MXPA00011223A - Produccion mejorada in vivo de cefalosporinas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona ADN, celulas huesped heterologas capaces de transcribir, traducir o expresar dicho ADN y metodos que emplean tales celulas huespes y cultivos de las mismas para obtener una mejorada produccion in vivo de cefalosporinas aciladas, con rendimientos mas altos. De conformidad con la presente invencion, se proporciona una celula huesped que comprende una enzima que tiene actividad de expadasa, la cual predominantemente se localiza en el citosol (contrariamente a localizarse principalmente dentro o con los peroxisomas o microcuerpos) de la celula huesped.

Description

PRODUCCIÓN MEJORADA ZN VIVO DE CEFALOSPORINAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al campo de las técnicas de ADN recombinante- Más en particular, la presente invención se refiere al campo de la producción de cefalosporinas utilizando microorganismos huésped genéticamente modificados, a microorganismos huésped así modificados, así como al ADN para utilizarse en los mismos. La presente invención además se refiere a enzimas modificadas expresadas por ADN recombinante en dichos microorganismos huésped. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los antibióticos ß-lactámicos constituyen el grupo más importante de compuestos antibióticos, con un largo historial de uso clínico. Entre este grupo, los predominantes son las penicilinas y cefalosporinas. Estos compuestos son producidos naturalmente por los hongos filamentosos tales como Penicillium chrysogenum y Acremonium chrysogenum, respectivamente. Como resultado de las técnicas de mejoría de cepas clásicas, los niveles de producción de los antibióticos en P. chrysogenum y A. chrysogenum se han incrementado drásticamente en las últimas décadas. Con el incremento de conocimientos acerca de las rutas Ref: 124866 biosintéticas que conducen a las penicilinas y cefalosporinas, y con el advenimiento de la tecnología de ADN recombinante, actualmente se dispone de nuevas herramientas para mejorar la producción de cepas y para la derivación in vivo de los compuestos. Gran parte de las enzimas involucradas en la biosíntesis de ß-lactamas han sido identificadas y se han clonado sus correspondientes genes, tal como se puede encontrar en Ingolia y Queener, Med. Res. Rev. 9 (1989), 245-264 (biosynthesis route and enzymes) , y Aharonowitz, Cohén y Martin, Ann. Rev. Microbiol. 46 (1992), 461-495 (gene cloning) . Las primeras dos etapas en la biosíntesis de la penicilina en P. chrysogenum son la condensación de los tres aminoácidos ácido L-5-amino-5-carboxipentanoico (ácido L-a-aminoadípico) (A) , L-cisteína (C) y L-valina (V) para formar el tripéptido LLD-ACV, seguido por la ciclización de este tripéptido para formar la isopenicilina N. Este compuesto contiene la estructura típica ß-lactámica. La tercera etapa involucra el intercambio de la cadena lateral hidrofílica del ácido L-5-amino-5-carboxipentanoico por una cadena lateral hidrofóbica, mediante la acción de la enzima aciltransferasa. La reacción de intercambio enzimático mediada por la aciltransferasa se lleva a cabo dentro de un organelo celular, el microcuerpo, tal como ha sido descrita en la Patente Europea EP-A-0,448, 180. Las . cefalosporinas son mucho más costosas que las penicilinas. Una razón es porque algunas cefalosporinas (e.g. cefalexima) se preparan a partir de penicilinas mediante un numero de transformaciones químicas. Otra razón es que, hasta la actualidad, sólo las cefalosporinas con una cadena lateral D-5-amino-5-carboxipentanoilo podían ser sometidas a una transformación fermentativa. La cefalosporina C, por mucho la materia prima más importante en este aspecto, es muy soluble en agua a cualquier pH, implicando de esta manera procesos de aislamiento más prolongados y costosos utilizando tecnologías de columna problemáticas y caras. La cefalosporina C obtenida de esta manera tiene que ser transformada en las cefalosporinas terapéuticamente utilizadas, mediante un número de transformaciones químicas y enzimáticas. Los métodos actualmente favorecidos en la industria para preparar el intermediario 7-ADCA, involucran complejas etapas químicas que conducen a la expansión y derivación de la penicilina G. Una de las etapas químicas necesarias para producir el 7-ADCA involucra la expansión de la estructura de anillo de penicilina de 5 miembros a una estructura de anillo de cefalosporina de 6 miembros (véase por ejemplo la Patente Norteamericana US 4,003,894). Este proceso químico complejo es tanto costoso como nocivo para el ambiente. En consecuencia, existe un gran deseo de reemplazar tales procesos químicos por reacciones enzimáticas tales como catálisis enzimática, de preferencia en un proceso in vivo. Una clave para el reemplazo del proceso de expansión química por los procesos enzimáticos e in vivo, es la enzima central en la ruta de biosíntesis de las cefalosporinas, que es la desacetoxicefalosporina C sintetasa (DAOCS) , también denominada como "expandasa". La enzima expandasa de la bacteria Streptomyces clavuligerus se encontró que lleva a cabo, en algunos casos, expansiones del anillo de penicilina. Cuando se introduce en P. chrysogenum, ésta puede transformar la estructura de anillo de penicilina en una estructura de anillo de cefalosporina, in vivo, tal como fue descrito en Cantwell et al . , Proc . R. Soc. Lond. B. 248 (1992), 283-289. La enzima expandasa ha sido bien caracterizada (Patente Europea EP-A-0, 366-354) tanto bioquímica como funcionalmente, al igual que su correspondiente gen cefE. Se han descrito tanto mapas físicos del gen cefE (Patente Europea EP-A-0, 341, 892) , como la secuencia de ADN y estudios de transformación en P. chrysogenum con cefE . Otra fuente para obtener una enzima de expansión de anillo es por ejemplo la bacteria Nocardia lactamdurans (anteriormente Streptomyces lactamdurans) y el hongo Acremoníum chrysogenum (anteriormente Cephalosporium acremonium) . La expandasa del Cephalosporium es una enzima bifuncional, que tiene actividad tanto de expandasa (expansión de anillos) como de 3-hidroxflación. Tanto las propiedades bioquímicas de la enzima como la secuencia de ADN del gen han sido descritas (Cortés et al . J. Gen.

Microbiol. 133 (1987), 3165-3174; y Coque et al . , Mol. Gen. Genet. 236 (1993), 453-458, respectivamente). Como la expandasa cataliza la expansión del anillo de tiazolidina de cinco miembros de la penicilina N al anillo dihidrotiazina de 6 miembros de la DAOC, esta enzima sería un candidato lógico para reemplazar las etapas de expansión de anillo del proceso químico. Desafortunadamente, la enzima trabaja sobre el intermediario penicilina N de la ruta biosintética de las cefalosporinas, pero no, o cuando menos de manera relativamente ineficiente, sobre las penicilinas fácilmente disponibles y poco costosas producidas por P. chrysogenum, tales como la penicilina V o la penicilina G. La penicilina N no está disponible comercialmente y aun cuando se expande, su cadena lateral D-5-amino-5-carboxipentanoilo no puede ser removida fácilmente por la acción de las penicilina acilasas.

Recientemente se encontró que la enzima expandasa es capaz de expandir penicilinas con cadenas laterales de origen no natural para obtener los correspondientes derivados 7-ADCA. Estas cadenas laterales incluyen adipato (ácido 5-carboxilpentanoico) y varios otros compuestos. Esta característica de la expandasa ha sido explotada en un proceso para la explotación ín vivo de adipoil-7-ADCA en Penicillium chrysogenum, tal como se describe en la Patente Europea EP-A-0, 532, 341. Las cepas de Penicillium chrysogenum son transformadas con la expandasa de Streptomyces clavuligerus para producir el ácido adipoil-6-aminopenicilánico (adipoil-6-APA) cuando estas transformantes son alimentadas con ácido adípico. Subsecuentemente, el adipoil-6-APA es "expandido" a adipoil-7-ADCA. La producción de varias otras cefalosporinas 7-aciladas se ha descrito en la Publicación Internacional WO 95/04148 y en la Publicación Internacional WO95/04149. En las Publicaciones Internacionales WO95/04148 y WO95/04149 se describe que la adición de ácido 3'-carboximetiltiopropiónico y ácido 3, 3'-tiodipropiónico al medio de cultivo, produce penicilinas que son sustratos para la expandasa, conduciendo de esta manera a la síntesis de 2- (carboxietiltio) -acetil-7-7?DCA y 3- (carboximetiltio) -propionil-7-ADCA, respectivamente. Aun cuando la expandasa muestra una actividad sobre las penicilinas con diferentes cadenas laterales, la expansión de estas nuevas penicilinas ocurre de manera menos eficiente en comparación con la expansión del sustrato natural, la penicilina N. Esta noción ha sido la base para modificar la expandasa, con el propósito de r alterar la actividad sobre el ácido adipoilpenicilanico. La aplicación de expandasa mutagenizada fue descrita en la Publicación Internacional WO98/02551. La etapa final en la síntesis de las penicilinas, que es el intercambio de la cadena lateral a-aminoadipoilo de la IPN por una cadena lateral alternativa, ocurre en el microcuerpo, en donde se ubica la aciltransferasa. Para la expansión óptima de la penicilina, la ubicación preferida de la expandasa, por lo tanto, se cree que es en el microcuerpo. Esto se basa no sólo en el hecho de que el sustrato para la expandasa se piensa que es producido en el ' microcuerpo, sino que también en la expectativa de que en el microcuerpo la expandasa debería estar mejor protegida de la degradación por parte de proteasas, lo cual es un inconveniente conocido para el uso de P. chrysogenum para la producción de enzimas (véase por ejemplo, Theilaard et al . , 1997; Purification and characterisation of d- (L-a-aminoadipyl) -L-cysteinyl-D-valine synthetase from Penicillium chrysogenum; Biochem. J. 327, 185-191) .

La modificación de ia ubicación celular de las enzimas involucradas en la producción de antibióticos ß-lactámicos, ha sido sugerida en la Patente Europea EP-0,448,180. Por ejemplo, en la página 1, penúltimo párrafo, se sugiere ubicar la epimerasa y de preferencia las subsecuentes enzimas biosintéticas de cefalosporina tales como la expandasa/hidroxilasa de Acremonium chrysogenum o la expandasa de Streptomyces spec. en los microcuerpos, para mejorar la eficiencia de la producción de las cefalosporinas o intermediarios en Penicillium chrysogenum. En este documento también se demostró que la remoción de la señal de blanco del microcuerpo de la aciltransferasa, una enzima involucrada en la remoción de la cadena lateral del acil-6-APA, destruye también la producción de penicilina. Esto sugiere que las enzimas involucradas en la producción de beta-lactamas deben estar ubicadas en los microcuerpos, si no por razones de localización del sustrato, entonces cuando menos por razones de estabilidad. DESCRIPCIÓN DE LA INV?NCIÓN La presente invención proporciona ADN, células huésped heterólogas capaces de transcribir, traducir o expresar dicho ADN y métodos empleados tales como células huésped y cultivos para las mismas, para una mejor producción in vivo de cefalosporinas aciladas con un alto rendimiento. De conformidad con la presente invención, se proporciona una célula huésped que comprende una enzima que tiene actividad expandasa, la cual está predominantemente localizada en el citosol (en vez de estar localizada principalmente dentro o con los peroxisomas o microcuerpos) de la células huésped. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un fragmento de ADN aislado que codifica para una expandasa modificada, en donde la expandasa, después de la expresión de dicho fragmento de ADN en un huésped Penicillium chrysogenum, se encuentra predominantemente en el citosol del huésped Penicillium. Tal fragmento de ADN que codifica para una expandasa modificada, por ejemplo, se puede obtener modificando el ADN que codifica para una expandasa tal como el encontrado 'en Nocardia lactamdurans (anteriormente Streptomyces lactamdurans) y el hongo Acremonium chrysogenum, y otros microorganismos -relacionados (i.e. productores de cefalosporina/cefamicina) . La presente invención proporciona un fragmento de ADN aislado que codifica para una expandasa modificada que preferiblemente se localiza predominantemente en el citosol en vez de estar localizada en el microcuerpo del huésped heterólogo. En una modalidad preferida de la presente invención, tal fragmento de ADN se obtiene de Streptomyces clavuligerus el cual codifica para una expandasa, y se modifica para obtener un fragmento de ADN que codifica para una expandasa el cual, cuando se expresa en un huésped Penicillium chrysogenum, se encuentra predominantemente en el citosol de dicho huésped Penicillium. Tal modificación comprende clonar por técnicas recombinantes una secuencia de nucleótido que codifica para la expandasa, pero preferiblemente comprende modificar por técnicas recombinantes una secuencia que codifica para una señal de blanco de microcuerpo o peroxisoma en dicha expandasa. La modificación puede comprender una mutación única o múltiple (por ejemplo una deleción, inserción o reversión) de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para una expandasa, de preferencia una secuencia que codifica para una secuencia de aminoácido carboxilo-terminal de dicha expandasa. Entre los organismos eucarióticos, el blanco de -las proteínas hacia los peroxisomas o microcuerpos se ha estudiado relativamente bien en levaduras no filamentosas . En estos microorganismos, las proteínas destinadas hacia el peroxisoma o microcuerpo generalmente contienen una secuencia de blanco C-terminal, cuya secuencia de aminoácidos generalmente es S (serina) K (lisina) L (leucina) o más generalmente S/C/A/ - K/H/R - L. Tal secuencia de blanco, cuando menos en un contexto homólogo, proporciona la señal necesaria para que una proteína tal como una enzima sea dirigida hacia el microcuerpo, en donde encuentra su ubicación final. Para los hongos filamentosos tales como Penicillium chrysogenum, dirigir al blanco, proteínas hacia los peroxisomas o microcuerpos se ha estudiado relativamente poco, y se sabe muy poco acerca de dirigir al blanco proteínas en un contexto heterólogo, cuando un microorganismo tal como una levadura o un hongo se utiliza como célula huésped para traducir o inclusive expresar una proteína heteróloga. Este es especialmente el caso cuando una proteína heteróloga se deriva de un organismo procariótico tal como una bacteria, ya que las bacterias no tienen organelos como peroxisomas o microcuerpos y, de esta manera, no utilizan la señal de blanco peroxisomal en un contexto homólogo. Se piensa generalmente que, con el fin de expresar heterólogamente una proteína o enzima para que funcione bien en su huésped, las respectivas señales de blanco deben cuando menos parecerse a aquellas utilizadas por el huésped a fin de encontrar una ubicación subcelular comparativa. La expandasa de la bacteria S. clavuligerus generalmente comprende una secuencia C-terminal, SKA (Serina-Lisina-Alanina) , que funciona de manera similar a una secuencia de blanco peroxisomal cuando dicha proteína se expresa en un contexto heterólogo en un huésped eucariótico. Por ejemplo, las cepas de Penicillium chrysogenum transformadas con la expandasa de S. clavuligerus (por ejemplo como la descrita en la Patente Europea EP 0,532,341 Al) muestran la localización de la respectiva expandasa dentro del peroxisoma. Se ha encontrado que la expandasa de tipo silvestre de Streptomyces clavuligerus, cuando se produce de manera recombinante en Penicillium chrysogenum, se acumula predominantemente en los microcuerpos. Dicha secuencia de tres aminoácidos, Ser-Lys-Ala aparentemente sirve como una señal de blanco hacia el microcuerpo en Penicillium chrysogenum, aunque es algo divergente de las secuencias consensúales para las señales de blanco de microcuerpo en levaduras . Cuando las señales de blanco peroxisomal, así como las señales que deberían prevenir la localización' dentro de los peroxisomas, fueron manipuladas en el extremo carboxilo-terminal de la expandasa de S. clavuligerus, o para ese fin en el extremo carboxilo-terminal de la expandasa/hidrolasa de Cephalosporium acremonium, esta tendencia a ubicarse dentro del peroxisoma no se alteró, independientemente de las diferentes secuencias de aminoácidos carboxilo-terminales que fueron agregadas (Verbug et al . , P. 35, pág. 108. In: 7th Int. Symp. Gen. Industr. Microorg. 26 de junio - 1 de julio de 1994, Montreal, Canadá) . Aparentemente, la enzima es portadora de una señal de blanco efectiva, causando que se localice, cuando menos predominantemente, dentro del microcuerpo de la célula huésped Penicillium chrysogenum heteróloga. Sin embargo, en una modalidad de la presente invención, la presente invención ahora proporciona una modificación efectiva de una expandasa, alterando la tendencia de ubicarse dentro del microcuerpo y causando la localización predominante de dicha expandasa en el citosol del huésped. La tendencia de ubicarse en el microcuerpo o peroxisoma está gobernada por las señales de blanco de peroxisoma N-terminales o C-terminales (PTSs), en donde la modificación de las PTS (ya sea N-terminal o C-terminal) previene 'sustancialmente tal ubicación en los microcuerpos. Un ejemplo de tal modificación es una modificación en una secuencia de nucleótidos que codifica para un tripéptido carboxilo-terminal XI - X2 - X3, por ejemplo en donde XI es un residuo de aminoácido que se selecciona del grupo que consiste de Serina, Cisteína y Alanina, X2 es un residuo de aminoácido que se selecciona del grupo que consiste de Lisina, Histidina y Arginina, y X3 es Leucina o Alanina. Tales secuencias tripeptídicas también son denominadas péptidos similares a SKL, y la secuencia esencial de la señal puede ser un pequeño aminoácido en el primer residuo, un residuo básico en el penúltimo residuo y un residuo no polar grande en la posición C-terminal. La presente invención proporciona un fragmento de ADN que codifica para una expandasa, en donde el fragmento codifica para un tripéptido similar a SKL que ha sido modificado o que se selecciona de tal manera que prevenga sustancialmente que la expandasa se ubique en los microcuerpos y, de esta manera, que cause que la expandasa se localice principalmente en el citosol de la célula huésped cuando es expresada en dicha célula huésped heteróloga. En una modalidad preferida de la presente invención, el fragmento de ADN se obtiene a partir de un ADN que codifica para la expandasa de S. clavuligerus' que inicialmente comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un tripéptido carboxilo-terminal Serina-Lisina-Alanina, el cual es modificado para que provoque que la expandasa se localice predominantemente en el citosol de la célula huésped después de que es expresada en la misma. Tal modificación se ejemplifica particularmente por un fragmento de ADN de la presente invención en donde una secuencia de nucleótidos que codifica para Serina - Lisina - Alanina ha sido modificada en una secuencia que codifica para Serina - Lisina - Ácido aspártico, o en donde el aminoácido en la última posición ha sido eliminado o reemplazado, por ejemplo, por otro residuo no hidrofóbico.

Todavía otra modificación comprende el tripéptido Serina - Serina - Ácido aspártico, o en donde el aminoácido en la penúltima posición ha sido eliminado o reemplazado por un residuo sin carga positiva. Todavía otras modificaciones comprenden deleciones o modificaciones en la primera posición del tripéptido que alteran la ruta de la proteína así modificada en una célula huésped heteróloga y provocan que la enzima se localice predominantemente en el citosol de la célula huésped utilizada. Todavía otras modificaciones comprenden deleciones o modificaciones de cualquier combinación de estos tres aminoácidos o codones que codifican para estos aminoácidos carboxilo-terminales . Por un lado, sorpresivamente se encontró que la modificación deliberada, utilizando técnicas de ADN recombinantes convencionales, de la secuencia tripeptídica SK? (O variantes funcionales de la misma, tal como se explicó anteriormente) que aparentemente funcionan como una señal de blanco de microcuerpo, provoca que la enzima heterólogamente expresada se acumule predominantemente en el citosol de la célula huésped, en vez de acumularse en los microcuerpos. Sin embargo, por otro lado, variaciones de las proteínas abundan en la naturaleza y es posible ahora encontrar microorganismos que comprenden una enzima tal como una expandasa la cual, cuando fuera expresada en un huésped heterólogo, estaría predominantemente localizada en el citosol del huésped. Especialmente las proteínas o enzimas que tienen una secuencia C-terminal que se deriva de la secuencia de blanco anteriormente identificada, son posibles candidatos para ser probados con respecto a la ubicación citosólica y seleccionados para su uso posterior para mejorar el rendimiento de la producción de cefalosporinas. En una modalidad particular, la presente invención proporciona una secuencia de nucleótidos que codifica para una expandasa la cual, al ser expresada en una célula huésped Penicillium chrysogenum, se ubica predominantemente en el citosol, mejorando de esta manera el rendimiento de cefalosporina con respecto al obtenido en una célula huésped que expresa una enzima comparable dentro " de los microcuerpos. Contrariamente a las expectativas, la presente invención proporciona una enzima que parece ser estable fuera de los microcuerpos. Una expandasa, tal como la proporcionada por la presente invención, es capaz de expandir penicilinas aún aquellas que tienen cadenas laterales de origen no natural (véanse por ejemplo las Patentes Europeas EP 97201196.9 y EP 97201197.7) a los correspondientes derivados 7-ADCA.

La presente invención también proporciona un fragmento de ADN aislado que codifica para una enzima modificada o seleccionada, tal como la proporcionada por la presente invención, en donde el fragmento además comprende regiones reguladoras para la expresión del ADN en una célula huésped eucariótica. Por ejemplo, está dentro de la capacidad de los técnicos en la materia proporcionar un fragmento de ADN con regiones reguladoras funcionales en una o más células huésped de varios organismos, tales como de origen animal o de planta o una levadura o un hongo. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un fragmento de ADN que codifica para una enzima modificada, tal como la proporcionada por la presente invención, que comprende regiones reguladoras adecuadas para regular la expresión en una célula huésped derivada de un microorganismo tal como una levadura o un hongo. • Sorpresivamente, se encontró que una célula huésped (e.g. Penicilli um chrysogenum) transformada con una expandasa que se acumula principalmente en el citosol, en vez de dentro de los microcuerpos, se incrementaba la producción de antibióticos de cefalosporina (e.g. adipil-7-ADCA) , en vez de disminuir. Esto es real incluso cuando se compara con una célula huésped que ha sido transformada con un ADN que codifica para una expandasa que, en todos los demás aspectos, es comparable, pero que está localizada en los microcuerpos . La presente invención también proporciona una célula huésped u organismo huésped (o progenie de los mismos) que ha sido provisto con un fragmento de ADN recombinante modificado o seleccionado que codifica para una enzima localizada en el citosol, tal como la proporcionada por la presente invención. Tal organismo huésped, por ejemplo, incorpora, por ejemplo como resultado de la transformación de dicho organismo huésped o un ancestro del mismo, un fragmento de ADN que opcionalmente comprende regiones reguladoras o secuencias reguladoras que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica para una enzima modificada tal como la proporcionada por la presente invención. Tal huésped de preferencia se selecciona del grupo que consiste de plantas y microorganismos, de preferencia un hongo que se selecciona ' del grupo que consiste de Penicillium chrysogenum, Aspergillus nidulans o A. niger y Cephalosporium acremonium. La presente invención también proporciona cultivos de células huésped o de organismos huésped tales como los proporcionados por la presente invención. Tal cultivo comprende células en donde una expandasa funcional capaz de expandir las penicilinas con cadenas laterales (de origen no natural) para obtener los correspondientes derivados 7-ADCA, predominantemente se encuentra en el citosol. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un cultivo para la fermentación a gran escala, en donde una expandasa modificada localizada en el citosol contribuye a obtener más altos niveles de producción de adipoil-7-ADCA, en comparación con un cultivo de fermentación a escala comparable que utiliza una expandasa de tipo natural y de origen comparable. En todavía otra modalidad, la presente invención proporciona una célula huésped y cultivos de la misma, que han sido obtenidos por técnicas recombinantes con una expandasa que se selecciona entre otras por su capacidad o tendencia de localizarse predominantemente en el citosol de un huésped heterólogo, independientemente de si dicha expandasa se localiza en un contexto homólogo en un microcuerpo o no. Tal célula huésped se puede seleccionar proporcionándole a una célula huésped un fragmento de ADN que codifica para una expandasa y probando si la expandasa se localiza predominantemente en el citosol. En una modalidad preferida, la prueba para la localización de la enzima se realiza por microscopía electrónica, tal como se explica en la parte experimental de la presente descripción. La presente invención también proporciona un método para preparar una células huésped u organismo huésped que tenga un fragmento de ADN modificado o seleccionado que codifique para una enzima modificada o seleccionada como la proporcionada por la presente invención, en donde el método comprende poner en contacto células bajo condiciones transformantes con un fragmento de ADN como el proporcionado por la presente invención y seleccionar las células que hayan obtenido el ADN. La transformación de células huésped, por ejemplo de P. chrysogenum u otros hongos, en general se puede lograr por diferentes medios de distribución de ADN, por ejemplo como la incorporación de protoplastos mediada por PEG-Ca, electroporación o técnicas de disparo de partículas, y la selección de _las transformantes. Véase por ejemplo Van den Hondel en Punt, Gene and Transfer and Vector Development for Filamentous Fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi (Peberdy, Laten, Ogden, Bennett, eds.), Cambridge' University Press (1991) . La aplicación de marcadores de selección dominantes y no dominantes ha sido descrita (Van den Hondel, supra) . Los marcadores de selección tanto de origen homólogo (derivado de P. chrysogenum) como de origen heterólogo (no derivado de P. chrysogenum) también se han descrito (Gouka et al . , J. Biotechnnol. 20? (1991) 189-200). La aplicación de diferentes marcadores de selección de transformantes, homólogos o heterólogos, en presencia o ausencia de secuencias de vectores, físicamente ligados o no al ADN no seleccionable, en la selección de transformantes son bien conocidos en la técnica. La presente invención también proporciona un método para expresar un fragmento de ADN que codifica para una expandasa en una célula huésped, en donde el fragmento de ADN codifica para una expandasa que provoca que la enzima se produzca y localice predominantemente en el citosol. En una modalidad preferida de la presente invención, tal método comprende proporcionarle al fragmento de ADN una modificación en una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia de aminoácidos carboxilo-terminal, de preferencia una secuencia tripeptídica tal como la SKA encontrada en la expandasa de Streptomyces clavuligerus. Tal método proporcionado por la presente invención, de preferencia se utiliza con una célula huésped de Penicillium chrysogenum. La presente invención también proporciona un método para expandir el anillo de 5 miembros del compuesto beta-lactama para formar un compuesto cefem de seis miembros, el cual comprende las etapas de hacer crecer un huésped capaz de producir el compuesto beta-lactámico bajo condiciones que conduzcan y permitan a dicho huésped expresar una expandasa heteróloga derivada por medios recombinantes y capaz de expandir el anillo de 5 miembros del compuesto beta-lactámico proveniente del fragmento de ADN que lo codifica, para formar el compuesto de cefem de 6 miembros, caracterizado porque la expandasa se expresa a partir de un fragmento de ADN que ha sido modificado o seleccionado para codificar para una expandasa que es producida o cuando menos se localiza predominantemente en el citosol de la célula huésped. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un método para expandir el anillo de 5 miembros de un compuesto beta-lactámico por una expandasa modificada, en donde la expandasa se localiza en el citosol de una célula huésped debido a una modificación en el fragmento de ADN que la codifica, en donde una señal de blanco de microcuerpo ha sido modificada, preferiblemente una señal de blanco que comprende una secuencia de aminoácidos tripeptídica tal como la obtenida en la expandasa de Streptomyces clavuligerus ha sido modificada. En la parte experimental de la presente descripción, se presenta un ejemplo de un método como el proporcionado por la presente invención, en donde la célula huésped es Penicillium chrysogenum. En una modalidad preferida de la presente invención, se proporciona un método en donde el compuesto beta-lactámico se selecciona del grupo que consiste de fenilacetil-6-APA, fenoxiacetil-6-APA, alfa-aminoadipoil-6-APA, adipoil-6-APA, glutaril-6-APA o suberil-6-APA pimelil-6-APA, trans-ß-hidromuconil-6-APA o compuestos comparables. Además, la presente invención proporciona un método para preparar un compuesto de cefem que comprende los pasos de expandir el anillo de 5 miembros (penam) del compuesto beta-lactámico, en un proceso o método de conformidad con la presente invención, y recuperar el compuesto cefem así formado. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un método para preparar un compuesto de cefem en una célula huésped cultivada por fermentación a gran escala, en donde la expandasa que se localiza predominantemente en el citosol de la célula huésped contribuye a obtener niveles más altos de producción de adipoil-7-ADCA, en comparación con un método para preparar un compuesto de cefem a través de un cultivo por fermentación a escala comparable utilizando una expandasa (de tipo natural o modificada) de origen comparable que está localizada predominantemente en un microcuerpo . La presente invención se ilustra con mayor detalle en las siguientes 4 figuras. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una representación esquemática del plásmido pISEWA. La Figura 2 es una representación esquemática del plásmido ISEWA-SKD.

La Figura 3 representa la productividad de adipoil-7-ADCA de un gran número (aproximadamente 80) de transformantes derivadas de las transformaciones realizadas con los plásmido pISEWA (barras blancas) y pISEWA-SKD (barras negras). Eje X: clase de productividad (unidades arbitrarias); eje Y: % de transformantes por clase. La Figura 4 presenta fotografías de microscopía electrónica de una transformante que expresa una expandasa de origen natural (panel A) y una transformante que expresa una expandasa con una señal no dirigida a blanco (SKA->SKD, panel B) . Las partículas de oro indican la presencia de la expandasa. N: núcleo, M: mitocondria, P: peroxisoma (microcuerpo) . PARTE EXPERIMENTAL La transformación de células huésped, por ejemplo P. chrysogenum u otros hongos, en general se puede llevar a cabo por diferentes mecanismos de distribución de ADN, por ejemplo la incorporación de protoplastos mediada por PEG-Ca, electroporación o técnicas de disparo de partículas, y la~ selección de las transformantes. Véase por ejemplo Van den Hondel en Punt, Gene and Transfer and Vector Development for Filamentous Fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi (Peberdy, Laten, Ogden, Bennett, eds.), Cambridge University Press (1991) . Se ha descrito la aplicación de selectores de selección dominantes y no dominantes (Van den Hondel, supra) . Se han descrito marcadores de selección tanto de origen homólogo (derivados de P. chrysogenum) como de origen heterólogo (no derivados de P. chrysogenum) (Gouka et al . , J. Biotechnol. 20 (1991) 189-200) . La aplicación de diferentes marcadores de selección de transformantes, homólogos o heterólogos, en presencia o ausencia de secuencias de vectores, físicamente ligados o no al ADN no seleccionable, en la selección de cepas transformantes son bien conocidos. La reacción de expansión del anillo, mediada por la enzima expandasa modificada o seleccionada, se introduce y se expresa de esta manera en P. chrysogenum, por ejemplo en la cepa Wisconsin 54-1255 (depositada en la ATCC con el número de acceso 28089) . Otras cepas de P. chrysogenum, incluyendo mutantes de la cepa Wisconsin 54-1255, que tengan un rendimiento mejorado de compuestos beta-lactámicos, también son adecuadas. Además, el gen cefE modificado se coloca bajo el control transcripcional y traduccional de elementos de control del gen del hongo. Estos elementos se pueden obtener a partir de genes fúngicos clonados como el IPNS o el gen pcbC de P. chrysogenum, el gen de la b-tubulina, el gen gpdA de Aspergillus nidulans o el gen glcA de Aspergillus niger. De conformidad con la presente invención, el intermediario ß-lectámico adipoil-7-ADCA es producida en transformantes de P. chrysogenum que expresan la expandasa, agregando ácido adípico o una sal o un éster del mismo al medio de cultivo. Las sales adecuadas son, por ejemplo, sales de sodio o de potasio. El adipoil-7-ADCA se recupera eficientemente del medio de cultivo a través de una simple extracción con solventes, por ejemplo de la siguiente manera: El caldo se filtra y se agrega un disolvente orgánico inmiscible con agua al filtrado. El pH se ajusta con el fin de extraer la cefalosporina de la fase acuosa. El rango de pH tiene que ser más bajo de 4.5; de preferencia entre 4 y 1, más preferiblemente entre 2 y 1. De esta manera se separa la cefalosporina de muchas otras impurezas presentes en el caldo de fermentación. Preferiblemente se utiliza un volumen pequeño de disolvente orgánico, obteniéndose una solución más concentrada de la cefalosporina, logrando de esta manera la reducción de los índices de flujo volumétrico. Una segunda posibilidad es la extracción del caldo completo a pH 4 ó menor. De preferencia, el caldo se somete a extracción a un pH entre 4 y 1 con un disolvente orgánico inmiscible con agua. Se puede utilizar cualquier disolvente que no interfiera con la molécula de cefalosporina. Los • disolventes adecuados son, por ejemplo, acetato de butilo, acetato de etilo, metilisobutilcetona, alcoholes como butano, etcétera. De preferencia se utilizan 1-butanol o isobutanol . Posteriormente, la cefalosporina se extrae nuevamente con agua a un pH entre 4 y 10, de preferencia entre 6 y 9. Nuevamente, el volumen final se puede reducir. La recuperación se puede llevar a cabo a temperaturas entre 0 y 50°C, de preferencia a temperatura ambiente . La solución acuosa de cefalosporina obtenida de esta manera, se trata con una enzima adecuada con el fin de remover la cadena lateral adipoilo y obtener el 7-ADCA deseado. Preferiblemente, se utiliza una enzima inmovilizada con el fin de poder usar dicha enzima repetidas veces. La metodología para la preparación de tales partículas y la inmovilización de las enzimas, han sido descritas extensamente en la Patente Europea EP-A- 0222462. El pH de la solución acuosa tiene un valor, por ejemplo, de 4 a 9, valor al cual la reacción de degradación de la cefalosporina se minimiza y se optimiza la transformación deseada con la enzima. Así pues, la enzima se. agrega a la solución acuosa de cefalosporina manteniendo el pH en el nivel apropiado, por ejemplo agregando una base inorgánica tal como una solución de hidróxido de potasio, o aplicando una resina de intercambio catiónico. Cuando concluye la reacción, la enzima inmovilizada se remueve por filtración. Otra posibilidad es la aplicación de la enzima inmovilizada en una columna fija o de lecho fluidizado, o utilizar la enzima en solución y remover los productos por filtración de membrana. Subsecuentemente, la mezcla de reacción se acidifica en presencia de un disolvente orgánico inmiscible con agua. Las enzimas adecuadas son, por ejemplo, derivadas de un microorganismo como Pseudomonas SY77 que tiene una mutación en una o más de las posiciones 62, 177, 178 y 179. También se pueden utilizar enzimas de otros microorganismos del género Pseudomonas, preferiblemente Pseudomonas SE83, opcionalmente con una mutación en una o más de las posiciones que corresponden a las posiciones 62, 177, 178 y 179 de Pseudomonas SY77. Después de ajustar el pH a aproximadamente 0.1 a 1.5, las fases se separaron y el pH de la fase acuosa se ajustó a un valor entre 2 y 5, de preferencia entre 3 y 4. Después se filtró el 7-ADCA cristalino. La desacilación se puede llevar a cabo químicamente de la manera conocida en la técnica, por ejemplo mediante la formación de una cadena lateral iminocloruro, agregando pentacloruro de fósforo a una temperatura inferior a 10°C y subsecuentemente isobutanol a temperatura ambiente o menor. Los siguientes ejemplos se ofrecen a manera de ilustración y no de manera limitante. El enfoque global incluye i) la identificación de residuos de la expandasa involucrados en la especificidad de blanco, ii) la selección de proteínas expandasa o construcción de proteínas mutantes de expandasa, iii) la subclonación de genes de expandasa mutantes o seleccionados en vectores de expresión de P. chrysogenum y la expresión de la expandasa en P. chrysogenum, iv) la determinación de la producción de adipoil-7-ADCA versus la producción de a-D-aminoadipoil-7-ADCA y adipoil-6-APA. De manera similar a la descrita para la cadena lateral adipoilo, un técnico en la materia también podría utilizar la enzima expandasa modificada en procesos descritos en las Publicaciones Internacionales WO95/04148 y WO95/04149 que utilizan ácido 3'-carboximetiltiopropiónico y ácido 3, 3 ' -tiodipropiónico como cadenas laterales, obteniendo 2- (carboxietiltio) -acetil-7-ADCA y una mezcla de 3- (carboximetiltio) -propionil-7-ADCA y 2- (carboxietiltio) -acetil-7-ADCA, respectivamente. EJEMPLO 1 Mutagénesis dirigida a sitio del gen cefE de S. cla ruligerus Las técnicas involucradas en la manipulación genética del gen de la expandasa, ya se han descrito. Las fuentes que se pueden utilizar como plantilla en reacciones de PCR, incluyen preparaciones de ADN cromosómico proveniente de cepas de Streptomyces clavuligerus disponibles al público (tales como la ATCC 27064), o cartuchos de expresión tales como pZEx (descrito en la Publicación de Patente PCT/EP97/03879) y pISEWA (descrito en la Patente Europea EP-02812P) . El cartucho de expresión de expandasa pISEWA (Figura 1) contiene el gen de expandasa de Streptomyces clavuligerus de tipo natural, incluyendo el promotor IPNS y el terminador AT. Con el fin de interrumpir el blanco peroxisomal de la expandasa, la secuencia del extremo C-terminal del cejfE se muta de SKA a SKD. Para este fin, con el pISEWA como plantilla, se realiza una reacción de PCR empleando los cebadores 1 y 2 (véase tabla I) . La PCR se realiza con una polimerasa de prueba-lectura. Después de una etapa de desnaturalización (2 minutos a 98°C) , parte del gen cefE es amplificado en 25 ciclos (1.15 min, 94°C, 45 seg, 55°C, 1 min, 72°C) seguido por una etapa de extensión (8 min, 72°C) . El producto de esta reacción corre del sitio Stul del cefE (aproximadamente a 450 pb del inicio de la traducción, véase Covacevic et al . : Cloning, characterisation, and expression in Escherichia coli of the Streptomyces clavuligerus gene encoding desacetoxycephalosporin C synthetase, J. Bacteriol., 171, 754-760, 1989) hasta un sitio Nsil cadena abajo del codón de faro. Después de verificar la secuencia mediante una secuenciación de nucleótidos, el fragmento Stul-Nsil se utilizó para intercambiar el fragmento cefE "de origen natural" en el plásmido pISEWA, generando de esta manera el plásmido pISEWA-SKD (Figura 2) . Tabla I. Cebadores utilizados en la construcción de la expandasa mutante. El sitio Stul en el cebador 1 y el sitio Nsil en el cebador 2, están subrayados EJEMPLO 2 Transformación de una cepa de P. chrysogenum. Las técnicas involucradas en la transferencia de AD? a protoplastos de P. chrysogenum son bien conocidas en este campo y se describen en numerosas referencias, incluyendo Finkelstein and Ball (eds.), Biotechnology of filamentous fungi, technology and products, Butter orth-Heinemann (1992); Bennett and Lasure (eds.) More Gene Manipulations in fungi, Academic Press (1991) ; Turner, in: Pühler (ed.), Biotechnology, second completely revised edition, VHC (1992) . La transformación de protoplasto mediada por Ca-PEG se utiliza de la manera descrita en la Patente Europea EP635574. De esta manera se introducen las construcciones pISEWA y pISEWA-SKD en P. chrysogenum Wisconsin 54-1255 (ATCC 28089) mediante la cotransformación con GBGLA28 (Patente Europea EP635574), lo cual hace posible que las transformantes de P. chrysogenum crezcan en un medio de selección conteniendo acetamida como única fuente de nitrógeno. De preferencia se utiliza una cepa que tenga una capacidad más pronunciada para producir penicilinas. Un ejemplo de tales cepas es la CBS 455.95. EJEMPLO 3 Selección: Cultivos líquidos Las transformantes se purificaron mediante cultivos repetidos en un medio selectivo. Se utilizaron colonias estables aisladas para posterior selección en presencia del gen de expandasa por bioensayo. Las transformaciones se hicieron crecer en un medio de agar. Se utilizo E. coli ESS2231 como bacteria indicadora en una sobrecapa de agar, la cual también contenía bacto penasa para poder discriminar entre la producción de penicilina y la producción de cefalosporina de conformidad con los métodos conocidos en la técnica y descritos, por ejemplo, en Gutiérrez et al . , Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 56-64. La presencia del gen cefE en las transformantes se confirmó por PCR de la manera descrita en la Publicación Internacional WO 95/04149 sobre ADN cromosómico, utilizando los cebadores 1 y 2 (véase la Tabla I) . Las transformantes positivas para expandasa se seleccionaron para llevar a cabo una selección adicional sobre la capacidad de producir cefalosporinas, de la manera descrita, por ejemplo, en la Publicación Internacional WO 95/04149. Se utilizaron transformantes para inocular matraces en agitación con medio líquido, de la manera descrita, por ejemplo en la Publicación Internacional WO 95/04149. Las transformantes se inocularon a razón de 2x1O6 conidias/ml en un medio de cultivo consistente, por ejemplo, en gramos/litro: glucosa, 30; (NH4)2S04, 10; KH2P04, 10; solución de elementos traza I (MgS04*7H20, 25; FeS04-7H20, 10; CuS04-5H20, 0.5; ZnS04 • 7H20, 2; NasS04, 50; MnS04-H20, 2; CaCl2'2H20, 5) 10 (ml/L) (pH antes de la esterilización, 6.5). El medio de cultivo se incuba durante 48-72 horas a 25-30°C y subsecuentemente se utiliza para inocular 10-20 volúmenes de un medio de producción conteniendo, en g/L: lactosa, 80; CaS04, 4; urea, 3; MgS04-7H20, 2; KH2P04, 7; NaCl, 0.5; (NH4)2S04, 6; FeS04 • 7H20, 0.1; ácido adípico, de 2 a 5; solución de elementos traza II (CuS04*5 H20, 0.5; ZnS0 -7H20, 2; MsS0 :H20, 2; Na2S0, 50), 10 (m/L) (pH antes de la esterilización, 5.5-6.0) . Posteriormente, la incubación se continúa durante otras 96-120 horas. Se analizaron los filtrados de los cultivos ya crecidos por HPLC y NMR para verificar la producción de adipoil-7-ADCA. Tal como se muestra en la Figura 3, las transformantes con la expandasa que se localiza predominantemente en el citosol, tuvieron un desempeño significativamente mejor que las transformantes de expandasa que se localizaban en el microcuerpo, EJEMPLO 4 Localización de la expandasa Con el fin de evaluar que la mutación del extremo C-terminal de la expandasa da como resultado un bloqueo en el transporte de la expandasa hacia el peroxisoma, se utilizó la técnica de microscopía electrónica. Se fijaron muestras utilizando glutaraldehído de conformidad con un procedimiento descrito por Waterham et al . , J. Cell. Biol. 127: 737-749 (1994). Los estudios de localización se realizaron utilizando inmunocitoquímica, con un anticuerpo policlonal antiexpandasa. La Figura 4 muestra si la expandasa se acumuló predominantemente en el citosol o en el microcuerpo. EJEMPLO 5 Desempeño de las mutantes de expandasa a escala mayor Para determinar el rendimiento de las transformantes con la expandasa mutada en fermentaciones a mayor escala, se seleccionaron transformantes de ambas cepas para análisis posteriores. De esta manera, se seleccionó una transformante de expandasa mutante que produce 10% más de adipoil-7-ADCA que la transformante que se seleccionó de la transformación con el gen de expandasa de tipo natural. Cuando las cepas se hicieron crecer en un fermentador de 10 L, la cantidad de adipoil-7-ADCA en el cultivo con la expandasa predominantemente localizada en el citosol fue mayor que en la fermentación en donde la expandasa se localizaba predominantemente en el microcuerpo. Así pues, la expandasa predominantemente localizada en el citosol parecer ser lo suficientemente estable para mantener una productividad estable y un rendimiento mejorado, en una fermentación de largo plazo o a gran escala. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (23)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecedente, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un fragmento de ADN aislado que codifica para una expandasa, caracterizado porque la expandasa, después de la expresión del fragmento de ADN en una célula huésped Penicillium chrysogenum, se encuentra predominantemente en el citosol del huésped.
2. 2. Un fragmento de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se ha modificado una secuencia de nucleótidos que codifica para una señal de blanco de microcuerpo carboxilo-terminal.
3. 3. Un fragmento de ADN de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia tripeptídica XI - X2 - X3 carboxilo-terminal, en donde XI es un residuo de aminoácido que se selecciona del grupo que consiste de Serina, Cisteína y Alanina, X2 es un residuo de aminoácido que se selecciona del grupo que consiste de Lisina, Histidina y Arginina, y X3 es Leucina o Alanina, ha sido modificada para prevenir sustancialmente que la expandasa se localice en los microcuerpos de la célula huésped cuando ésta es expresada en la célula huésped.
4. 4. Un fragmento de ADN de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el fragmento de ADN se obtiene de Streptomyces clavuligerus .
5. 5. Un fragmento de ADN de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia tripeptídica Serina-Lisina-Alanina carboxilo-terminal, ha sido modificada para prevenir sustancialmente que la expandasa se localice en los microcuerpos de la célula huésped cuando es expresada en la misma.
6. 6. Un fragmento de ADN de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la secuencia nucleotídica que codifica para la secuencia tripeptídica Serina - Lisina - Alanina carboxilo-terminal, ha sido modificada para obtener una secuencia nucleotídica que codifica para la secuencia tripeptídica Serina - Lisina -Ácido aspártico .
7. 7. Un fragmento de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque además comprende regiones reguladoras para la expresión del ADN en una célula huésped.
8. 8. Un fragmento de ADN de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la célula huésped se selecciona de entre los microorganismos, tal como una levadura o un hongo.
9. 9. Un fragmento de ADN de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la célula huésped es Penicillium chrysogenum.
10. 10. Una célula huésped que incorpora como resultado de una transformación, opcionalmente de un ancestro, y de manera expresable, un fragmento de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11. 11. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste de microorganismos, de preferencia un hongo que se selecciona del grupo que consiste de Penicillium chrysogenum, Aspergillus nidulans, A. niger y Acremonium chrysogenum.
12. 12. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el huésped es una cepa de Penicillium chrysogenum.
13. 13. Una célula huésped de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizada porque comprende una expandasa funcional que está localizada predominantemente en el citosol.
14. 14. Un cultivo caracterizado porque comprende una célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13.
15. 15. Un método para preparar una célula huésped de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque comprende los pasos de poner en contacto células, bajo condiciones transformantes de los huéspedes, con un ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y seleccionar una célula que haya obtenido dicho ADN.
16. 16. Un método para preparar una célula huésped de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque además comprende seleccionar una célula en donde la expandasa se localiza predominantemente en el citosol.
17. 17. Un método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la célula huésped es una célula de Penicillium chrysogenum.
18. 18. Un método para expandir el anillo de 5 miembros de un compuesto beta-lactámico para formar un compuesto de cefem de 6 miembros, en donde comprende los pasos de hacer crecer un huésped capaz de producir el compuesto beta-lactámico bajo condiciones que lo conduzcan y que le permitan al huésped expresar una expandasa heteróloga capaz de expandir el anillo de 5 miembros del compuesto beta-lactámico a partir de un fragmento de ADN que lo codifica, de tal manera que se forme el compuesto de cefem de 6 miembros, caracterizado porque la expandasa se expresa a partir de un fragmento de ADN que codifica para una expandasa que se localiza predominantemente en el citosol de la célula huésped.
19. 19. Un método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la expandasa se localiza predominantemente en el citosol debido a una modificación del fragmento de ADN que la codifica, en donde se ha modificado una señal de blanco de microcuerpo.
20. 20. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 ó 19, caracterizado porque el fragmento de ADN que codifica para la expandasa se obtiene de Streptomyces clavuligerus.
21. 21. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, caracterizado porque el huésped es Penicillium chrysogenum.
22. 22. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, caracterizado porque el compuesto beta-lactámico se selecciona del grupo que consiste de fenilacetil-6-APA, fenoxiacetil-6-APA, alfa-aminoadipoil-6-APA, adipoil-6-APA, glutaril-6-APA, suberil-6-APA, pimelil-6-APA o trans-b-hidromuconil-6-APA.
23. 23. Un método para preparar un compuesto de cefem, caracterizado porque comprende los pasos de expandir el anillo de pena del compuesto beta-lactámico, en un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 23, y recuperar el compuesto de cefem formado de esta manera.