KR20140042888A - 5탄당 발효 세포 - Google Patents

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종 르네 마르셀 드
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디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
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Abstract

본 발명은 자일로스 아이소머라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 관한 것이며, 여기에서 상기 자일로스 아이소머라제의 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열과 75% 이상의 서열 일치성을 가지며 상기 뉴클레오타이드 서열은 숙주와 이종이다. 본 발명의 세포를 에탄올과 같은 발효 산물의 생산 방법에 사용할 수 있다. 상기와 같은 방법은 자일로스의 공급원을 포함하는 배지를, 본 발명의 세포가 자일로스를 상기 발효 산물로 발효하도록 상기 세포와 함께 발효시킴을 포함할 수 있다.

Description

5탄당 발효 세포{A PENTOSE SUGAR FERMENTING CELL}
본 발명은 자일로스를 자일룰로스로 이성화할 수 있는 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기와 같은 세포를 발효 산물, 예를 들어 에탄올의 생산에 사용하는 방법에 관한 것이다.
최근 수십년간 전통적인 화석 연료(석유-기재 연료)의 대규모 소비는 높은 수준의 오염에 원인이 되어 왔다. 이는, 화석 연료의 세계 매장량이 유한하지 않다는 사실 및 점점 커지는 환경적 자각과 함께, 리터 기준으로 무연 가솔린보다 CO2를 덜 방출하는 미립자-부재 연소 연료 공급원인 에탄올과 같은 대체 연료의 가능성을 조사하고자 하는 새로운 발의를 자극하였다.
바이오매스-유도된 에탄올을, 다수의 다양한 공급원들로부터 수득한 6탄당의 발효에 의해 생산할 수도 있지만, 연료 알콜의 상업적인 규모의 생산에 전형적으로 사용되는 기질, 예를 들어 사탕수수당 및 옥수수 전분은 값이 비싸다. 따라서 연료 에탄올의 생산 증가는 보다 저렴한 공급원료의 사용을 필요로 할 것이다.
현재, 오직 식물 바이오매쓰로부터 유도된 리그노셀룰로스 공급원료만이 현재 에탄올 생산에 사용되는 작물을 대체하기에 충분한 양으로 입수 가능하다. 대부분의 리그노셀룰로스 물질에서, 글루코스 다음의 두 번째 가장 통상적인 당은 자일로스이다. 따라서, 경제적으로 실행 가능한 연료 생산 공정을 위해서는 6탄당 및 5탄당을 모두 발효시켜 에탄올을 형성시켜야 한다. 효모 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)가 에탄올 생산에 확고하고 매우 적합하지만, 탄소원으로서 자일로스를 사용하여 에탄올을 생산할 수는 없다. 또한, 고 에탄올 수율 및 고 에탄올 생산성으로 자일로스를 에탄올로 발효할 수 있는 천연 유기체는 공지되어 있지 않다.
따라서 리그노셀룰로스 공급원료로부터 에탄올의 상업적으로 실행할 수 있는 생산을 가능하게 하기 위해서는 상기의 성질들을 갖는 유기체가 필요하다.
본 발명에 따라, 발효, 예를 들어 알콜 발효가 가능하고 탄소원으로서 자일로스를 이용할 수 있는 세포를 제공한다. 상기와 같은 세포는 자일로스 아이소머라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 여기에서 상기 자일로스 아이소머라제의 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열과 75% 이상의 서열 일치성을 가지며 상기 뉴클레오타이드 서열은 숙주와 이종이다. 상기와 같은 세포는 탄소원으로서 자일로스를 사용할 때 야생형 사상균에 비해 더 많은 양의 에탄올을 생산한다.
본 발명은 또한
- 본 발명의 세포가 자일로스를 발효 산물로 발효하도록 자일로스의 공급원을 함유하는 배지를 상기 세포와 함께 발효시킴을 포함하는 발효 산물의 생산 방법;
- L-아라비노스를 또한 이용할 수 있는 본 발명에서 정의된 바와 같은 세포가 자일로스 및 L-아라비노스를 발효 산물로 발효하도록 적어도 자일로스의 공급원 및 L-아라비노스의 공급원을 함유하는 배지를 상기 세포와 함께 발효시킴을 포함하는 발효 산물의 생산 방법; 및
- 적어도 자일로스의 공급원 및 L-아라비노스의 공급원을 함유하는 배지를 본 발명의 세포 및 L-아라비노스를 이용할 수 있는 세포와 함께 발효시키고, 이에 의해 각각의 세포가 자일로스 및/또는 아라비노스를 발효 산물로 발효함을 포함하는 발효 산물의 생산 방법
을 제공한다.
하나의 실시태양에서, 상기 세포는 클로스트리디움(Clostridium) 속의 세포, 예를 들어 클로스트리디움 베이제링키이(Clostridium beijerinckii) 세포로부터 수득할 수 있는 자일로스 아이소머라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 뉴클레오타이드는 야생형이거나 또는 코돈 최적화되거나 또는 코돈 쌍 최적화될 수 있다.
본 발명은 또한 발효 산물의 생산 방법에서 본 발명의 세포의 용도를 제공한다.
도 1은 사카로마이세스 세레비지아에에서의 발현을 위한, 클로스트리디움 베이제링키이로부터의 자일로스 아이소머라제를 암호화하는 p427-TEF의 플라스미드 지도를 나타낸다. CpO는 최적화된 코돈 쌍을 나타낸다.
도 2는 유일한 탄소원으로서 2% 자일로스 상에서 pPWT215에 의해 형질전환된 BIE104P1, 및 플라스미드 중에 DNA가 없이 형질전환된(모의 형질전환) 비교 균주의 생육 곡선을 나타낸다. 숫자 "1" 및 "2"는 배양물 분액의 신선한 배지로의 이동을 가리킨다. 마지막 배양물(2차 이동 후)을 제외하고, 모든 배양물을 공기의 존재 하에서 배양시켰다.
도 3은 실시예 6으로부터의, 균주 BIE292XI(클로스트리디움 베이제링키이)(흑색 선) 및 모의 균주(회색 선)의 생육 곡선들을 나타낸다.
서열 목록의 간단한 설명
서열번호 1은 클로스트리디움 베이제링키이로부터의 코돈 쌍 최적화된 자일로스 아이소머라제 서열을 나타낸다.
서열번호 2는 클로스트리디움 베이제링키이로부터의 자일로스 아이소머라제의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열번호 3은 순방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
서열번호 4는 역방향 프라이머의 서열을 나타낸다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위 전체를 통해서 "포함하다" 및 "함유하다"란 단어들 및 "포함하는", "포함하여", "함유하는" 및 "함유하여"와 같은 어미변화 단어들은 총괄적으로 해석되어야 한다. 즉, 이들 단어는, 내용상 허용되는 경우, 구체적으로 인용되지 않은 다른 요소들 또는 정수들의 가능한 포함을 전하고자 한다.
본 발명은 자일로스 아이소머라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 관한 것이며, 여기에서 상기 자일로스 아이소머라제의 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열과 75% 이상의 일치성을 갖고 상기 뉴클레오타이드 서열은 숙주와 이종이다.
자일로스 아이소머라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 존재는 상기 세포에 자일로스를 자일룰로스로 이성화시키는 능력을 부여한다.
"자일로스 아이소머라제"(EC 5.3.1.5)는 본 발명에서 D-자일로스의 D-자일룰로스로의, 및/또는 이와 역으로의 직접 아이소머화를 촉매화하는 효소로서 정의된다. 상기 효소는 또한 D-자일로스 케토아이소머라제로서 공지되어 있다. 자일로스 아이소머라제는 본 발명에서 또한 D-글루코스와 D-프럭토스 간의 전환을 촉매화할 수도 있다(따라서 글루코스 아이소머라제로도 지칭될 수 있다). 본 발명에서 자일로스 아이소머라제는 보조인자로서 2가 양이온, 예를 들어 마그네슘, 망간 또는 코발트를 필요로 할 수도 있다.
따라서, 본 발명의 세포는 자일로스를 자일룰로스로 이성화할 수 있다. 자일로스를 자일룰로스로 이성화하는 능력은, 정의된 자일로스 아이소머라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 구조물로 숙주 세포를 형질전환시킴으로써 상기 숙주 세포에 부여된다. 본 발명의 세포는 자일로스의 자일룰로스로의 직접 이성화에 의해 자일로스를 자일룰로스로 이성화한다. 이는, 자일로스 리덕타제 및 자일리톨 데하이드로게나제 각각에 의해 촉매화되는 바와 같은 자일리톨 중간체를 통한 자일로스의 자일룰로스로의 2 단계 전환과 상반되게, 자일로스 아이소머라제에 의해 촉매화되는 단일 반응으로 자일로스가 자일룰로스로 이성화됨을 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명에서 자일로스 아이소머라제 활성의 1 단위(U)는 쿠이퍼(Kuyper) 등(문헌[2003, FEMS Yeast Res. 4: 69-78])에 의해 개시되는 바와 같은 조건 하에서, 분당 1 nmol의 자일룰로스를 생산하는 효소의 양으로서 정의될 수 있다.
본 발명의 세포를 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 이와 74% 이상의 서열 일치성을 갖는 서열을 갖는 자일로스 아이소머라제에 관하여 정의한다. 마찬가지로, 본 발명의 세포를 상기와 같은 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열인 자일로스 아이소머라제에 관하여 정의할 수도 있다.
서열번호 2는 클로스트리디움 베이제링키이로부터의 자일로스 아이소머라제의 아미노산 서열을 나타낸다. 본 발명의 세포는 서열번호 2 또는 이와 74% 이상의 서열 일치성을 갖는 서열의 아미노산을 갖는 자일로스 아이소머라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 세포는 서열번호 2의 아미노산 서열과 약 75% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상, 또는 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 일치성을 갖는 서열을 갖는 자일로스 아이소머라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포이다. 본 발명에 따른 세포는 서열번호 1에서 나타낸 핵산 서열과 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상, 또는 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 일치성을 갖는 서열을 갖는 자일로스 아이소머라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서 서열 일치성(또는 서열 유사성)은 서열들을 비교함으로써 측정된 바와 같은, 2 개 이상의 아미노산(폴리펩타이드 또는 단백질) 서열 또는 2 개 이상의 핵산(폴리뉴클레오타이드) 서열 간의 관계로서 정의된다. 대개, 서열 일치성 또는 유사성은 전형적으로는 비교되는 서열들의 전체 길이에 대해 비교된다. 그러나, 서열들을 보다 짧은 비교 창에 대해서 비교할 수도 있다. 당해 분야에서, "일치성"은 또한 경우에 따라, 일련의 아미노산 또는 핵산 서열들 간의 합치에 의해 측정되는 바와 같은, 상기 서열들간의 서열 관련성의 정도를 의미한다.
일치성을 측정하기에 바람직한 방법들은 검사되는 서열들간의 가장 큰 합치를 제공하도록 설계된다. 일치성 및 유사성을 측정하기 위한 방법들은 공개적으로 입수할 수 있는 컴퓨터 프로그램으로 성문화되어 있다. 2 개 서열간의 일치성 및 유사성을 측정하기에 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 예를 들어 BestFit, BLASTP, BLASTN, 및 FASTA(문헌[Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)], NCBI 및 다른 출처(문헌[BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894]로부터 공개적으로 입수할 수 있다)를 포함한다. BLASTP를 사용하는 아미노산 서열 비교에 바람직한 매개변수들은 갭 오픈 11.0, 갭 익스텐드 1, 블로섬(Blosum) 62 매트릭스이다. BLASTP를 사용하는 핵산 서열 비교에 바람직한 매개변수는 갭 오픈 11.0, 갭 익스텐드 1, DNA 전체 매트릭스(DNA 일치성 매트릭스)이다.
임의로, 아미노산 유사성의 정도를 측정함에 있어서, 숙련가는 소위 "보존적" 아미노산 치환을 또한 고려할 수 있으며, 이는 숙련가에게 명백할 것이다.
보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기들의 호환성을 지칭한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 아이소류신이고; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 세린 및 쓰레오닌이고; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 아스파라진 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 리신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 시스테인 및 메티오닌이다.
바람직한 보존적 아미노산 치환 군은 발린-류신-아이소류신, 페닐알라닌-타이로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 및 아스파라진-글루타민이다. 본 발명에 개시된 아미노산 서열의 치환 변체는 개시된 서열들 중의 하나 이상의 잔기가 제거되고 그 자리에 상이한 잔기가 삽입된 것들이다. 바람직하게는, 상기 아미노산 변화는 보존적이다. 천연 아미노산 각각에 대해 바람직한 보존적 치환은 하기와 같다: Ala에서 ser로; Arg에서 lys로; Asn에서 gln 또는 his로; Asp에서 glu로; Cys에서 ser 또는 ala로; GIn에서 asn으로; GIu에서 asp로; GIy에서 pro로; His에서 asn 또는 gln으로; He에서 leu 또는 val로; Leu에서 ile 또는 val로; Lys에서 arg로; gln 또는 glu로; Met에서 leu 또는 ile로; Phe에서 met, leu 또는 tyr로; Ser에서 thr로; Thr에서 ser로; Trp에서 tyr로; Tyr에서 trp 또는 phe로; 및 Val에서 ile 또는 leu로.
본 발명에 따른 자일로스에서 자일룰로스로의 전환을 촉매화하는 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 또한, 보통의 또는 바람직하게는 엄격한 하이브리드화 조건 하에서, 서열번호 2에 나타낸 서열 또는 이와 74% 이상의 서열 일치성을 갖는 서열을 갖는 상기 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 하이브리드화하는 능력에 의해 정의할 수도 있다.
공식적으로, 상기와 같은 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 2에 나타낸 서열 또는 이와 74% 이상의 서열 일치성을 갖는 서열을 갖는 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 역 보체와 하이브리드화한다, 예를 들어 서열번호 1 또는 2의 역 보체와 하이브리드화한다.
본 발명에서 엄격한 하이브리드화 조건은 약 1 M 염, 바람직하게는 6 x SCC(염화 나트륨, 나트륨 시트레이트)를 포함하는 용액 또는 필적하는 이온 강도를 갖는 임의의 다른 용액 중에서 약 65 ℃의 온도에서 약 25 이상, 바람직하게는 약 50, 75 또는 100 뉴클레오타이드, 및 가장 바람직하게는 약 200 이상의 뉴클레오타이드의 핵산 서열의 하이브리드화를 허용하고 약 0.1 M 염, 바람직하게는 0.2 x SCC를 포함하는 용액 또는 필적하는 이온 강도를 갖는 임의의 다른 용액 중에서 65 ℃에서 세척하는 조건으로서 정의된다. 바람직하게는, 상기 하이브리드화를 밤새, 즉 10 시간 이상 동안 수행하고, 바람직하게는 세척을, 상기 세척액을 2 회 이상 교환하면서 1 시간 이상 동안 수행한다. 이러한 조건은 대개 약 90% 이상의 서열 일치성을 갖는 서열들의 특이적인 하이브리드화를 허용할 것이다.
본 발명에서 보통의 조건은 약 1 M 염, 바람직하게는 6 x SCC를 포함하는 용액 또는 필적하는 이온 강도를 갖는 임의의 다른 용액 중에서 약 45 ℃의 온도에서 50 이상, 바람직하게는 약 200 이상의 뉴클레오타이드의 핵산 서열의 하이브리드화를 허용하고 약 1 M 염, 바람직하게는 6 x SCC를 포함하는 용액 또는 필적하는 이온 강도를 갖는 임의의 다른 용액 중에서 실온에서 세척하는 조건으로서 정의된다. 바람직하게는, 상기 하이브리드화를 밤새, 즉 10 시간 이상 동안 수행하고, 바람직하게는 세척을, 상기 세척액을 2 회 이상 교환하면서 1 시간 이상 동안 수행한다. 이러한 조건은 대개 약 50% 이하의 서열 일치성을 갖는 서열들의 특이적인 하이브리드화를 허용할 것이다. 당해 분야의 숙련가는 50% 내지 90%로 일치성이 다양한 서열들을 명확히 확인하기 위해서 이들 하이브리드화 조건을 변경시킬 수 있을 것이다.
상기 도입된 효소가 본 발명의 세포에서 활성 형태로 발현될 가능성을 증가시키기 위해서, 상응하는 암호화 뉴클레오타이드 서열을 그의 코돈 사용이 선택된 효모 세포의 경우에 최적화되도록 적합화시킬 수 있다. 코돈 최적화를 위한 여러 방법들이 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 뉴클레오타이드 서열의 코돈 사용을 효소의 경우에 최적화시키는 바람직한 방법은 WO2006/077258 및/또는 WO2008/000632에 개시된 바와 같은 코돈 쌍 최적화 기술이다. WO2008/000632는 코돈-쌍 최적화를 다룬다. 코돈-쌍 최적화는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 개선된 발현 및/또는 상기 암호화된 폴리펩타이드의 개선된 생산을 획득하기 위해서 그의 코돈-사용, 특히 사용되는 코돈-쌍에 관하여 변형시키는 방법이다. 코돈 쌍은 암호화 서열 중 일련의 2 개의 후속 3 개(코돈)로서 정의된다.
본 발명에서, 유전자 발현 및 번역 효율에 대한 간단한 척도로서, 문헌[Xuhua Xia, Evolutionary Bioinformatics 2007: 3 53-58]에 개시된 바와 같은 코돈 적응 지수(CAI)를 사용한다. 상기 지수는 각 코돈의 상대적인 이점을 평가하기 위해서 하나의 종으로부터 고도로 발현된 비교 유전자 세트를 사용하며, 유전자에 대한 점수를 상기 유전자 중의 모든 코돈의 사용 빈도로부터 계산한다. 상기 지수는 코돈 사용 패턴을 성형함에 있어서 선택이 유효한 정도를 평가한다. 그 점에 있어서, 상기 지수는 유전자의 발현 수준을 예견하고, 숙주에 대한 바이러스 유전자의 적합성을 평가하고, 상이한 유기체에서 코돈 사용의 비교를 수행하는데 유용하다. 상기 지수는 또한 이종 유전자 발현의 있음직한 성공을 대략적으로 가리킬 수도 있다. 본 발명에 따른 코돈 쌍 최적화된 유전자에서, 상기 CAI는 0.6 이상, 0.7 이상, 0.8 이상, 0.85 이상, 0.87 이상, 0.9 이상, 0.95 이상, 또는 약 1.0이다.
본 발명의 세포에서, 상기 자일로스 아이소머라제는 전형적으로 상기 세포에 대해 이종이다. 즉, 상기 자일로스 아이소머라제는 상기가 존재하는 문제의 세포 중에 유기체, 세포, 게놈 DNA 또는 RNA 서열의 부분으로서 천연으로 존재하지 않는 서열을 갖는다. 즉, 상기 자일로스 아이소머라제는 상기 세포에 대해 외인성이거나 또는 상기 세포에 천연으로 존재하지 않는다. 따라서, 자일로스 아이소머라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 형질전환된 숙주 세포에서 전형적으로 발현되거나 또는 활성 형태로 발현될 수 있다.
따라서 본 발명의 세포는 상기 정의된 바와 같은 자일로스 아이소머라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 구조물을 포함하는, 즉 상기 구조물에 의해 형질전환된 세포이다. 상기 자일로스 아이소머라제 암호화 서열을 포함하는 핵산 구조물은 바람직하게는 상기 숙주 세포에서 상기 자일로스 아이소머라제를 발현시킬 수 있다.
세포에서 이종 자일로스 아이소머라제 서열을 발현시키는 방법은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다.
따라서, 본 발명의 세포는 재조합 세포이다. 즉, 본 발명의 세포는 문제의 세포에서 천연으로 존재하지 않는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 또는 상기 서열에 의해 형질전환되거나 또는 상기 서열에 의해 유전자 변형된다.
세포에서 자일로스 아이소머라제의 재조합 발현 뿐만 아니라 본 발명의 세포의 추가적인 유전자 변형에 대한 기법들은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다. 전형적으로 상기와 같은 기법은 관련된 서열을 포함하는 핵산 구조물에 의한 세포의 형질전환을 수반한다. 상기와 같은 방법들은 예를 들어 표준 안내서, 예를 들어 문헌[Sambrook and Russel (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press] 또는 문헌[F. Ausubel et al., eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)]으로부터 공지되어 있다. 진균 숙주 세포의 형질전환 및 유전자 변형에 대한 방법들은 예를 들어 EP-A-0635 574, WO98/46772, WO99/60102, WO00/37671, WO90/14423, EP-A-0481008, EP-A-0635574 및 미국 특허 제 6,265,186 호로부터 공지되어 있다.
대부분의 에피솜유사 또는 2μ 플라스미드는 비교적 불안정하여, 각 세대 후에 대략 10-2 이상의 세포에서 상실된다. 선택적인 생육 조건 하에서조차, 상기 세포의 오직 60% 내지 95%만이 상기 에포솜유사 플라스미드를 유지한다. 대부분의 에피솜유사 플라스미드의 사본수는 cir+ 숙주의 세포당 10 내지 40의 범위이다. 그러나, 상기 플라스미드는 상기 세포 중에서 균등하게 분포되지 않으며, 집단에서 세포당 사본수에 높은 변동이 존재한다. 편입형 플라스미드에 의해 형질전환된 균주는 선택적인 압력의 부재 하에서조차 대단히 안정하다. 그러나, 나란히 반복되는 DNA 간의 상동 재조합에 의해 대략 10-3 내지 10-4 빈도로 플라스미드 상실이 발생할 수 있으며, 이는 상기 벡터 서열을 루핑 아웃(looping out)에 이르게 한다. 바람직하게는, 따라서 안정한 편입의 경우에 상기 벡터 설계는, 상기 선택 마커 유전자의 상실 시(이는 또한 분자내, 상동 재조합에 의해 발생한다) 상기 편입된 구조물의 루핑 아웃이 더 이상 가능하지 않도록 하는 것이다. 바람직하게는, 따라서 상기 유전자는 안정하게 편입된다. 본 발명에서 안정한 편입은 상기 게놈 내로의 편입으로서 정의되며, 여기에서 상기 편입된 구조물의 루핑 아웃은 더 이상 가능하지 않다. 바람직하게는 선택 마커가 존재하지 않는다.
전형적으로, 상기 핵산 구조물은 플라스미드, 예를 들어 낮은 사본수 플라스미드 또는 높은 사본수 플라스미드일 수 있다. 본 발명에 따른 세포는, 예를 들어 뉴클레오타이드 구조물의 다중 복제에 의해 또는 상기 자일로스 아이소머라제 서열의 다중 사본수를 갖는 구조물의 사용에 의해 자일로스 아이소머라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 단일 또는 다중 사본수를 포함할 수 있다.
상기 핵산 구조물을 에피솜에 의해 유지시킬 수 있으며 따라서 상기 구조물은 자율 복제를 위한 서열, 예를 들어 자율 복제 서열을 포함할 수 있다. 적합한 에피솜유사 핵산 구조물은 예를 들어 효모 2μ 또는 pKD1 플라스미드(문헌[Gleer et al., 1991, Biotechnology 9: 968-975]), 또는 AMA 플라스미드(문헌[Fierro et al., 1995, Curr Genet. 29:482-489])를 기본으로 할 수 있다. 한편으로, 각각의 핵산 구조물을 상기 세포의 게놈에 하나 이상의 사본수로 편입시킬 수 있다. 상기 세포 게놈 내로의 편입은 비-상동 재조합에 의해 무작위로 발생할 수 있지만, 바람직하게는 상기 핵산 구조물은 당해 분야에 널리 공지된 바와 같이 상동 재조합에 의해 상기 세포의 게놈 내로 편입될 수 있다(예를 들어 WO90/14423, EP-A-0481008, EP-A-0635 574 및 미국 특허 제 6,265,186 호를 참조하시오).
전형적으로, 상기 자일로스 아이소머라제 암호화 서열은 하나 이상의 핵산 서열에 작동적으로 결합될 것이며, 상기 자일로스 아이소머라제 서열의 전사 및/또는 번역을 제공하거나 도울 수 있다.
"작동적으로 결합된"이란 용어는 개시된 성분들이 그들이 의도하는 방식으로 작용할 수 있게 하는 관계로 놓인 병렬 배치를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서가 암호화 서열에 작동적으로 결합되며 상기 프로모터 또는 인핸서는 상기 암호화 서열의 전사에 영향을 미친다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "프로모터"란 용어는, 유전자의 전사 개시 부위의 전사 방향에 대해 상류에 위치한, 하나 이상의 유전자의 전사를 조절하는 작용을 하고 DNA-의존적인 RNA 폴리머라제에 대한 결합 부위, 전사 개시 부위 및 당해 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 다른 DNA 서열의 존재에 의해 구조적으로 확인되는 핵산 단편을 지칭한다. "구성" 프로모터는 대부분의 환경 및 발생 조건 하에서 활성인 프로모터이다. "유도" 프로모터는 환경 또는 발생 조절 하에서 활성인 프로모터이다.
본 발명에 따른 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 달성하기 위해 사용될 수 있는 프로모터는 발현시키고자 하는 상기 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 고유하지 않을 수 있다, 즉 상기 프로모터는 작동적으로 결합되는 뉴클레오타이드 서열(암호화 서열)에 이종이다. 그러나, 상기 프로모터는 숙주 세포에 대해서는 상동성, 즉 내생적일 수도 있다.
이와 관련하여 적합한 프로모터는 구성 및 유도 특성 프로모터 모두뿐만 아니라 조작된 프로모터를 포함하며, 이들은 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지되어 있다. 진핵생물 숙주 세포에서 적합한 프로모터는 GAL7, GAL10, 또는 GAL1, CYC1, HIS3, ADH1, PGL, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO1, TPI1, 및 AOX1일 수 있다. 다른 적합한 프로모터는 PDC1, GPD1, PGK1, TEF1, 및 TDH3을 포함한다.
본 발명의 세포에서, 자일로스 아이소머라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 산 서열의 3'-단부는 전사 종결자 서열에 작동적으로 결합된다. 바람직하게는 상기 종결자 서열은 선택된 숙주 세포, 예를 들어 선택된 효모 종에서 작동성일 수 있다. 어쨌든 상기 종결자의 선택은 중요하지 않으며; 상기 종결자는 예를 들어 임의의 효모 유전자로부터 나올 수 있지만, 때때로 비-효모, 진핵생물 유전자로부터 나오는 종결자들이 작용할 수도 있다. 대개 상기 자일로스 아이소머라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 종결자를 포함한다. 바람직하게는, 상기와 같은 종결자는 본 발명의 숙주 세포에서 넌센스 매개된 mRNA 분해를 방지하는 돌연변이와 결합된다(예를 들어 문헌[Shirley et al., 2002, Genetics 161:1465-1482]을 참조하시오).
상기 전사 종결 서열은 바람직하게는 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함한다.
임의로, 선택성 마커가 본 발명에 사용하기에 적합한 핵산 구조물 중에 존재할 수도 있다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "마커"란 용어는 상기 마커를 함유하는 숙주 세포의 선택 또는 상기 세포에 대한 선별을 허용하는 특징 또는 표현형을 암호화하는 유전자를 지칭한다. 상기 마커 유전자는 항생제 내성 유전자일 수 있으며 이에 의해 적합한 항생제를 사용하여, 형질전환되지 않은 세포들 중에서 형질전환된 세포를 선택할 수 있다. 적합한 항생제 내성 마커의 예는 예를 들어 다이하이드로폴레이트 리덕타제, 하이그로마이신-B-포스포트랜스퍼라제, 3'-O-포스포트랜스퍼라제 II(가나마이신, 네오마이신 및 G418 내성)를 포함한다. 상기 항생제 내성 마커들은 배수성 숙주 세포의 형질전환에 가장 편리할 수 있지만, 바람직하게는 비-항생제 내성 마커들, 예를 들어 영양요구성 마커들(URA3, TRP1, LEU2) 또는 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) TPI 유전자가 사용된다(문헌[Russell P R, 1985, Gene 40: 125-130]에 개시됨). 바람직한 실시태양에서 핵산 구조물로 형질전환된 숙주 세포는 마커 유전자가 없다. 재조합 마커 유전자 부재 미생물 숙주 세포의 제작 방법이 EP-A-O 635 574에 개시되어 있으며 상기 방법은 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans) amdS(아세트아미다제) 유전자 또는 효모 URA3 및 LYS2 유전자와 같은 양방향 마커의 사용을 기본으로 한다. 한편으로, 선별 가능한 마커, 예를 들어 녹색 형광 단백질, lacL, 루시페라제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, 베타-글루쿠로니다제를 본 발명의 핵산 구조물에 통합시켜 형질전환된 세포의 선별을 허용할 수 있다.
본 발명에 사용하기에 적합한 핵산 구조물 중에 존재할 수 있는 임의의 추가의 요소들은 비제한적으로 하나 이상의 리더 서열, 인핸서, 편입 인자, 및/또는 리포터 유전자, 인트론 서열, 센트로머, 텔로머 및/또는 기질 부착(MAR) 서열을 포함한다. 본 발명의 핵산 구조물은 자율 복제를 위한 서열, 예를 들어 ARS 서열을 추가로 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 자일로스 아이소머라제를 시토솔에서 발현시킨다. 시토솔 발현을 미토콘드리아 또는 페록시솜 표적화 신호의 결실 또는 변형에 의해 성취할 수 있다.
본 발명의 세포는 임의의 적합한 세포, 예를 들어 원핵생물 세포, 예를 들어 세균 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 전형적으로, 상기 세포는 진핵생물 세포, 예를 들어 효모 또는 사상균일 것이다.
효모는 본 발명에서 진핵 미생물로서 정의되며 현저하게는 단세포 형태로 생육하는 유미코티나(Eumycotina) 아문(문헌[Alexopoulos, C. J.,1962, In: Introductory Mycology, John Wiley & Sons, Inc., New York])의 모든 종을 포함한다.
효모는 단세포 엽상체의 출아에 의해 성장하거나 또는 상기 유기체의 분열에 의해 성장할 수 있다. 본 발명의 세포로서 바람직한 효모는 사카로마이세스, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 칸디다(Candida), 피키아(Pichia), 스키조사카로마이세스, 한세눌라(Hansenula), 클로에케라(Kloeckera), 슈바니오마이세스(Schwanniomyces) 또는 야로위아(Yarrowia) 속에 속할 수 있다. 바람직하게는 상기 효모는 혐기성 발효가 가능한 것, 보다 바람직하게는 혐기성 알콜 발효가 가능한 것이다.
사상균은 본 발명에서 유미코티나 아문의 모든 섬유 형태들을 포함하는 진핵 미생물로서 정의된다. 이들 진균은 키틴, 셀룰로스, 및 다른 복합 폴리사카라이드로 구성된 영양 균사체를 특징으로 한다.
본 발명의 세포로서 사용하기에 적합한 사상균은 효모와 형태학적으로, 생리학적으로 및 유전학적으로 다르다. 유리하게는 사상균 세포가, 대부분의 진균이 번식을 위해 멸균 조건을 필요로 하지 않고 박테리오파지 감염에 민감하지 않기 때문에, 사용될 수 있다. 사상균에 의한 영양 생육은 균사 신장에 의하며 대부분 사상균의 탄소 이화작용은 절대적으로 호기성이다. 본 발명의 숙주 세포로서 바람직한 사상균은 아스퍼질러스, 트리코더마(Trichoderma), 휴미콜라(Humicola), 아크레모니우라(Acremoniurra), 푸사리움(Fusarium) 또는 페니실리움(Penicillium) 속에 속할 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 사상균 세포는 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae), 페니실리움 크리소제늄(Penicillium chrysogenum) 또는 리조푸스 오리자에(Rhizopus oryzae) 세포일 수 있다.
수년간, 당료 작물로부터 바이오-에탄올을 생산하기 위해 다양한 유기체들의 도입이 제안되어 왔다. 그러나, 실제로 모든 주요 바이오-에탄올 생산 공정들은 계속해서 에탄올 생산자로서 사카로마이세스 속의 효모들을 사용하고 있다. 이는 산업적인 공정에 대한 사카로마이세스 종의 많은 매력적인 특징들, 즉 높은 산-, 에탄올-내성 및 내삼투성, 혐기성 생육 능력, 및 물론 그의 높은 알콜 발효 능력에 기인한다. 숙주 세포로서 바람직한 효모 종은 사카로마이세스 세레비지아에, 사카로마이세스 불데리(Saccharomyces bulderi), 사카로마이세스 바르네티(Saccharomyces barnetti), 사카로마이세스 엑시구우스(Saccharomyces exiguus), 사카로마이세스 유바룸(Saccharomyces uvarum), 사카로마이세스 다이아스타티쿠스(Saccharomyces diastaticus), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus) 또는 클루이베로마이세스 프라길리스(Kluyveromyces fragilis)를 포함한다.
본 발명의 세포는 식물 바이오매스, 셀룰로스, 헤미셀룰로스, 펙틴, 람노스, 갈락토스, 퓨코스, 말토스, 말토덱스트린, 리보스, 리뷸로스, 또는 전분, 전분 유도체, 슈크로스, 락토오스 및 글리세롤을, 예를 들어 발효성 당으로 전환시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 세포는 하나 이상의 효소, 예를 들어 셀룰로스의 글루코스 단량체로의 전환 및 헤미셀룰로스의 자일로스 및 아라비노스 단량체로의 전환에 필요한 셀룰라제(엔도셀룰라제 또는 엑소셀룰라제), 헤미셀룰라제(엔도- 또는 엑소-자일라나제 또는 아라비나제), 펙틴을 글루쿠론산 및 갈락투론산으로 전환시킬 수 있는 펙티나제, 또는 전분을 글루코스 단량체로 전환시키는 아밀라제를 발현할 수 있다.
본 발명의 세포는 바람직하게는 상기 세포 내로의 능동 또는 수동 자일로스 수송이 가능한 숙주이다.
바람직하게는, 본 발명의 세포는
능동 해당작용이 가능하고/하거나;
펜토스 포스페이트 경로를 통한 흐름을 보이고/보이거나;
자일로스로부터 이성화된 자일룰로스가 피루베이트로 대사될 수 있도록 자일룰로스 키나제 활성을 나타낸다.
상기 세포는 바람직하게는 피루베이트의 목적하는 발효 산물, 예를 들어 에탄올, 부탄올, 락트산, 3-하이드록시-프로피온산, 아크릴산, 아세트산, 숙신산, 시트르산, 퓨마르산, 말산, 이타콘산, 아미노산, 1,3-프로판-다이올, 에틸렌, 글리세롤, β-락탐 항생제 또는 세파로스포린으로의 전환에 필요한 효소 활성을 추가로 포함한다.
본 발명의 바람직한 세포는 알콜 발효, 바람직하게는 혐기성 알콜 발효가 천연으로 가능한 세포이다. 본 발명의 세포는 바람직하게는 에탄올에 대한 높은 내성, 낮은 pH에 대한 높은 내성(즉 약 5, 약 4, 약 3 또는 약 2.5보다 더 낮은 pH에서 생육이 가능함), 및 락트산, 아세트산 또는 폼산과 같은 유기산 및/또는 당 분해 산물, 예를들어 푸르푸랄 및 하이드록시-메틸푸르푸랄에 대한 높은 내성 및/또는 승온에 대한 높은 내성을 갖는다.
본 발명의 세포의 상기 특징들 또는 활성들 중 임의의 것이 상기 세포 중에 천연으로 존재하거나 또는 도입되거나 유전자 변형에 의해 변형될 수 있다.
자일로스 아이소머라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 형질전환된 숙주 세포에서 전형적으로 발현되거나 또는 활성 형태로 발현될 수 있다. 따라서, 상기 숙주 세포에서 상기 뉴클레오타이드 서열의 발현은, 전형적으로 약 30 ℃에서 단백질 ㎎당 약 10 U 이상의 자일로스 아이소머라제 활성, 바람직하게는 약 30 ℃ 이상에서 ㎎당 약 20 이상, 약 25 이상, 약 30 이상, 약 50 이상, 약 100 이상, 약 200 이상, 약 300 이상, 약 500 이상, 약 750 이상, 또는 약 1000 U 이상의 비활성을 갖는 활성 자일로스 아이소머라제를 생산한다. 상기 형질전환된 숙주 세포에서 발현된 자일로스 아이소머라제의 비활성을 본 발명에서는 상기 숙주 세포의 무세포 용해물, 예를 들어 효모 세포 부재 용해물의 단백질 ㎎당 자일로스 아이소머라제 활성량으로서 정의한다. 상기 자일로스 아이소머라제 활성의 측정, 단백질의 양 및 상기 무세포 용해물의 제조는 본 발명에 개시된 바와 같다. 바람직하게는 상기 숙주 세포에서 자일로스 아이소머라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 발현은 50, 40, 30 또는 25 mM 미만인 자일로스에 대한 Km을 갖는 자일로스 아이소머라제를 생산하며, 보다 바람직하게는 상기 자일로스에 대한 Km은 약 20 mM 이하이다.
본 발명의 세포는 상기 펜토스 포스페이트 경로의 흐름을 증가시키는 하나 이상의 유전자 변형을 포함할 수 있다. 특히, 상기 유전자 변형(들)은 비-산화성 부분 펜토스 포스페이트 경로를 통해 증가된 흐름을 도출시킬 수 있다. 본 발명에서 상기 펜토스 포스페이트 경로의 비-산화성 부분의 증가된 흐름을 야기하는 유전자 변형은 상기 흐름을, 상기 증가된 흐름을 야기하는 상기 유전자 변형을 제외하고 유전적으로 동일한 균주에서의 상기 흐름에 비해 적어도 약 1.1, 약 1.2, 약 1.5, 약 2, 약 5, 약 10 또는 약 20의 인자까지 증가시키는 변형을 의미하는 것으로 이해된다. 상기 펜토스 포스페이트 경로의 비-산화성 부분의 흐름을, 상기 변형된 숙주를 유일한 탄소원으로서 자일로스 상에서 생육시키고, 특이적인 자일로스 소비율을 측정하고, 임의의 자일리톨이 생산되는 경우, 상기 특이적인 자일로스 소비율로부터 특이적인 자일리톨 생산율을 감함으로써 측정할 수 있다. 그러나, 상기 펜토스 포스페이트 경로의 비-산화성 부분의 흐름은 유일한 탄소원으로서 자일로스 상에서의 생육율, 바람직하게는 유일한 탄소원으로서 자일로스 상에서의 혐기성 생육율에 비례한다. 상기 유일한 탄소원으로서 자일로스 상에서의 생육율(μmax)과 상기 펜토스 포스페이트 경로의 비-산화성 부분의 흐름 사이에 1차적인 관계가 존재한다. 상기 특정한 자일로스 소비율(Qs)은 상기 생육율(μ)을 당에서의 바이오매스의 수율(Yxs)로 나눈 것과 같은데, 그 이유는 상기 당에서의 바이오매스의 수율이 일정하기 때문이다(주어진 일련의 조건 하에서: 혐기성, 생육 배지, pH, 균주의 유전적 배경 등; 즉 Qs = μ/Yxs). 따라서 상기 펜토스 포스페이트 경로의 비-산화성 부분의 증가된 흐름을, 수송이 없는 한(흡수가 제한된다) 이러한 조건 하에서 최대 생육율의 증가로부터 추론할 수 있다.
상기 펜토스 포스페이트 경로의 흐름을 증가시키는 하나 이상의 유전자 변형을 다양한 방식으로 상기 숙주 세포에 도입시킬 수 있다. 여기에는 예를 들어 자일룰로스 키나제 및/또는 상기 비-산화성 부분 펜토스 포스페이트 경로의 효소들 중 하나 이상의 보다 높은 정상 상태 활성 수준 및/또는 비특이적인 알도스 리덕타제 활성의 감소된 정상 상태 활성 수준을 달성함이 포함된다. 이러한 정상 상태 활성 수준의 변화는 돌연변이체(자발적이거나 또는 화학물질 또는 방사선에 의해 유발된)의 선택에 의해서 및/또는 재조합 DNA 기술에 의해서, 예를 들어 각각 상기 효소들을 암호화하는 유전자 또는 이들 유전자를 조절하는 인자들의 과발현 또는 불활성화에 의해 수행될 수 있다.
바람직한 숙주 세포에서, 상기 유전자 변형은 상기 (비-산화성 부분) 펜토스 포스페이트 경로의 하나 이상의 효소의 과발현을 포함한다. 바람직하게는 상기 효소는 리뷸로스-5-포스페이트 아이소머라제, 리뷸로스-5-포스페이트 에피머라제, 트랜스케톨라제 및 트랜스알돌라제를 암호화하는 효소들로 이루어진 군 중에서 선택된다. 상기 (비-산화성 부분) 펜토스 포스페이트 경로의 효소들의 다양한 조합들이 과발현될 수 있다. 예를 들어, 과발현되는 효소들은 적어도 효소 리뷸로스-5-포스페이트 아이소머라제 및 리뷸로스-5-포스페이트 에피머라제; 또는 적어도 효소 리뷸로스-5-포스페이트 아이소머라제 및 트랜스케톨라제; 또는 적어도 효소 리뷸로스-5-포스페이트 아이소머라제 및 트랜스알돌라제; 또는 적어도 효소 리뷸로스-5-포스페이트 에피머라제 및 트랜스케톨라제; 또는 적어도 효소 리뷸로스-5- 포스페이트 에피머라제 및 트랜스알돌라제; 또는 적어도 효소 트랜스케톨라제 및 트랜스알돌라제; 또는 적어도 효소 리뷸로스-5-포스페이트 에피머라제, 트랜스케톨라제 및 트랜스알돌라제; 또는 적어도 효소 리뷸로스-5-포스페이트 아이소머라제, 트랜스케톨라제 및 트랜스알돌라제; 또는 적어도 효소 리뷸로스-5-포스페이트 아이소머라제, 리뷸로스-5-포스페이트 에피머라제, 및 트랜스알돌라제; 또는 적어도 효소 리뷸로스-5-포스페이트 아이소머라제, 리뷸로스-5-포스페이트 에피머라제, 및 트랜스케톨라제일 수 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 상기 효소 리뷸로스-5-포스페이트 아이소머라제, 리뷸로스-5-포스페이트 에피머라제, 트랜스케톨라제 및 트랜스알돌라제 각각은 상기 숙주 세포에서 과발현된다. 숙주 세포에서의 상기 유전자 변형이 적어도 효소 트랜스케톨라제 및 트랜스알돌라제 모두의 과발현을 포함하는 상기 숙주 세포가, 상기와 같은 숙주 세포는 이미 자일로스 상에서 혐기성 생육이 가능하기 때문에 보다 바람직하다. 사실상, 일부 조건 하에서 오직 상기 트랜스케톨라제 및 트랜스알돌라제만을 과발현하는 숙주 세포는 이미 상기 4 개의 효소, 즉 리뷸로스-5-포스페이트 아이소머라제, 리뷸로스-5-포스페이트 에피머라제, 트랜스케톨라제 및 트랜스알돌라제를 모두 과발현하는 숙주 세포와 동일한 자일로스 상에서의 혐기성 생육율을 갖는다. 더욱이, 효소 리뷸로스-5-포스페이트 아이소머라제 및 리뷸로스-5-포스페이트 에피머라제 모두를 과발현하는 숙주 세포가, 상기 효소들 중 오직 하나만을 과발현하는 것은 대사 불균형을 발생시킬 수도 있으므로, 오직 상기 아이소머라제만 또는 오직 상기 에피머라제만을 과발현하는 숙주 세포보다 바람직하다.
본 발명에서 "리뷸로스 5-포스페이트 에피머라제"(EC 5.1.3.1) 효소는 D-자일룰로스 5-포스페이트의 D-리뷸로스 5-포스페이트로의 에피머화 및 이와 역을 촉매화하는 효소로서 정의된다. 상기 효소는 또한 포스포리뷸로스 에피머라제; 에리쓰로스-4-포스페이트 아이소머라제; 포스포케토펜토스 3-에피머라제; 자일룰로스 포스페이트 3-에피머라제; 포스포케토펜토스 에피머라제; 리뷸로스 5-포스페이트 3- 에피머라제; D-리뷸로스 포스페이트-3-에피머라제; D-리뷸로스 5-포스페이트 에피머라제; D-리뷸로스-5-P 3-에피머라제; D-자일룰로스-5-포스페이트 3-에피머라제; 펜토스-5-포스페이트 3-에피머라제; 또는 D-리뷸로스-5-포스페이트 3-에피머라제로서 공지되어 있다. 리뷸로스 5-포스페이트 에피머라제를 그의 아미노산 서열에 의해 추가로 정의할 수 있다. 마찬가지로, 리뷸로스 5-포스페이트 에피머라제를 상기 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 의해서 뿐만 아니라 리뷸로스 5-포스페이트 에피머라제를 암호화하는 비교 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하는 뉴클레오타이드 서열에 의해서 정의할 수 있다. 상기 리뷸로스 5-포스페이트 에피머라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 본 발명에서 RPE1로 나타낸다.
본 발명에서 "리뷸로스 5-포스페이트 아이소머라제"(EC 5.3.1.6)는 D-리보스 5-포스페이트의 D-리뷸로스 5-포스페이트로의 직접적인 이성화 및 이와 역을 촉매화하는 효소로서 정의된다. 상기 효소는 또한 포스포펜토스아이소머라제; 포스포리보아이소머라제; 리보스 포스페이트 아이소머라제; 5-포스포리보스 아이소머라제; D-리보스 5-포스페이트 아이소머라제; D-리보스-5-포스페이트 케톨-아이소머라제; 또는 D-리보스-5-포스페이트 알도스-케토스-아이소머라제로서 공지되어 있다. 리뷸로스 5-포스페이트 아이소머라제를 그의 아미노산 서열에 의해 추가로 정의할 수 있다. 마찬가지로, 리뷸로스 5-포스페이트 아이소머라제를 상기 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 의해서 뿐만 아니라 리뷸로스 5-포스페이트 아이소머라제를 암호화하는 비교 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하는 뉴클레오타이드 서열에 의해서 정의할 수 있다. 상기 리뷸로스 5-포스페이트 아이소머라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 본 발명에서 RPI1로 나타낸다.
본 발명에서 효소 "트랜스케톨라제"(EC 2.2.1.1)는 반응: D-리보스 5-포스페이트 + D-자일룰로스 5-포스페이트 ↔ 세도헵튤로스 7-포스페이트 + D-글리세르알데하이드 3-포스페이트 및 이와 역을 촉매화하는 효소로서 정의된다. 상기 효소는 또한 글리콜알데하이드트랜스퍼라제 또는 세도헵튤로스-7-포스페이트:D-글리세르알데하이드-3-포스페이트 글리콜알데하이드트랜스퍼라제로서 공지되어 있다. 트랜스케톨라제를 그의 아미노산 서열에 의해 추가로 정의할 수 있다. 마찬가지로, 트랜스케톨라제를 상기 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 의해서 뿐만 아니라 트랜스케톨라제를 암호화하는 비교 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하는 뉴클레오타이드 서열에 의해서 정의할 수 있다. 상기 트랜스케톨라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 본 발명에서 TKL1로 나타낸다.
본 발명에서 "트랜스알돌라제"(EC 2.2.1.2)는 반응: 세도헵튤로스 7-포스페이트 + D-글리세르알데하이드 3-포스페이트 ↔ D-에리쓰로스 4-포스페이트 + D-프럭토스 6-포스페이트 및 이와 역을 촉매화하는 효소로서 정의된다. 상기 효소는 또한 다이하이드록시아세톤트랜스퍼라제; 다이하이드록시아세톤 신타제; 폼알데하이드 트랜스케톨라제; 또는 세도헵튤로스-7-포스페이트: D-글리세르알데하이드-3-포스페이트 글리세론트랜스퍼라제로서 공지되어 있다. 트랜스알돌라제를 그의 아미노산 서열에 의해 추가로 정의할 수 있다. 마찬가지로, 트랜스알돌라제를 상기 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 의해서 뿐만 아니라 트랜스알돌라제를 암호화하는 비교 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하는 뉴클레오타이드 서열에 의해서 정의할 수 있다. 상기 트랜스케톨라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 본 발명에서 TAL1로 나타낸다.
본 발명의 세포에서 효소의 발현 및 과발현을 위한 다양한 수단들이 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있다. 특히, 숙주 세포에서, 예를 들어 상기 숙주 세포의 게놈 중에 효소를 암호화하는 유전자의 추가적인 사본을 편입시킴으로써, 에피솜 다중사본 발현 벡터로부터 상기 유전자를 발현시킴으로써, 또는 상기 유전자의 다중 사본을 포함하는 에피솜 발현 벡터를 도입시킴으로써 상기 유전자의 사본수를 증가시킴으로써 상기 효소를 과발현시킬 수 있다.
한편으로, 본 발명의 숙주 세포에서 효소의 과발현을, 상기 과발현시키려는 효소를 암호화하는 서열에 고유하지 않은 프로모터, 즉 작동적으로 결합된 암호화 서열에 이종인 프로모터를 사용함으로써 성취할 수 있다. 상기 프로모터는 바람직하게는 작동적으로 결합되는 암호화 서열에 이종이지만, 상기 프로모터가 상기 숙주 세포에 상동성인, 즉 내생적인 것이 또한 바람직하다. 바람직하게는 상기 이종 프로모터는, 바람직하게는 자일로스 또는 자일로스 및 글루코스를 탄소원으로서, 보다 바람직하게는 주요 탄소원으로서(즉 이용할 수 있는 탄소원의 50% 초과가 자일로스 또는 자일로스 및 글루코스로 이루어진다), 가장 바람직하게는 유일한 탄소원으로서 이용할 수 있는 조건 하에서, 상기 암호화 서열에 고유한 프로모터보다 상기 암호화 서열을 포함하는 전사물의 보다 높은 정상 상태 수준을 생성시킬 수 있다(또는 시간 단위당 보다 많은 전사 분자, 즉 mRNA 분자를 생성시킬 수 있다). 이와 관련하여 적합한 프로모터는 구성 및 유도 천연 프로모터 모두 뿐만 아니라 조작된 프로모터를 포함한다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 프로모터는 또한 이화 생성물(글루코스) 억제에 무감각하고/하거나 바람직하게는 유도에 자일로스가 필요하지 않을 것이다. 이러한 특징들을 갖는 프로모터는 광범위하게 입수될 수 있으며 숙련가에게 공지되어 있다. 상기와 같은 프로모터의 적합한 예는 예를 들어 해당 유전자로부터의 프로모터, 예를 들어 포스포프럭토키나제(PFK), 트라이오스 포스페이트 아이소머라제(TPI), 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(GPD, TDH3 또는 GAPDH), 피루베이트 키나제(PYK), 효모 또는 사상균으로부터의 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터를 포함하며; 효모로부터의 상기와 같은 프로모터에 대한 보다 상세한 내용은 WO 93/03159에서 찾을 수 있다. 다른 유용한 프로모터는 리보솜 단백질 암호화 유전자 프로모터, 락타제 유전자 프로모터(LAC4), 알콜 데하이드로게나제 프로모터(ADHI, ADH4 등), 및 에놀라제 프로모터(ENO)이다. 구성적이고 유도성인 다른 프로모터들, 및 인핸서 또는 상류 활성화 서열들이 당해 분야의 숙련가들에게 공지될 것이다. 본 발명의 숙주 세포에 사용되는 프로모터를 경우에 따라 그의 조절 특징에 영향을 미치도록 변형시킬 수도 있다.
상기 언급된 효소들의 과발현에 사용되는 암호화 서열은 바람직하게는 본 발명의 숙주 세포에 상동성일 수 있다. 그러나, 본 발명의 숙주 세포에 이종인 암호화 서열을 사용할 수도 있다.
효소의 과발현은, 유전자 변형된 숙주 세포에서 상기 효소의 생산을 언급할 때, 상기 효소가 동일한 조건 하에서 변형되지 않은 숙주 세포에 비해 보다 높은 수준의 특이적인 효소 활성으로 생산됨을 의미한다. 대개 이는 상기 효소 활성 단백질(또는 다중-서브유닛 효소의 경우에 단백질들)이 동일한 조건 하에서 변형되지 않은 숙주 세포에 비해 더 많은 양으로 또는 다소 더 높은 정상 상태 수준으로 생산됨을 의미한다. 유사하게 이는 대개 상기 효소 활성 단백질을 암호화하는 mRNA가 동일한 조건 하에서 변형되지 않은 숙주 세포에 비해 더 많은 양으로 또는 다시 다소 더 높은 정상 상태 수준으로 생산됨을 의미한다. 따라서 효소의 과발현은 바람직하게는 본 발명에 개시된 바와 같은 적합한 효소 분석을 사용하여 상기 숙주 세포에서 상기 효소의 비활성 수준을 측정함으로써 측정된다. 한편으로, 상기 효소의 과발현을, 예를 들어 상기 효소에 특이적인 항체를 사용하여 효소 단백질의 특이적인 정상 상태 수준을 정량화하거나 또는 상기 효소를 암호화하는 mRNA의 특이적인 정상 상태 수준을 정량화함으로서 간접적으로 측정할 수도 있다. 상기 효소에 대한 기질을 상업적으로 입수할 수 없기 때문에 효소 분석을 쉽게 실행할 수 없는 펜토스 포스페이트 경로 효소들의 경우에는 후자가 특히 적합할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 숙주 세포에서, 과발현시키려는 효소는 상기 과발현을 야기하는 유전자 변형을 제외하고는 유전학적으로 동일한 균주에 비해 적어도 약 1.1, 약 1.2, 약 1.5, 약 2, 약 5, 약 10 또는 약 20의 인자까지 과발현된다. 이러한 과발현 수준을 상기 효소 활성의 정상 상태 수준, 상기 효소 단백질의 정상 상태 수준뿐만 아니라 상기 효소를 암호화하는 전사물의 정상 상태 수준에 적용할 수 있음은 물론이다.
본 발명의 세포는 상기 특이적인 자일룰로스 키나제 활성을 증가시키는 하나 이상의 유전자 변형을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 유전자 변형 또는 변형들은 예를 들어 자일룰로스 키나제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 과발현에 의해 자일룰로스 키나제의 과발현을 야기한다. 상기 자일룰로스 키나제를 암호화하는 유전자는 상기 숙주 세포에 내생적이거나 또는 상기 숙주 세포에 이종인 자일룰로스 키나제일 수 있다. 본 발명의 숙주 세포에서 자일룰로스 키나제의 과발현에 사용되는 뉴클레오타이드 서열은 자일룰로스 키나제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이다.
본 발명에서 효소 "자일룰로스 키나제"(EC 2.7.1.17)는 반응 ATP + D-자일룰로스 = ADP + D-자일룰로스 5-포스페이트를 촉매화하는 효소로서 정의된다. 상기 효소는 또한 인산화 자일룰로키나제, D-자일룰로키나제 또는 ATP:D-자일룰로스 5-포스포트랜스퍼라제로서 공지되어 있다. 본 발명의 자일룰로스 키나제는 그의 아미노산 서열에 의해 추가로 정의될 수 있다. 마찬가지로 자일룰로스 키나제는 상기 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 의해서 뿐만 아니라 자일룰로스 키나제를 암호화하는 비교 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 정의될 수도 있다.
본 발명의 세포에서, 상기 특이적인 자일룰로스 키나제 활성을 증가시키는 유전자 변형 또는 변형들을 상술한 바와 같은 펜토스 포스페이트 경로의 흐름을 증가시키는 변형들 중 임의의 변형과 결합시킬 수도 있다. 이는 그러나 필수적이지는 않다.
따라서, 본 발명의 숙주 세포는 오직 상기 특이적인 자일룰로스 키나제 활성을 증가시키는 유전자 변형 또는 변형들만을 포함할 수 있다. 본 발명의 숙주 세포에서 자일룰로스 키나제의 과발현을 성취하고 분석하기 위한 당해 분야에서 입수할 수 있는 다양한 수단들은 상기 펜토스 포스페이트 경로의 효소들에 대해 상술한 바와 같다. 바람직하게는 본 발명의 숙주 세포에서, 과발현시키려는 자일룰로스 키나제는 상기 과발현을 야기하는 유전자 변형(들)을 제외하고는 유전학적으로 동일한 균주에 비해 적어도 약 1.1, 약 1.2, 약 1.5, 약 2, 약 5, 약 10 또는 약 20의 인자까지 과발현된다. 이러한 과발현 수준을 상기 효소 활성의 정상 상태 수준, 상기 효소 단백질의 정상 상태 수준뿐만 아니라 상기 효소를 암호화하는 전사물의 정상 상태 수준에 적용할 수 있음은 물론이다.
본 발명의 세포는 상기 숙주 세포에서 비특이적인 알도스 리덕타제 활성을 증가시키는 하나 이상의 유전자 변형을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 비특이적인 알도스 리덕타제 활성을, 비특이적인 알도스 리덕타제를 암호화하는 유전자의 발현을 감소시키거나 또는 상기 유전자를 불활성화시키는 하나 이상의 유전자 변형에 의해 상기 숙주 세포에서 감소시킨다. 바람직하게는 상기 유전자 변형(들)은 상기 숙주 세포에서 비특이적인 알도스 리덕타제를 암호화하는 유전자의 각각의 내생적인 사본의 발현을 감소시키거나 또는 불활성화시킨다. 숙주 세포는 이배성, 배수성 또는 이수성의 결과로서 비특이적인 알도스 리덕타제를 암호화하는 유전자의 다중 사본을 포함하고/하거나, 상기 숙주 세포는 아미노산 서열이 상이하고 상이한 유전자에 의해 각각 암호화되는 알도스 리덕타제 활성을 갖는 다수의 상이한 (동종)효소를 함유할 수도 있다. 또한 상기와 같은 경우에 바람직하게는 비특이적인 알도스 리덕타제를 암호화하는 각각의 유전자의 발현이 감소되거나 불활성화된다. 바람직하게는, 상기 유전자를 상기 유전자의 적어도 일부의 결실에 의해서 또는 상기 유전자의 파괴에 의해서 불활성화시키며, 이때 상기와 관련하여 유전자란 용어는 또한 상기 암호화 서열의 상류 또는 하류의 임의의 비-암호화 서열을 포함하며, 그의 (부분)결실 또는 불활성화는 상기 숙주 세포에서 비특이적인 알도스 리덕타제 활성의 발현을 감소시킨다.
본 발명의 숙주 세포에서 활성을 감소시키고자 하는 알도스 리덕타제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 알도스 리덕타제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이다.
본 발명의 숙주 세포에서, 상기 숙주 세포에서의 비특이적인 알도스 리덕타제 활성을 감소시키는 유전자 변형을, 상기 펜토스 포스페이트 경로의 흐름을 증가시키는 변형들 중 임의의 것 및/또는 상술한 바와 같이 상기 숙주 세포에서 특이적인 자일룰로스 키나제 활성을 증가시키는 변형들 중 임의의 것과 결합시킬 수 있다. 그러나, 이는 필수적인 것은 아니다.
따라서, 본 발명의 숙주 세포에서 오직 비특이적인 알도스 리덕타제 활성을 감소시키는 유전자 변형 또는 변형(들)만을 포함하는 상기 숙주 세포가 본 발명에 특별히 포함된다.
본 발명에서 효소 "알도스 리덕타제"(EC 1.1.1.21)는 자일로스 또는 자일룰로스를 자일리톨로 환원시킬 수 있는 임의의 효소로서 정의된다. 본 발명과 관련하여, 알도스 리덕타제는 본 발명의 숙주 세포에 고유하고(내생적이고) 자일로스 또는 자일룰로스를 자일리톨로 환원시킬 수 있는 임의의 비특이적인 알도스 리덕타제일 수 있다. 비특이적인 알도스 리덕타제는 반응:
알도스 + NAD(P)H + H+ ↔ 알디톨 + NAD(P)+
를 촉매화한다.
상기 효소는 광범위한 특이성을 가지며 알도스 리덕타제; 폴리올 데하이드로게나제(NADP+); 알디톨:NADP 옥시도리덕타제; 알디톨:NADP+ 1-옥시도리덕타제; NADPH-알도펜토스 리덕타제; 또는 NADPH-알도스 리덕타제로서 공지되어 있다.
상기와 같은 비특이적인 알도스 리덕타제의 특정한 예는 사카로마이세스 세레비지아에에 대해 내생적이고 GRE3 유전자에 의해 암호화되는 것이다(문헌[Traff et al., 2001, Appl. Environ. Microbiol. 67: 5668-74]). 따라서, 본 발명의 알도스 리덕타제는 그의 아미노산 서열에 의해 추가로 정의될 수 있다. 마찬가지로 알도스 리덕타제는 상기 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 의해서 뿐만 아니라 알도스 리덕타제를 암호화하는 비교 뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 정의될 수도 있다.
본 발명의 세포를 자일로스, 바람직하게는 유일한 탄소원으로서 자일로스 상에서, 및 보다 바람직하게는 혐기성 조건 하에서의 생육에 대해, 자발적이거나 또는 유도된(예를 들어 방사선 또는 화학물질에 의해) 돌연변이체의 선택에 의해 자일로스 활용에 적합화시킬 수 있다. 돌연변이체의 선택을, 예를 들어 문헌[Kuyper et al., 2004, FEMS Yeast Res. 4: 655-664]에 개시된 배양물의 연속적인 계대배양을 포함한 기법에 의해서 또는 케모스탯 배양에서 선택적인 압력 하에서의 배양에 의해서 수행할 수 있다. 본 발명의 바람직한 숙주 세포에서 돌연변이체의 선택에 의해 획득된 변형을 포함하여, 상술한 유전자 변형들 중 하나 이상은 상기 숙주 세포에게, 탄소원으로서, 바람직하게는 유일한 탄소원으로서 자일로스 상에서, 및 바람직하게는 혐기성 조건 하에서 생육하는 능력을 부여한다. 바람직하게는 상기 변형된 숙주 세포는 본질적으로 자일리톨을 생산하지 않는다, 예를 들어 상기 생산된 자일리톨은 검출 한계 이하, 예를 들어 몰 기준으로 소비된 탄소의 약 5, 약 2, 약 1, 약 0.5, 또는 약 0.3% 미만이다.
본 발명의 세포는 유일한 탄소원으로서 자일로스 상에서 호기성 조건 하에 약 0.05 이상, 약 0.1, 약 0.2, 약 0.25, 또는 약 0.3 h-1의 속도로, 또는 적용 가능한 경우, 혐기성 조건 하에서 약 0.03 이상, 약 0.05, 약 0.07, 약 0.08, 약 0.09, 약 0.1, 약 0.12, 약 0.15 또는 약 0.2 h-1의 속도로 생육하는 능력을 가질 수 있다. 바람직하게는 상기 변형된 숙주 세포는 유일한 탄소원으로서 글루코스 및 자일로스의 혼합물(1:1 중량비로) 상에서 호기성 조건 하에 약 0.05 이상, 약 0.1, 약 0.2, 약 0.25, 또는 약 0.3 h-1의 속도로, 또는 적용 가능한 경우, 혐기성 조건 하에서 약 0.03 이상, 약 0.05, 약 0.1, 약 0.12, 약 0.15 또는 약 0.2 h-1의 속도로 생육하는 능력을 갖는다.
본 발명의 세포는 약 200 이상, 약 250, 약 300, 약 346, 약 350, 약 400, 약 500, 약 600, 약 750, 또는 약 1000 ㎎ 자일로스/g 세포/h의 특이적인 자일로스 소비율을 가질 수 있다. 본 발명의 세포는 자일로스 상에서, 글루코스 상의 발효 산물(예를 들어, 에탄올)의 숙주 세포의 수율의 약 40 이상, 약 50, 약 55, 약 60, 약 70, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95 약 98 또는 약 99%인 발효 산물(예를 들어, 에탄올)의 수율을 가질 수 있다. 보다 바람직하게는, 자일로스 상에서 본 발명의 세포의 발효 산물(예를 들어, 에탄올)의 수율은 글루코스 상에서 발효 산물(예를 들어, 에탄올)의 상기 세포의 수율과 같을 수도 있다. 마찬가지로, 자일로스 상에서 상기 세포의 바이오매스 수율은 글루코스 상에서 상기 숙주 세포의 바이오매스 수율의 약 40 이상, 약 50, 약 55, 약 60, 약 70, 약 80, 약 85, 약 90, 약 95, 약 98 또는 약 99%일 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 자일로스 상에서의 상기 세포의 바이오매스 수율은 글루코스 상에서의 상기 숙주 세포의 바이오매스 수율과 같을 수도 있다. 글루코스 및 자일로스 상에서의 수율의 비교에서 상기 두 수율을 모두 호기성 조건 하에서 또는 모두 혐기성 조건 하에서 비교하는 것으로 생각된다.
본 발명의 세포는 아라비노스를 사용할 수 있다. 따라서 본 발명의 세포는 L-아라비노스를 L-리뷸로스 및/또는 자일룰로스 5-포스페이트로 및/또는 목적하는 발효 산물, 예를 들어 본 발명에서 언급된 것들 중 하나로 전환시킬 수 있다.
L-아라비노스로부터 에탄올을 생산할 수 있는 유기체, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지아에는 적합한 공급원으로부터 araA(L-아라비노스 아이소머라제), araB(L-리뷸로키나제) 및 araD(L-리뷸로스-5-P4-에피머라제) 유전자를 도입하는 세포를 변형시킴으로써 생산될 수 있다. 상기와 같은 유전자를 본 발명의 세포 내에, 아라비노스를 사용할 수 있는 정도로 도입시킬 수 있다. 상기와 같은 접근법은 WO 2003/095627에 개시되어 있다.
본 발명의 세포는 에탄올의 생산에 적합한 세포일 수 있다. 그러나, 본 발명의 세포는 에탄올 이외의 발효 산물의 생산에 적합할 수도 있다. 상기와 같은 비-에탄올성 발효 산물은 주로 효모 또는 사상균과 같은 진핵 미생물에 의해 생산될 수 있는 임의의 벌크 또는 정제 화학물질을 포함한다.
상기와 같은 발효 산물은 예를 들어 부탄올, 락트산, 3-하이드록시-프로피온산, 아크릴산, 아세트산, 숙신산, 시트르산, 말산, 퓨마르산, 이타콘산, 아미노산, 1,3-프로판-다이올, 에틸렌, 글리세롤, β-락탐 항생제 또는 세파로스포린일 수 있다. 비-에탄올성 발효 산물의 생산에 바람직한 본 발명의 변형된 숙주 세포는 감소된 알콜 데하이드로게나제 활성을 생성시키는 유전자 변형을 함유하는 숙주 세포이다.
추가의 태양에서 본 발명은 본 발명의 변형된 숙주 세포를 자일로스와 같은 자일로스의 공급원을 포함하는 탄소원의 발효에 사용한다. 자일로스의 공급원 외에, 상기 발효 배지 중의 탄소원은 또한 글루코스의 공급원을 포함할 수 있다. 상기 자일로스 또는 글루코스의 공급원은 자일로스 또는 글루코스 자체이거나 또는 자일로스 또는 글루코스 단위를 포함하는 임의의 탄수화물 올리고- 또는 중합체, 예를 들어 리그노셀룰로스, 자일란, 셀룰로스, 전분 등일 수 있다. 상기와 같은 탄수화물로부터 자일로스 또는 글루코스 단위의 방출을 위해서, 적합한 카보하이드라제(예를 들어 자일라나제, 글루카나제, 아밀라제 등)를 상기 발효 배지에 첨가하거나 또는 상기 변형된 숙주 세포에 의해 생성시킬 수 있다. 후자의 경우에 상기 변형된 숙주 세포는 상기와 같은 카보하이드라제를 생산하고 분비하도록 유전자 조작될 수 있다. 글루코스의 올리고- 또는 중합체성 공급원을 사용하는 추가적인 이점은 상기 공급원이, 예를 들어 속도-제한량의 카보하이드라제를 사용함으로써, 상기 발효 동안 자유 글루코스의 낮은(보다 낮은) 농도를 유지할 수 있게 한다는 것이다. 이는 차례로 자일로스와 같은 비-글루코스 당의 대사 및 수송에 필요한 시스템의 억제를 방지할 것이다.
바람직한 방법에서, 상기 변형된 숙주 세포는 상기 자일로스와 글루코스를 모두, 바람직하게는 동시에 발효하며, 이 경우에 바람직하게는 글루코스 억제에 무감각하여 이중영양적 생육을 방지하는 변형된 숙주 세포가 사용된다. 탄소원으로서 자일로스(및 글루코스)의 공급원 외에, 상기 발효 배지는 상기 변형된 숙주 세포의 생육에 필요한 적합한 성분을 추가로 포함할 것이다. 효모와 같은 미생물의 생육을 위한 발효 배지의 조성은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 상기 발효 공정은 발효 산물, 예를 들어 에탄올, 부탄올, 락트산, 3-하이드록시-프로피온산, 아크릴산, 아세트산, 숙신산, 시트르산, 퓨마르산, 말산, 이타콘산, 아미노산, 1,3-프로판-다이올, 에틸렌, 글리세롤, β-락탐 항생제, 예를 들어 페니실린 G 또는 페니실린 V 및 그의 발효 유도체, 및 세파로스포린의 생산을 위한 공정이다.
상기 발효 공정은 호기성 또는 혐기성 발효 공정일 수 있다. 본 발명에서 혐기성 발효 공정은, 산소 부재 하의 또는 실질적으로 산소 소비가 없는, 바람직하게는 약 5 미만, 약 2.5 또는 약 1 mmol/L/h, 보다 바람직하게는 0 mmol/L/h가 소비되는(즉, 산소 소비를 검출할 수 없는) 발효 공정 실행으로서 정의되며, 여기에서 유기 분자가 전자 공여체 및 전자 수용체 모두로서 작용한다. 산소의 부재 하에서, 해당 및 바이오매스 형성에서 생성된 NADH는 산화적 인산화에 의해서 산화될 수 없다. 상기 문제를 해결하기 위해서, 다수의 미생물들은 전자 및 수소 수용체로서 피루베이트 또는 그의 유도체들 중 하나를 사용하고, 이에 의해 NAD+를 재생시킨다.
따라서, 바람직한 혐기성 발효 공정에서 피루베이트가 전자(및 수소 수용체)로서 사용되며 발효 산물, 예를 들어 에탄올, 부탄올, 락트산, 3-하이드록시-프로피온산, 아크릴산, 아세트산, 숙신산, 시트르산, 퓨마르산, 말산, 아미노산, 1,3-프로판-다이올, 에틸렌, 글리세롤, β-락탐 항생제 또는 세파로스포린으로 환원된다.
상기 발효 공정을 바람직하게는 상기 변형된 숙주 세포에 최적인 온도에서 실행한다. 따라서, 대부분의 효모 또는 진균 숙주 세포의 경우, 상기 발효 공정을 약 42 ℃ 미만, 바람직하게는 약 38 ℃ 미만인 온도에서 수행한다. 효모 또는 사상균 숙주 세포의 경우, 상기 발효 공정을 바람직하게는 약 35 미만, 약 33, 약 30 또는 약 28 ℃인 온도에서, 및 약 20 미만, 약 22, 또는 약 25 ℃ 초과인 온도에서 수행한다.
바람직한 공정은 에탄올의 생산 공정이며, 이때 상기 공정은 (a) 자일로스의 공급원을 함유하는 배지를 상기 정의된 바와 같은 변형된 숙주 세포와 함께 발효시키고, 이때 상기 숙주 세포가 자일로스를 에탄올로 발효하며; 임의로, (b) 상기 에탄올을 회수하는 단계를 포함한다. 상기 발효 배지는 에탄올로 또한 발효되는 글루코스의 공급원을 또한 포함할 수 있다. 상기 공정에서 상기 에탄올 부피 생산성은 바람직하게는 시간당 리터당 약 0.5 이상, 약 1.0, 약 1.5, 약 2.0, 약 2.5, 약 3.0, 약 5.0 또는 약 10.0 g 에탄올이다. 상기 공정에서 자일로스 및/또는 글루코스 상에서의 에탄올 수율은 바람직하게는 약 50 이상, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 95 또는 약 98%이다. 본 발명에서 상기 에탄올 수율은 이론적인 최대 수율의 백분율로서 정의된다.
본 발명은 또한 발효 산물, 예를 들어 부탄올, 락트산, 3-하이드록시-프로피온산, 아크릴산, 아세트산, 숙신산, 시트르산, 퓨마르산, 말산, 이타콘산, 아미노산, 1,3-프로판-다이올, 에틸렌, 글리세롤, β-락탐 항생제 및 세파로스포린으로 이루어진 군 중에서 선택된 산물의 생산 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 바람직하게는 자일로스의 공급원을 함유하는 배지를 상기 본 발명에서 정의된 바와 같은 변형된 숙주 세포와 함께 발효시킴을 포함하며, 이때 상기 숙주 세포는 자일로스를 상기 발효 산물로 발효한다.
본 발명은 또한 발효 산물, 예를 들어 에탄올, 부탄올, 락트산, 3-하이드록시-프로피온산, 아크릴산, 아세트산, 숙신산, 시트르산, 퓨마르산, 말산, 이타콘산, 아미노산, 1,3-프로판-다이올, 에틸렌, 글리세롤, β-락탐 항생제 및 세파로스포린으로 이루어진 군 중에서 선택된 산물의 생산 방법을 제공한다. 상기 방법은 바람직하게는 적어도 자일로스의 공급원 및 L-아라비노스의 공급원을 함유하는 배지를, 세포가 자일로스 및 L-아라비노스를 발효 산물로 발효하도록 자일로스 및 L-아라비노스를 모두 사용할 수 있는 상기 정의된 바와 같은 세포와 함께 발효시킴을 포함한다.
본 발명은 또한 발효 산물, 예를 들어 에탄올, 부탄올, 락트산, 3-하이드록시-프로피온산, 아크릴산, 아세트산, 숙신산, 시트르산, 퓨마르산, 말산, 이타콘산, 아미노산, 1,3-프로판-다이올, 에틸렌, 글리세롤, β-락탐 항생제 또는 세파로스포린으로 이루어진 군 중에서 선택된 산물의 생산 방법을 또한 제공한다. 상기 방법은 바람직하게는 적어도 자일로스의 공급원 및 L-아라비노스의 공급원을 함유하는 배지를 상기 정의된 바와 같은 세포 및 L-아라비노스를 사용할 수 있는 세포와 함께 발효시킴을 포함하며, 이때 각각의 세포는 자일로스 및/또는 아라비노스를 상기 발효 산물로 발효한다.
본 발명의 방법은 상기 발효 산물의 회수를 또한 포함할 수 있다. 상기 방법이 수행되는 배지는 글루코스의 공급원을 또한 함유할 수도 있다.
본 발명에 따른 방법을 호기성 및 혐기성 조건 하에서 실행할 수 있다. 바람직하게는, 상기 방법을 미세-호기성 또는 산소 제한된 조건 하에서 수행한다.
본 발명에서 혐기성 발효 공정은 산소 부재 하의 또는 실질적으로 산소 소비가 없는, 바람직하게는 약 5 미만, 약 2.5 또는 약 1 mmol/L/h가 소비되는 발효 공정 실행으로서 정의되며, 여기에서 유기 분자가 전자 공여체 및 전자 수용체 모두로서 작용한다.
산소-제한된 발효 공정은 상기 산소 소비가 기체에서 액체로의 산소 이동에 의해 제한되는 공정이다. 상기 산소 제한의 정도는 유입되는 기체 흐름의 양 및 조성뿐만 아니라 사용되는 발효 장비의 실제 혼합/물질 이동 성질에 의해 결정된다. 바람직하게는, 산소-제한된 조건 하의 공정에서, 산소 소비율은 약 5.5 이상, 보다 바람직하게는 약 6 이상, 예를 들어 7 mmol/L/h 이상이다.
하기의 실시예들은 본 발명을 예시한다:
실시예
일반적인 분자 생물학 기법
달리 나타내지 않는 한, 사용되는 방법들은 표준 생화학적 기법들이다. 적합한 일반적인 방법의 교과서들에 대한 예는 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989)] 및 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc]을 포함한다.
생육 실험을, 실시예들에 지시된 바와 같은 당들이 보충된 베르듀인 배지(문헌[Verduyn, 1992]) 또는 YEPh-배지(10 g/ℓ의 효모 추출물, 20 g/ℓ의 파이톤)를 사용하여 수행하였다. 고체 YEPh 배지의 경우 20 g/ℓ의 아가를 멸균 전 상기 액체 배지에 첨가하였다.
환상 DNA에 의한 효모 세포의 형질전환
효모 형질전환을 플라스미드 DNA의 경우에 문헌[Chen et al., Current Genetics (1992), Volume 21, Number 1, 83-84]에 개시된 방법에 따라 수행하였다.
일렉트로포레이션에 의한 선형 DNA 단편에 의한 효모 세포의 형질전환
효모 세포를, 2% 글루코스를 함유하는 YEPh-배지(25 ㎖)를 단일 효모 콜로니로 접종함으로써 배양하였다. 상기 플라스크를 30 ℃, 280 rpm에서 밤새 배양하였다.
600 ㎚에서의 최적 밀도를 측정하고 0.2의 광학 밀도를 획득하기 위해 필요한 양을 2% 글루코스를 갖는 YEPh-배지(100 ㎖)로 옮겼다. 상기 세포를 대략 1.2 내지 1.3의 광학 밀도에 도달시키기 위해서(이는 2 내지 3 세대에 상응한다), 30 ℃, 280 rpm에서 4 내지 5 시간 동안 생육시켰다. 세포를 원심분리에 의해 수거하고 TE(28 ㎖; 10 mM 트리스.HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5)에 재현탁하였다. 1 M LiAC 용액(3 ㎖; 희석된 HAc에 의해 pH 7.5로 설정하였다)을 가하였다. 상기 세포를 회전 배양기(150 rpm, 30 ℃)에서 45 분 동안 서서히 진탕시켰다. 1 M DTT(다이티오쓰레이톨) 용액(500 ㎕)의 첨가 후에, 상기 세포를 상기 조건 하에서 15 분간 한 번 더 배양하였다. 상기 분량은 멸균, 빙냉 밀리Q 수에 의해 100 ㎖까지 구성되었다. 상기 세포를 원심분리에 의해 수거하였다.
상등액을 버리고 펠릿화된 세포를 멸균, 빙냉 밀리Q 수(50 ㎖)로 세척하고, 원심분리에 의해 수거하였다. 후속의 세척 처리를 빙냉 1 M 솔비톨 용액(30 ㎖)으로 수행하였다. 원심분리 후에, 상등액을 버리고 세포 펠릿을 빙냉 1 M 솔비톨 용액(4 ㎖)에 재현탁하였다. 원심분리 후에, 상등액을 버리고 세포 펠릿을 빙냉 1 M 솔비톨 용액(300 ㎕)에 재현탁하였다.
각각의 형질전환을 위해서, 상기 세포 현탁액(40 ㎕)을 빙냉 에펜도르프 튜브로 옮겼다. 형질전환 DNA 및 연어 정자 DNA(담체 DNA)(5 ㎍)를 함께 최대 20 ㎕의 부피로 가하였다. 상기 DNA를 TE에 용해시켜야 한다. 상기 에펜도르프 튜브를, 내용물을 서서히 혼합하기 위해서 조립스럽게 가볍게 두드렸다. 후속으로, 상기 내용물을 0.2 ㎝의 간격으로 예비-냉각된(얼음 상에서) 일렉트로포레이션 큐벳으로 옮기고 1.5 kV, 200 Ohm 및 25 μF의 펄스(예를 들어 바이오래드(BioRad) 일렉트로포레이션 장치 사용)를 적용하였다. 상기 펄스 시간은 대략 5 ms이어야 한다.
상기 세포를 바로 1 M 솔비톨(200 ㎕)로 옮겼다. 후속으로 YEPh 2% 글루코스(4 ㎖)를 가하고 상기 세포 현탁액을 30 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 상기 시간 후에, 상기 세포를 원심분리에 의해 수거하고, 상등액을 버리고, 펠릿을 1 M 솔비톨(4 ㎖)에 재현탁하였다. 상기 세포를 다시 원심분리에 의해 수거하고, 상등액을 버리고, 펠릿을 1 M 솔비톨(300 ㎕)에 재현탁하였다. 상기 세포를 적합한 대로 희석하고 선택성 배지에 사용하였다.
에탄올 생산
100 ㎖ 진탕 플라스크 중의 2% 글루코스가 보충된 베르듀인(Verduyn)-배지(25 ㎖)(문헌[Verduyn et al., Yeast 8:501-517, 1992])에 냉동된 모 배양물 또는 아가 플레이트로부터의 단일 콜로니를 접종하여 예비-배양물을 제조하였다. 오비탈 진탕기(280 rpm)에서 30 ℃에서 대략 24 시간 동안 배양한 후에, 상기 배양물을 수확하고 이산화 탄소 방출의 측정 및 에탄올 생산 실험에 사용하였다.
에탄올 생산을 위한 배양을 BAM(바이오로지컬 액티비티 모니터(Biological Activity Monitor), 할로텍(Halotec), 네덜란드 소재)에서 5% 글루코스, 5% 자일로스, 3.5% 아라비노스, 1% 갈락토스 및 0.5% 만노스가 보충된 합성 모델 배지(100 ㎖)(베르듀인-배지(문헌[Verduyn et al., Yeast 8:501-517, 1992]))에서 30 ℃에서 수행하였다. 상기 배지의 pH를 멸균 전에 2 M NaOH/H2SO4로 4.2로 조절하였다. 혐기성 배양을 위한 합성 배지에 에탄올 중에 용해된 0.01 g/ℓ의 에르고스테롤 및 0.42 g/ℓ의 트윈 80을 보충하였다(문헌[Andreasen and Stier. J. Cell Physiol. 41:23-36, 1953]; 및 [Andreasen and Stier. J. Cell Physiol. 43:271-281, 1954]). 상기 배지를 대략 2의 초기 OD600에서 접종하였다. 배양물을 자기 교반기에 의해 교반하였다. 상기 배양물을 통기시키지 않았기 때문에 발효 중 혐기성 조건이 빠르게 발생하였다. 이산화 탄소 생산을 꾸준히 모니터하였다. 당 전환 및 생성물 형성(에탄올, 글리세롤)을 NMR에 의해 분석하였다. LKB 울트로스펙(Ultrospec) K 분광광도계 상에서 600 ㎚에서 상기 배양물의 광학 밀도를 추적함으로써 생육을 모니터하였다.
실시예 1
자일로스 아이소머라제 발현 벡터의 제작
합성 코돈-쌍 최적화된 xylA 유전자를 1차 아미노산 서열을 기본으로 설계하고 진아트(GeneArt)(독일 레겐스부르크 소재)에 의해 합성하였다. 코돈-쌍 최적화를 앞서 개시된 바와 같이(WO2008000632) 수행하였다. 상기 뉴클레오타이드 서열을 여기에서 서열번호 1로서 포함시키며, 상응하는 아미노산 서열은 서열번호 2로서 포함시킨다.
상기 개방 판독 프레임을 제한 효소 Spel 및 Xmal을 사용하여 효모 셔틀 벡터 p427-TEF(도 1; 듀얼시스템스 바이오테크(DualSystems Biotech), 스위스 슐리렌 소재) 내로 클로닝하였다.
상기 플라스미드를 pPWT215라 칭하였다.
실시예 2
pPWT215에 의한 BIE104P1의 형질전환
WO2009109633에 개시된 바와 같은 사카로마이세스 세레비지아에 균주, BIE104P1(MATa URA3 HIS3 LEU2 TRP1 MAL2-8 SUC2 GRE3::[TPI1p-TAL1_ADH1p-TKL1_PGI1p-RPE1_ENO1p-RKI1])(여기에서 GRE3-유전자가 펜토스 포스페이트 경로의 비-산화성 부분의 유전자에 의해 치환되었다)을 첸(Chen) 등(1992)에 의해 개시된 1-단계 효모 형질전환 방법을 사용하여, 플라스미드 pPWT215로 형질전환시켰다. 음성 대조군으로서, 밀리Q를 사용하였다. 상기 형질전환 과정의 최종 펠릿을 YEPh 2% 글루코스(1 ㎖)(상기 참조)에 재현탁하였다. 상기 형질전환 혼합물(50 ㎕)을 2% 글루코스 및 200 ㎍ G418/㎖이 보충된 YEPh 아가 플레이트 상에 도말하였다. 나머지 950 ㎕를, 2% 자일로스, 10 ㎍ G418/㎖ 및 250 ㎕의 펜-스트렙(Pen-Strep) 용액(깁코/인비트로젠(Gibco/Invitrogen))이 보충된, 베르듀인 배지(25 ㎖)를 함유하는 100 ㎖ 진탕 플라스크로 옮겼다. 상기 접종된 플라스크(모의 형질전환 및 플라스미드 형질전환)를 회전 진탕기에서 30 ℃ 및 280 rpm에서 배양하였다. 광학 밀도를 때를 맞춰 추적하였다.
실시예 3
생육 실험
형질전환에 이은 생육 실험의 진행을 도 2에 나타낸다.
상기 생육 실험의 처음 10일 동안, 상기 배양물의 600 ㎚에서의 광학 밀도는 거의 증가하지 않았다. 20일 후에(도 2에서 "1"로 나타냄) 상기 플라스미드 형질전환된 세포 배양물의 광학 밀도는 20을 초과하는 값에 도달하였다. 후속으로, 상당량의 상기 배양물을 2% 자일로스, 10 ㎍ G418/㎖ 및 250 ㎕의 펜-스트렙을 함유하는 베르듀인 배지의 새로운 분액(25 ㎖)으로 옮겼다. 도 2로부터 명백한 바와 같이, 4 회의 이동이 이루어졌다. 상기 생육 실험을, 상기 네 번째 이동(워터락(waterlock)이 있는 진탕 플라스크에서 수행되었다)(혐기성 조건) 후의 최종 배양물을 제외하고, 공기의 존재 하에서 수행하였다.
도 2로부터, pPWT215에 의해 형질전환된 균주 BIE104P1의 효모 세포는 유일한 탄소 및 에너지 공급원으로서 자일로스를 이용하는 능력을 획득한 반면, 모의 형질전환된, 동일 균주의 효모 세포는 광학 밀도의 증가를 보이지 않았으며, 따라서 자일로스 상에서 생육할 수 없다는 결론을 내릴 수 있다.
실시예 4
펜토스 발효 세포의 제작
사카로마이세스 세레비지아에 균주 BIE292는 균주 BIE201의 유도체이다. 상기 균주의 제작은 PCT/EP2011/056242, 실시예 7에 개시되었다. 이는 효율적인 아라비노스 발효를 위해 형질전환 및 적응진화에 의해 최적화된 균주인 균주 BIE201과, 적응 진화전, 그의 모 균주인 BIE104A2P1a와의 역교배의 결과이다. 균주 BIE292는 락토바실러스 플란타룸으로부터의 유전자 araA, araB 및 araD 및 비-산화성 펜토스 포스페이트 경로 유전자 TAL1, TKL1, RPE1 및 RKl1을 구성적으로 발현하고, 알도스 리덕타제를 암호화하는 GRE3 유전자는 결실되었다. 또한, BIE292는 GAL80 유전자 중의 SNP 및 염색체 VII 상에서 상기 아라비노스 카셋트의 증폭을 갖는다(뉴클레오타이드 변화 A436C, 이때 개시코돈 ATG의 A는 1이다).
후속으로, 균주 BIE292를, 게놈 중 Ty1 서열에 겹치는 100 bp 영역과 인접한, 프로모터 및 종결자 서열을 포함하는 상기 코돈-쌍 최적화된 xylA 유전자의 PCR 단편으로 형질전환시켰다. 상기 xylA 발현 카셋트를 주형으로서 pPWT215를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 상기 PCR 반응을, 공급자의 설명서를 사용하여 퓨젼(Phusion) DNA 폴리머라제(핀자임스(Pinnzymes))를 사용하여 프라이머 서열 서열번호 3 및 서열번호 4로 수행하였다. 상기 증폭된 발현 카셋트를 에탄올 침전시켰으며 사용 전에 -20 ℃에서 보관하였다.
상기 침전된 DNA를 원심분리에 의해 수거하고 DNA 펠릿을 70% 에탄올로 세척하고 후속으로 공기 건조시켰다. 상기 DNA를 TE-완충제 중에 대략 1 ㎍의 DNA/㎕의 농도로 용해시켰다.
효모 균주 BIE292를 2% 글루코스를 함유하는 YEPh-배지에서 생육시켰다. 수용 세포를 상술한 바와같이 일렉트로포레이션을 위해 제조하였다. 전기수용(electrocompetent) 세포를 PCR 산물(20 ㎍)로 형질전환시켰다. 음성 대조군으로서, 밀리Q 수를 사용하였다.
xylA- 및 모의 형질전환 모두의 형질전환 혼합물을 4 개의 상이한 진탕 플라스크(각각은 2% 자일로스 및 펜/스트렙(25 ㎕)이 보충된 베르듀인 배지(25 ㎖)를 함유한다)로 직접 옮겼다. 우세한 선택 마커를 사용하지 않기 때문에, 형질전환 후 플레이트 상에서 정확한 형질전환체의 선택을 수행하지 않았다.
8 개의 진탕 플라스크를 회전 진탕기에서 30 ℃ 및 280 rpm에서 배양하였다. 600 ㎚에서 광학 밀도를 빈번히 측정함으로써 생육을 모니터하였다.
실시예 5
펜토스 발효 효모 균주의 선택 및 특성화
실시예 4에 개시된 배양물이 600 ㎚에서 15 초과의 광학 밀도에 도달했다면, 분액(250 ㎕)을 2% 자일로스가 보충된 베르듀인 배지를 함유하는 플라스크로 옮긴다. 600 ㎚에서의 광학 밀도를 빈번히 모니터한다. 상기 생육율을 상기 광학 밀도 데이터의 사용에 의해 측정한다.
여러 주기의 자일로스 함유 배지 상에서의 접종 후에, 탄소원으로서 2% 아라비노스를 함유하는 베르듀인 배지를, 아라비노스 활용에 대한 선택적인 압력을 유지시키기 위해 사용하고 있다. 마찬가지로, 헥소스(즉 글루코스, 갈락토스 및/또는 만노스) 및 펜토스(즉 아라비노스 및/또는 자일로스)의 혼합물이 보충된 베르듀인 배지를 함유하는 플라스크를 사용한다. 상기 배양 실험을 초기에는 호기성 조건 하에서 수행하지만, 후속으로, 예를 들어 상기 생육율이 아라비노스 및 자일로스 모두 상에서 약 0.07/시간 이상의 값을 초과하는 경우, 혐기성 조건 하에서 수행한다.
혐기성 조건 하에서 다수의 생육 및 재-접종 주기 후에, 상기 배양물의 분액을 약 100 내지 1000 콜로니 형성 단위(CFU)/밀리리터로 희석하고 후속으로 10 내지 100 ㎕의 분액들을 2% 글루코스를 함유하는 YEPh-아가 플레이트 상에 도말한다. 플레이트들을 30 ℃에서 48 시간 이상 동안 또는 단일 콜로니를 볼 수 있을 때까지 배양한다.
단일 콜로니 단리물을 BAM(상기 참조)에서 시험한다. 단일 콜로니 단리물을, 이산화 탄소 프로파일 및 상기 당, 에탄올 및 부산물의 NMR 데이터로부터 추측되는 바와 같이, 5 개의 당을 모두 효율적으로 발효하는 능력을 기준으로 선택한다.
최상의 균주는 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 유전자 및 분자 생물학 기법, 예를 들어 PCR, 써던 블럿(들), FIGE 및 재서열화에 의해 특성화된다.
실시예 6
펜토스 발효 효모 균주의 선택 및 특성화
실시예 4에 개시된 배양물이 600 ㎚에서 10 초과의 광학 밀도에 도달했다면, 분액(25 ㎕)을 2% 자일로스가 보충된 베르듀인 배지를 함유하는 진탕 플라스크로 옮겼다. 광학 밀도를 빈번히 모니터하고, 생육율을 상기 데이터를 사용하여 측정하였다. 상기 배양물이 600 ㎚에서 15 초과의 광학 밀도에 도달했다면, 상기 배양물의 분액을 2% 자일로스가 보충된 베르듀인 배지를 함유하는 진탕 플라스크로 옮기고 상기 진탕 플라스크를 혐기성 배양이 가능한 워터락으로 닫았다. 이 시점으로부터, 배양을 30 ℃ 및 100 rpm에서 오비탈 진탕기에서 수행하였다. 상기 배양물의 생육을 600 ㎚에서의 광학 밀도를 측정함으로써 모니터하고, 상기 생육율을 상기 데이터를 근거로 계산하였다. 상기 배양물의 600 ㎚에서의 광학 밀도가 3.75 초과의 값에 도달했다면, 상기 배양물의 분액을 2% 아라비노스가 보충된 베르듀인 배지를 함유하는 진탕 플라스크로 옮겼다. 상기 진탕 플라스크를 워터락으로 닫았다. 상기 배양물이 600 ㎚에서 5 초과 값의 광학 밀도에 도달한 경우, 상기 배양물의 분액을 2% 자일로스가 보충된 베르듀인 배지를 함유하는 진탕 플라스크로 다시 옮기고 상기 진탕 플라스크를 워터락으로 닫았다. 상기 생육 실험의 전형적인 결과를 도 3에 제공한다.
도 3으로부터 명백한 바와 같이, 클로스트리디움 베이제링키이로부터의 XylA에 의한 BIE292의 형질전환은 상기 균주가 자일로스-소비 표현형을 신속히 획득할 수 있게 한 반면, 모의 형질전환은 자일로스-소비 세포를 생성시키지 않았다.
표 1은 다수의 유기체들로부터의 자일로스 아이소머라제 유전자에 의해 형질전환된 사카로마이세스 세레비지아에 균주의 생육율을 나타낸다. 균주 BIE292XI(클로스트리디움 베이제링키이)는 형질전환 후 유일한 탄소원으로서 자일로스 상에서 초기 생육 시 호기성 조건 하에서 최고의 생육률을 나타내었다. 또한 BIE292XI(클로스트리디움 베이제링키이)는 광범위한 진화 공학 없이 혐기성 조건 하에서 자일로스 상에서 생육할 수 있는 유일한 균주였다.
자일로스 상에서 초기 생육 시, BIE292XI(클로스트리디움 베이제링키이)의 생육율, 및 클로스트리디움 피토페르멘탄스(Clostridium Phytofermentans)(비교 1), 오르피노마이세스(Orpinomyces)(비교 2), 피로마이세스(Piromyces)(RWB202)(비교 3), 및 써무스 써모필루스(Thermus Thermophilus)(비교 4)의 XI에 의해 형질전환된 사카로마이세스 세레비지아에 균주의 공개적으로 입수할 수 있는 데이터
자일로스 아이소머라제 호기성 혐기성
클로스트리디움 베이제링키이 0.061 h-1 0.056 h-1
클로스트리디움 피토페르멘탄스 0.039 h-1 --
오르피노마이세스 0.01 h-1 --
피로마이세스 0.005 h-1 --
써무스 써모필루스 -- --
상기 표에 제공된 데이터는 모두 상이한 균주 배경으로부터 획득된다. --는 측정되지 않았거나 시험되지 않았음을 가리킨다. 써무스 써모필루스로부터의 XI을 갖는 사카로마이세스 세레비지아에 균주의 경우, 자일로스의 소비가 관찰되었지만, 소비 수준이 생육을 지지하기에는 너무 낮았음에 주목한다.
<110> DSM IP Assets B.V. <120> A PENTOSE SUGAR FERMENTING CELL <130> 28261-WO-PCT <140> PCT/EP2012/065088 <141> 2012-08-02 <150> EP 11176601.0 <151> 2011-08-04 <150> US 61/515,014 <151> 2011-08-04 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1374 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 1 actagtaaaa acacatacat aaactaaaaa tgagagaata cttcgaaaac gtttccaaga 60 tcaactacga aggtgctaac tccaagaacc catactcttt caagtactac aacccagatg 120 aaatcattgg tgacaaggct atgaaggaac acttgagatt tgctctatcc tactggcaca 180 ctttaaccgc caccggtgct gatcctttcg gtgttggtac tatgatcaga ccatgggact 240 ctgaaaccaa tgaaatggac ttggccaagg ccagaatgga agctgctttc gaattgatgg 300 acaaattgaa catcgaatac ttctgtttcc acgaccgtga cattgcccca gaaggtaaga 360 ctttgcaaga aaccaacaag aacttggatg aaattgttgc tctatgtaag tctttgatga 420 agaagtacaa caagaaattg ttgtggggta ctgctaactg tttcaccaac ccacgttacg 480 ttcacggtgc tggtacttcc tgtaacgctg atgttttcgc ttatgctgct gctcaaatca 540 agaaggccat cgaaatcacc aaggaattgg atggtgaaaa ctacgtcttt tggggtggta 600 gagaaggtta cgaaacttta ttgaacactg acatgggttt ggaattggac aactttgcta 660 gattattgca aatggctgtc gactacgcca aggaaattgg tttcaccggt caattcttga 720 ttgaaccaaa gccaaaggaa ccaaccaagc accaatacga tttcgatgct gctaccgttt 780 tgggtttctt gaagaactac aacttggaca aatacttcaa ggttaacatt gaagctaacc 840 atgccacttt agctcaacac actttccaac acgaattgca cttcgccaga atcaacaaat 900 tcttgggttc tattgacgct aaccaaggtg acccattatt gggttgggac actgaccaat 960 tcccaaccaa catctacgat gctactttgg ctatgtacga aatcttgaaa aatggtggtt 1020 tggctccagg tggtgtcaac ttcgactcca aggtcagaag agcttctttc gaaaaggaag 1080 atttgttctt ggcttacatt gctggtatgg acacctttgc caagggtttg agagttgctt 1140 acaagttgtt ggaaaacggt gacttggaag atttcatcaa ggaaaaatac tcttctttca 1200 ccgaaggtat tggtaaggaa atcgtcgaag gtaaggtcgg tttcaaggaa ttggaagcct 1260 acgctttgaa caacaaccca atcatcaaca agtctggtag acaagaatta ttggaatcca 1320 ttgtcaacca atacatcttc gaagatcaca aataagccgc ggtcgcgacc cggg 1374 <210> 2 <211> 441 <212> PRT <213> xylose isomerase Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 <400> 2 Met Arg Glu Tyr Phe Glu Asn Val Ser Lys Ile Asn Tyr Glu Gly Ala 1 5 10 15 Asn Ser Lys Asn Pro Tyr Ser Phe Lys Tyr Tyr Asn Pro Asp Glu Ile 20 25 30 Ile Gly Asp Lys Ala Met Lys Glu His Leu Arg Phe Ala Leu Ser Tyr 35 40 45 Trp His Thr Leu Thr Ala Thr Gly Ala Asp Pro Phe Gly Val Gly Thr 50 55 60 Met Ile Arg Pro Trp Asp Ser Glu Thr Asn Glu Met Asp Leu Ala Lys 65 70 75 80 Ala Arg Met Glu Ala Ala Phe Glu Leu Met Asp Lys Leu Asn Ile Glu 85 90 95 Tyr Phe Cys Phe His Asp Arg Asp Ile Ala Pro Glu Gly Lys Thr Leu 100 105 110 Gln Glu Thr Asn Lys Asn Leu Asp Glu Ile Val Ala Leu Cys Lys Ser 115 120 125 Leu Met Lys Lys Tyr Asn Lys Lys Leu Leu Trp Gly Thr Ala Asn Cys 130 135 140 Phe Thr Asn Pro Arg Tyr Val His Gly Ala Gly Thr Ser Cys Asn Ala 145 150 155 160 Asp Val Phe Ala Tyr Ala Ala Ala Gln Ile Lys Lys Ala Ile Glu Ile 165 170 175 Thr Lys Glu Leu Asp Gly Glu Asn Tyr Val Phe Trp Gly Gly Arg Glu 180 185 190 Gly Tyr Glu Thr Leu Leu Asn Thr Asp Met Gly Leu Glu Leu Asp Asn 195 200 205 Phe Ala Arg Leu Leu Gln Met Ala Val Asp Tyr Ala Lys Glu Ile Gly 210 215 220 Phe Thr Gly Gln Phe Leu Ile Glu Pro Lys Pro Lys Glu Pro Thr Lys 225 230 235 240 His Gln Tyr Asp Phe Asp Ala Ala Thr Val Leu Gly Phe Leu Lys Asn 245 250 255 Tyr Asn Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Val Asn Ile Glu Ala Asn His Ala 260 265 270 Thr Leu Ala Gln His Thr Phe Gln His Glu Leu His Phe Ala Arg Ile 275 280 285 Asn Lys Phe Leu Gly Ser Ile Asp Ala Asn Gln Gly Asp Pro Leu Leu 290 295 300 Gly Trp Asp Thr Asp Gln Phe Pro Thr Asn Ile Tyr Asp Ala Thr Leu 305 310 315 320 Ala Met Tyr Glu Ile Leu Lys Asn Gly Gly Leu Ala Pro Gly Gly Val 325 330 335 Asn Phe Asp Ser Lys Val Arg Arg Ala Ser Phe Glu Lys Glu Asp Leu 340 345 350 Phe Leu Ala Tyr Ile Ala Gly Met Asp Thr Phe Ala Lys Gly Leu Arg 355 360 365 Val Ala Tyr Lys Leu Leu Glu Asn Gly Asp Leu Glu Asp Phe Ile Lys 370 375 380 Glu Lys Tyr Ser Ser Phe Thr Glu Gly Ile Gly Lys Glu Ile Val Glu 385 390 395 400 Gly Lys Val Gly Phe Lys Glu Leu Glu Ala Tyr Ala Leu Asn Asn Asn 405 410 415 Pro Ile Ile Asn Lys Ser Gly Arg Gln Glu Leu Leu Glu Ser Ile Val 420 425 430 Asn Gln Tyr Ile Phe Glu Asp His Lys 435 440 <210> 3 <211> 123 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 3 tttctcatgg tagcgcctgt gcttcggtta cttctaagga agtccacaca aatcaagatc 60 cgttagacgt ttcagcttcc aaaacagaag aatgtgagac caaaagctgg agctcatagc 120 ttc 123 <210> 4 <211> 121 <212> DNA <213> Synthetic DNA <400> 4 tggaggtggt actgaagcag gttgaggaga ggcatgatgg gggttctctg gaacagctga 60 tgaagcaggt gttgttgtct gttgagagtt agccttagtg gtaccggccg caaattaaag 120 c 121

Claims (17)

  1. 자일로스 아이소머라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포로, 상기 자일로스 아이소머라제의 아미노산 서열이 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열과 75% 이상의 서열 일치성을 가지며 상기 뉴클레오타이드 서열이 숙주와 이종인 세포.
  2. 제 1 항에 있어서,
    효모 세포인 세포.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    자일로스 아이소머라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 클로스트리디움(Clostridium) 속의 세포로부터 수득될 수 있는 세포.
  4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,
    사카로마이세스(Saccharomyces), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 칸디다(Candida), 피키아(Pichia), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 한세눌라(Hansenula), 클로에케라(Kloeckera), 슈바니오마이세스(Schwanniomyces) 또는 야로위아(Yarrowia) 속의 효모 세포인 세포.
  5. 제 4 항에 있어서,
    효모 세포가 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 불데리(Saccharomyces bulderi), 사카로마이세스 바르네티(Saccharomyces barnetti), 사카로마이세스 엑시구우스(Saccharomyces exiguus), 사카로마이세스 유바룸(Saccharomyces uvarum), 사카로마이세스 다이아스타티쿠스(Saccharomyces diastaticus), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus) 또는 클루이베로마이세스 프라길리스(Kluyveromyces fragilis) 종의 것인 세포.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. 세포에서 자일로스의 수송의 증가;
    b. 자일룰로스 키나제 활성의 증가;
    c. 펜토스 포스페이트 경로를 통한 흐름의 증가;
    d. 알도스 리덕타제 활성의 감소;
    e. 이화 생성물 억제에 대한 민감성의 감소;
    f. 에탄올, 삼투성 또는 유기산에 대한 내성의 증가; 또는
    g. 부산물의 감소된 생성
    을 생성시키는 하나 이상의 유전자 변형을 포함하는 세포.
  7. 제 6 항에 있어서,
    하나 이상의 유전자 변형이 펜토스 포스페이트 경로의 비-산화성 부분의 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자의 과발현을 생성시키는 세포.
  8. 제 7 항에 있어서,
    유전자가 리뷸로스-5-포스페이트 아이소머라제, 리뷸로스-5-포스페이트 에피머라제, 트랜스케톨라제 또는 트랜스알돌라제를 암호화하는 유전자인 세포.
  9. 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 유전자 변형이 자일룰로스 키나제를 암호화하는 유전자의 과발현을 생성시키는 세포.
  10. 제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 유전자 변형이 세포에서 비특이적인 알도스 리덕타제 활성의 감소를 생성시키는 세포.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    L-아라비노스를 사용하는 능력을 가지며, 유전자 TAL1, TKL1, RPE1 및 RKI1이 과발현되는 세포.
  12. 제 6 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    GRE3-유전자의 암호화 영역이, 유전자 TAL1, TKL1, RPE1 및 RKI1을 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 의한 상기 암호화 영역의 치환에 의해 불활성화된 세포.
  13. 제 6 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)으로부터의 유전자 araA, araB 및 araD가 발현된 세포.
  14. 제 6 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 구성적으로 발현되거나 구성적으로 과발현된 유전자가 세포의 게놈 내에 안정하게 편입된 세포.
  15. 자일로스의 공급원을 함유하는 배지를, 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 세포가 자일로스를 발효 산물로 발효하도록 상기 세포와 함께 발효시킴을 포함하는 발효 산물의 생산 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    발효 산물이 에탄올, 부탄올, 락트산, 3-하이드록시-프로피온산, 아크릴산, 아세트산, 숙신산, 시트르산, 말산, 퓨마르산, 이타콘산, 아미노산, 1,3-프로판-다이올, 에틸렌, 글리세롤, 부탄올, β-락탐 항생제 및 세파로스포린인 방법.
  17. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서,
    혐기성인 방법.
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