JP2008079564A - キシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質及びその利用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】キシロースイソメラーゼ活性を有する野生型タンパク質において、配列番号2における第54位及び第370位の双方又はいずれかに対応する位置において変異を有するアミノ酸配列を有し、キシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質を提供する。
【選択図】なし
Description
(a)配列番号2に記載のアミノ酸配列の第54位に対応するアミノ酸が置換されているアミノ酸配列
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列の第370位に対応するアミノ酸が置換されているアミノ酸配列
(c)配列番号2に記載のアミノ酸配列の第54位及び第370位に対応するアミノ酸が置換されているアミノ酸配列
本発明のタンパク質は、キシロースイソメラーゼ活性を有する野生型タンパク質のアミノ酸配列を改変した新規なタンパク質に関する。キシロースイソメラーゼ活性を有する野生型タンパク質、すなわち、キシロースイソメラーゼ(EC5.3.1.5)は、D−キシロースをD−キシルロースに異性化する酵素である。本発明においてキシロースイソメラーゼ活性を有する野生型タンパク質には、二量体以上の形態でキシロースイソメラーゼ活性を発揮する場合、当該二量体以上の形態のほか、当該多量体を構成する単量体タンパク質を含んでいる。本明細書において示す配列番号2に記載のアミノ酸配列は、Piromyces sp. E2(ATCC76762)のXIのアミノ酸配列である。Piromyces sp. E2(ATCC76762)のXIは、ホモ4量体構造を有し、キシロースイソメラーゼ活性部位は4量体が会合することによって形成されていると推測されている。
本発明のタンパク質は、キシロースイソメラーゼ活性を有している。キシロースイソメラーゼ活性は、既に説明したように、キシロースをキシルロースに変換する活性であり、マグネシウム要求性の酵素反応によるものである。キシロースイソメラーゼ活性は、35℃、pH5.5で、基質であるキシロースほかMgの存在下、酵素反応を行い、その後、キシルロースを定量することにより、測定できる。酵素反応は、詳しくは、200mMマレイン酸緩衝液(pH5.5)、20mM MgSO4、1mM CoCl2、1mM MnCl2、10mM キシロースの存在下、35℃で2時間反応させた後、システイン−カルバゾール−硫酸法によりキシルロースを定量する。システイン−カルバゾール−硫酸法は、システイン−カルバゾール−硫酸溶液を加えて室温で30分間呈色させて吸光度(540nm)を測定することで、キシルロースを定量できる(J. B. C.(1951, VOL.192, p583-587)。なお、キシルロースは、HPLC法等によっても測定することができる。
本発明のポリヌクレオチドは、キシロースイソメラーゼ活性を有する野生型タンパク質のアミノ酸配列において配列番号2に記載のアミノ酸配列の第54位及び第370位の双方又はいずれかに対応する位置に変異を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしている。本発明のポリヌクレオチドによれば、野生型タンパク質のキシロースイソメラーゼ活性を変化させた改変型のタンパク質を得ることができる。改変型タンパク質は、キシロースイソメラーゼ活性を有していることが好ましい。配列番号2に記載のアミノ酸配列における第54位及び第370位の双方又はいずれかに対応する位置における好ましい変異、すなわち、アミノ酸の置換については既に記載したとおりである。また、本発明のタンパク質が有する好ましいアミノ酸配列についても既に記載したとおりである。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質が採りうる好ましい態様のタンパク質のほか本発明のタンパク質が採り得る各種態様のタンパク質をコードすることができる。すなわち、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号2に記載のアミノ酸配列において第54位及び第370位に対応する位置以外において1又は2以上の変異を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしていてもよい。
本発明の細胞は、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、前記タンパク質を発現可能に保持することができる。宿主となる細胞としては、特に限定しないが、Eshrichia coli、Bacillus subtilisなどの細菌のほか、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Saccharomyces pombe)などのサッカロマイセス属酵母、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)などの酵母、sf9、sf21等の昆虫細胞、COS細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)などの動物細胞、サツマイモ、タバコなどの植物細胞などとすることができるが、好ましくは酵母である。酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエなどのサッカロマイセス属を好ましく用いることができる。本発明のポリヌクレオチドは、宿主の染色体上及び染色体外において保持させることができる。
本発明のキシロースのキシルロースへの変換方法は、本発明のタンパク質を用いることができる。本発明のタンパク質を用いた酵素反応により、効率的にキシロースをキシルロースに変換することができる。また、本発明の変換方法は、上記した本発明の細胞を用いることもできる。本発明の細胞を用いることで、キシロースあるいはヘミセルロースを含む原料を用いて効率的にキシロースからキシルロースへと変換させることができ、結果として細胞による物質生産及び細胞増殖を、ヘミセルロースを含むヘミセルロース系原料を用いても効率的に実施することができる。
Piromyces sp E2由来キシロースイソメラーゼ遺伝子xyla(Genbank: AJ249909)(配列番号1)をerror-prone PCR(10 mM Tris-HClpH 9.0, 50 mM KCl, 0.1% TritonX-100, 2-6 mM MgCl2, 0.2-0.6mM MnCl2, 0.2 mM dATP, 0.2 mM dGTP,1 mM dCTP,1 mM dTTP,1-100 ng/μl MnP, 0.3μM primer, 25 mU/μl Promega Taq DNA polymerase)により増幅し、100塩基当たり平均1個の変異(error率1%)をランダムに導入したライブラリーを作製した。ライブラリーに含まれる各クローンにつき、200mMマレイン酸緩衝液(pH5.5)、20mM MgSO4、1mM CoCl2、1mM MnCl2、10mM キシロースの存在下、35℃で2時間反応させた後、システイン−カルバゾール−硫酸法によりキシルロースを定量して、キシロースイソメラーゼ活性を測定した。システイン−カルバゾール−硫酸法は、上記反応後に、システイン−カルバゾール−硫酸溶液を加えて室温で30分間呈色させ、吸光度(540nm)を測定して行った。
Claims (28)
- キシロースイソメラーゼ活性を有する野生型タンパク質において、配列番号2における第54位及び第370位の双方又はいずれかに対応する位置において変異を有するアミノ酸配列を有し、キシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質。
- 配列番号2に記載のアミノ酸配列の第54位及び第370位の双方又はいずれかに対応するアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を有する、請求項1に記載のタンパク質。
- 前記第54位に対応するアミノ酸がシステインよりも塩基性のアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有する、請求項1又は2に記載のタンパク質。
- 前記第54位に対応するアミノ酸がアルギニン、リシン及びヒスチジンのいずれかで置換されているアミノ酸配列を有する、請求項1〜3のいずれかに記載のタンパク質。
- 前記第54位に対応するアミノ酸がアルギニンで置換されているアミノ酸配列を有する、請求項1〜4のいずれかに記載のタンパク質。
- 前記第370位に対応するアミノ酸が側鎖に水酸基を有するアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を有する、請求項1〜5のいずれかに記載のタンパク質。
- 前記第370位に対応するアミノ酸がセリンで置換されているアミノ酸配列を有する、請求項1〜6のいずれかに記載のタンパク質。
- 前記第54位に対応するアミノ酸がアルギニンで置換され、前記第370位に対応するアミノ酸がセリンで置換されているアミノ酸配列を有する、請求項1又は2に記載のタンパク質。
- 配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が備えるキシロースイソメラーゼ活性よりも高いキシロースイソメラーゼ活性を備える、請求項1〜8のいずれかに記載のタンパク質。
- 配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が備えるキシロースイソメラーゼ活性に対して1.5倍以上のキシロースイソメラーゼ活性を備える、請求項9に記載のタンパク質。
- 配列番号2に記載のアミノ酸配列において第54位及び第370位に対応する位置以外において1又は2以上の変異を有する酸配列を有する、請求項1〜10のいずれかに記載のタンパク質。
- キシロースイソメラーゼ活性を有する野生型タンパク質のアミノ酸配列において、配列番号2における第54位及び第370位の双方又はいずれかに対応する位置に変異を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 以下の(a)〜(c)のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、請求項12に記載のポリヌクレオチド。
(a)配列番号2に記載のアミノ酸配列の第54位に対応するアミノ酸が置換されているアミノ酸配列
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列の第370位に対応するアミノ酸が置換されているアミノ酸配列
(c)配列番号2に記載のアミノ酸配列の第54位及び第370位に対応するアミノ酸が置換されているアミノ酸配列 - 前記タンパク質はキシロースイソメラーゼ活性を有する、請求項12又は13に記載のポリヌクレオチド。
- 前記(a)のアミノ酸配列は、前記第54位に対応するアミノ酸がリシン、ヒスチジン及びアルギニンのいずれかで置換されているアミノ酸配列である、請求項12又は13又は14に記載のポリヌクレオチド。
- 前記(b)のアミノ酸配列は、前記第370位に対応するアミノ酸がスレオニン、チロシン及びセリンのいずれかで置換されているアミノ酸配列である、請求項13〜15のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
- 前記(c)のアミノ酸配列は、前記第54位に対応するアミノ酸がリシン、ヒスチジン及びアルギニンのいずれかで置換され、前記第370位に対応するアミノ酸がスレオニン、チロシン及びセリンのいずれかで置換されているアミノ酸配列である、請求項13又は14に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号2に記載のアミノ酸配列において第54位及び第370位に対応する位置以外において1又は2以上の変異を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、請求項13又は14に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号1、3、5及び7に記載の塩基配列又はその一部若しくはこれらの相補鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチドである、請求項12〜18のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
- 請求項12〜19のいずれかに記載のポリヌクレオチドを当該ポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現可能に保持する細胞。
- 前記細胞は酵母である、請求項20に記載の細胞。
- 有機酸生産に関連する1種又は2種以上の酵素をコードするポリヌクレオチドを前記酵素を発現可能に保持する、請求項20又は21に記載の細胞。
- 前記有機酸は乳酸であり、前記酵素は乳酸脱水素酵素である、請求項22に記載の細胞。
- エタノール生産に関連する1種あるいは2種以上の酵素をコードするポリヌクレオチドを前記酵素を発現可能に保持する、請求項20〜23のいずれかに記載の細胞。
- 請求項1〜11のいずれかに記載のタンパク質を用いてキシロースをキシルロースに変換する方法。
- 請求項20〜24のいずれかに記載の細胞を用いて、キシロースをキシルロースに変換する方法。
- 請求項22又は23に記載された細胞を用いて有機酸を生産する工程、を備える、有機酸の生産方法。
- 請求項24に記載された細胞を用いてエタノールを生産する工程、を備える、エタノールの生産方法。
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WO2013105653A1 (ja) | 2012-01-13 | 2013-07-18 | 東レ株式会社 | 化学品の製造方法 |
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