilated even when the fermentation raw material contains pentose sugars are as described above, such as ammonia gas, aqueous ammonia, ammonium salts, urea, nitrates, amino acids, and other supplementary uses.
  • Organic nitrogen sources used such as oil cakes, soybean hydrolysates, casein degradation products, corn steep liquor, yeasts or yeast extracts, meat extracts, peptides such as peptones, various fermented cells and their hydrolysates Is done.
  • inorganic salts phosphates, magnesium salts, calcium salts, iron salts, manganese salts, zinc salts and the like can be appropriately added and used.
  • ammonium salts such as ammonium sulfate and ammonium monohydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, monohydrogen phosphate are used to produce 2,3-butanediol by pentose fermentation.
  • Phosphate such as potassium, ammonium monohydrogen phosphate, calcium salt such as calcium chloride, iron salt such as ferrous sulfate, manganese salt such as manganese sulfate, zinc salt such as zinc sulfate, magnesium sulfate
  • EDTA such as magnesium salt, EDTA disodium or a salt thereof.
  • nicotinic acid may be appropriately added to the medium depending on the growth of the microorganism, and an antifoaming agent may be appropriately added and used. .
  • the fermentation raw material contains pentose as an assimilable carbon source and cultivates Zymobacter microorganisms having the ability to assimilate the pentose sugar, the cultivation temperature, the pH during cultivation, the cultivation form of the microorganism
  • the aeration conditions and the oxygen supply conditions to the medium are the same as described above, including the preferable conditions.
  • the culture solution obtained in the 2,3-butanediol fermentation process contains impurities derived from fermentation raw materials and ethanol, which is a fermentation byproduct, in addition to 2,3-butanediol. It is necessary to purify the 2,3-butanediol contained.
  • the 2,3-butanediol purification step from the 2,3-butanediol culture solution is not particularly limited and may be carried out by a technique known to those skilled in the art.
  • the 2,3-butanediol culture is performed. It is preferable to include a step of distilling the liquid.
  • 2,3-butanediol is recovered from the vapor side.
  • the distillation method is not particularly limited, but any of simple distillation, precision distillation, atmospheric distillation, and vacuum distillation, which are generally applicable, may be selected from a thin film distillation apparatus, a plate distillation apparatus, a packed distillation apparatus, or the like. Can do. Moreover, it is applicable to this invention even if it is a batch type or a continuous type. Among them, vacuum distillation is preferable, and the boiling point can be lowered, so that generation of impurities can be suppressed.
  • the heating temperature is preferably 60 ° C. or higher and 150 ° C. or lower.
  • the degree of decompression needs to be remarkably lowered, so that it is very difficult to maintain the apparatus at an industrial level.
  • the temperature is higher than 150 ° C., a trace amount of sugar remaining in the 2,3-butanediol solution is decomposed, and coloring substances are produced as by-products, which is not preferable. Therefore, the degree of vacuum is preferably adjusted so that 2,3-butanediol distills within the above heating temperature range.
  • the 2,3-butanediol culture solution may be directly used in the distillation step, but it is preferable to use it in the desalting step and the concentration step prior to the distillation step.
  • ion exchange treatment is a method of removing ion components in the 2,3-butanediol culture solution using an ion exchanger.
  • ion exchanger ion exchange resin, ion exchange membrane, ion exchange fiber, ion exchange paper, gel ion exchanger, liquid ion exchanger, zeolite, carbonaceous ion exchanger, montmorillonite can be used.
  • a treatment using an ion exchange resin is preferably employed.
  • strong anion exchange resins include “Amberlite” IRA410J, IRA411, IRA910CT manufactured by Organo Corporation, and “Diaion” SA10A, SA12A, SA11A, NSA100, SA20A, SA21A, UBK510L, UBK530, UBK550 manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation. , UBK535, UBK555, etc.
  • weak anion exchange resins examples include “Amberlite” IRA478RF, IRA67, IRA96SB, IRA98, and XE583 manufactured by Organo Corporation and “Diaion” WA10, WA20, WA21J, and WA30 manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation.
  • strong cation exchange resins include “Amberlite” IR120B, IR124, 200CT, 252 manufactured by Organo Corporation and “Diaion” SK104, SK1B, SK110, SK112, PK208, PK212, PK216 manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation.
  • PK218, PK220, PK228, etc. and weak cation exchange resins selected from “Amberlite” FPC3500, IRC76 manufactured by Organo Corporation, “Diaion” WK10, WK11, WK100, WK40L manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation, etc. can do.
  • an anion exchange resin and a cation exchange resin together as the ion exchange resin, and among them, it is better to use a strong anion resin and a strong cation resin capable of removing various ions.
  • the anion exchange resin is preferably regenerated with a dilute alkaline aqueous solution such as sodium hydroxide and used as an OH type.
  • a cation exchange resin it is preferably regenerated with a dilute acidic aqueous solution such as hydrochloric acid and used as an H type. .
  • the desalting method using an ion exchange resin may be a batch method or a column method, and is not particularly limited as long as it is a method capable of efficiently desalting. However, in the manufacturing process, a column method that can be easily used repeatedly is preferably employed.
  • SV space velocity
  • SV space velocity
  • Various types of resins such as gel type, porous type, high porous type, and MR type are commercially available, and these ion exchange resins may have any shape, and an optimal shape may be selected in accordance with the quality of the solution.
  • nanofiltration membrane treatment can be cited as a specific example of the desalting process.
  • the nanofiltration membrane treatment of the 2,3-butanediol culture solution is performed by filtering the 2,3-butanediol culture solution through the nanofiltration membrane, as disclosed in, for example, JP-A-2010-150248.
  • 2,3-butanediol can be efficiently separated on the permeate side, and inorganic salts, sugars, and coloring components can be efficiently separated on the non-permeate side.
  • the material for the nanofiltration membrane polymer materials such as piperazine polyamide, polyamide, cellulose acetate, polyvinyl alcohol, polyimide, polyester, and inorganic materials such as ceramics are used.
  • the nanofiltration membrane is generally used as a flat membrane or a hollow fiber membrane in addition to the spiral membrane element, but the nanofiltration membrane used in the present invention is preferably a spiral membrane element.
  • nanofiltration membrane element used in the present invention include, for example, “GEsepa” of a nanofiltration membrane manufactured by GE Osmonics, which is a cellulose acetate-based nanofiltration membrane, and a nanolayer manufactured by Alfa Laval, which uses polyamide as a functional layer.
  • GEsepa of a nanofiltration membrane manufactured by GE Osmonics, which is a cellulose acetate-based nanofiltration membrane, and a nanolayer manufactured by Alfa Laval, which uses polyamide as a functional layer.
  • NF99 or NF99HF as a filtration membrane
  • NF-45, NF-90, NF-200 or NF-400 as a nano-filtration membrane manufactured by Filmtech with a functional layer of cross-linked piperazine polyamide, or manufactured by the same company as UTC60 manufactured by Toray Industries, Inc.
  • Nanofiltration membrane element SU-210, SU-220, SU-600 or SU-610 is mentioned.
  • NF99 or NF99HF of a nanofiltration membrane manufactured by Alfa Laval Corporation having a functional layer of polyamide, and a functional layer of a crosslinked piperazine polyamide are preferable.
  • the nanofiltration membrane may be filtered, and the filtration pressure is preferably used in the range of 0.1 MPa to 8 MPa. If the filtration pressure is lower than 0.1 MPa, the membrane permeation rate decreases, and if it is higher than 8 MPa, the membrane may be damaged. Also, if the filtration pressure is 0.5 MPa or more and 7 MPa or less, the membrane permeation flux is high, so that the 2,3-butanediol fermentation solution can be efficiently permeated, and the membrane damage can be affected. It is more preferable because of its low property, and it is particularly preferable to use at 1 MPa or more and 6 MPa or less.
  • the concentration of 2,3-butanediol in the 2,3-butanediol solution filtered through the nanofiltration membrane is not particularly limited, but if the concentration is high, the concentration of 2,3-butanediol contained in the permeate is also high. Therefore, energy can be reduced when concentrating, which is suitable for cost reduction.
  • ion exchange treatment or nanofiltration membrane treatment may be used, and these may be used in combination, but at least ion exchange treatment is preferred.
  • the inorganic salt obtained from the permeate side is reduced by treating the 2,3-butanediol culture with nanofiltration membrane 2 1,3-butanediol culture solution is preferably subjected to ion exchange treatment.
  • the removal rate of inorganic salts can be raised by removing the inorganic salt and organic acid which pass a part of nanofiltration membrane with an ion exchange resin.
  • a general method known to those skilled in the art may be used.
  • a method using a reverse osmosis membrane or a heat concentration using an evaporator may be used. The method is preferably applied.
  • the 2,3-butanediol solution is filtered through the reverse osmosis membrane to allow water to pass through to the permeate side, while holding 2,3-butanediol on the non-permeate side of the membrane. It is a method of concentrating by doing.
  • a reverse osmosis membrane preferably used in the present invention, a composite membrane using a cellulose acetate-based polymer as a functional layer (hereinafter also referred to as a cellulose acetate-based reverse osmosis membrane) or a composite membrane using a polyamide as a functional layer (hereinafter, Polyamide-based reverse osmosis membrane).
  • cellulose acetate-based polymer organic acid esters of cellulose such as cellulose acetate, cellulose diacetate, cellulose triacetate, cellulose propionate, cellulose butyrate and the like, or a mixture thereof and those using mixed esters can be mentioned. It is done.
  • the polyamide includes a linear polymer or a crosslinked polymer having an aliphatic and / or aromatic diamine as a monomer.
  • the membrane form an appropriate form such as a flat membrane type, a spiral type, and a hollow fiber type can be used.
  • reverse osmosis membrane used in the present invention include, for example, low pressure type SU-710, SU-720, SU-720F, SU-710L, SU-, which are polyamide-based reverse osmosis membrane modules manufactured by Toray Industries, Inc.
  • Concentration with a reverse osmosis membrane is carried out under pressure, but if the filtration pressure is lower than 1 MPa, the membrane permeation rate decreases, and if it is higher than 8 MPa, the membrane damage is affected, so in the range of 1 MPa to 8 MPa. Preferably there is. Further, when the filtration pressure is in the range of 1 MPa or more and 7 MPa or less, the membrane permeation flux is high, so that the 2,3-butanediol solution can be concentrated efficiently. Most preferably, it is in the range of 2 MPa or more and 6 MPa or less because there is little possibility of affecting the film damage. For a low concentration 2,3-butanediol solution, a method using a reverse osmosis membrane is preferred because of its low cost.
  • the cell separation step for example, a method such as centrifugation or filtration separation can be used. Only one of these methods may be used or a combination thereof may be used.
  • the 2,3-butanediol produced by the present invention is characterized by high purity.
  • evaluation should be performed by using purity measurement by gas chromatography (GC) and purity measurement by UV detection using high performance liquid chromatography (HPLC). Since these are evaluated by the ratio of the area of 2,3-butanediol in the total detection peak area, the higher the ratio, the higher the purity of 2,3-butanediol.
  • GC gas chromatography
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • kLa Measurement Dynamic in which dissolved oxygen electrode (manufactured by Able Co., Ltd.) is inserted into a culture apparatus (manufactured by Able Co., Ltd., Able Co., Ltd.), the dissolved oxygen concentration is measured for each aeration stirring condition, and nitrogen gas is used. KLa was determined by the method. First, 1L of water is added to the culture tank, and the water temperature is adjusted to 30 ° C while stirring at a constant speed. Nitrogen gas is sufficiently blown into the water, and when the electrode value reaches the minimum value, the dissolved oxygen electrode is zero. Calibration was performed. Thereafter, the change in dissolved oxygen concentration over time after switching the aeration gas from nitrogen gas to air or nitrogen gas at a predetermined aeration rate was measured to obtain kLa. Table 1 shows kLa for each aeration stirring condition obtained.
  • Examples 1 to 6 kLa ⁇ 2,3-butanediol fermentation> Z. palmae ATCC51623 strain was transformed into T medium (20 g / L Glucose, 10 g / L Yeast extract, 10 g / L KH 2 PO 4 , 2 g / L (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.5 g / L In a test tube containing 5 mL of MgSO 4 .7H 2 O, pH 6.0), static culture was performed at 30 ° C. for 24 hours to prepare a culture in advance. The whole amount of the pre-cultured solution was added to an Erlenmeyer flask containing 50 mL of T medium, and then static culture was performed at 30 ° C.
  • the preculture solution was added to 1 L of 2,3-butanediol fermentation medium having the composition shown in Table 2, and neutralized with potassium hydroxide so as to have a pH of 5.5 at a temperature of 30 ° C. according to kLa shown in Table 1. Culture was performed. The culture solution was collected using an autosampler (manufactured by Able Co., Ltd.) every 2 hours from the start of the culture until a maximum of 40 hours, and the glucose concentration and 2,3-butanediol concentration in the collected culture solution were measured.
  • 2,3-butanediol concentration measurement column Shodex Sugar SH1011 (manufactured by Showa Denko KK) Column temperature: 65 ° C
  • Mobile phase 0.05 M sulfuric acid aqueous solution, 0.6 mL / min Detection: RI.
  • Table 3 shows the 2,3-butanediol and glucose concentrations in the culture solution and the fermentation yield at the time when the glucose concentration in the culture solution was closest to zero.
  • the obtained 2,3-butanediol culture solution was collected and centrifuged at 4 ° C. and 8000 rpm for 15 minutes, and then the supernatant was filtered through a microfiltration membrane (manufactured by Toray Industries, Inc.) to remove the cells. The above process was performed twice to obtain 2 L of 2,3-butanediol culture solution in total.
  • Examples 7-11 pH Z.
  • the palmae ATCC 51623 strain was cultured by the pre-culture method and the pre-culture method described in Examples 1-6.
  • the preculture was added to 1 L of 2,3-butanediol fermentation medium having the composition shown in Table 2, and the pH was 4.5, 4.8, 5.2, 5.5, 6.1, 6.5, respectively.
  • Culturing was carried out at aeration speed of 0.2 vvm, stirring speed of 400 rpm, and temperature of 30 ° C. while neutralizing with potassium hydroxide so as to be either.
  • the culture solution was collected using an autosampler (manufactured by Able Co., Ltd.) every 2 hours from the start of the culture until a maximum of 40 hours, and the glucose concentration and 2,3-butanediol concentration in the collected culture solution were determined in Example 1. It was measured by the method described in -6. Table 4 shows the concentrations of 2,3-butanediol and glucose and the fermentation yield in the culture solution at the time when the glucose concentration in the culture solution was closest to zero. The 2,3-butanediol culture solution after the fermentation test was collected and centrifuged at 4 ° C.
  • Examples 12 to 16 Sugar concentration
  • the palmae ATCC 51623 strain was cultured by the pre-culture method and the pre-culture method described in Examples 1-6.
  • the preculture solution was added to 1 L of 2,3-butanediol fermentation medium having the composition shown in Table 2 adjusted so that the glucose concentration was 12, 20, 100, 180, or 250 g / L, respectively, and the pH was 5.
  • the cells were cultured at aeration rate of 0.2 vvm, stirring speed of 400 rpm, and temperature of 30 ° C. while neutralizing with potassium hydroxide so as to be 5.
  • the culture solution is collected every 2 to 8 hours after the start of culture using an autosampler (manufactured by Able Co., Ltd.).
  • the glucose concentration and 2,3-butanediol concentration in the collected culture solution are measured in Examples 1 to 6. It was measured by the method described. Table 5 shows the concentrations of 2,3-butanediol and glucose and the fermentation yield in the culture solution when the glucose concentration in the culture solution was closest to zero.
  • the 2,3-butanediol culture solution after the fermentation test was collected and centrifuged at 4 ° C. and 8000 rpm for 15 minutes, and then the supernatant was filtered through a microfiltration membrane (manufactured by Toray Industries, Inc.) to remove the cells. The above process was performed twice to obtain 2 L of 2,3-butanediol culture solution in total.
  • the obtained culture broth was desalted and distilled by the methods described in Examples 1 to 6 to obtain purified 2,3-butanediol.
  • Table 5 shows the GC purity and distillation yield of 2,3-butanediol after distillation determined by the methods described in Examples 1 to 6.
  • Examples 17 to 21 kLa ⁇ 2,3-butanediol fermentation> Zymobacter palmae [pMFY31-xt] disclosed in Patent Documents 1 and 2 was used as a microorganism belonging to the genus Zymobacter imparted with xylose utilization.
  • Zymobacter palmae [pMFY31-xt] was created by transforming Zymobacter palmae with a broad host range recombinant plasmid vector introduced with foreign genes encoding xylose isomerase, xylulokinase, transaldolase and transketolase It is a known transformant and, as described above, is deposited under the accession number of FERM BP-10048 based on the Budapest Treaty and can be sold. Z.
  • the culture broth was added to 1 L of 2,3-butanediol fermentation medium having the composition shown in Table 6 and neutralized with potassium hydroxide so as to have a pH of 5.5 at a temperature of 30 ° C. Culturing was performed under stirring conditions. During the cultivation, a culture solution was appropriately collected, and the xylose concentration and 2,3-butanediol concentration were measured.
  • 2,3-butanediol concentration measurement column Shodex Sugar SH1011 (manufactured by Showa Denko KK) Column temperature: 65 ° C
  • Mobile phase 0.05 M sulfuric acid aqueous solution, 0.6 mL / min Detection: RI.
  • Table 7 shows the concentrations of 2,3-butanediol and xylose in the culture solution and the fermentation yield when the xylose concentration in the culture solution is closest to zero.
  • the obtained 2,3-butanediol culture solution was collected and centrifuged at 4 ° C. and 8000 rpm for 15 minutes, and then the supernatant was filtered through a microfiltration membrane (manufactured by Toray Industries, Inc.) to remove the cells. The above process was performed twice to obtain 2 L of 2,3-butanediol culture solution in total.
  • the analysis conditions for gas chromatography are shown below. Column: RT-BDEXM (0.25 mm ⁇ 30 m, manufactured by Restek) Column temperature: 75 ° C Vaporization chamber, detector temperature: 230 ° C Carrier gas: He Linear velocity: 35 cm / sec Detection: Flame ionization detector (FID).
  • Total yield of 2,3-butanediol It was calculated from the fermentation yield calculated from the result of the fermentation process and the distillation yield calculated from the result of the purification process, by the following formula. The results are shown in Table 7.
  • Total yield of 2,3-butanediol (g / g sugar) (fermentation yield) / 100 ⁇ (distillation yield) / 100.
  • Examples 22-25 pH Z. palmae [pMFY31-xt] was cultured by the method described in Examples 17-21.
  • the culture broth cultured in a flask was added to 1 L of 2,3-butanediol fermentation medium having the composition shown in Table 6, and water was adjusted so that the pH was 4.5, 4.8, 6.1, or 6.5, respectively.
  • the cells were cultured at an aeration rate of 0.2 vvm, a stirring speed of 400 rpm, and a temperature of 30 ° C.
  • an appropriate culture solution was collected, and the xylose concentration and 2,3-butanediol concentration were measured by the methods described in Examples 17-21.
  • Table 8 shows the concentrations of 2,3-butanediol and xylose in the culture solution and the fermentation yield at the time when the xylose concentration in the culture solution was closest to zero.
  • the 2,3-butanediol culture solution after the fermentation test was collected and centrifuged at 4 ° C. and 8000 rpm for 15 minutes, and then the supernatant was filtered through a microfiltration membrane (manufactured by Toray Industries, Inc.) to remove the cells. The above process was performed twice to obtain 2 L of 2,3-butanediol culture solution in total.
  • the obtained culture broth was desalted and distilled by the methods described in Examples 17 to 21 to obtain purified 2,3-butanediol.
  • Table 8 shows the GC purity and distillation yield of 2,3-butanediol after distillation determined by the methods described in Examples 17 to 21.
  • Examples 26 to 28 Sugar concentration palmae [pMFY31-xt] was cultured by the method described in Examples 17-21.
  • the culture broth cultured in a flask was added to 1 L of 2,3-butanediol fermentation medium having the composition shown in Table 6 adjusted so that the xylose concentration was 5.0, 15, or 100 g / L, respectively, and the pH was 5.
  • the cells were cultured at aeration rate of 0.2 vvm, stirring speed of 400 rpm, and temperature of 30 ° C. while neutralizing with potassium hydroxide so as to be 5.
  • an appropriate culture solution was collected, and the xylose concentration and 2,3-butanediol concentration were measured by the methods described in Examples 17-21.
  • Table 9 shows the concentrations of 2,3-butanediol and xylose and the fermentation yield in the culture solution when the xylose concentration in the culture solution was closest to zero.
  • the 2,3-butanediol culture solution after the fermentation test was collected and centrifuged at 4 ° C. and 8000 rpm for 15 minutes, and then the supernatant was filtered through a microfiltration membrane (manufactured by Toray Industries, Inc.) to remove the cells. The above process was performed twice to obtain 2 L of 2,3-butanediol culture solution in total.
  • the obtained culture broth was desalted and distilled by the methods described in Examples 17 to 21 to obtain purified 2,3-butanediol.
  • Table 9 shows the results of determining the GC purity and distillation yield of 2,3-butanediol after distillation by the methods described in Examples 17-21.
  • Examples 29-31 Five carbon sugar ratio palmae [pMFY31-xt] was cultured by the method described in Examples 17-21.
  • the composition shown in Table 6 was prepared by adjusting the concentration of the xylose and glucose (g / L) to (40:20), (20:40), or (2.5: 40) in the culture solution cultured in the flask. was added to 1 L of 2,3-butanediol fermentation medium, and the cells were cultured at an aeration rate of 0.2 vvm, an agitation rate of 400 rpm, and a temperature of 30 ° C. while neutralizing with potassium hydroxide so that the pH was 5.5.
  • the culture broth was appropriately collected, and the sugar concentration and 2,3-butanediol concentration were measured by the methods described in Examples 17-21.
  • Table 10 shows the 2,3-butanediol and sugar concentrations in the culture solution and the fermentation yield at the time when the sugar concentration in the culture solution was closest to zero.
  • the 2,3-butanediol culture solution after the fermentation test was collected and centrifuged at 4 ° C. and 8000 rpm for 15 minutes, and then the supernatant was filtered through a microfiltration membrane (manufactured by Toray Industries, Inc.) to remove the cells. The above process was performed twice to obtain 2 L of 2,3-butanediol culture solution in total.
  • the obtained culture broth was desalted and distilled by the methods described in Examples 17 to 21 to obtain purified 2,3-butanediol.
  • Table 10 shows the results of determining the GC purity and distillation yield of 2,3-butanediol after distillation by the methods described in Examples 17-21.
  • Examples 32 to 35 Organic nitrogen source
  • the palmae ATCC 51623 strain was cultured by the pre-culture method and the pre-culture method described in Examples 1-6.
  • a preculture solution is added to 1 L of a medium in which the corn steep liquor in the 2,3-butanediol fermentation medium having the composition shown in Table 2 is replaced with various organic nitrogen sources shown in Table 11 so that the pH becomes 5.5.
  • the culture was performed at an aeration rate of 0.2 vvm, an agitation rate of 400 rpm, and a temperature of 30 ° C.
  • the culture solution is collected every 2 to 4 hours after the start of culture using an autosampler (manufactured by Able Co., Ltd.).
  • the glucose concentration and 2,3-butanediol concentration in the collected culture solution are measured in Examples 1 to 6. It was measured by the method described. Table 12 shows the concentrations of 2,3-butanediol and glucose and the fermentation yield in the culture solution when the glucose concentration in the culture solution was closest to zero.
  • the 2,3-butanediol culture solution after the fermentation test was collected and centrifuged at 4 ° C. and 8000 rpm for 15 minutes, and then the supernatant was filtered through a microfiltration membrane (manufactured by Toray Industries, Inc.) to remove the cells. The above process was performed twice to obtain 2 L of 2,3-butanediol culture solution in total.
  • the obtained culture broth was desalted and distilled by the methods described in Examples 1 to 6 to obtain purified 2,3-butanediol.
  • Table 12 shows the results of determining the GC purity and distillation yield of 2,3-butanediol after distillation by the methods described in Examples 1-6.
  • 2,3-Butanediol (2,3-BDO) obtained by the method of the present invention is a raw material for intermediates of medicines and cosmetics, inks, perfumes, liquid crystals, insecticides, softening reagents, explosives, plasticizers, etc. As a useful compound.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

要約　生物的に安全な微生物を利用した微生物発酵による２，３－ブタンジオールの製造方法が開示されている。２，３－ブタンジオールの製造方法は、炭素源を含む発酵原料中で、ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属微生物を培養する工程（工程Ａ）、およびこの工程で得られた培養液から２，３－ブタンジオールを精製する工程（工程Ｂ）を含む。この方法において、炭素源が、五炭糖を含み、ザイモバクター属微生物が、五炭糖を資化する能力を有する方法も開示されている。

Description

２，３－ブタンジオールの製造方法
　本発明は、微生物発酵による２，３－ブタンジオールの製造方法に関する。
　２，３－ブタンジオールは（以下、「２，３－ＢＤＯ」と呼ぶことがある）は、医薬品や化粧品の中間体原料、インク、香水、液晶、殺虫剤、軟化試薬、爆薬、可塑剤などの原料として用いられる有用な化合物であり、具体例として、メチルエチルケトン（非特許文献１）や１，３－ブタジエン（非特許文献２）の原料となりうる。２，３－ＢＤＯは工業的には２－ブテンオキシドを過塩素酸水溶液中で加水分解する方法で製造されている。また、近年では石油資源の枯渇や温暖化問題への対応として持続可能な循環型社会への転換が迫られており、化学産業においても、石油原料からバイオマス由来原料へのシフトが盛んに研究されている中で、微生物発酵法による２，３－ブタンジオールの製造方法が注目されつつある。
　２，３－ブタンジオールを効率よく発酵生産する微生物にはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（非特許文献３）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｏｘｙｔｏｃａ（非特許文献４）などの腸内細菌が知られている。これらの微生物は発酵に特定のビタミンやアミノ酸等を必要としないため、発酵液から２，３－ブタンジオールを単離・精製する際に必要となる工程が少なくすむという利点がある。しかしながら、これらの微生物には病原性があり、呼吸器感染症などを引き起こすことが知られている。そのため産業的な２，３－ブタンジオール製造を目的としてこれらの発酵菌を大量培養しようとした場合には厳重な管理のための設備が必要であり、コストの増大に繋がる。
　生物的に安全であり、かつ発酵効率のよい２，３－ブタンジオール発酵微生物としては、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（非特許文献５）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ（非特許文献６）などのバチルス科細菌を用いる方法が開示されている。しかしながら、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓによる２，３－ブタンジオール発酵では発酵を促進するための栄養源として高価な動物性エキスを使用する必要がある。また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓによる２，３－ブタンジオール発酵では発酵を促進するためにクエン酸アンモニウムが使用されるが、クエン酸は２，３－ブタンジオールと沸点が近いため、培養液中に残存した場合には２，３－ブタンジオールの単離・精製が困難である。
　一方、微生物発酵の発酵原料としては、従来の可食バイオマス由来の糖の他、非可食バイオマス由来の糖が注目されている。発酵原料として非可食バイオマス由来の糖を使用する際には、非可食バイオマスに含まれるセルロース、ヘミセルロースなどを糖化酵素によって糖に分解するが、この際にグルコースなどの六炭糖だけではなく、キシロースなどの五炭糖も同時に得られる。そのため、五炭糖を含む原料の効率的な発酵技術の開発が求められている。
　五炭糖から２，３－ブタンジオールを効率よく発酵生産する微生物にはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｏｘｙｔｏｃａ（非特許文献３）などの腸内細菌が知られている。これらの微生物は発酵に特定のビタミンやアミノ酸等を必要としないため、発酵液から２，３－ブタンジオールを精製する際に必要となる工程が少なくすむという利点がある。しかしながら、これらの微生物には病原性があり、呼吸器感染症などを引き起こすことが知られている。そのため産業的な２，３－ブタンジオール製造を目的としてこれらの発酵菌を大量培養しようとした場合には厳重な管理のための設備が必要であり、コストの増大に繋がる。
　一方、生物的に安全であり、かつ五炭糖を２，３－ブタンジオールへと発酵する微生物としては、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（非特許文献９）やＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｏｌｙｍｙｘａなどのバチルス科細菌（非特許文献１０）を用いる方法が開示されている。しかしながら、これらの微生物を用いる２，３－ブタンジオール発酵では酵母エキスや動物性タンパク加水分解物などの高価な副原料を使用するため、コストが増大する。
　また、ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属微生物にキシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードする外来遺伝子が導入され、五炭糖を資化する能力を有するザイモバクター属の形質転換微生物が知られている（特許文献１、特許文献２）。しかしながら、この形質転換微生物が、エタノール生産性を有することは、特許文献１及び２に記載されているが、五炭糖を２，３－ブタンジオールへと発酵する能力については記載も示唆もない。
特開2005-261421号公報 米国特許出願公開2007/0298476号
Ａ．Ｎ．Ｂｏｕｒｎｓ，Ｔｈｅ　Ｃａｔａｌｙｔｉｃ　Ａｃｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ａｌｕｍｉｎｉｕｍ　Ｓｉｌｉｃａｔｅｓ，Ｃａｎａｄｉａｎ　Ｊ．Ｒｅｓ．（１９４７年） Ｎａｔｈａｎ　Ｓｈｌｅｃｈｔｅｒ，Ｐｙｒｏｌｙｓｉｓ　ｏｆ　２，３－ｂｕｔｙｌｅｎｅ　Ｇｌｙｃｏｌ　Ｄｉａｃｅｔａｔｅ　ｔｏ　Ｂｕｔａｄｉｅｎｅ，Ｉｎｄｕ．Ｅｎｇ．Ｃｈｅｍ．９０５（１９４５年） Ｍａ　ＣＱ，　Ｅｎｈａｎｃｅｄ　２，３－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　ＳＤＭ．　Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　２００９；８２：４９-５７ Ｊｉ　ＸＪ，　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｏｘｙｔｏｃａ　ｆｏｒ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　２，３－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ　ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｇｅｎｅ．　Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　２０１０；８５：１７５１-８． Ｓ．　Ｓ．　Ｎｉｌｅｇａｏｎｋａｒ，　Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　２，　３－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｖｏｌｕｍｅ　８２，　Ｉｓｓｕｅ　４，　１９９６，　Ｐａｇｅｓ　４０８-４１０ Ｙａｎｇ　Ｔ，　Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｃａｌｅ－ｕｐ　ｏｆ　２，３－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ　Ｂ１０－１２７．　Ｗｏｒｌｄ　Ｊ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　２０１２　Ａｐｒ；２８（４）：１５６３－７４ Ｏｋａｍｏｔｏ　Ｔ，　Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ　ｐａｌｍａｅ　ｇｅｎ．　ｎｏｖ．，　ｓｐ．　ｎｏｖ．，　ａ　ｎｅｗ　ｅｔｈａｎｏｌ－ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ　ｐｅｒｉｔｒｉｃｈｏｕｓ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｐａｌｍ　ｓａｐ．　Ａｒｃｈ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　１９９３；１６０（５）：３３３－７． Ｊａｎｓｅｎ　ＮＢ，　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　２，３－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ　ｆｒｏｍ　Ｄ－ｘｙｌｏｓｅ　ｂｙ　Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｏｘｙｔｏｃａ　ＡＴＣＣ　８７２４．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｅｎｇ．　１９８４　Ａｐｒ；２６（４）：３６２－９． Ｗａｎｇ　Ｑ，　Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ　ｆｏｒ　ｃｈｉｒａｌ　ｐｕｒｅ　Ｄ－２，３－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｅｎｇ．　２０１２　Ｊｕｌ；１０９（７）：１６１０－２１． Ｍａｒｗｏｔｏ　Ｂ，　Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａｃｅｔａｔｅ　ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｘｙｌｏｓｅ　ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｏｌｙｍｙｘａ．　Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　２００４　Ｍａｒ；６４（１）：１１２－９．
　前述のとおり、従来の微生物発酵による２，３－ブタンジオールの製造方法において生物的に安全な微生物を用いる場合、高コストになる、あるいは副生物との分離が困難であることが課題であった。
　そこで本発明は、生物的に安全な微生物を利用した微生物発酵による２，３－ブタンジオールの製造方法を確立することを目的とする。さらに、炭素源として五炭糖を含む発酵原料から、生物的に安全な微生物を利用した微生物発酵による経済的な２，３－ブタンジオールの製造方法を確立することをも目的とする。
　本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、これまで２，３－ブタンジオール発酵微生物としては知られていなかったザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属細菌が２，３－ブタンジオール発酵能を有することを見出し、本発明を完成するに至った。また、該ザイモバクター属細菌として、五炭糖を資化する能力を有するものを用いることにより、五炭糖から２，３－ブタンジオールを製造することが可能であることを見出した。
　すなわち、本発明は以下の（１）～（１５）の通りである。
（１）炭素源を含む発酵原料中で、ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属微生物を培養する工程（工程Ａ）、および
　該工程で得られた培養液から２，３－ブタンジオールを精製する工程（工程Ｂ）を含む、２，３－ブタンジオールの製造方法。
（２）前記微生物がザイモバクター・パルメ（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ　ｐａｌｍａｅ）である、（１）に記載の方法。
（３）前記工程Ａが通気条件下での培養である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記工程Ａが酸素移動容量係数（ｋＬａ）９ｈ－１以上の条件での培養である、（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記工程ＡがｐＨ５～７の条件での培養である、（１）から（４）のいずれかに記載の２，３－ブタンジオールの製造方法。
（６）前記工程Ａが総糖濃度２０ｇ／Ｌ以上の培地での培養である、（１）から（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記炭素源が、五炭糖を含み、前記ザイモバクター属微生物が、五炭糖を資化する能力を有する（１）から（６）のいずれかに記載の方法。
（８）前記微生物が、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼから選ばれる少なくとも１つの酵素をコードする外来遺伝子が導入されたザイモバクター属の形質転換微生物である、（１）から（７）に記載の方法。
（９）前記微生物が、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードする外来遺伝子が導入されたザイモバクター属の形質転換微生物である、（８）に記載の方法。
（１０）前記工程Ａの発酵原料に含まれる五炭糖がキシロースである、（７）から（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）前記発酵原料中の総糖に対するキシロースの存在比率が５～１００％である、（７）から（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）前記発酵原料がバイオマス由来の糖液を含む、（７）から（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）前記工程Ａの発酵原料がコーンスティープリカーを含む、（１）から（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）前記工程Ｂが蒸留工程を含む、（１）から（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）前記蒸留工程前に脱塩処理工程を含む、（１４）に記載の方法。
（１６）前記脱塩処理工程としてイオン交換処理工程を含む、（１５）に記載の方法。
　本発明によれば、微生物発酵にて発酵原料から２，３－ブタンジオールを製造する方法において、従来技術に比べて安全かつ経済的に２，３－ブタンジオールを得ることができる。また、発酵原料が炭素源として五炭糖を含む場合でも、安全かつ経済的に五炭糖から２，３－ブタンジオールを得ることができる。
工程Ａ：２，３－ブタンジオール発酵工程
　本発明では２，３－ブタンジオール（以下、「２，３－ＢＤＯ」と呼ぶことがある）発酵微生物としてザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属細菌を使用することを特徴とする。使用する微生物は自然環境から単離されたものでもよく、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものでもよい。２，３－ＢＤＯの発酵能を有するザイモバクター属細菌の具体例としては、２，３－ＢＤＯ発酵能の観点からザイモバクター・パルメ（Ｚｙｍｏｂａｔｃｅｒ　ｐａｌｍａｅ）が好ましく利用される。
　発酵原料は、同化可能な炭素源、同化可能な窒素源、無機塩類、および必要に応じてアミノ酸、およびビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地が良い。また、発酵を効率よく行うことを目的に適宜消泡剤を含有させてもよい。
　同化可能な炭素源の具体例としては、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、シュクロース、スターチ、廃糖蜜、澱粉などの糖類、クエン酸、コハク酸、酢酸などの有機酸、グリセロール、エタノールなどのアルコールが用いられるが、好ましくは糖類が用いられる。糖類が用いられる場合の培地中の糖類の濃度は、後段の２，３－ブタンジオールの精製工程を効率よく行うために通常、１５ｇ／Ｌ以上、好ましくは２０ｇ／Ｌ以上である。培地である発酵原料中の総糖濃度は、通常、１５～５００ｇ／Ｌであり、２０～３００ｇ／Ｌが好ましい。総糖濃度が１５ｇ／Ｌ以下であると、炭素源からの収率向上の効果が低下してしまうことがある。また、総糖濃度が低いと２，３－ＢＤＯの生産効率も低下してしまう。
　同化可能な窒素源の具体例としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、アミノ酸、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば、油粕類、大豆加水分解物、カゼイン加水分解物、動物組織加水分解物、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。このうち有機窒素源としては大豆加水分解物またはコーンスティープリカーが好ましく、コーンスティープリカーがより好ましい。発酵原料に含まれるコーンスティープリカーの濃度は特に限定されないが、例えばコーンスティープリカーに含まれる固形分として、通常、２．５ｇ／Ｌ～３５ｇ／Ｌ、好ましくは５ｇ／Ｌ～２５ｇ／Ｌ、より好ましくは１０ｇ／Ｌ～２０ｇ／Ｌである。コーンスティープリカーに含まれる固形分の測定方法としては特に限定されないが、例えば、加熱乾燥における乾燥前後の重量差を水分含量とし、乾燥前の重量より水分含量を引いた残りを固形分として求めることができる。
無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加使用することができる。
　その他、微生物の生育に応じてニコチン酸を培地に適宜添加使用してもよく、また、消泡剤を適宜添加使用してもよい。
　培養温度は、微生物が生育する範囲であれば特に限定されないが、通常、温度が２０～５０℃、好ましくは２５～４０℃の範囲で行われる。また、培養時間は、精製可能な量の２，３－ＢＤＯが培地に蓄積される時間であればよく、培地中の炭素源濃度又は生成した２，３－ＢＤＯ濃度を経時的にモニターすることにより適宜設定することが可能であり、特に限定されないが、通常、１時間～３００時間、好ましくは４時間～１５０時間である。
　培養時の培地ｐＨは、無機あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガスなどによって、通常、ｐＨ４～８の範囲内に維持されるが、ｐＨ５～７に調節して培養を行うことが好ましく、ｐＨ５以上６未満がより好ましい。
　微生物の培養形態には特に制限はなく、バッチ培養、流加発酵、連続培養などで行う。
　本発明では通気条件下で微生物を培養することが好ましい。本発明における通気とは、培養槽の内部に酸素を含む気体を流入させることを意味する。通気方法としては特に制限はないが、例えば、培養液中に酸素を含んだ気体を通過させる方法のほかに、培養液上の空気層を、酸素を含む気体で置換する上面通気も含まれる。また、上面通気には培養槽に酸素を含む気体を吹き込む方法のほかに、大気開放された状態で培養液を攪拌することで培養液上に空気の流れを生じさせ、培養液中に酸素を供給する方法も含まれる。本発明では、培養液中に酸素を含んだ気体を通過させる方法によって通気することが好ましい。
　微生物の培養における培地への酸素供給条件は、通気と攪拌とを組み合わせることで適宜設定でき、常圧で３０℃の水を対象とした場合の酸素移動容量係数ｋＬａ（ｈ－１）（以下、単にｋＬａと略す。）で表される。ｋＬａとは、通気攪拌時において、単位時間に気相から液相へ酸素を移動させ溶存酸素を生成させる能力を示すものであり、以下の式（１）で定義される。（生物工学実験書、日本生物工学会編、培風館、ｐ．３１０（１９９２））。
ｄＣ／ｄｔ＝ｋＬａ×（Ｃ＊－Ｃ）・・・式（１）。
　ここで、Ｃ：培養液中の溶存酸素濃度ＤＯ（ｐｐｍ）、Ｃ＊：微生物による酸素の消費がない場合の気相と平衡の溶存酸素濃度ＤＯ（ｐｐｍ）、ｋＬａ：酸素移動容量係数（ｈｒ－１）である。上記式（１）より、下記式（２）が導かれるため、通気した時間に対して、Ｃ＊－Ｃの対数をプロットすることで、ｋＬａを求めることができる。
Ｉｎ（Ｃ＊－Ｃ）＝－ｋＬａ×ｔ・・・式（２）。
　本発明でのｋＬａは気体置換法（ダイナミック法）により測定される数値である。気体置換法（ダイナミック法）とは、溶存酸素濃度電極を差し込んだ通気攪拌培養装置に水を入れ、これらの液体中の酸素を窒素ガスにより置換して該液体の酸素濃度を低下させ、次に窒素ガスを圧縮空気に切り替え、所定の通気速度、攪拌速度および温度下での溶存酸素の上昇過程を測定することによりｋＬａを計算する方法である。
　本発明での培養時に設定するｋＬａは特に制限されないが、好ましくは９ｈ－１以上である。ｋＬａの上限は、特に限定されないが、好ましくは２００ｈ－１以下である。
　本発明の方法において、発酵原料が、同化可能な炭素源として五炭糖を含み、五炭糖を資化する能力を有するザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属微生物を培養することにより、該五炭糖を原料として２，３－ブタンジオールを製造することができる。この場合、使用するザイモバクター属細菌は自然環境から単離されたものでもよく、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものでもよい。２，３－ブタンジオールの発酵能を有するザイモバクター属細菌の具体例としては、２，３－ブタンジオール発酵能の観点からザイモバクター・パルメ（Ｚｙｍｏｂａｔｃｅｒ　ｐａｌｍａｅ）が好ましく利用される。ザイモバクター・パルメは通常五炭糖を資化しないが、五炭糖の資化に関わる遺伝子を導入することで付与することができる。
　本発明で導入する遺伝子としては、アルドペントースをケトペントースに異性化する酵素遺伝子を用いることができる。用いる遺伝子としては、例えばペントースイソメラーゼ、ペントースレダクターゼおよび／またはペントールデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。
　ペントースイソメラーゼは、五炭糖（ペントース）のうち構造異性体であるアルドペントースとケトペントースの異性化を触媒する酵素として定義される。本発明に用いられるペントースイソメラーゼは五炭糖の直接的な異性化を触媒する活性を持っていれば特に限定されないが、例えば、キシロースイソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．５）やアラビノースイソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．３）が挙げられる。この中で、例えばキシロースイソメラーゼはキシロース（アルドペントース）のキシルロース（ケトペントース）への、かつ／またはその逆の直接的な異性化を触媒する酵素であり、キシロースケトイソメラーゼとしても知られる。直接的な異性化とは、ペントースレダクターゼおよびペントールデヒドロゲナーゼにより触媒される、糖アルコール中間体を経た２段階転化とは異なり、ペントースイソメラーゼにより触媒される１段階での異性化のことを指す。
　ペントースレダクターゼとは、還元酵素のひとつであり、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを補酵素としてアルドペントースを糖アルコールに変換する活性を有する酵素を意味する。例えば、キシロースレダクターゼは例えばＥＣ１．１．１．３０７やＥＣ１．１．１．２１が該当し、はキシロースをキシリトールに変換する酵素である。アラビノースレダクターゼは例えばＥＣ１．１．１．２１が該当し、アラビノースをアラビトールに変換する酵素である。また、前記ＥＣ番号で分類される酵素でなくとも、上記活性を有する酵素であれば、本発明中におけるペントースレダクターゼに含まれる。
　ペントールデヒドロゲナーゼとは、脱水素酵素のひとつであり、ＮＡＤ＋を補酵素としてペントールをケトペントースに変換する酵素である。例えば、キシリトールデヒドロゲナーゼは例えばＥＣ１．１．１．９やＥＣ１．１．１．１０が該当し、キシリトールをキシルロースに変換する酵素である。アラビトールデヒドロゲナーゼは例えばＥＣ１．１．１．１１やＥＣ１．１．１．１２が該当し、アラビトールをリボースに変換する酵素である。分類上ペントールデヒドロゲナーゼと異なる酵素であっても、上記活性を有する酵素であれば、本発明中におけるペントールデヒドロゲナーゼに含まれるとする。
　ペントースレダクターゼとペントールデヒドロゲナーゼが触媒する反応は、ペントースイソメラーゼと同様に、アルドペントースをケトペントースに異性化する。
　上記のアルドペントースとケトペントースの異性化を触媒する酵素のうち、好ましくはペントースのペントースイソメラーゼ用いることができ、より好ましくはキシロースイソメラーゼを用いることができる。
　用いるキシロースイソメラーゼ遺伝子は特に限定されることはなく、ゲノムＤＮＡのほか、ｃＤＮＡ等であってもよい。また、動物、植物、真菌（酵母、カビ等）、細菌などいずれの生物に由来するものであってもよい。こうした遺伝子に関する情報は、ＮＣＢＩ等のウェブにて公開されているデータベースにて検索を行うことで簡単に知ることができる。例えば、本発明において好ましく用いることができる、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）のキシロースイソメラーゼ遺伝子の塩基配列は、例えば、GenBank Accession No.NC_007779 REGION: 3909650..3910972に記載されている。
　キシロースイソメラーゼの活性は、キシロース存在下で酵素反応を行い、異性化されたキシルロースをＨＰＬＣなどを用いて測定することで確認することができる。キシロースイソメラーゼ活性は、例えば特開２００８－７９５６４に開示される方法で測定できる。
　キシロースイソメラーゼの供与体となる生物としては、例えば、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属などの腸内細菌科類、アクチノプラネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属などの放線菌類、あるいはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属に属する微生物を用いることができ、好ましくはエシェリシア属に属する微生物であり、さらに好ましくは、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）である。
　また本発明で導入する遺伝子としては、ケトペントースのリン酸化を触媒する活性を有する酵素遺伝子を用いることもできる。ケトペントースのリン酸化を触媒する活性を有する酵素としては、例えば、キシルロキナーゼ（ＥＣ　２．７．１．１７）やリブロキナーゼ（ＥＣ　２．７．１．１６）が挙げられるが、キシルロキナーゼを好ましく用いることができる。
　用いるキシルロキナーゼ遺伝子は特に限定されることはなく、ゲノムＤＮＡのほか、ｃＤＮＡ等であってもよい。また、動物、植物、真菌（酵母、カビ等）、細菌などいずれの生物に由来するものであってもよい。こうした遺伝子に関する情報は、ＮＣＢＩ等のウェブにて公開されているデータベースにて検索を行うことで簡単に知ることができる。例えば、本発明において好ましく用いることができる、エシェリシア・コリのキシルロキナーゼ遺伝子の塩基配列は、例えば、GenBank Accession No.NC_007779 REGION: 3911044..3912498に記載されている。
　キシルロキナーゼの活性は、キシルロース存在下で酵素反応を行い、リン酸化されたキシルロース－５－リン酸をHPLCなどを用いて測定するか、補助的な酵素反応を用いてNADPHの増加などを測定することで確認でき、例えば、Ｆｅｌｄｍａｎｎ　ＳＤ，　Ｓａｈｍ　Ｈ，　Ｓｐｒｅｎｇｅｒ　ＧＡ．　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｓ　ｆｏｒ　ｘｙｌｏｓｅ　ｉｓｏｍｅｒａｓｅ　ａｎｄ　ｘｙｌｕｌｏｋｉｎａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　１０３３　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ１２．　Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ．　１９９２　Ａｕｇ；２３４（２）：２０１－１０．に開示される方法により測定できる。
　キシルロキナーゼの供与体となる生物としては、例えば、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属などの腸内細菌科細菌、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属などの乳酸菌類、またアクチノプラネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属などの放線菌類、あるいはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、に属する微生物を用いることができ、好ましくは、エシェリシア属に属する微生物であり、さらに好ましくはエシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）である。
　さらに、本発明で導入する遺伝子としてはトランスケトラーゼおよび／またはトランスアルドラーゼ活性を有する酵素遺伝子を用いることもできる。トランスケトラーゼは、キシルロース－５－リン酸およびエリスロース－４－リン酸をフルクトースー６－リン酸およびグリセルアルデヒド－３－リン酸へと変換する反応及びその逆反応、および／またはリボース５－リン酸およびキシルロース５－リン酸をセドヘプツロース－７－リン酸およびグリセルアルデヒド－３－リン酸へと変換する反応及びその逆反応を触媒する酵素と定義される。本発明に用いられるトランスケトラーゼは上記の触媒活性を持っていれば特に限定されないが、例えばＥＣ２．２．１．１が該当する。
　用いるトランスケトラーゼおよび／あるいはトランスアルドラーゼ遺伝子は特に限定されることはなく、ゲノムＤＮＡのほか、ｃＤＮＡ等であってもよい。また、動物、植物、真菌（酵母、カビ等）、細菌などいずれの生物に由来するものであってもよい。こうした遺伝子に関する情報は、ＮＣＢＩ等のウェブにて公開されているデータベースにて検索を行うことで簡単に知ることができる。例えば、本発明において好ましく用いることができる、エシェリシア・コリのトランスケトラーゼ遺伝子の塩基配列は、例えば、GenBank Accession No.NC_007779 REGION: complement(3078300..3080291)に記載されている。また、例えば、本発明において好ましく用いることができる、エシェリシア・コリのトランスアルドラーゼ遺伝子の塩基配列は、例えば、GenBank Accession No.NC_007779 REGION: 8238..9191に記載されている。
　トランスケトラーゼの活性は、キシルロース－５－リン酸およびエリスロース－４－リン酸存在下で酵素反応を行い、生成したグリセルアルデヒド－３－リン酸をHPLCなどを用いて測定するか、補助的な酵素反応を用いてNADHの減少などを測定することで確認でき、例えば、Ｓｐｒｅｎｇｅｒ　ＧＡ，　Ｓｃｈｏｒｋｅｎ　Ｕ，　Ｓｐｒｅｎｇｅｒ　Ｇ，　Ｓａｈｍ　Ｈ．　Ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ　Ａ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ１２．　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ｆｒｏｍ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓ．　Ｅｕｒ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１９９５　Ｊｕｎ　１；２３０（２）：５２５－３２．に開示される方法で測定できる。
　トランスアルドラーゼはセドヘプツロース７－リン酸およびグリセルアルデヒド３－リン酸をエリスロース－４－リン酸およびフルクトース－６－リン酸へと変換する反応及びその逆反応を触媒する酵素と定義される。本発明に用いられるトランスケトラーゼは上記の触媒活性を持っていれば特に限定されないが、例えばＥＣ２．２．１．２が該当する。
　トランスアルドラーゼの活性は、フルクトース－６－リン酸およびエリスロース－４－リン酸存在下で酵素反応を行い、生成したグリセルアルデヒド－３－リン酸をHPLCなどを用いて測定するか、補助的な酵素反応を用いてNADHの減少などを測定することで確認でき、例えば、ＧＡ．Ｓｐｒｅｎｇｅｒ，Ｕ．Ｓｃｈｏｒｋｅｎ，Ｇ．Ｓｐｒｅｎｇｅｒ　＆　Ｈ．Ｓａｈｍ　ＴｒａｎｓａｌｄｏｌａｓｅＢ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ－１２：ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｇｅｎｅ，ｔａｌＢ，ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ｆｒｏｍ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓ）．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９５，１７７：２０：５９３０－６）により記載される方法により測定され得る。
　トランスアルドラーゼおよび／またはトランスアルドラーゼの供与体となる生物としては、例えば、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属などの腸内細菌科類、アクチノプラネス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属などの放線菌類、あるいはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属に属する微生物を用いることができ、好ましくはエシェリシア属に属する微生物であり、さらに好ましくは、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）である。
　ザイモバクター属微生物が、五炭糖を資化する能力を有する限り、上記した各遺伝子の少なくともいずれかを導入したものであってよいが、（１）キシロースイソメラーゼ、（２）キシルロキナーゼ並びに（３）トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼの少なくともいずれか一方をコードする外来遺伝子が導入されたものが好ましく、さらには、（１）キシロースイソメラーゼ遺伝子、（２）キシルロキナーゼ並びに（３）トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼの両者をコードする外来遺伝子が導入されたものが好ましい。
　上記以外の微生物であって、キシロース分解能を有するもの、さらにはプロモーター部位やリボソーム結合部位の異常などによりキシロース分解能は有しないが、そのＤＮＡ上にキシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼまたはトランスケトラーゼ遺伝子をコードする微生物も供与体として用いることができる。
　導入する遺伝子は異なる複数の供与体の遺伝子を組み合わせてもよい。またそれらの遺伝子は宿主となるザイモバクター属細菌内のゲノムＤＮＡに取り込まれてもよいし、ベクター上に存在していてもよい。
　遺伝子の導入方法としては特に制限されないが、ベクター上に存在する遺伝子の導入方法としては、例えば特許文献１および特許文献２に開示される方法を用いることができる。すなわち、市販の大腸菌用のクローニングプラスミドベクター（例えば、pUC118等）のマルチクローニングサイトに各遺伝子を挿入し、これで大腸菌を形質転換して各遺伝子の産物を産生する形質転換体を増殖させる。増殖させた形質転換体から、プラスミドを回収し、導入された各遺伝子を含む領域を切り出し、広宿主域ベクタープラスミド（例えば、pMFY31 (Agric. Biol. Chem., Vol.49(9), 2719-2724, 1985等）のマルチクローニングサイトに挿入した組換えプラスミドベクターでザイモバクター属細菌を形質転換することにより、五炭糖を資化する能力を有するザイモバクター属形質転換体を作出することができる。なお、広宿主域ベクタープラスミドとしては、市販のものを用いることもできる。形質転換方法自体は周知であり、例えば、特許文献１及び特許文献２に記載されている通り、マグネシウムイオンを含むＴ培地（2.0重量％グルコース、1.0重量％バクト－酵母エキス、1.0重量％リン酸二水素カリウム、0.2重量％硫酸アンモニウム、0.05重量％硫酸マグネシウム七水塩、pH6.0）等の培地中で培養してコンピテントセルとした後、エレクトロポレーション法のような常法により形質転換を行うことができる。キシロースの資化能を有する形質転換体は、キシロースを唯一の炭素源とする培地中で形質転換処理後の細菌を培養して選択することにより得ることができる。
　導入遺伝子をゲノムＤＮＡに取り込ませる場合には、例えばＫｉｒｉｌｌ　Ａ．　Ｄａｔｓｅｎｋｏ　ａｎｄ　Ｂａｒｒｙ　Ｌ．　Ｗａｎｎｅｒ．　Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ　ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ－１２　ｕｓｉｎｇ　ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．　Ｊｕｎ　６，　２０００；　９７（１２）：　６６４０-６６４５．に開示される方法を用いることができる。
　発酵原料が五炭糖を含む場合であっても、五炭糖の他に六炭糖を含んでいてもよい。
　五炭糖とは、糖を構成する炭素の数が５つのものであり、ペントース（Ｐｅｎｔｏｓｅ）とも呼ばれる。１位にアルデヒド基をもつアルドペントースと２位にケトン基をもつケトペントースがある。アルドペントースとしては、キシロース、アラビノース、リボース、リキソースが挙げられ、ケトペントースとしては、リブロース、キシルロースが挙げられる。本発明で用いる五炭糖としては、微生物が資化できるものであればいずれでも良いが、自然界での存在割合や入手のしやすさなどの観点から、好ましくはキシロース、アラビノースであり、より好ましくはキシロースである。
　六炭糖とは、糖を構成する炭素の数が６つのものであり、ヘキソース（Ｈｅｘｏｓｅ）とも呼ばれる。１位にアルデヒド基をもつアルドースと２位にケトン基をもつケトースがある。アルドースとしては、グルコース、マンノース、ガラクトース、アロース、グロース、タロースなどが挙げられ、ケトースとしては、フルクトース、プシコース、ソルボースなどが挙げられる。本発明で用いる六炭糖としては、微生物が資化できるものであればいずれでも良いが、自然界での存在割合や入手のしやすさなどの観点から、好ましくはグルコース、マンノース、ガラクトースであり、より好ましくはグルコースである。
　五炭糖と六炭糖を含む発酵原料に関しては特に限定されないが、六炭糖と五炭糖を両方含むことが知られているセルロース含有バイオマス由来糖液が好ましく使用される。セルロース含有バイオマスには、バガス、スイッチグラス、コーンストーバー、稲わら、麦わらなど草木系バイオマスと、樹木、廃建材などの木質系バイオマスなどを例として挙げることができる。セルロース含有バイオマスは、糖が脱水縮合した多糖であるセルロースあるいはヘミセルロースを含有しており、こうした多糖を加水分解することで発酵原料として利用可能な糖液が製造される。セルロース含有バイオマス由来糖液の調製方法自体は周知であり、どのような方法であってもよく、こうした糖の製造方法としては、濃硫酸を使用してバイオマスを酸加水分解して糖液を製造する方法（特表平１１－５０６９３４号公報、特開２００５－２２９８２１号公報）、バイオマスを希硫酸で加水分解処理した後に、さらにセルラーゼなどの酵素処理することより糖液を製造する方法が開示されている（Ａ．Ａｄｅｎら、“ＬｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃＢｉｏｍａｓｓ　ｔｏ　Ｅｔｈａｎｏｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ　Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ　Ｃｏ－Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｄｉｌｕｔｅ　Ａｃｉｄ　Ｐｒｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　ｆｏｒ　Ｃｏｒｎ　Ｓｔｏｖｅｒ”ＮＲＥＬ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｒｅｐｏｒｔ（２００２））。また酸を使用しない方法として、２５０～５００℃程度の亜臨界水を使用しバイオマスを加水分解して糖液を製造する方法（特開２００３－２１２８８８号公報）、またバイオマスを亜臨界水処理した後に、さらに酵素処理することにより糖液を製造する方法（特開２００１－９５５９７号公報）、バイオマスを２４０～２８０℃の加圧熱水で加水分解処理した後に、さらに酵素処理することにより糖液を製造する方法（特許３０４１３８０号公報）が開示されている。以上のような処理の後、得られた糖液を精製してもよい。その方法は、例えばＷＯ２０１０／０６７７８５に開示されている。
　混合糖に含まれる五炭糖と六炭糖の重量比率は特に制限はないが、混合糖中の五炭糖と六炭糖の重量比率として（五炭糖）：（六炭糖）と表すと、１：９～９：１が好ましい。これは、混合糖としてセルロース含有バイオマス由来糖液を想定した場合の糖比率である。
　本発明に使用する発酵原料に含まれる六炭糖濃度は、上記の総糖濃度、五炭糖と六炭糖の割合の範囲において特に限定されないが、本発明の２，３－ＢＤＯの製造方法を用いれば、六炭糖を濃度５ｇ／Ｌ以上含む混合糖液においても良好な収率を得ることができる。
　発酵原料が五炭糖を含む場合であっても、上記と同様、発酵原料には、前記糖の他、２，３－ブタンジオール発酵微生物の発酵に好ましく作用するような同化可能な炭素源、同化可能な窒素源、無機塩類、並びに必要に応じてアミノ酸およびビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有させてもよい。また、発酵を効率よく行うことを目的に適宜消泡剤を含有させてもよい。
　発酵原料が五炭糖を含む場合であっても、同化可能な窒素源の具体例としては、上記と同様、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、アミノ酸、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば、油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩、亜鉛塩等を適宜添加使用することができる。五炭糖の発酵により２，３－ブタンジオールを製造するためには、これらのうち、コーンスティープリカー、硫酸アンモニウムやリン酸一水素アンモニウムのようなアンモニウム塩、リン酸二水素カリウム、リン酸一水素カリウム、リン酸一水素アンモニウムのようなリン酸塩、塩化カルシウムのようなカルシウム塩、硫酸第一鉄のような鉄塩、硫酸マンガンのようなマンガン塩、硫酸亜鉛のような亜鉛塩、硫酸マグネシウムのようなマグネシウム塩、ＥＤＴＡ２ナトリウムのようなＥＤＴＡ又はその塩を含むことが好ましい。
　発酵原料が五炭糖を含む場合であっても、上記と同様、微生物の生育に応じてニコチン酸を培地に適宜添加使用してもよく、また、消泡剤を適宜添加使用してもよい。
　発酵原料が、同化可能な炭素源として五炭糖を含み、五炭糖を資化する能力を有するザイモバクター属微生物を培養する場合であっても、培養温度、培養時のｐＨ、微生物の培養形態、通気条件及び培地への酸素供給条件は、それぞれの好ましい条件も含めて上記と同様である。
　２，３－ブタンジオール発酵工程で得られる培養液には、２，３－ブタンジオールの他、発酵原料由来の不純物や発酵副産物であるエタノールなどが含まれるため、後段のプロセスおいて培養液に含まれる２，３－ブタンジオールを精製する必要がある。
精製工程
　２，３－ブタンジオール培養液からの２，３－ブタンジオールの精製工程は特に制限はなく、当業者に公知の手法によって実施すればよいが、本発明では２，３－ブタンジオール培養液を蒸留する工程を含むことが好ましい。
　２，３－ブタンジオール培養液の蒸留では、２，３－ブタンジオールは蒸気側から回収される。蒸留法は特に限定されないが、一般的に適応される単蒸留や精密蒸留、常圧蒸留や減圧蒸留のいずれでもよく、薄膜蒸留装置や棚段式蒸留装置、充填式蒸留装置などから選択することができる。また、回分式であっても連続式であっても本発明に適用できる。中でも好ましくは、減圧蒸留であり、沸点を下げることができるため、不純物の発生を抑制することができる。具体的には、加熱温度が６０℃以上１５０℃以下で行うのが好ましい。６０℃未満の場合は減圧度を著しく下げる必要があるため、工業レベルでは装置の維持が非常に困難となる。また、１５０℃より高くなる場合には、２，３－ブタンジオール溶液中に残存する微量の糖などが分解し、着色性物質の副生が起こるため好ましくない。そのため、上記加熱温度範囲で２，３－ブタンジオールが留出するよう、減圧度を調節するのがよい。
　なお、２，３－ブタンジオール培養液をそのまま蒸留工程に供してもよいが、蒸留工程に先立ち、脱塩工程や濃縮工程に供することが好ましい。
　脱塩工程の具体例としては、イオン交換処理が挙げられる。イオン交換処理は、イオン交換体を用いて２，３－ブタンジオール培養液中のイオン成分を除去する方法である。イオン交換体としては、イオン交換樹脂、イオン交換膜、イオン交換繊維、イオン交換紙、ゲルイオン交換体、液状イオン交換体、ゼオライト、炭質イオン交換体、モンモリロン石を用いることができるが、本発明ではイオン交換樹脂を用いた処理が好ましく採用される。
　イオン交換樹脂にはその官能基の違いにより、強アニオン交換樹脂、弱アニオン交換樹脂、強カチオン交換樹脂、弱カチオン交換樹脂、キレート交換樹脂などがある。例えば、強アニオン交換樹脂は、オルガノ株式会社製の“アンバーライト”ＩＲＡ４１０Ｊ、ＩＲＡ４１１、ＩＲＡ９１０ＣＴや三菱化学株式会社製の“ダイヤイオン”ＳＡ１０Ａ、ＳＡ１２Ａ、ＳＡ１１Ａ、ＮＳＡ１００、ＳＡ２０Ａ、ＳＡ２１Ａ、ＵＢＫ５１０Ｌ、ＵＢＫ５３０、ＵＢＫ５５０、ＵＢＫ５３５、ＵＢＫ５５５などから選定される。また、弱アニオン交換樹脂は、オルガノ株式会社製の“アンバーライト”ＩＲＡ４７８ＲＦ、ＩＲＡ６７、ＩＲＡ９６ＳＢ、ＩＲＡ９８、ＸＥ５８３や三菱化学株式会社製の“ダイヤイオン”ＷＡ１０、ＷＡ２０、ＷＡ２１Ｊ、ＷＡ３０などがある。一方、強カチオン交換樹脂は、オルガノ株式会社製の“アンバーライト”ＩＲ１２０Ｂ、ＩＲ１２４、２００ＣＴ、２５２の他、三菱化学株式会社製の“ダイヤイオン”ＳＫ１０４、ＳＫ１Ｂ、ＳＫ１１０、ＳＫ１１２、ＰＫ２０８、ＰＫ２１２、ＰＫ２１６、ＰＫ２１８，ＰＫ２２０、ＰＫ２２８などがあり、弱カチオン交換樹脂としては、オルガノ株式会社製の“アンバーライト”ＦＰＣ３５００、ＩＲＣ７６や三菱化学株式会社製の“ダイヤイオン”ＷＫ１０、ＷＫ１１、ＷＫ１００、ＷＫ４０Ｌなどから選定することができる。
　本発明では、イオン交換樹脂としてアニオン交換樹脂およびカチオン交換樹脂を併用することが好ましく、中でも、多様なイオンを除去することができる強アニオン樹脂および強カチオン樹脂を用いる方がよい。また、アニオン交換樹脂は水酸化ナトリウムなどの希アルカリ性水溶液により再生し、ＯＨ型として用いることが好ましく、カチオン交換樹脂の場合は、塩酸などの希酸性水溶液により再生し、Ｈ型として用いることが好ましい。イオン交換樹脂による脱塩方法はバッチ法でもカラム法でもよく、効率的に脱塩出来る方法であれば特に制限はない。しかしながら、製造プロセスにおいては、繰り返し利用が容易なカラム法が好ましく採用される。通液速度は通常、ＳＶ（空間速度）で制御され、ＳＶ＝２～５０が好ましく、より高度に精製できるＳＶ＝２～１０で通液することが好ましい。樹脂はゲル型でもポーラス型、ハイポーラス型、ＭＲ型などの種類が市販されており、これらイオン交換樹脂の形状はいずれでもよく、溶液の品質に合わせて最適な形状を選択すればよい。
　また、ナノ濾過膜処理も脱塩工程の具体例として挙げられる。２，３－ブタンジオール培養液のナノ濾過膜処理は、例えば特開２０１０－１５０２４８号公報にも開示されているように、２，３－ブタンジオール培養液をナノ濾過膜に通じて濾過することによって透過液側に２，３－ブタンジオール、非透過液側に無機塩、糖類および着色成分を効率的に分離することができる。
　ナノ濾過膜の素材としては、ピペラジンポリアミドやポリアミド、酢酸セルロース、ポリビニルアルコール、ポリイミド、ポリエステルなどのポリマー系素材のほか、セラミックスなどの無機材料が用いられている。また、ナノ濾過膜は一般にスパイラル型の膜エレメントの他、平膜や中空糸膜として使用されるが、本発明で用いるナノ濾過膜は、スパイラル型の膜エレメントが好ましく使用される。
　本発明で用いられるナノ濾過膜エレメントの好ましい具体例としては、例えば、酢酸セルロース系のナノろ過膜であるＧＥ　Ｏｓｍｏｎｉｃｓ社製ナノ濾過膜の“ＧＥｓｅｐａ”、ポリアミドを機能層とするアルファラバル社製ナノ濾過膜のＮＦ９９またはＮＦ９９ＨＦ、架橋ピペラジンポリアミドを機能層とするフィルムテック社製ナノ濾過膜のＮＦ－４５、ＮＦ－９０、ＮＦ－２００またはＮＦ－４００、あるいは東レ株式会社製のＵＴＣ６０を含む同社製ナノ濾過膜エレメントＳＵ－２１０、ＳＵ－２２０、ＳＵ－６００またはＳＵ－６１０が挙げられ、中でも好ましくはポリアミドを機能層とするアルファラバル社製ナノ濾過膜のＮＦ９９またはＮＦ９９ＨＦ、架橋ピペラジンポリアミドを機能層とするフィルムテック社製ナノ濾過膜のＮＦ－４５、ＮＦ－９０、ＮＦ－２００またはＮＦ－４００、東レ株式会社製のＵＴＣ６０を含む同社製ナノ濾過膜モジュールＳＵ－２１０、ＳＵ－２２０、ＳＵ－６００またはＳＵ－６１０であり、さらに好ましくは架橋ピペラジンポリアミドを主成分とする、東レ株式会社製のＵＴＣ６０を含む同社製ナノ濾過膜エレメントＳＵ－２１０、ＳＵ－２２０、ＳＵ－６００またはＳＵ－６１０である。
　ナノ濾過膜による濾過は、圧力をかけてもよく、その濾過圧は、０．１ＭＰａ以上８ＭＰａ以下の範囲で好ましく用いられる。濾過圧が０．１ＭＰａより低ければ膜透過速度が低下し、８ＭＰａより高ければ膜の損傷に影響を与えるおそれがある。また、濾過圧が０．５ＭＰａ以上７ＭＰａ以下で用いれば、膜透過流束が高いことから、２，３－ブタンジオール発酵液を効率的に透過させることができ、膜の損傷に影響を与える可能性が少ないことからより好ましく、１ＭＰａ以上６ＭＰａ以下で用いることが特に好ましい。
　ナノ濾過膜に通じて濾過する２，３－ブタンジオール溶液の２，３－ブタンジオールの濃度は特に限定されないが、高濃度であれば透過液中に含まれる２，３－ブタンジオール濃度も高いため、濃縮する際のエネルギー削減ができ、コスト削減にも好適である。
　脱塩工程においては、イオン交換処理またはナノ濾過膜処理のいずれかであってもよく、それらを併用してもよいが、少なくともイオン交換処理をすることが好ましい。また、イオン交換処理とナノ濾過膜処理を併用する場合の順序は特に制限はないが、２，３－ブタンジオール培養液をナノ濾過膜処理して透過液側から得られる無機塩が低減した２，３－ブタンジオール培養液をイオン交換処理することが好ましい。これにより、ナノ濾過膜を一部通過する無機塩や有機酸をイオン交換樹脂で除去することで、無機塩類の除去率を上げることができる。
　２，３－ブタンジオール培養液の濃縮方法としては当業者が公知の一般的な方法でよく、例えば、逆浸透膜を用いる方法や、エバポレーターによる加熱濃縮などが挙げられるが、逆浸透膜を用いる方法が好ましく適用される。
　逆浸透膜を用いる方法は、２，３－ブタンジオール溶液を逆浸透膜に通じて濾過することで透過液側に水を透過させ、２，３－ブタンジオールを膜の非透過液側に保持することで濃縮する方法である。本発明で好ましく使用される逆浸透膜としては、酢酸セルロール系のポリマーを機能層とした複合膜（以下、酢酸セルロース系の逆浸透膜ともいう）またはポリアミドを機能層とした複合膜（以下、ポリアミド系の逆浸透膜ともいう）が挙げられる。ここで、酢酸セルロース系のポリマーとしては、酢酸セルロース、二酢酸セルロース、三酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酪酸セルロース等のセルロースの有機酸エステルの単独もしくはこれらの混合物並びに混合エステルを用いたものが挙げられる。ポリアミドとしては、脂肪族および／または芳香族のジアミンをモノマーとする線状ポリマーまたは架橋ポリマーが挙げられる。膜形態としては、平膜型、スパイラル型、中空糸型など適宜の形態のものが使用できる。
　本発明で使用される逆浸透膜の具体例としては、例えば、東レ株式会社製ポリアミド系逆浸透膜モジュールである低圧タイプのＳＵ－７１０、ＳＵ－７２０、ＳＵ－７２０Ｆ、ＳＵ－７１０Ｌ、ＳＵ－７２０Ｌ、ＳＵ－７２０ＬＦ、ＳＵ－７２０Ｒ、ＳＵ－７１０Ｐ、ＳＵ－７２０Ｐの他、高圧タイプのＳＵ－８１０、ＳＵ－８２０、ＳＵ－８２０Ｌ、ＳＵ－８２０ＦＡ、同社酢酸セルロース系逆浸透膜ＳＣ－Ｌ１００Ｒ、ＳＣ－Ｌ２００Ｒ、ＳＣ－１１００、ＳＣ－１２００、ＳＣ－２１００、ＳＣ－２２００、ＳＣ－３１００、ＳＣ－３２００、ＳＣ－８１００、ＳＣ－８２００、日東電工株式会社製ＮＴＲ－７５９ＨＲ、ＮＴＲ－７２９ＨＦ、ＮＴＲ－７０ＳＷＣ、ＥＳ１０－Ｄ、ＥＳ２０－Ｄ、ＥＳ２０－Ｕ、ＥＳ１５－Ｄ、ＥＳ１５－Ｕ、ＬＦ１０－Ｄ、アルファラバル製ＲＯ９８ｐＨｔ、ＲＯ９９、ＨＲ９８ＰＰ、ＣＥ４０４０Ｃ－３０Ｄ、ＧＥ製“ＧＥＳｅｐａ”、Ｆｉｌｍｔｅｃ製ＢＷ３０－４０４０、ＴＷ３０－４０４０、ＸＬＥ－４０４０、ＬＰ－４０４０、ＬＥ－４０４０、ＳＷ３０－４０４０、ＳＷ３０ＨＲＬＥ－４０４０などが挙げられる。
　逆浸透膜による濃縮は、圧力をかけて行うが、その濾過圧は、１ＭＰａより低ければ膜透過速度が低下し、８ＭＰａより高ければ膜の損傷に影響を与えるため、１ＭＰａ以上８ＭＰａ以下の範囲であることが好ましい。また、濾過圧が１ＭＰａ以上７ＭＰａ以下の範囲であれば、膜透過流束が高いことから、２，３－ブタンジオール溶液を効率的に濃縮することができる。膜の損傷に影響を与える可能性が少ないことから最も好ましくは、２ＭＰａ以上６ＭＰａ以下の範囲である。低濃度の２，３－ブタンジオール溶液においては、逆浸透膜を用いる方法が低コストであるため好ましい。
　その他、上記工程に先立ち、２，３－ブタンジオール培養液に含まれる菌体を分離する工程を含むことが好ましい。菌体の分離工程としては、例えば遠心分離、ろ過分離などの方法を用いることができる。これらの方法はどちらか一方のみでもよいし、組み合わせてもよい。
　本発明によって製造される２，３－ブタンジオールは高純度であることを特徴とする。２，３－ブタンジオールに含まれる不純物を測定する方法としては、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）による純度測定や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いたＵＶ検出による純度測定などを併用して評価することができ、これらは全検出ピーク面積中の２，３－ブタンジオール面積の比率で評価するため、比率が高いほど２，３－ブタンジオールが高純度であることを意味する。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
参考例１　　ｋＬａ測定
　培養装置（エイブル株式会社製、ジャー容量１．５Ｌ）に溶存酸素電極（エイブル株式会社製）を挿入して各通気攪拌条件に対する溶存酸素濃度を測定し、窒素ガスを用いるダイナミック法によりｋＬａを求めた。まず、培養槽に水１Ｌを投入し、水温を３０℃に調整しながら一定の速度で攪拌して窒素ガスを十分に水中に吹き込み、電極値が最低値となった時点で溶存酸素電極のゼロ校正を行った。そののち通気ガスを窒素ガスから所定の通気速度の空気あるいは窒素ガスに切り替えてからの溶存酸素濃度の経時変化を測定してｋＬａを求めた。得られた各通気攪拌条件に対するｋＬａを表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実施例１～６：ｋＬａ
　＜２，３－ブタンジオール発酵＞
　ザイモバクター・パルメ（Ｚ．ｐａｌｍａｅ）　ＡＴＣＣ５１６２３株を、Ｔ培地（２０ｇ／Ｌ　Ｇｌｕｃｏｓｅ，　１０ｇ／Ｌ　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ，　１０ｇ／Ｌ　ＫＨ２ＰＯ４、　２ｇ／Ｌ　（ＮＨ４）２ＳＯ４、　０．５ｇ／Ｌ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、　ｐＨ６．０）を５ｍＬ入れた試験管にて３０℃で２４時間静置培養を行い、前々培養とした。この前々培養液を、Ｔ培地を５０ｍＬ入れた三角フラスコに全量添加したのち、３０℃で１６時間静置培養を行い、前培養とした。前培養液を表２に示す組成の２，３－ブタンジオール発酵培地１Ｌに添加し、ｐＨ５．５となるように水酸化カリウムで中和しながら温度３０℃で表１に記載のｋＬａにて培養を行った。培養液の採取はオートサンプラー（エイブル株式会社製）を用いて培養開始後から２時間おきに最大４０時間まで行い、採取した培養液中のグルコース濃度および２，３－ブタンジオール濃度を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　以下に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、株式会社島津製作所製）によるそれぞれの濃度測定条件を示す。発酵後の２，３－ブタンジオール濃度、グルコース濃度、発酵収率は以下の測定方法によって求めた。
２，３－ブタンジオール濃度測定
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　Ｓｕｇａｒ　ＳＨ１０１１（昭和電工株式会社製）
カラム温度：６５℃
移動相：０．０５Ｍ　硫酸水溶液、０．６ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ。
グルコース濃度測定
カラム：Ａｓａｈｉｐａｋ　ＮＨ２Ｐ５０　４Ｅ（昭和電工株式会社製）
カラム温度：３０℃
移動相：水：アセトニトリル＝１：３、０．６ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ。
発酵収率
　上述のＨＰＬＣ分析により測定した２，３－ブタンジオール濃度およびグルコース濃度より、下式を用いて算出した。
発酵収率（％）＝１００×｛（培養液中２，３－ブタンジオール濃度）－（培地中２，３－ブタンジオール濃度）｝／｛（培地中グルコース濃度）－（培養液中グルコース濃度）｝。
　培養液中のグルコース濃度が最も０に近くなった時点での、培養液中の２，３－ブタンジオールおよびグルコース濃度、発酵収率を表３に示す。得られた２，３－ブタンジオール培養液を回収し、４℃、８０００ｒｐｍで１５分間遠心したのち上清を精密ろ過膜（東レ株式会社製）にてろ過し、菌体を除去した。上記工程を２回行い、計２Ｌの２，３－ブタンジオール培養液を得た。
　＜２，３－ブタンジオール培養液のイオン交換精製＞
　上述の発酵試験により得られた培養液について、イオン交換処理による残留イオンの除去を行った。強アニオン交換樹脂ＩＲＡ１２０Ｊ（株式会社オルガノ製）および強カチオン交換樹脂ＩＲ４１０（株式会社オルガノ製）を用い、それぞれ１Ｎ水酸化ナトリウムおよび１Ｎ塩酸によってＯＨ型およびＨ型に再生して使用した。樹脂量は各種無機塩と有機酸との総量とイオン交換樹脂の交換容量が等量になるように算出した。前述のイオン交換樹脂をカラムに充填し、アニオン交換、カチオン交換の順に通液速度ＳＶ＝５で通液した。
　＜２，３－ブタンジオールの蒸留精製＞
　イオン交換処理した２，３－ブタンジオール溶液は、薄膜濃縮装置　ＭＦ－１０（東京理化器械株式会社製）によって水を除去した。この時、減圧度は３０ｈＰａ、加熱温度は６０℃で水を蒸発させた。濃縮した２，３－ブタンジオール溶液を減圧蒸留（５ｍｍＨｇ）し、精製２，３－ブタンジオールを得た。蒸留後の２，３－ブタンジオールのＧＣ純度、蒸留収率は以下の測定方法によって求めた。
ＧＣ純度
　蒸留後の２，３－ブタンジオールをガスクロマトグラフィー（ＧＣ、株式会社島津製作所製）を用いて分析し、全検出ピーク面積中の２，３－ブタンジオールピーク面積の比率から、下式によって算出した。
ＧＣ純度（％）＝１００×（２，３－ブタンジオールピーク面積）／（全検出ピーク面積）。
　ガスクロマトグラフィーの分析条件を以下に示す。
カラム：ＲＴ－ＢＤＥＸＭ（０．２５ｍｍ×３０ｍ、Ｒｅｓｔｅｋ社製）
カラム温度：７５℃
気化室、検出器温度：２３０℃
キャリアガス：Ｈｅ
線速度：３５ｃｍ／ｓｅｃ
検出：水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）。
蒸留収率
　ＨＰＬＣ分析で測定した２，３－ブタンジオール濃度と仕込み液量から算出した蒸留前の２，３－ブタンジオール仕込み量と、蒸留後の留出液量と上述のＧＣ純度から算出した２，３－ブタンジオール回収量から、下式により計算した。
蒸留収率（％）＝１００×｛（蒸留後の留出液量）×（ＧＣ純度）｝／｛（蒸留前２，３－ブタンジオール濃度）×（蒸留前の仕込み液量）｝。
２，３－ブタンジオール総収率
　発酵工程の結果より算出した発酵収率および精製工程の結果より算出した蒸留収率から、下式により計算した。結果を表３に示す。
２，３－ブタンジオール総収率（ｇ／ｇ糖）＝（発酵収率）／１００×（蒸留収率）／１００。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
実施例７～１１：ｐＨ
　Ｚ．ｐａｌｍａｅ　ＡＴＣＣ５１６２３株を、実施例１～６記載の前々培養方法および前培養方法にて培養した。前培養液を表２に示す組成の２，３－ブタンジオール発酵培地１Ｌに添加し、ｐＨがそれぞれ４．５、４．８、５．２、５．５、６．１、６．５のいずれかとなるように水酸化カリウムで中和しながら通気速度０．２ｖｖｍ、攪拌速度４００ｒｐｍ、温度３０℃で培養を行った。培養液の採取はオートサンプラー（エイブル株式会社製）を用いて培養開始後から２時間おきに最大４０時間まで行い、採取した培養液中のグルコース濃度および２，３－ブタンジオール濃度を実施例１～６記載の方法にて測定した。培養液中のグルコース濃度が最も０に近くなった時点での、培養液中の２，３－ブタンジオールおよびグルコース濃度、発酵収率を表４に示す。発酵試験後の２，３－ブタンジオール培養液を回収し、４℃、８０００ｒｐｍで１５分間遠心したのち上清を精密ろ過膜（東レ株式会社製）にてろ過し、菌体を除去した。上記工程を２回行い、計２Ｌの２，３－ブタンジオール培養液を得た。得られた培養液について、実施例１～６記載の方法にて脱塩および蒸留処理を行い、精製２，３－ブタンジオールを得た。蒸留後の２，３－ブタンジオールのＧＣ純度、蒸留収率を実施例１～６記載の方法によって求めた結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
実施例１２～１６：糖濃度
　Ｚ．ｐａｌｍａｅ　ＡＴＣＣ５１６２３株を、実施例１～６記載の前々培養方法および前培養方法にて培養した。前培養液をグルコース濃度がそれぞれ１２、２０、１００、１８０、２５０ｇ／Ｌのいずれかとなるように調整した表２に示す組成の２，３－ブタンジオール発酵培地１Ｌに添加し、ｐＨが５．５となるように水酸化カリウムで中和しながら通気速度０．２ｖｖｍ、攪拌速度４００ｒｐｍ、温度３０℃で培養を行った。培養液の採取はオートサンプラー（エイブル株式会社製）を用いて培養開始後から２～８時間おきに行い、採取した培養液中のグルコース濃度および２，３－ブタンジオール濃度を実施例１～６記載の方法にて測定した。培養液中のグルコース濃度が最も０に近くなった時点での、培養液中の２，３－ブタンジオールおよびグルコース濃度、発酵収率を表５に示す。発酵試験後の２，３－ブタンジオール培養液を回収し、４℃、８０００ｒｐｍで１５分間遠心したのち上清を精密ろ過膜（東レ株式会社製）にてろ過し、菌体を除去した。上記工程を２回行い、計２Ｌの２，３－ブタンジオール培養液を得た。得られた培養液について、実施例１～６記載の方法にて脱塩および蒸留処理を行い、精製２，３－ブタンジオールを得た。蒸留後の２，３－ブタンジオールのＧＣ純度、蒸留収率を実施例１～６記載の方法によって求めた結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
実施例１７～３１
　特許文献１及び特許文献２に記載された形質転換株細胞内での４種の酵素遺伝子の発現を確認した。なお、この形質転換株は、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターにブダペスト条約に基づき２００４年６月３０日から寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ　ＢＰ－１００４８である。この形質転換株は、特許文献２が米国特許第7,569,379号となっているため、既に分譲可能となっている。
実施例１７～２１：ｋＬａ
　＜２，３－ブタンジオール発酵＞
　キシロース資化を付与したザイモバクター属微生物としては、特許文献１及び２に開示されているＺｙｍｏｂａｃｔｅｒ　ｐａｌｍａｅ［ｐＭＦＹ３１－ｘｔ］を用いた。Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ　ｐａｌｍａｅ［ｐＭＦＹ３１－ｘｔ］は、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードする外来遺伝子が導入された広宿主域組換えプラスミドベクターでＺｙｍｏｂａｃｔｅｒ　ｐａｌｍａｅを形質転換することにより作出された公知の形質転換体であり、上記の通り、ブダペスト条約に基づきＦＥＲＭ　ＢＰ－１００４８の受託番号で寄託されており、分譲可能となっているものである。Ｚ．ｐａｌｍａｅ［ｐＭＦＹ３１－ｘｔ］を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＴＸ培地（４０ｇ／Ｌ　Ｘｙｌｏｓｅ，　１０ｇ／Ｌ　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ，　１０ｇ／Ｌ　ＫＨ２ＰＯ４、　２ｇ／Ｌ　（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．５ｇ／Ｌ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、　ｐＨ６．０）を５ｍＬ入れた試験管にて３０℃で２４時間静置培養を行った。その培養液を、ＴＸ培地を５０ｍＬ入れた三角フラスコに全量添加したのち、３０℃で２４時間静置培養を行った。その培養液を表６に示す組成の２，３－ブタンジオール発酵培地１Ｌに全量添加し、ｐＨ５．５となるように水酸化カリウムで中和しながら温度３０℃で表１に記載の通気・攪拌条件にて培養を行った。培養中に適宜培養液を採取し、キシロース濃度および２，３－ブタンジオール濃度を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　以下に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、株式会社島津製作所製）によるそれぞれの濃度測定条件を示す。発酵後の２，３－ブタンジオール濃度、糖濃度、発酵収率は以下の測定方法によって求めた。
２，３－ブタンジオール濃度測定
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　Ｓｕｇａｒ　ＳＨ１０１１（昭和電工株式会社製）
カラム温度：６５℃
移動相：０．０５Ｍ　硫酸水溶液、０．６ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ。
糖濃度測定
カラム：Ａｓａｈｉｐａｋ　ＮＨ２Ｐ５０　４Ｅ（昭和電工株式会社製）
カラム温度：３０℃
移動相：水：アセトニトリル＝１：３、０．６ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ。
発酵収率
　上述のＨＰＬＣ分析により測定した２，３－ブタンジオール濃度および糖濃度より、下式を用いて算出した。
発酵収率（％）＝１００×｛（培養液中２，３－ブタンジオール濃度）－（培地中２，３－ブタンジオール濃度）｝／｛（培地中糖濃度）－（培養液中糖濃度）｝。
　培養液中のキシロース濃度が最も０に近くなった時点での、培養液中の２，３－ブタンジオールおよびキシロース濃度、発酵収率を表７に示す。得られた２，３－ブタンジオール培養液を回収し、４℃、８０００ｒｐｍで１５分間遠心したのち上清を精密ろ過膜（東レ株式会社製）にてろ過し、菌体を除去した。上記工程を２回行い、計２Ｌの２，３－ブタンジオール培養液を得た。
　＜２，３－ブタンジオール培養液のイオン交換精製＞
　上述の発酵試験により得られた培養液について、イオン交換処理による残留イオンの除去を行った。強アニオン交換樹脂ＩＲＡ１２０Ｊ（株式会社オルガノ製）および強カチオン交換樹脂ＩＲ４１０（株式会社オルガノ製）を用い、それぞれ１Ｎ水酸化ナトリウムおよび１Ｎ塩酸によってＯＨ型およびＨ型に再生して使用した。樹脂量は各種無機塩と有機酸との総量とイオン交換樹脂の交換容量が等量になるように算出した。前述のイオン交換樹脂をカラムに充填し、アニオン交換、カチオン交換の順に通液速度ＳＶ＝５で通液した。
　＜２，３－ブタンジオールの蒸留精製＞
　イオン交換処理した２，３－ブタンジオール溶液は、薄膜濃縮装置　ＭＦ－１０（東京理化器械株式会社製）によって水を除去した。この時、減圧度は３０ｈＰａ、加熱温度は６０℃で水を蒸発させた。濃縮した２，３－ブタンジオール溶液を減圧蒸留（５ｍｍＨｇ）し、精製２，３－ブタンジオールを得た。蒸留後の２，３－ブタンジオールのＧＣ純度、蒸留収率は以下の測定方法によって求めた。
ＧＣ純度
　蒸留後の２，３－ブタンジオールをガスクロマトグラフィー（ＧＣ、株式会社島津製作所製）を用いて分析し、全検出ピーク面積中の２，３－ブタンジオールピーク面積の比率から、下式によって算出した。
ＧＣ純度（％）＝１００×（２，３－ブタンジオールピーク面積）／（全検出ピーク面積）。
　ガスクロマトグラフィーの分析条件を以下に示す。
カラム：ＲＴ－ＢＤＥＸＭ（０．２５ｍｍ×３０ｍ、Ｒｅｓｔｅｋ社製）
カラム温度：７５℃
気化室、検出器温度：２３０℃
キャリアガス：Ｈｅ
線速度：３５ｃｍ／ｓｅｃ
検出：水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）。
蒸留収率
　ＨＰＬＣ分析で測定した２，３－ブタンジオール濃度と仕込み液量から算出した蒸留前の２，３－ブタンジオール仕込み量と、蒸留後の留出液量と上述のＧＣ純度から算出した２，３－ブタンジオール回収量から、下式により計算した。
蒸留収率（％）＝１００×｛（蒸留後の留出液量）×（ＧＣ純度）｝／｛（蒸留前２，３－ブタンジオール濃度）×（蒸留前の仕込み液量）｝。
２，３－ブタンジオール総収率
　発酵工程の結果より算出した発酵収率および精製工程の結果より算出した蒸留収率から、下式により計算した。結果を表７に示す。
２，３－ブタンジオール総収率（ｇ／ｇ糖）＝（発酵収率）／１００×（蒸留収率）／１００。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
実施例２２～２５：ｐＨ
　Ｚ．ｐａｌｍａｅ［ｐＭＦＹ３１－ｘｔ］を、実施例１７～２１記載の方法にて培養した。フラスコ培養した培養液を表６に示す組成の２，３－ブタンジオール発酵培地１Ｌに添加し、ｐＨがそれぞれ４．５、４．８、６．１、６．５のいずれかとなるように水酸化カリウムで中和しながら通気速度０．２ｖｖｍ、攪拌速度４００ｒｐｍ、温度３０℃で培養を行った。培養中に適宜培養液を採取し、キシロース濃度および２，３－ブタンジオール濃度を実施例１７～２１記載の方法にて測定した。培養液中のキシロース濃度が最も０に近くなった時点での、培養液中の２，３－ブタンジオールおよびキシロース濃度、発酵収率を表８に示す。発酵試験後の２，３－ブタンジオール培養液を回収し、４℃、８０００ｒｐｍで１５分間遠心したのち上清を精密ろ過膜（東レ株式会社製）にてろ過し、菌体を除去した。上記工程を２回行い、計２Ｌの２，３－ブタンジオール培養液を得た。得られた培養液について、実施例１７～２１記載の方法にて脱塩および蒸留処理を行い、精製２，３－ブタンジオールを得た。蒸留後の２，３－ブタンジオールのＧＣ純度、蒸留収率を実施例１７～２１記載の方法によって求めた結果を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
実施例２６～２８：糖濃度
　Ｚ．ｐａｌｍａｅ［ｐＭＦＹ３１－ｘｔ］を、実施例１７～２１記載の方法にて培養した。フラスコ培養した培養液をキシロース濃度がそれぞれ５．０、１５、１００ｇ／Ｌのいずれかとなるように調整した表６に示す組成の２，３－ブタンジオール発酵培地１Ｌに添加し、ｐＨが５．５となるように水酸化カリウムで中和しながら通気速度０．２ｖｖｍ、攪拌速度４００ｒｐｍ、温度３０℃で培養を行った。培養中に適宜培養液を採取し、キシロース濃度および２，３－ブタンジオール濃度を実施例１７～２１記載の方法にて測定した。培養液中のキシロース濃度が最も０に近くなった時点での、培養液中の２，３－ブタンジオールおよびキシロース濃度、発酵収率を表９に示す。発酵試験後の２，３－ブタンジオール培養液を回収し、４℃、８０００ｒｐｍで１５分間遠心したのち上清を精密ろ過膜（東レ株式会社製）にてろ過し、菌体を除去した。上記工程を２回行い、計２Ｌの２，３－ブタンジオール培養液を得た。得られた培養液について、実施例１７～２１記載の方法にて脱塩および蒸留処理を行い、精製２，３－ブタンジオールを得た。蒸留後の２，３－ブタンジオールのＧＣ純度、蒸留収率を実施例１７～２１記載の方法によって求めた結果を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
実施例２９～３１：五炭糖比率
　Ｚ．ｐａｌｍａｅ［ｐＭＦＹ３１－ｘｔ］を、実施例１７～２１記載の方法にて培養した。フラスコ培養した培養液をキシロースおよびグルコースの濃度（ｇ／Ｌ）がそれぞれ（４０：２０）、（２０：４０）、（２．５：４０）のいずれかとなるように調整した表６に示す組成の２，３－ブタンジオール発酵培地１Ｌに添加し、ｐＨが５．５となるように水酸化カリウムで中和しながら通気速度０．２ｖｖｍ、攪拌速度４００ｒｐｍ、温度３０℃で培養を行った。培養中に適宜培養液を採取し、糖濃度および２，３－ブタンジオール濃度を実施例１７～２１記載の方法にて測定した。培養液中の糖濃度が最も０に近くなった時点での、培養液中の２，３－ブタンジオールおよび糖濃度、発酵収率を表１０に示す。発酵試験後の２，３－ブタンジオール培養液を回収し、４℃、８０００ｒｐｍで１５分間遠心したのち上清を精密ろ過膜（東レ株式会社製）にてろ過し、菌体を除去した。上記工程を２回行い、計２Ｌの２，３－ブタンジオール培養液を得た。得られた培養液について、実施例１７～２１記載の方法にて脱塩および蒸留処理を行い、精製２，３－ブタンジオールを得た。蒸留後の２，３－ブタンジオールのＧＣ純度、蒸留収率を実施例１７～２１記載の方法によって求めた結果を表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
実施例３２～３５：有機窒素源
　Ｚ．ｐａｌｍａｅ　ＡＴＣＣ５１６２３株を、実施例１～６記載の前々培養方法および前培養方法にて培養した。表２に示す組成の２，３－ブタンジオール発酵培地におけるコーンスティープリカーを表１１に示す種々の有機窒素源で置き換えた培地１Ｌに前培養液を添加し、ｐＨが５．５となるように水酸化カリウムで中和しながら通気速度０．２ｖｖｍ、攪拌速度４００ｒｐｍ、温度３０℃で培養を行った。培養液の採取はオートサンプラー（エイブル株式会社製）を用いて培養開始後から２～４時間おきに行い、採取した培養液中のグルコース濃度および２，３－ブタンジオール濃度を実施例１～６記載の方法にて測定した。培養液中のグルコース濃度が最も０に近くなった時点での、培養液中の２，３－ブタンジオールおよびグルコース濃度、発酵収率を表１２に示す。発酵試験後の２，３－ブタンジオール培養液を回収し、４℃、８０００ｒｐｍで１５分間遠心したのち上清を精密ろ過膜（東レ株式会社製）にてろ過し、菌体を除去した。上記工程を２回行い、計２Ｌの２，３－ブタンジオール培養液を得た。得られた培養液について、実施例１～６記載の方法にて脱塩および蒸留処理を行い、精製２，３－ブタンジオールを得た。蒸留後の２，３－ブタンジオールのＧＣ純度、蒸留収率を実施例１～６記載の方法によって求めた結果を表１２に示す。
　いずれの有機窒素源においても良好な２，３－ＢＤＯ収率が得られたが、実施例４に示すコーンスティープリカーを用いた場合に２，３－ＢＤＯ収率が最も高くなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　本発明の方法により得られる２，３－ブタンジオールは（２，３－ＢＤＯ）は、医薬品や化粧品の中間体原料、インク、香水、液晶、殺虫剤、軟化試薬、爆薬、可塑剤などの原料として有用な化合物である。

Claims (16)

  1. 　炭素源を含む発酵原料中で、ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）属微生物を培養する工程（工程Ａ）、および
    　該工程で得られた培養液から２，３－ブタンジオールを精製する工程（工程Ｂ）を含む、２，３－ブタンジオールの製造方法。
  2. 　前記微生物がザイモバクター・パルメ（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ　ｐａｌｍａｅ）である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記工程Ａが通気条件下での培養である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記工程Ａが酸素移動容量係数（ｋＬａ）９ｈ－１以上の条件での培養である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記工程ＡがｐＨ５～７の条件での培養である、請求項１から４のいずれかに記載の２，３－ブタンジオールの製造方法。
  6. 　前記工程Ａが総糖濃度２０ｇ／Ｌ以上の培地での培養である、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記炭素源が、五炭糖を含み、前記ザイモバクター属微生物が、五炭糖を資化する能力を有する請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記微生物が、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼから選ばれる少なくとも１つの酵素をコードする外来遺伝子が導入されたザイモバクター属の形質転換微生物である、請求項１から７に記載の方法。
  9. 　前記微生物が、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードする外来遺伝子が導入されたザイモバクター属の形質転換微生物である、請求項８に記載の方法。
  10. 　前記工程Ａの発酵原料に含まれる五炭糖がキシロースである、請求項７から９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　前記発酵原料中の総糖に対するキシロースの存在比率が５～１００％である、請求項７から１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　前記発酵原料がバイオマス由来の糖液を含む、請求項７から１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　前記工程Ａの発酵原料がコーンスティープリカーを含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　前記工程Ｂが蒸留工程を含む、請求項１から１３のいずれか1項に記載の方法。
  15. 　前記蒸留工程前に脱塩処理工程を含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 　前記脱塩処理工程としてイオン交換処理工程を含む、請求項１５に記載の方法。
PCT/JP2014/080571 2013-11-22 2014-11-19 ２，３－ブタンジオールの製造方法 WO2015076279A1 (ja)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES14864767T ES2742418T3 (es) 2013-11-22 2014-11-19 Procedimiento para producir 2,3 butanodiol
BR112016011487-6A BR112016011487B1 (pt) 2013-11-22 2014-11-19 Método de produção de 2,3-butanodiol
CN201480063541.7A CN105793429B (zh) 2013-11-22 2014-11-19 2,3-丁二醇的制造方法
SG11201604094VA SG11201604094VA (en) 2013-11-22 2014-11-19 Method for producing 2,3-butanediol
EP14864767.0A EP3072974B1 (en) 2013-11-22 2014-11-19 Method for producing 2,3-butanediol
US15/037,735 US10072275B2 (en) 2013-11-22 2014-11-19 Method of producing 2,3-butanediol

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013241869 2013-11-22
JP2013-241869 2013-11-22
JP2014215075A JP2016077262A (ja) 2014-10-22 2014-10-22 ２，３−ブタンジオールの製造方法
JP2014-215075 2014-10-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015076279A1 true WO2015076279A1 (ja) 2015-05-28

Family

ID=53179539

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2014/080571 WO2015076279A1 (ja) 2013-11-22 2014-11-19 ２，３－ブタンジオールの製造方法

Country Status (9)

Country Link
US (1) US10072275B2 (ja)
EP (1) EP3072974B1 (ja)
CN (1) CN105793429B (ja)
BR (1) BR112016011487B1 (ja)
ES (1) ES2742418T3 (ja)
MY (1) MY179877A (ja)
SG (1) SG11201604094VA (ja)
TW (1) TW201525139A (ja)
WO (1) WO2015076279A1 (ja)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112014008195B1 (pt) * 2011-10-14 2021-04-20 Toray Industries, Inc método para produzir 2,3-butanodiol
KR102133193B1 (ko) * 2017-12-01 2020-07-13 지에스칼텍스 주식회사 혼합당 동시발효능을 갖는 재조합 미생물 및 이를 이용한 다이올의 생산 방법
IL281601B2 (en) * 2018-09-21 2024-03-01 Versalis Spa A method for purifying bio-3,1-butanediol from fermentation liquid

Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11506934A (ja) 1995-06-07 1999-06-22 アーケノール，インコーポレイテッド 強酸加水分解法
JP3041380B2 (ja) 1997-06-02 2000-05-15 工業技術院長 水溶性オリゴ糖類及び単糖類の製造方法
JP2001095597A (ja) 1999-07-27 2001-04-10 Shiseido Co Ltd ステロイド５α−リダクターゼの阻害活性の検出方法
JP2003212888A (ja) 2002-01-18 2003-07-30 Asahi Kasei Corp グルコース及び／又は水溶性セロオリゴ糖の製造方法
JP2005229821A (ja) 2004-02-17 2005-09-02 Jgc Corp バイオマスから単糖を製造する方法及び単糖製造装置
JP2005261421A (ja) 2003-07-31 2005-09-29 Kansai Paint Co Ltd ペントース発酵性ザイモバクター属形質転換微生物
US20070298476A1 (en) 2003-07-31 2007-12-27 Hideshi Yanase Pentose-fermentative transformed Zymobacter microorganisms
WO2008000809A1 (en) * 2006-06-30 2008-01-03 Biogasol Ipr Aps Production of fermentation products in biofilm reactors using microorganisms immobilised on sterilised granular sludge
JP2008079564A (ja) 2006-09-28 2008-04-10 Toyota Central R&D Labs Inc キシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質及びその利用
WO2010067785A1 (ja) 2008-12-09 2010-06-17 東レ株式会社 糖液の製造方法
JP2010150248A (ja) 2008-11-28 2010-07-08 Toray Ind Inc ジオールまたはトリオールの製造方法
JP2011522563A (ja) * 2008-06-09 2011-08-04 ランザテク・ニュージーランド・リミテッド 嫌気的微生物発酵によるブタンジオールの製造
WO2013054874A1 (ja) * 2011-10-14 2013-04-18 東レ株式会社 ２，３－ブタンジオールの製造方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2388295A (en) 1994-04-15 1995-11-10 Midwest Research Institute Recombinant zymomonas for pentose fermentation
JP6344388B2 (ja) * 2013-07-02 2018-06-20 三菱ケミカル株式会社 糖液の処理方法、水素化処理糖液、有機化合物の製造方法および微生物の培養方法

Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11506934A (ja) 1995-06-07 1999-06-22 アーケノール，インコーポレイテッド 強酸加水分解法
JP3041380B2 (ja) 1997-06-02 2000-05-15 工業技術院長 水溶性オリゴ糖類及び単糖類の製造方法
JP2001095597A (ja) 1999-07-27 2001-04-10 Shiseido Co Ltd ステロイド５α−リダクターゼの阻害活性の検出方法
JP2003212888A (ja) 2002-01-18 2003-07-30 Asahi Kasei Corp グルコース及び／又は水溶性セロオリゴ糖の製造方法
US20070298476A1 (en) 2003-07-31 2007-12-27 Hideshi Yanase Pentose-fermentative transformed Zymobacter microorganisms
JP2005261421A (ja) 2003-07-31 2005-09-29 Kansai Paint Co Ltd ペントース発酵性ザイモバクター属形質転換微生物
US7569379B2 (en) 2003-07-31 2009-08-04 Kansai Paint Co., Ltd. Pentose-fermentative transformed zymobacter microorganisms
JP2005229821A (ja) 2004-02-17 2005-09-02 Jgc Corp バイオマスから単糖を製造する方法及び単糖製造装置
WO2008000809A1 (en) * 2006-06-30 2008-01-03 Biogasol Ipr Aps Production of fermentation products in biofilm reactors using microorganisms immobilised on sterilised granular sludge
JP2008079564A (ja) 2006-09-28 2008-04-10 Toyota Central R&D Labs Inc キシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質及びその利用
JP2011522563A (ja) * 2008-06-09 2011-08-04 ランザテク・ニュージーランド・リミテッド 嫌気的微生物発酵によるブタンジオールの製造
JP2010150248A (ja) 2008-11-28 2010-07-08 Toray Ind Inc ジオールまたはトリオールの製造方法
WO2010067785A1 (ja) 2008-12-09 2010-06-17 東レ株式会社 糖液の製造方法
WO2013054874A1 (ja) * 2011-10-14 2013-04-18 東レ株式会社 ２，３－ブタンジオールの製造方法

Non-Patent Citations (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Laboratory Manual for Bioengineering. The Society for Biotechnology", 1992, BAIFUKAN CO., LTD., pages: 310
A. N. BOURNS: "The Catalytic Action Of Aluminium Silicates", CANADIAN J. RES., 1947
AGRIC. BIOL. CHEM., vol. 49, no. 9, 1985, pages 2719 - 2724
FELDMANN SD; SAHM H; SPRENGER GA: "Cloning and expression of the genes for xylose isomerase and xylulokinase from Klebsiellapneumoniae 1033 in Escherichia coli K12", MOL GEN GENET, vol. 234, no. 2, August 1992 (1992-08-01), pages 201 - 10
GA. SPRENGER; U. SCHORKEN; G. SPRENGER; H. SAHM: "Transaldolase B of Escherichia coli K-12: cloning of its gene, talB, and characterization of the enzyme from recombinant strains", J. BACTERIOL., vol. 177, no. 20, 1995, pages 5930 - 6
HEROLD B. ET AL.: "Determination of the Three Isomers of 2,3-Butanediol Formed by Yeasts or Lactic Acid Bacteria During Fermentation", AM. J. ENOL. VITIC., vol. 46, no. 1, 1995, pages 134 - 137, XP008183575 *
JANSEN NB: "Production of 2,3-butanediol from D- xylose by Klebsiella oxytoca ATCC 8724", BIOTECHNOL BIOENG., vol. 26, no. 4, April 1984 (1984-04-01), pages 362 - 9
JI XJ: "Engineering Klebsiella oxytoca for efficient 2,3-butanediol production through insertional inactivation of acetaldehyde dehydrogenase gene", APPL MICROBIOL BIOTECHNOL, vol. 85, 2010, pages 1751 - 8
KIM S-J. ET AL.: "Production of 2,3-butanediol by engineered Saccharomyces cerevisiae", BIORES. TECHNOL., vol. 146, 24 July 2013 (2013-07-24), pages 274 - 281, XP028710847 *
KIRILL A. DATSENKO; BARRY L. WANNER: "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products", PROC NATL ACAD SCI U S A., vol. 97, no. 12, 6 June 2000 (2000-06-06), pages 6640 - 6645
LI Z-J. ET AL.: "Microbial production of meso- 2,3-butanediol by metabolically engineered Escherichia coli under low oxygen condition", APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL., vol. 87, 2010, pages 2001 - 2009, XP002737401 *
MA CQ: "Enhanced 2,3-butanediol production by Klebsiella pneumoniae SDM", APPL MICROBIOL BIOTECHNOL, vol. 82, 2009, pages 49 - 57
MARWOTO B: "Metabolic analysis of acetate accumulation during xylose consumption by Paenibacillus polymyxa", APPL MICROBIOL BIOTECHNOL., vol. 64, no. 1, March 2004 (2004-03-01), pages 112 - 9
NATHAN SHLECHTER: "Pyrolysis of 2,3-butylene Glycol Diacetate to Butadiene", INDU. ENG. CHEM., 1945, pages 905
OKAMOTO T: "Zymobacter palmae gen. nov., sp. nov., a new ethanol-fermenting peritrichous bacterium isolated from palm sap", ARCH MICROBIOL., vol. 160, no. 5, 1993, pages 333 - 7
S. S. NILEGAONKAR: "Potential of Bacillus licheniformis for the production of 2,3-butanediol", JOURNAL OF FERMENTATION AND BIOENGINEERING, vol. 82, no. 4, 1996, pages 408 - 410
SIEMERINK M. A. J. ET AL.: "D-2,3-Butanediol Production Due to Heterologous Expression of an Acetoin Reductase in Clostridium acetobutylicum", APPL. ENVIRON. MICROBIOL., vol. 77, no. 8, April 2011 (2011-04-01), pages 2582 - 2588, XP055111121 *
SPRENGER GA; SCHORKEN U; SPRENGER G; SAHM H: "Transketolase A of Escherichia coli K12. Purification and properties of the enzyme from recombinant strains", EUR J BIOCHEM., vol. 230, no. 2, 1 June 1995 (1995-06-01), pages 525 - 32
WANG Q: "Metabolic engineering of thermophilic Bacillus licheniformis for chiral pure D-2,3-butanediol production", BIOTECHNOL BIOENG, vol. 109, no. 7, July 2012 (2012-07-01), pages 1610 - 21
YANG T: "Optimization and scale-up of 2,3-butanediol production by Bacillus amyloliquefaciens B10-127", WORLD J MICROBIOL BIOTECHNOL., vol. 28, no. 4, April 2012 (2012-04-01), pages 1563 - 74

Also Published As

Publication number Publication date
ES2742418T3 (es) 2020-02-14
CN105793429A (zh) 2016-07-20
EP3072974B1 (en) 2019-07-24
CN105793429B (zh) 2019-12-06
BR112016011487B1 (pt) 2022-05-24
TW201525139A (zh) 2015-07-01
MY179877A (en) 2020-11-18
EP3072974A4 (en) 2017-07-19
SG11201604094VA (en) 2016-07-28
US10072275B2 (en) 2018-09-11
US20160298144A1 (en) 2016-10-13
BR112016011487A2 (pt) 2020-06-30
EP3072974A1 (en) 2016-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Jang et al. Butanol production from renewable biomass by clostridia
Kaur et al. Advances in biotechnological production of 1, 3-propanediol
Van Hecke et al. Integrated bioprocess for long-term continuous cultivation of Clostridium acetobutylicum coupled to pervaporation with PDMS composite membranes
Qureshi et al. Butanol,‘a superior biofuel’production from agricultural residues (renewable biomass): recent progress in technology
Sabra et al. Microbial cell factories for diol production
Jiang et al. Microbial production of short chain diols
EP2204453B1 (en) Process for cell-free production of chemicals
Maiti et al. A re-look at the biochemical strategies to enhance butanol production
JP6032012B2 (ja) ２，３−ブタンジオールの製造方法
Zhao et al. Biological production of butanol and higher alcohols
US20120231514A1 (en) Fermentation method to produce a lignocellulose-based sugar stream with enriched pentose content
Vivek et al. Production and applications of 1, 3-propanediol
Maiti et al. Quest for sustainable bio‐production and recovery of butanol as a promising solution to fossil fuel
Mitsui et al. Bioengineering for the industrial production of 2, 3-butanediol by the yeast, Saccharomyces cerevisiae
CN105793429B (zh) 2,3-丁二醇的制造方法
Loureiro‐Pinto et al. Valorization of crude glycerol from the biodiesel industry to 1, 3‐propanediol by Clostridium butyricum DSM 10702: influence of pretreatment with ion exchange resins
Hou-Rui Key drivers influencing the large scale production of xylitol
Tang et al. Bioprocesses for lactic acid production from organic wastes toward industrialization-a critical review
JP2016077262A (ja) ２，３−ブタンジオールの製造方法
Kalisa et al. Current trends in efficient production of 1, 3-propanediol
Karayannis et al. A non-aseptic bioprocess for production and recovery of 2, 3-butanediol via conversion of crude glycerol and corn steep liquor at pilot-scale
Lu Butanol production from lignocellulosic feedstocks by acetone-butanol-ethanol fermentation with integrated product recovery
Isar et al. 1, 3-Propanediol: From Waste to Wardrobe
Sun et al. 1, 3‐Propanediol
JP6485009B2 (ja) ２，３−ブタンジオールの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14864767

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15037735

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112016011487

Country of ref document: BR

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2014864767

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2014864767

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112016011487

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20160520

ENPC Correction to former announcement of entry into national phase, pct application did not enter into the national phase

Ref document number: 112016011487

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Free format text: ANULADA A PUBLICACAO CODIGO 1.3 NA RPI NO 2431 DE 08/08/2017 POR TER SIDO INDEVIDA.

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01E

Ref document number: 112016011487

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Free format text: APRESENTE A TRADUCAO SIMPLES DA FOLHA DE ROSTO DA CERTIDAO DE DEPOSITO DAS PRIORIDADES JP 2013-241869 E JP 2014-215075; OU DECLARACAO DE QUE OS DADOS DO PEDIDO INTERNACIONAL ESTAO FIELMENTE CONTIDOS NAS PRIORIDADES REIVINDICADAS, CONTENDO TODOS OS DADOS IDENTIFICADORES DESTAS (TITULARES, NUMERO DE REGISTRO, DATA E TITULO), CONFORME O PARAGRAFO UNICO DO ART. 25 DA RESOLUCAO 77/2013 E ART. 2O DA RESOLUCAO 179/2017. CABE SALIENTAR QUE NAO FOI POSSIVEL IDENTIFICAR OS TITULARES DOS PEDIDOS PRIORITARIOS NOS DOCUMENTOS JUNTADOS AO PROCESSO, TAMPOUCO NOS APRESENTADOS NA OMPI. TAL INFORMACAO E NECESSARIA PARA O EXAME DA CESSAO DO DOCUMENTO DE PRIORIDADE.

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112016011487

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20160520