NO315802B1 - Biologisk fremgangsmåte for fremstilling av 7-ACA og 7-ADAC - Google Patents

Description

Oppfinnelsens bakgrunn

1. Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse ligger innen området syntesefremgangsmåter for fremstilling av kommersielle cefalosporinantibiotika, av hvilke det i dag foreligger et betydelig antall fjerde generasjons terapeutiske midler. Den store variasjon i sidekjeder som finnes i kommersielle cefalosporiner og den vesentlige økonomiske betydning av cefalosporinene har gjort det å finne mer økonomiske og effektive fremgangsmåter for fremstilling av nøkkelintermediater som tillater enkel syntese av de forskjellige cefalosporiner stadig mer viktig.

En av disse nøkkelintermediater er 7-amino-cefalosporansyre (7-ACA), som kan representeres ved følgende formel:

I dag fremstilles 7-ACA fra cefalosporin C. Cefalosporin C er selv et fermenteringsprodukt som er utgangsmateriale for nær sagt alle cefalosporiner som nå finnes på markedet. Den syntetiske manipulering for fremstilling av disse forskjellige kommersielle cefalosporiner starter imidlertid i de fleste tilfeller med 7-aminocefalosporansyre, som må avledes fra cefalosporin C ved kløyving av 7-aminoadipoyl-sidekjeden. Typiske kommersielle cefalosporiner som er avledet syntetisk fra 7-ACA og som således har 3-acetyloksymetylensidekjeden, omfatter cefotaksinin, cefaloglysin, cefalotin og cefapirin.

Et annet nøkkelintermediat er 7-aminodeacetylcefalosporansyre (7-ADAC), som kan representeres ved følgende formel:

I dag fremstilles også 7-ADAC fra cefalosporin C ved fjerning av 7-D-a-aminoadipoylsidekjeden, sammen med overføring av 3-acetyloksymetylensidekjeden til 3-hydroksymetyl. 7-ADAC er en nyttig mellomforbindelse i syntesen av cefalosporiner som inneholder modifiserte substituenter i C-3-posisjonen.

I dag er den foretrukne fremgangsmåte innen faget kløyving av 7-aminoadipoylsidekjeden kjemisk. Den basiske imino-halidprosessen krever blokkering av amino- og karboksyl-gruppene i 7-aminoadipoylsidekjeden, og flere fremgangsmåter for å oppnå dette benyttes i dag. Som den benyttes nå har imidlertid den kjemiske kløyvingsprosess alvorlige ulemper. Blant disse er behovet for en flertrinns kompleks prosess, ekstremt lave temperaturer, dyre reagenser, en betydelig mengde sideprodukter som fører til problemer med hensyn til behandling av avfall, og rensingen av et meget urent utgangsmateriale før den kjemiske behandling begynner. Følgelig har det pågått en stadig søken etter en mikrobiologisk eller fermentativ prosess som kunne gi enzymatisk deacylering av cefalosporin C og dannelse av 7-aminocefalosporansyre på en mer økonomisk basis enn den kjemiske prosess som benyttes i dag.

Denne søken etter en effektiv mikrobiologisk prosess har imidlertid stort sett vist seg å være forgjeves. Dette skyldes, som litteraturen gjør det klart, strukturen, og spesielt stereokjemien, til aminoadipoylsidekjeden i cefalosporin C-molekylet, siden penicillin med hell lar seg deacylere ved enzymatisk kløyving med penicillinacylase, som fremstilles av en rekke mikroorganismer. Beskrivelser av vellykket ettrinns enzymatisk deacylering av cefalosporin C i litteraturen er på den annen side ofte ikke reproduserbare, eller gir bare svært marginale utbytter.

Foreliggende oppfinnelse gjelder følgelig fremstilling av cefalosporin-nøkkelintermediatet 7-ACA, og mer spesielt bioprosesser for fremstilling av 7-ACA.

Til dags dato har jakten på en vellykket bioprosess for fremstilling av 7-ACA stort sett vært mislykket, spesielt med tanke på fremstilling i kommersiell skala. Mens 6-aminopenicillansyre (6-APA) lar seg fremstille ved direkte fermentering og/eller ved enzymatisk behandling av penicillin G, slik at bare ringutvidelse er nødvendig for å gi 7-ADCA, har det f.eks. dessverre vist seg at Cephalosporium- eller Streptomyces-enzymene som utfører ringekspansjon i de normale metabolske veier i disse mikroorganismer ikke aksepterer 6-APA som substrat. Disse enzymer, som innen faget vises til med fellesbetegnelsen DAOCS eller ekspandase-enzym, defineres som enzymer som katalyserer ekspansjonen av penamringstrukturer som finnes i molekyler av penicillintype til cef-3-em-ringer som finnes i cefalosporinene. I det følgende vil disse enzymer bli betegnet med fellesbetegnelsen "ekspandaseenzymet".

Et substrat på hvilket ekspandaseenzymet virker er penicillin N, som ved ringekspansjon og hydroksylering gir deacetylcefalosporansyre (DAC). Her er det bare nødvendig å kløyve (D)-a-aminoadipoylsidekjede for å danne 7-ADAC, men denne sidekjede har vist seg uhyre motstandsdyktig mot enzymatisk kløyving og gir bare uakseptabelt lavt utbytte.

Ifølge foreliggende oppfinnelse har det vist seg mulig å oppnå en effektiv bioprosess i hvilken en penicillin-forbindelse (med en adipoylsidekjede) fremstilles ved en ny fermenteringsprosess i høye konsentrasjoner, hvor penicillinforbindelsen er et akseptabelt substrat for ekspandaseenzymet som fremstilles in situ av samme mikroorganisme som fremstiller penicillinforbindelsen, da den har blitt transformert til å uttrykke ekspandaseenzymet. Ekspandaseenzymet virker så ved å ekspandere ringen i penicillinforbindelsen til en cefalosporinforbindelse i høyt utbytte.

Det adipoyl-7-ADCA som fremstilles ved in situ-virkning av ekspandaseenzymet har en 3-metyl-( -CH3)-sidekjede mens 7-ACA, sluttproduktet, har en 3-acetyloksymetyl-[-CH20C(0)CH3]-sidekjede. For å overføre 3-metylsidekjeden til en 3-acetyl-oksymetylsidekjede uttrykkes ifølge foreliggende oppfinnelse også in situ ytterligere to enzymaktiviteter i tillegg til ekspandaseaktiviteten. Disse er i rekkefølge en hydroksylase og en acetyltransferase, og begge er ekspresjonsprodukter av gener med hvilke mikroorganismen som fremstiller penicillinforbindelsen også har blitt transformert. Hydroksylaseenzymet overfører 3-etylsidekjeden i adipoyl-7-ADCA til 3-hydroksymetyl, og av acetyltransferaseenzymet overfører denne 3-hydroksymetylsidekjede til 3-acetyloksymetylsidekjeden i 7-ACA.

Og, noe som er viktig i det siste, kritiske trinn i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse: sidekjeden i penicillinforbindelsen som nå er en cefalosporinforbindelse lar seg fjerne av et annet enzymsystem med overraskende høyt utbytte. Det uventede resultat av denne unike, totale bioprosess som utgjør foreliggende oppfinnelse er fremstilling av 7-ACA i overraskende høyt utbytte og tilstrekkelig økonomisk til å representere et fornuftig alternativ til de kjemiske og biokjemiske prosesseringsmetoder som benyttes i dag.

2. Kort beskrivelse av teknikkens stand

Den nye bioprosess ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en enestående og overraskende effektiv fremgangsmåte for fremstilling av 7-ACA som et økonomisk leve-dyktig alternativ til den kjemiske syntese som benyttes i dag. Stadige forsøk innen faget på å utvikle en slik bioprosess har gjentakende ganger vist seg mislykkede. F.eks. beskrives EP-A-0 422 790 DNA som koder for isopenicillin N:acyl-CoA acyl-transerfaseaktivitet fra Aspergillus nidulans og dets anvend-else for å fremstille anvendbare cefalosporiner i penicillinproduserende sopp, noe som hittil ikke har blitt oppnådd innen faget. Men dette beskrives oppnådd ved å splitte eller flytte acyltransferasegenet samtidig som gener som koder for epimerase- og ekspandase-enzymer fra cefalosporinproduserende organismer tilføres, videre oppnås tilsynelatende ikke anvendbare transformasjon- og ekspresjonsresultater. Videre ville det, selv om transformasjonen hadde vært vellykket, ikke vært anvendbart for foreliggende oppfinnelses formål, da problemet med hvordan D-a-aminoadipoylsidekjeden skal fjernes fortsatt ville gjenstå. Et slikt mislykket forsøk innen faget på å oppnå signifikante resultater for fremstilling av kommersielle cefalosporinintermediater fra penicillinproduserende sopp-kulturer står i fullstendig kontrast til resultatene som oppnås ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.

Det første enzymatiske bioprosesstrinn i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er ringekspansjonen av adipoyl-6-APA utført av et ekspandaseenzym som er ekspresjons-produktet av et ekspandasegen med hvilket den ikke-rekombinante P. chrysogenum- vext. har blitt transformert. Bruk av et slikt ekspandaseenzym er utforsket i teknikkens stand. F.eks. har Cantwell et al., -i Curr. Genet (1990) 17:213-221 foreslått en bioprosess for fremstilling av 7-ADCA ved ringekspansjonen av penicillin ved, fulgt av enzymatisk hydrolyse av det resulterende deacetoksycefalosporin V slik at 7-ADCA dannes. Dette forslag er basert tilgjengeligheten av et klonet penicillin N ekspandasegen ( cefE) fra S. clavuligerus: Kovacevic et al., J. Bacteriol. (1989) 171:754-760, og Ingolia et al. US 5 070 020. Da ekspandasen imidlertid virker på penicillin N, dens naturlige substrat, men ikke på penicillin V, krever forslaget gensløyd for fremstilling av et modifisert ekspandasegen som kan ringekspandere penicillin V. Den påkrevde modifisering ble imidlertid ikke oppnådd av Cantwell et al., og de lykkedes bare i å transformere Penlcillium chrysogenum med cefE-genet fra Streptomyces clavuligerus og oppnå ekspresjon på et lavt nivå av DAOCS (ekspandase)-enzymet.

Ekspandaseenzymet er grundig undersøkt innen faget, både når det gjelder aktivitet og genetisk sekvens. I Wolfe US 4 510 246 og 4 536 476 ble f.eks. syklase, epimerase og ring-ekspansjonsenzymer isolert separat fra et cellefritt ekstrakt av prokaryote p-laktamproduserende organismer, heriblant Streptomyces clavuligerus, slik at stabile enzymreagenser ble erholdt. Dotzlaf US 5 082 772 (EP-A-0 366 354) beskriver et isolert og renset ekspandaseenzym fra S. clavuligerus som er karakterisert, blant annet ved terminal aminosyrerest og aminosyresammensetning, og som sies å ha en molekylvekt på tilnærmet 34600 dalton. Dette står imidlertid i kontrast til molekylvekten på 29000 som er tilskrevet hva som synes å være samme enzym i US 4 536 476. EP-A-0 233 715 beskriver isolering og karakterisering ved restriksjonskartlegging med endo-nukleaser av ekspandasegenet erholdt fra S. clavuligerus og ekspresjon av rekombinant ekspandasekodende DNA (som gir aktivt ekspandaseenzym) i en S. clavuligerus- stamme som

mangler evnen til cefalosporinproduksjon. Ingolia et al., US

5 070 020 (EP-A-0 341 892) beskriver DNA-sekvensen som koder for ekspandaseenzymet fra S. clavuligerus og beskriver transformasjon av en P. chrysogenum-stamme med en ekspresjonsvektor som inneholder denne DNA-sekvens, hvorved ekspresjon av ekspandaseenzymet oppnås. Selv om det antydes at dette enzym er anvendbart for ekspansjon av andre substrater enn penicillin N foreligger ingen faktisk demonstrasjon av slik ekspansjon.

Arbeidet beskrevet ovenfor fokuserte på ekspandaseenzymet avledet fra den prokaryote S. clavuligerus. Et enzym med tilsynelatende samme ringekspansjonsaktivitet uttrykkes også av stammer av den eukaryote Cephalosporium acremonium (også kalt Acremonium chrysogenum). I slike stammer uttrykkes ekspandaseaktiviteten imidlertid av et bifunksjonelt gen ( CefEF). som også uttrykker DACS (hydroksylase)-aktiviteten hvis naturlige funksjon er overføring av desacetoksycefalosporansyre (DAOC), produktet av ekspandaseenzymet, til deacetyl-cefalosporin C (DAC). Resultatet av denne ekspresjon er et enkelt, men bifunksjonelt, ekspandase/hydroksylaseenzym. Selv om forsøk har blitt gjort på å skille aktiviteten av disse to genprodukter har ingen hittil vært vellykket. EP-A-

0 281 391 beskriver f.eks. isolering og DNA-sekvensidentifi-sering av DAOCS/DACS-genet erholdt fra C. acremonium ATCC 11550 sammen med enzymets tilsvarende aminosyresekvens. En Peniclllium transformeres og uttrykker enzymene, den forsøkte overføring av penicillinene G og V til de tilsvarende cefalosporiner demonstreres imidlertid ikke. Videre, trass i at det antydes at gensløydteknikker tilveiebringer et enkelt middel for å skille den genetiske informasjon som koder for DAOCS fra den som koder for DACS og uttrykker disse separat, beskrives ingen faktisk demonstrasjon av slik separering.

DAOCS/DACS (ekspandase/hydroksylase)-enzymet fra

C. acremonium er også grundig undersøkt innen faget, både når det gjelder aktivitet og dets karakteristika og genetiske sekvens. F.eks. behandles i Demain, US 4 178 210, 4 248 966 og 4 307 192 forskjellige utgangsmaterialer av penicillintype med et cellefritt ekstrakt fra C. acremonium som epimeriserer og ekspanderer ringen slik at et antibiotisk cefalosporinprodukt dannes. Wu-kuang Yeh US 4 753 881, beskriver C. acremojiium-enzymet med hensyn til isoelektrisk punkt, molekylvekter, aminosyrerester, forhold mellom hydroksylase- og ekspandase-aktivitetene og peptidfragmenter.

Acetyltransferaseenzymet fra C. acremonium er også beskrevet innen faget når det gjelder aktivitet, karakteristika, restriksjonskartlegging og nukleotid- og aminosyresekvenser. Se f.eks. EP-A-0 437 378 og EP-A-0 450 758.

Teknikkens stand som diskutert ovenfor behandler bare ett enkelt aspekt ved foreliggende oppfinnelse, nemlig transformasjon av en P. c/irysogenum-stamme med gener som uttrykker ekspandase- og ekspandase/hydroksylase-enzymene og oppnådd ekspresjon av disse enzymer. Man har imidlertid bare benyttet de uttrykte enzymer til ringekspansjon av penicillin N, ikke penicillinene G og V. Selv i dette tilfelle har penicillin N en sidekjede i 7-posisjonen som ikke kan kløyves enzymatisk slik at en fri aminogruppe gjenblir. Foreliggende oppfinnelse er basert på den overraskende oppdagelse at en adipoyl-sidekjede effektivt kan adderes av en P. chrysogenum-stamme, at ekspandaseenzymet uttrykt in situ kan benytte denne forbindelse effektivt som substrat for ringekspansjonen til adipoyl-7-ADCA, at hydroksylase- og acetyltransferase-enzymer likeledes uttrykt in situ kan benytte adipoyl-7-ADCA som substrat for fremstilling av 3-acetoksymetylsidekjeden i 7-ACA, og at adipoylsidekjeden deretter effektivt kan fjernes med ytterligere ett enzym slik at 7-ACA dannes. Mens forskjellige isolerte fragmenter av foreliggende oppfinnelse kan finnes innen teknikkens stand har det aldri blitt foreslått å kombinere disse for å oppnå de uventede resultater som erholdes med fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.

Produksjon av 6-adipoyl-penicillansyre er f.eks. kjent innen faget, se Ballio, A. et al., Nature (1960) 185, 97-99. Den enzymatiske ekspansjon av 6-adipoyl-penicillansyre er også kjent innen faget, men bare på in vitro-basis, se Baldwin et al., Tetrahedron (1987) 43, 3009-3014 og EP-A-

0 268 343. Videre er enzymatisk kløyving av adipoylsidekjeder også kjent innen faget, se f.eks. Matsuda et al., J. Bact.

(1987) 169, 5815-5820.

Adipoylsidekjeden har følgende struktur: C00H-(CH2 )4-C0-, mens to sidekjeder med nært beslektet struktur er glutaryl med formelen: C00H-(CH2)3-C0-, og (D)-a-aminoadipoyl med formelen: C00H-CH(NH2)-(CH2)3-C0-. Enzymatisk kløyving av glutarylsidekjeder er kjent innen faget, se f.eks. Shibuya et al., Agric. Biol. Chem. (1981) 45, 1561-1567, og US 3 960 662; Matsuda og Komatsu, J. Bact. (1985) 163, 1222-1228; Matsuda et al., J. Bact. (1987) 169, 5815-5820; JP 53-086084 (1978 - Banyu Pharmaceutical Co. Ltd.); og JP 52-128293 (1977

- Banyu Pharmaceutical Co. Ltd.). Videre beskriver EPA-A-

0 453 048 fremgangsmåter for forbedret adipoylkløyvings-aktivitet av glutarylacylase som produseres av Psevdomonas SY-77-1. Ved å substituere forskjellige aminosyrer i visse posisjoner i a-subenheten ble en tre til fem ganger høyere hastighet for adipoylkløyving (fra adipoyl-serin) observert. Det bør bemerkes at selv om EP-A-0 453 048 tilsynelatende demonstrerer en acylase med forbedret aktivitet mot adipoyl-sidekjeder beskriver den ingen måter (verken kjemiske eller ved en bioprosess som på noe vis tilsvarer den beskrevet i den foreliggende beskrivelse) ved hvilken adipoyl-cefalosporin i utgangspunktet kan dannes.

Når en (D)-a-aminoadipoylsidekjede foreliggende er det kjent innen faget først enzymatisk å fjerne aminogruppen og forkorte sidekjeden med en (D)-aminosyreoksidase slik at en gluarylsidekjede (GL-7) gjenblir, med fjerning av gluaryl-sidekjeden med nok et enzym (glutarylacylase). Slik to-trinns kløyving er beskrevet i Matsuda, US 3 960 662; EP-A-0 275 901; JP 61-218057 (1988 - Komatsu, Asahi Chemical Industry Co.); WO 90/12110 (1990 - Wong, Biopure Corp.) og EP-A-0 436 355, Isogai et al., også Bio/Technology (1991) 9, 188-191.

Det er også kjent innen faget å utføre en ett-trinns kløyving av (D)-a-aminoadipoylsidekjeden, særlig ved bruk av rekombinante teknikker. Se f.eks.:

Ettrinns ( D)- a- aminoadipoylsidek1ede- kløwina:

- JP 53-94093 (Meiji, Pseudomonas sp. BN-188); - JP 52-143289 (= US 4 141 790, Meiji, Rspergillus sp. ); - US 4 774 179 (Asahi 1988, Pseudomonas sp. SE-83 og SE-495), JP 61-21097 og Jap. 61-152286; - FR 2 241 557 (Aries 1975, Bacillus cereus var. fluorescens); - JP 52-082791 (Toyo Jozo 1977, Bacillus megaterlum NRRL B 5385); - EP-A-0 321 849 (Hoechst, Pseudomonas, Bacillus subtilis, y- ql\ xtamyl transpeptidase); - EP-A-0 322 032, EP-A-0 405 846 og US 5 104 800 (Merck, Bacillus megaterlum) ; - EP-A-0 283 218 og US 4 981 789 (Merck, Arthroiacter viscosus);

Et trinns rekombinant: Cef C -> 7- ACA

- JP 60-110292 (Asahi 1985, Comamonas, rekombinant E. coil med gen fra Comamonas sp. SY-77-1, ettrinns omdanning); - JP 61-152 286 (Asahi 1986, Pseudomonas, rekombinant E. coil med gen fra Pseudomonas sp. SE83, genetiske sekvenser beskrevet og krevd, ettrinnsprosess allerede krevd i US 4 774 179); - JP 63-74488 (Asahi 1988, Trigonopsis variabills, Comamonas, rekombinant E. coli ekspresjon av D-aminosyre-oksidasjon og GL-7-ACA acylasekonstruksjon); - EP-A-0 475 652 (Fujisawa, cefalosporin C acylase og dets fremstilling via rekombinant teknologi). Forskjellige aspekter ved fremgangsmåter for fremstilling av 7-ADAC er kjent innen faget. Se f.eks. US 3 304 236 og 3 972 774 (Eli Lilly & Co.); EP-A-0 454 478 (Shionogi & Co., Ltd.); og publisert japansk søknad nr.

04 53499 (Shionogi & Co., Ltd.).

Henvisning til innlevert søknad

Det henvises til innlevert søknad med serienummer 07/933469, innlevert 28. august 1992, som beskriver en bioprosess for fremstilling av 7-ADCA som bygger på ekspresjon av ekspandaseenzymaktiviteten i en P. chrysogenum-transformant på samme måte som i bioprosessen for fremstilling av 7-ADAC og 7-ACA som beskrives her. I den foreliggende bioprosess benyttes imidlertid ytterligere omdanninger for ekspresjon av ytterligere enzymaktiviteter for å oppnå en helt forskjellig, rekombinant metabolsk vei til distinkte sluttprodukter, av hvilke ingen antydes i den innleverte søknad.

For å forenkle en bedre forståelse av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse og henvisningene til teknikkens stand som diskutert ovenfor, beskrives like herunder de forskjellige trinn i de metabolske veier som fører til adipoyl-6-APA, adipoyl-7-ADCA, adipoyl-7-ACA og 7-ACA, mellom-produktene og enzymene som utfører de omdanninger som inngår.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse gjelder en ny biologisk fremgangsmåte for fremstilling av 7-aminodeacetylcefalosporansyre (7-ADAC) som omfatter følgende trinn: 1) dyrking i et dyrkingsmedium som er i stand til å opprettholde dens vekst av en stamme av Penicillium chrysogenum som produserer isopenicillin N, og tilsetning til dyrkingsmediet av et adipatfor som omfatter adipinsyre, dets salt og/eller estere som kan assimileres og utnyttes av Penicillium chrysogenum-stammen til fremstilling av adipoyl-6-aminopenicillansyre (adipoyl-6-APA), hvorved adipoyl-6-APA fremstilles, 2) utføring av følgende enzymatiske overføringer ved in si tu-ekspresjon av det tilsvarende gen: a) adipoyl-6-APA ringekspanderes in situ av ekspandaseenzym slik at adipoyl-7-aminodesacetoksycefalosporansyre (adipoyl-7-ADCA) dannes, hvor P. chrysogenum-stammen er transformert med DNA som koder for aktiviteten av ekspandaseenzymet som aksepterer adipoyl-6-APA som substrat, hvorved, som resultat av dets ekspresjon, adipoyl-6-APA fremstilt av stammen også deretter in situ ringekspanderes slik at adipoyl-7-ADCA dannes, b) 3-metylsidekjeden i adipoyl-7-ADCA hydroksyleres in situ av hydroksylaseenzym slik at adipoyl-7-aminodeacetylce falosporansyre (adipoyl-7-ADAC) dannes, hvor P. chrysogenum-stammen er transformert med DNA som koder for aktiviteten av hydroksylaseenzymet som kan akseptere adipoyl-7-ADCA som substrat, hvorved, som et resultat av ekspresjonen, adipoyl-7-ADCA fremstilt av stammen også deretter hydroksyleres in situ slik at adipoyl-7-ADAC dannes, og (3) behandling av adipoyl-7-ADAC med en adipoylamidase, hvorved adipoylsidekjeden fjernes og 7-ADAC-produktet dannes, hvoretter dette produkt isoleres.

Foreliggende oppfinnelse gjelder videre en ny biologisk fremgangsmåte for fremstilling av 7-aminocefalosporansyre (7-ACA) som omfatter følgende trinn: 1) dyrking i et dyrkingsmedium som er i stand til å opprettholde dens vekst av en Penicillium chrysogenum-stamme som produserer isopenicillin N, og tilsetning til dyrkingsmediet av et adipatfor som omfatter adipinsyre, dets salter og/eller estere som kan assimileres og utnyttes av Penicillium chrysogenum-stammen til fremstilling av adipoyl-6-aminopenicillansyre (adipoyl-6-APA), hvorved adipoyl-6-APA dannes, 2) utføring av de følgende enzymatiske omdanninger ved in situ-ekspresjon av det tilsvarende gen: a) adipoyl-6-APA ringekspanderes in situ av ekspandaseenzym slik at adipoyl-7-aminodesacetoksycefalosporansyre (adipoyl-7-ADCA) dannes, hvor P. chrysogenum-stammen er transformert med DNA som koder for aktiviteten av ekspandaseenzymet som kan akseptere adipoyl-6-APA som substrat, hvorved, som et resultat av ekspresjonen, adipoyl-6-APA fremstilt av stammen også deretter ringekspanderes in situ slik at adipoyl-7-ADCA dannes, b) 3-metylsidekjeden i adipoyl-7-ADCA hydroksyleres in situ av hydroksylaseenzym slik at adipoyl-7-aminodeacetylcefalosporansyre (adipoyl-7-ADAC) dannes, hvor P. chrysogenum-stammen er transformert med DNA som koder for aktiviteten av hydroksylaseenzymet som kan akseptere adipoyl-7-ADCA som substrat, hvorved, som et resultat av dets ekspresjon, adipoyl-7-ADCA produsert av stammen også deretter hydroksyleres in situ slik at adipoyl-7-ADAC dannes, og c) adipoyl-7-ADAC acetyleres in situ av acetyltransferaseenzym slik at adipoyl-7-aminocefalosporansyre (adipoyl-7-ACA) dannes, hvor P. chrysogenum-stammen er transformert med DNA som koder for aktiviteten av acetyltransferaseenzymet, som kan akseptere adipoyl-7-ADAC som substrat, hvorved, som et resultat av dets ekspresjon, adipoyl-7-ADAC produsert av stammen også deretter acetyleres in situ slik at adipoyl-7-ACA dannes, og 3) behandling av adipoyl-7-ACA med en adipoylamidase,

hvorved adipoylsidekjeden fjernes og 7-ACA-produktet dannes, hvoretter dette produkt isoleres.

Som benyttet heri har følgende begreper de angitte betydninger: "7-ACA" betyr 3-[(acetoyloksy)-metyl]-7-amino-8-oksy-5-tia-l-azabisyklo[4.2.0]okt-2-en-2-karboksylsyre,

" adipoyl - 6 - APA" betyr [2S-(2a, 5a, 6]3) ] -3, 3-dimetyl-7-okso-6-[heksan-1,6-dioyl)amino]-4-tia-l-azabisyklo[3.2.0]-heptan-2-karboksylsyre,

"adipoyl-7-ADCA" betyr 3-metyl-7-[(heksan-1,6-dioyl)-amino]-3-metyl-8-okso-5-tia-l-azabisyklo[4.2.0]okt-2-en-2-karboksy1syre, og

"adipoyl-7-ADAC" betyr 3-hydroksymetyl-7-[(heksan-1, 6-dioyl)amino]-3-metyl-8-okso-5-tia-l-azabisyklo[4.2.0]okt-2-en-karboksylsyre.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Den viktigste side ved foreliggende oppfinnelse er en ny bioprosess for fremstilling av 7-aminocefalosporansyre (7-ACA) og 7-aminodeacetylcefalosporansyre (7-ADAC), som er nøkkelintermediater i fremstillingen av syntetiske kommersielle cefalosporiner og som kan representeres ved følgende strukturformler:

I tillegg til cefalosporinkjernen er de karakteristiske egenskaper ved 7-ACA 7-aminogruppen og 3-acetyloksymetyl- (eller 3-acetoksymetyl, som den oftere kalles) gruppen. 7-aminogruppen kan omvandles til et stort antall derivatiserte sidekjeder, og således danne basis for syntese av forskjellige kommersielle cefalosporiner. 3-acetyloksymetylgruppen vil ofte konverteres til en annen sidekjede ved syntese av et kommersielt cefalosporin.

Sluttproduktet 7-ACA og mellomproduktet adipoyl-7-ACA i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse står i kontrast til cefalosporin C, nok et viktig cefalosporininter-mediat, som kan representeres ved følgende strukturformel:

I dette intermediat er 7-(D)-a-aminoadipoylsidekjeden ikke tilgjengelig for ytterligere syntetisk derivatisering, og må kløyves for å gi den aksepterbare 7-aminogruppe. Uheldigvis har 7-(D)-a-aminoadipoylsidekjeden alltid vist seg vanskelig å fjerne, både ved kjemiske og biokjemiske midler.

Definisjoner

Som benyttet i foreliggende beskrivelse, og spesielt i seksjonen kalt beskrivelse av foretrukne utførelser, har følgende begreper de angitte betydninger:

7-ACA 7-aminocefalosporansyre

7-ADAC 7-aminodeacetylcefalosporansyre 7-ADCA 7-aminodesacetoksycefalosporansyre 6-APA 6-aminopenicillansyre

DAOC Desacetoksycefalosporansyre

DAOCS DAOC-syntetase

DAC Deacetylcefalosporin C

DACS DAC-syntase

IPNS Isopenicillin N-syntetase

Tris Tris[hydroksymetyl]aminometan

EDTA Etylendiamintetraeddiksyre

DEPC Dietylpyrokarbonat

TE Tris/EDTA-buffer

SSC Salt (natriumklorid), natriumsitratbuffer SDS Natriumdodecylsulfat

PEG Polyetylenglykol

Dyrking av Penicillium chrysogenum

Første trinn i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter dyrking av en Penicillium chrysogenum-stamme som produserer isopenicillin N i et dyrkningsmedium i stand til å opprettholde dens vekst, og tilsetning til dyrkingsmediet av adipatfår, som omfatter adipinsyre, dens salter og/eller estere, som kan assimileres og benyttes av Penicillium chrysogenum-stammen for fremstilling av adipoyl-6-APA. Adipatf6ret kan tilsettes til dyrkingsmediet etter inokulering med P. chrysogenum, men det foretrekkes at det allerede foreligger i dyrkingsmediet når inokulasjonen finner sted.

Andre slekter enn Penicillium, f.eks. Aspergillus nidulans, så vel som andre arter av slekten Penicillium enn chrysogenum-arten, fremstiller isopenicillin N. Historisk sett har imidlertid de stammer som produserer mest isopenicillin N alle blitt utviklet ved velkjente teknikker for stammeforbed-ring fra chrysogenum-arten. Av praktiske grunner har derfor foreliggende oppfinnelse blitt begrenset til Penicillium chrysogenum-stammer, selv om dens anvendbarhet på andre arter er åpenbar. Enhver deponert Penicillium chrysogenum-stamme eller annen offentlig tilgjengelig kilde for en slik stamme er et egnet utgangspunkt for å utføre fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.

Dyrkningsmediet som kan opprettholde vekst av en Penicillium chrysogenum-stamme som produserer isopenicillin N er av den type som enhver fagmann med vanlige kunnskaper kjenner. Dyrkningen vil f.eks. bli utført ved neddykket aerob fermentering, og det anvendte medium kan velges fra et stort antall tilgjengelige, egnede medier. Typiske medier benytter karbonkilder som sukrose, glukose og stivelse, nitrogenkilder som soyamel og -grøp, bomullsfrøolje, peanøttmasse og forskjellige aminosyrer, blandinger av disse og peptoner. Produk-sjonskrav legger vekt på utbytte og enkel isolering, og foretrukne medier i slike situasjoner kan således være melasse som karbonkilde og soyamel og aminosyrer som nitrogenkilde.

Uorganiske næringssalter tilsettes vanligvis til dyrkingsmediet, og omfatter salter som kan gi følgende ione-komponenter: natrium, kalium, ammonium, kalsium, fosfat, sulfat, klorid, bromid, nitrat, karbonat, treverdig jern, toverdig jern, magnesium, mangan og så videre. Sporelementer er også vanligvis nødvendige for vekst, utvikling og metabol-isme i Penicillium chrysogenum, og kan tilsettes direkte til dyrkningsmediet med mindre de allerede foreligger som forurensninger i andre bestanddeler i dyrkingsmediet.

Penicillium chrysogenum-stammene kan dyrkes i utstyr med lite volum, f.eks. i én-liters risteflasker, dersom det ønskes produksjon av bare små mengder adipoyl-7-ACA, og til slutt 7-ACA. Dersom større mengder adipoyl-7-ACA ønskes vil imidlertid fermenteringstanker i stor skala og betingelser for neddyrket aerob fermentering benyttes.

Ved fremstilling av adipoyl-7-ACA i stor skala bibeholdes sporer av Penicillium chrysogenum-stammen på skråagar. Sporene fra agaren benyttes til inokulering av et liten volum med vegetativt medium. Det vegetative medium inkuberes slik at en tett, fersk, aktivt voksende kultur av mikroorganismen erholdes. Denne vegetative kultur benyttes så som inokulum for storskalafermenteringsmediet. I visse tilfeller kan det være ønskelig å innbefatte nok et vegetativt medium som inokulum for fermenteringsmediet. Slike annen-trinns vegetative medier benyttes vanligvis når volumet av fermenteringsmediet er vesentlig større enn det første vegetative medium. På denne måte dyrkes mikroorganismens sporer først i et lite volum vegetativt medium slik at inokulum for et vegetativt medium med større volum erholdes. Det store volum med vegetativt medium gir så en tilstrekkelig konsentrasjon av mikroorganismer til å kunne starte en rask fermenteringsstart i storskala-fermenteringstanken. Det vegetative medium kan ha samme sammensetning som fermenteringsmediet, eller det kan inneholde ytterligere bestanddeler for å fremme vekst og utvikling av mikroorganismen i liten skala.

Penicillium chrysogenum-artene som benyttes i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse dyrkes mest effektivt ved temperaturer mellom tilnærmet 20 og 30 °C, men opti-malt utbytte vil oppnås når temperaturen mellom tilnærmet 22 og 28 °C, fortrinnsvis tilnærmet 25 °C.

Maksimal produksjon av adipoyl-7-ACA oppnås når Penicillium chrysogenum-stammen dyrkes i storskala-tanker i et tidsrom på mellom tilnærmet 10 og 30 dager, fortrinnsvis 15 til 25 dager. Ved dyrking i utstyr med liten skala, f.eks. 250 ml risteflasker, er mikroorganismens vekst raskere og den produserer adipoyl-7-ACA på kortere tid, f.eks. 4 til 15 dager, ofte 5 til 7 dager.

Dersom slutt-pH i fermenteringstanker av stor skala nå 8,0 eller høyere kan dette ha uheldig virkning på utbyttet av adipoyl-7-ACA. I slike situasjoner er det ønskelig å følge pH i dyrkningsmediet gjennom fermenteringen. Dersom det synes som om pH vil nå et slikt nivå før det tidspunkt hvor maksimal produksjon av adipoyl-7-ACA forekommer, kan pH enkelt justeres nedover ved tilsetning av en egnet syre eller buffersubstans til fermenteringsmediet.

Produksjonen av adipoyl-7-ACA kan følges ved kromato-grafisk analyse av prøver fra fermenteringsbrygget.

Som i de fleste neddykkede aerobe fermenteringer passeres steril luft gjennom dyrkingsmediet for å oppnå mer effektiv vekst av Penicillium chrysogenum-stammen og forhøyet produksjon av adipoyl-7-ACA. Luftvolumet som presses gjennom dyrkningsmediet er vanligvis minst tilnærmet 0,2 volumer luft pr. minutt pr. volum dyrkingsmedium. En høyere luftgjennom-strømning kan imidlertid ofte ha gunstig virkning på produksjonen av adipoyl-7-ACA.

Penicillium chrysogenum-stammen vil typisk produsere mange biprodukter og metabolitter i tillegg til adipoyl-7-ACA. Da noen av disse er syrelabile er det, ved gjenvinning av adipoyl-7-ACA fra fermenteringsmediet, ønskelig å behandle hele fermenteringskulturen ved sur pH i et kort tidsrom for å ødelegge noen av disse samtidig fremstilte urenheter. Adipoyl-7-ACA-fermenteringsproduktet gjenvinnes fra det således behandlede, filtrerte fermenteringsbrygg, og kan om ønskelig skilles fra de andre bestanddeler i fermenteringsmediet ved kromatografi over en ionebytterharpiks, og kan om nødvendig renses ytterligere ved kromatografi før den påfølgende enzymatiske kløyving av adipoylsidekjeden. Det er også mulig å utføre slik separasjon ved ionebytterkromatografi etter at sidekjedekløyvingen er utført. Ett av hovedbiproduktene som gir separasjonsproblemer er adipoyl-6-APA, og det er mulig å degradere dette biprodukt kjemisk eller enzymatisk for å forenkle separasjonen. Først utsettes det filtrerte fermenteringsbrygg for en foreløpig renseprosedyre som kan omfatte en innledende ekstraksjon med et vannuløselig organisk løse-middel, f.eks. n-butanol eller amylacetat, for å fjerne urenheter. Det ekstraherte brygg kan så gis en innledende rensing ved kromatografi over aktivert karbon.

Tilsetning av adipatfdr

Adipatfor tilsettes fortrinnsvis til de andre ingrediensene i fermenteringsdyrkningsmediet når fermenteringskulturen for Penicillium chrysogenum etableres som beskrevet ovenfor, dvs. forut for inokuleringen. Eventuelt kan adipatf6ret tilsettes noen tid etter inokulering, f.eks. 1, 2 og/eller 3 dager etter inokulering. Adipatforet defineres som én eller flere av gruppen adipinsyre, eller salter eller estere av adipinsyre som kan assimileres og utnyttes av Penicillium chrysogenum-stammen som dyrkes for fremstilling av adipoyl-6-APA. Adipinsyren, saltene og esterne kan benyttes alene eller i enhver kombinasjon. Dinatriumsaltet foretrekkes, selv om kalium og blandede salter med natrium også ville være anvendbare. Metylesteren kan benyttes, men etylestere er vann-uløselig. Adipinsyresaltet eller -esteren må være slik at det kan assimileres og utnyttes av Penicillium chrysogenum-stammen til dannelse av adipoyl-6-APA. F.eks. kan adipinsyre selv være anvendbart, selv om den er vannuløselig, dersom et assimiler-bart salt dannes under passende pH-betingelser.

Egnede ekspandase og/ eller hydroksylase- enzymer

Penicillium chrysogenum-stammen som er dyrket og for-synt med adipatf6r som beskrevet ovenfor slik at den produserer adipoyl-6-APA er også transformert med DNA som koder for aktiviteten av ekspandase- og hydroksylase-enzymene, hvorved, som et resultat av dets ekspresjon, adipoyl-6-APA ringekspanderes in situ slik at adipoyl-7-ADCA dannes, og 3-metylsidekjeden overføres også til 3-hydroksymetyl.

Adipoyl-6-APA produseres intracellulært av Penicillium chrysogenum dyrket med adipatfor. I dette intra-cellulære miljø, dvs. på en in situ-basis, uttrykker den transformerte Penicillium chrysogenum også DNA som koder for aktiviteten av ekspandase- og hydroksylaseenzymene, hvorved enzymene virker på adipoyl-6-APA som substrat og ringekspan-derer det slik at adipoyl-7-ADCA dannes, som så hydroksyleres til adipoyl-7-ADAC (adipoyl-7-aminodeacetylcefalosporansyre).

Den nye bioprosess ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter innen sitt område transformasjon av en Penicillium chrysogenum-stamme av typen beskrevet ovenfor med ethvert DNA som koder for aktiviteten av ekspandase- og hydroksylase-enzymene, hvorved, som et resultat av deres ekspresjon, adipoyl-6-APA ringekspanderes in situ slik at adipoyl-7-ADCA dannes, og deretter hydroksyleres slik at adipoyl-7-ADAC dannes. Det DNA med hvilket Penicillium chrysogenum transformeres må således uttrykke enzymer med ikke bare aktiviteten til ekspandaseenzymet som kjent innen faget, dvs. evnen til ringekspansjon av isopenicillin N til DAOC, men evnen til ringekspansjon av adipoyl-6-APA til adipoyl-7-ADCA. I tillegg må hydroksylaseenzymet være i stand til å hydroksylere adipoyl-7-ADCA til adipoyl-7-ADAC.

To alternative tilnærminger anses for egnede utfør-elser innen foreliggende oppfinnelses område, når det gjelder måten på hvilken ekspandase- og hydroksylase-enzymaktivitetene tilveiebringe. I én utførelse, som foretrekkes, oppnås ekspandase- og hydroksylasefunksjonene ved aktiviteten uttrykt av ett enkelt, men i det vesentlige bifunksjonelt, gen fra Cephalosporium acremonium, med hvilket P. chrysogenum er transformert. Dette gen, som uttrykker både ekspandase- og hydroksylaseaktivitetene sammen, vil bli referert til som ekspandase/hydroksylasegenet, liksom dets genprodukt, ekspandase/hydroksylaseenzymet (enzymene). Når P. chrysogenum er transformert med DNA fra C. acremonium som koder for ekspandase/hydroksylaseaktiviteten vil typisk ekspresjonen av denne aktivitet kontrolleres av én enkelt promotersekvens, noe som tyder for nærvær av ett enkelt gen.

En alternativ utførelse av foreliggende oppfinnelse som er like godt egnet omfatter transformasjon av P. chrysogenum- verten med DNA som koder for ekspandase- og hydroksylaseaktivitetene som separate gener, i motsetning til ett enkelt ekspandase/hydroksylasegen. Det bør bemerkes at separate ekspandase- og hydroksylasegener og de tilsvarende enzymatiske aktiviteter for hvilke de koder finnes i prokaryote mikroorganismer som S. clavuligerus, snarere enn i eukaryote mikroorganismer som C. acremonium, som koder for ett enkelt ekspandase/hydroksylase-gen og -enzym, som allerede bemerket ovenfor.

Sekvensen av det prokaryote hydroksylaseenzym og nukleotider som koder for dette er beskrevet i Kovacevic, et al., J. Bacteriol., 173(1), 398-400 (1991) og EP-A-0 456 189, sammen med fremgangsmåtene for isolering av dette enzym. Som den erfarne fagmann vil forstå er det mulig fra hydroksylasens sekvens å syntetisere, ved velkjente manuelle metoder eller automatiserte DNA-syntesemaskiner, DNA som koder for hydroksylaseenzymet. DNA-forbindelsen, eller alternative sekvenser som koder for den samme hydroksylase-aminosyresekvens, eller fragmenter eller derivater av denne med ekvivalent hydroksylase-aktivitet kan i sin tur benyttes som utgangspunkt for fremstilling av forskjellige klonings- og ekspresjonsvektorer når den kombineres med promoter- og andre regulatoriske sekvenser, med hvilke det så er mulig å transformere P. chrysogenum-verten for ekspresjon av hydroksylaseenzymet og således utføre fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. Det er også mulig å benytte DNA-forbindelsen som en probe for gjennom-søkning av det genomiske bibliotek fra en kandidatstamme som kan tenkes å inneholde et anvendbart hydroksylaseenzym, for identifisering av homologe sekvenser ved hybridisering. Aktiviteten av en mulig hydroksylase identifisert på denne måte kan bekreftes ved å benytte det aktuelle adipoyl-7-ADCA-substrat i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, og isolere hydroksyleringsproduktet ved HPLC.

Når denne utførelse av foreliggende oppfinnelse benyttes, dvs. ett enkelt gen som kun uttrykker hydroksylase-aktivitet, vil det være nødvendig i tillegg å skaffe DNA som koder for aktiviteten av ekspandaseenzymet, slik at P. chrysogenum kan transformeres med en egnet ekspresjonsvektor som tillater in situ-ekspresjon av ekspandasefunksjonen, for å tilveiebringe ringekspansjonstrinnet i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. Mange ekspandaseenzymer er kjent, og basert på sidekjedelikheter antas det at mange ekspandase-enzymer vil kunne virke i den nye bioprosess ifølge foreliggende oppfinnelse.

Andre anvendbare utførelser av foreliggende oppfinnelse er basert på det faktum at DNA som koder for aktiviteten av mer enn én ekspandase og/eller mer enn én hydroksylase kan benyttes for å transformere den ikke-rekombinante P. chrysogenum-stamme. Med slike utførelser er det mulig å oppnå forsterket ekspandase- og/eller hydroksylase-aktivitet, grunnet de forhøyede mengder av enzymatisk protein som uttrykkes.

Det har allerede blitt bemerket i seksjonen som beskriver teknikkens stand at ekspandaseenzymet avledet fra

Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 er fullstendig sekvensert og karakterisert ved endonuklease-restriksjonskartlegging. Noe som synes å være samme enzym, avledet fra S. clavuligerus NRRL 3585 har ifølge rapporter en annen molekylvekt, men har ikke blitt sekvensert. Og, som også beskrevet ovenfor i seksjonen som omhandler teknikkens stand, DAOCS/DACS-enzymet fra Cephalosporium acremonium ATCC 11550 er sekvensert [Samson et al., Bio/Technology (1987)' 5: 1207-1214, og EP-A-0 281 391].

Disse ekspandaseenzymer som allerede er identifisert i teknikkens stand er anvendbare i den nye bioprosess ifølge foreliggende oppfinnelse. Andre ennå ikke identifiserte ekspandaseenzymer, avledet fra forskjellige stammer av S. clavuligerus eller C. acremonium, eller til og med fra mikroorganismer fra forskjellige slekter, kan også vise seg egnet for utførelse av den nye bioprosess ifølge foreliggende oppfinnelse. Fremgangsmåten for identifisering av slike nye stammer og slekter av anvendbare mikroorganismer og for isolering av de antatte ekspandaseenzymer og fastslåelse at de er egnet til bruk i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er ukompliserte, og ligger godt innen fagmannens kunnskapsområde. Gjennomsøkning av cellefrie ekstrakter fra nye kandidatstammer og -slekter av anvendbare mikroorganismer kan utføres på pålitelig og reproduserbar måte ved tilsetning av ekstraktene til adipoyl-6-APA-substratet i nærvær av kjente kofaktorer for DAOCS, som omfatter toverdige jernioner (Fe2+) , askorbat, a-ketoglutarat og adenosintrifosfat (ATP). Adipoyl-6-APA kan fremstilles i tilstrekkelige mengder ved tilsetning av et adipatfor til en ikke-transformert Penicillium chrysogenum på en måte som tilsvarer den beskrevet i detalj videre nedenfor. Det ønskede ekspandase- (eller ekspandase/hydroksylase-) enzym foreliggende dersom adipoyl-7-ADCA og/eller adipoyl-7-ADAC dannes, av hvilke forekomsten kan påvises ved kromatografi.

Det er også mulig ved velkjente rekombinantteknikker å lage DNA-prober basert på nukleotidsekvensene til ekspan-dasegenene fra f.eks. S. clavuligerus og C. acremonium, tor gjennomsøkning av DNA-innholdet fra en kandidat-mikroorganisme som kan tenkes å produsere en ekspandase egnet til bruk i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.

Mulige kilder for ekspandase-, hydroksylase og ekspandase/ hydroksylase- enzymer

Som allerede nevnt er ekspandaseenzymer enzymer som katalyserer ekspansjonen av penam-ringstrukturer (som finnes molekyler av penicillintype) til cef-3-em-ringer (som finnes i cefalosporinene). Enhver organisme som danner metabolitter som inneholder en cefemring er således en mulig kilde for et ekspandasekodende DNA. Likeledes er enhver organisme som produserer cefalosporiner som inneholder en 3-hydroksymetyl-gruppe en mulig kilde for hydroksylase- (eller ekspandase/hydroksylase-) kodende DNA. Eksempler på slike organismer er gitt nedenfor, men denne liste gir kun eksempler og skal ikke anses som utfyllende: SOPP Cephalosporium acremonium Cephalosporium sp. Emericellopsis Paeci1omyces Scopulariopsis Diheterospora

Spiroidium

Anoxiopsis

ACTINOMYCETES

Streptomyces clavuligerus S. lipmanii

S. wadayamensis

S. todorominensis

S. filipinensis cephamycini S. heteromorphus

S. panayensis

S. griseus

S. cattleya

Nocardia lactamdurans

ANDRE BAKTERIER

Flavobacterium sp. Alcaligenes denitrificans Mycoplana bullata Providencia rettgeri Lysobacter lactamgenus

Ekspandasene og hydroksylasene fra organismene ovenfor er kun kandidater for videre undersøkelser, og det kan tenkes at ikke alle vil være egnet i den nye prosess ifølge foreliggende oppfinnelse.

Isolering av DNA- fragmenter som koder for ekspandaseaktivitet

Når først nærvær av et ønsket ekspandaseenzym er påvist på måter som angitt ovenfor er fremgangsmåter for isolering av det DNA som koder for ekspandase-enzymaktiviteten også rett-frem og velkjent innen faget. Det konstrueres DNA-prober basert på de kjente sekvenser og partielle sekvenser til de gener som koder for ekspandaseenzymene, og som vil hybridisere til det ønskede enzymkodende DNA som skal isoleres. Konstruksjonen av slike prober baseres på kjennskap til aminosyre- og nukleotidbasesekvensen som koder for ekspandaseenzymet, så vel som på kodonpreferansene til den spesielle mikroorganisme det gjelder. En detaljert beskrivelse av typiske fremgangsmåter av denne art, anvendt på genomisk DNA fra Streptomyces clavuligerus ATCC 27064, beskrives videre nedenfor.

Isolering av det DNA som koder for ekspandaseenzymaktiviteten oppnås ved bruk av restriksjon- og ligeringsfrem-gangsmåter velkjent innen rekombinant DNA-teknologien. Det er nødvendig å ha et endonuklease-restriksjonskart over genomet til mikroorganismen det gjelder, slik at det rette restrik-sjonsfragment kan fremstilles og isoleres. Restriksjonskart for S. clavuligerus og C. acremonium foreligger allerede, således benyttes for de første restriksjonsenzymene BamHI og Sal I, og elektroforese tilveiebringer de ønskede fragmenter på 1,8 til 2,2 kb.

Kilder for acetyltransferaseenzym og isolering av DNA- fragmenter som koder for denne aktivitet

Kloning av DAC acetyltransferasegenet fra C. acremonium kan utføres ifølge rekombinante teknikker velkjent innen faget, som beskrives i generelle termer like nedenfor.

For å klone acetyltransferasegenet må først mutanter av C. acremonium, med manglende evne til overføring av deacetylcefalosporansyre (DAC) til cefalosporin C, frem-bringes. En slik prosess omfatter behandling av C. acremonium-celler med mutagener som N-nitrosoguanidin (NTG), salpetersyr-ling eller ultrafiolett lys, gjennoppfrisking på et egnet vekstmedium og deretter analyse ved f.eks. kromatografiske

eller biologiske midler for akkumulering av DAC.

Etter identifisering av en egnet mutant er neste trinn for identifisering av genet som koder for acetyltrans-ferasen isolering av C. acremonium-DNA fra en cefalosporin C-produserende stamme. Etter kløyving, enten med restriksjons-endonukleasekutting eller mekanisk kutting, til fragmenter av egnet størrelse, inkorporeres det i plasmid- eller kosmid-transformasjonsvektorer som også inneholder et egnet dominant markørgen, som f.eks. genet for hygromycin- eller fleomycin-resistens. Vektoren bør også inneholde DNA-sekvenser som forenkler den påfølgende gjenvinning av det innsatte DNA, f.eks. lambda (fag) cos-seter, som tillater gjenvinning av klonet DNA ved in vitro-pakking fulgt av inspeksjon av E. coli, som kan utføres ved veletablerte fremgangsmåter.

Protoplaster av acetyltransferase-minus-mutantstammen transformeres så med vektorene som inneholder tilfeldige fragmenter av genomisk DNA, og transformanter utvelges på basis av antibiotikaresistens. Transformanter kan så analyseres for gjenopprettet cefalosporin C-produksjon, da dette er en indikasjon på vellykket komplementering med et vektorbåret acetyltransferasegen. Mutanter som antas å inneholder klonede kopier av genet kan så dyrkes, deres DNA isoleres og vektor-DNA gjenvinnes ved fremgangsmåten opptrukket ovenfor. Bekreftelse av at vektoren virkelig inneholder acetyltransferasegenet oppnås ved subkloning i E. coli ved bruk av gjengse fremgangsmåter og lett tilgjengelige vektorer, fulgt av retransforma-sjon av acetyltransferase-minus-mutanten. Genet kan så isoleres, sekvenseres og manipuleres som beskrevet i arbeidseksemplene heri, ved bruk av teknikker som benyttes rutine-messig av gjennomsnittsfagkyndige innen molekylærgenetikken.

Ved å følge alternative fremgangsmåter, også velkjente innen faget, isolerte og sekvenserte Matsuda et al. genet som koder for acetyltransferaseaktiviteten fra C. acremonium, så vel som den utledete aminosyresekvens til enzymet selv, som beskrevet i EP-A-0 450 758. Disse alternative fremgangsmåter bestod av isolering av acetyltransferaseenzymet, N-terminal aminosyresekvensering, og fra denne informasjon utledning av nukleotidsekvensen som koder for denne del av enzymet. Fra denne informasjon lages så prober som hybridiserer til den fullstendige kodende sekvens og tillater dens isolering.

Transformasjon av Penicillium chrysogenum - stammen

Når først DNA-fragmentene som koder for ekspandase/hydroksylase-, ekspandase- og hydroksylase-, og acetyl-transf erase- aktivitetene er erholdt kan de innsettes (ligeres) i et plasmid eller en annen ekspresjonsvektor, sammen med DNA-fragmenter som omfatter promotere, translasjonsaktiverende sekvenser, resistensmarkører, regulatoriske sekvenser, kosmid-dannere og enhver annen DNA-sekvens som tillater eller fremmer transformasjon, driver ekspresjon av genproduktene og forenkler isolering av transformantene. Ekspresjonsvektoren konstruert på denne måte benyttes så for å oppnå transformasjon av Penicillium chrysogenum-stammen og intracellulær ekspresjon av aktiviteten til ekspandase/hydroksylase-, ekspandase- og hydroksylase-, og acetyltransferase-enzymene. Teknikkene som benyttes for å oppnå transformasjon og ekspresjon er velkjent innen faget, og en detaljert beskrivelse av slike typiske fremgangsmåter blir gitt nedenfor.

Som allerede beskrevet i detalj ovenfor uttrykker den transformerte Penicillium chrysogenum-stammen aktiviteten til ekspandase/hydroksylase-, ekspandase- og hydroksylase-, og acetyltransferase-enzymene intracellulært, disse virker så in situ på adipoyl-6-APA-substratet slik at det ringekspanderes til adipoyl-7-ADCA, hydroksylerer dette til adipoyl-7-ADAC som så acetyleres til adipoyl-7-ACA.

Ny transformant

De spesifikke Penicillium chrysogenum-transformanter som uttrykker aktivitetene kodet av ekspandase/hydroksylase-og ekspandase/hydroksylase- pluss acetyltransferase-genene som er de foretrukne utførelser av foreliggende oppfinnelse, er nye sammenlignet med lignende konstruksjoner innen teknikkens stand, som f.eks. de i Cantwell et al. (1990) Current Genetics, 17, 213-221, EP-A-0 281 391 og EP-A-0 437 378. Cantwell-konstruksjonen har ekspandasegenet fra Streptomyces clavuligerus plassert under kontroll av isopenicillin N syntetase (IPNS) -promoteren fra P. chrysogrenum, og skiller seg således fra konstruktene i foreliggende tilfelle ved at den mangler DNA som koder for hydroksylase- eller acetyltransferase-aktiviteter.

Ingolia et al. i EP-A-0 281 391 beskriver P. chrysogenum-transformasjonsvektorer som inneholder DNA som koder for det difunksjonelle ekspandase/hydroksylaseenzym fra C. acremonium, med ekspresjon drevet av IPNS-promoteren fra Penicillium. I én av disse konstruksjoner (pPS62) er ekspandase/hydroksylasegenet innsatt nedenfor og i samme leseramme som hygromisinfosfotransferasegenet. Genproduktet, et hygro-micinfosfotransferase::ekspandase/hydroksylase-fusjonsprotein, skiller seg fra produktet ifølge foreliggende oppfinnelse, et ekspandase/hydroksylaseenzym som i det vesentlige er identisk med det produsert C. acremonium. Den andre vektor som beskrives i EP-A-0 281 391 ble konstruert ved en omfattende serie av molekylære manipulasjoner, heriblant bruk av syntetiske DNA-linkere. Sluttkonstruksjonen (pPS61) benytter Ncol-fragmentet på 1,2 kb fra IPNS-promoteren fra Penicillium for ekspresjon av ekspandase/hydroksylasegenet, og acetamidase-genet fra Aspergillus nidulans som selekterbar markør for transformasjon av Penicillium. Sekvensen for kodonene 9 og 10 i ekspandase/hydroksylasegenet som koder for henholdsvis arginin og leucin er endret fra CGTCTC to CGCCTA, noe som ikke endrer den kodete aminosyresekvens.

I konstruksjonen ifølge foreliggende oppfinnelse ble Ncol-fragmentet på 1,2 kb fra IPNS-promoteren koblet til ekspandase/hydroksylasegenet uten endring av den native ekspandase/hydroksylasegensekvens. IPNS-promoteren som ble benyttet i konstruksjonen ifølge foreliggende oppfinnelse har to separate duplikasjoner på fire baser sammenlignet med den native promoter, én ved SalI-setet 760 bp oppstrøms for ATG-startkodonet, og den andre ved Xbal-setet fem basepar opp-strøms for startkodonet og inne i den 5<1->ikke-translaterte ledersekvens. Disse endringer påvirker ikke det høye ekspresjonsnivå for ekspandase/hydroksylasegenet.

Nok en forskjell i vektorene ligger i de benyttede seleksjonsmarkører. Konstruktene beskrevet i EP-A-0 281 3 91 benytter acetamidase og hygromycin som seleksjonsmarkører. Dette står i kontrast til ekspandase/hydroksylase- Penicillium-transformasjonsvektoren benyttet i foreliggende oppfinnelse (pPEN/CEPH-1), som inneholder pleomycin-resistensmarkøren. En Penicillium chrysogenum-stamme transformert med vektor pPEN/CEPH-1 og i stand til å uttrykke ekspandase/hydroksylase-aktivitet har blitt identifisert som PC200. Dens taksonomiske egenskaper omfatter typisk produksjon av vidtspredende kolonier med blågrønn til grønn farge, glatt fløyelsaktige med gule dråper, revers gult diffunderende inn i agaren, for-grenete sporehoder med alle deler glatte, elliptiske til kule-formede sporer 3-4 um lange. Akseptable dyrkningsbetingeIser for P. chrysogenum benytter et fast medium som inneholder 1,5 % (vekt/vol) laktose-monohydrat, 0,5 % (vol/vol) maisekstrakt, 0,5 % (vekt/vol) pepton, 0,4 % (vekt/vol) NaCl,

0,5 % (vekt/vol) MgS04-7H20, 0,06 % (vekt/vol) KH2P04, 0,0005 %

(vekt/vol) FeCl3-6H20, 0,0002 % (vekt/vol) CuS04-5H20, 3,0 %

(vekt/vol) agar i én liter destillert vann pH 4,8. P. chrysogenum-stammen beskrevet ovenfor og kalt PC200 er deponert hos American Type Culture Collection (ATCC), 123 01 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 under aksesjonsbetegn-elsen ATCC 74186 (deponeringsdato: 23. september 1992).

Den annen nye Penicillium chrysogenum-transformant ifølge foreliggende oppfinnelse som kan produsere adipoyl-7-ACA uttrykker både ekspandase/hydroksylase- og acetyltransferase-aktiviteter grunnet transformasjon med en enkelt vektor (pTS-8) som inneholder DNA som koder for begge disse enzymer. Denne vektor avviker derfor fra Penicillium-transformasjons-vektorene nevnt i EP-A-0 437 378, som inneholder DNA som koder for enten acetyltransferase fra C. acremonium alene, eller sammen med en DNA-sekvens som koder for et mutert ekspandase/hydroksylase-polypeptid. I pTS-8-konstruksjonen drives ekspresjon av ekspandase/hydroksylase- og acetyltransferase-genene hver for seg av separate kopier av IPNS-promoteren fra P. chrysogenum, en tredje kopi av IPNS-promoteren benyttes for å drive transkripsjonen av pleomycin-resistensgenet som be-

nyttes som seleksjonsmarkør.

I en alternativ utførelse av foreliggende oppfinnelse kan ekspandase/hydroksylase- og acetyltransferasegenene inkorporeres i separate vektorer og innføres i Penicillium-vertsstammen etter hverandre. Rekkefølgen med hvilke DNA-fragmentene som koder for ekspandase/hydroksylase- og acetyltransferase-enzymaktivitetene innføres i Penicillium-stammen har bare praktisk betydning. Fortrinnsvis bør transformasjon av Penicillium med ekspandase/hydroksylasegenet (genene) se forut for innsettingen av acetyltransferasegenet, da dette er rekke-følgen i hvilken enzymene arbeider in vivo. Ekspresjonen av ekspandase/hydroksylasen kan derfor følges ved å analysere for produksjon av adipoyl-7-ADAC. Da adipoyl-7-ADAC er et substrat for acetyltransferaseenzymet kan ekspresjon av det senere innsatte acetyltransferase-kodende gen påvises ved produksjon av adipoyl-7-ACA. Ved å benytte en egnet in vitro-analyse for acetyltransferase er det mulig å transformere Penicillium med acetyltransferasegenet først, bekrefte dets ekspresjon ved hjelp av in vi tro-analysen, og deretter introdusere ekspandase/hydroksylasegenet . Begge disse veier er således egnede utførelser av prosessen for fremstilling av 7-ACA ifølge foreliggende oppfinnelse.

Den foretrukne utførelse har imidlertid alle tre enzymaktiviteter introdusert samtidig via konstruksjon av en enkelt plasmidvektor som inneholder det DNA som koder for ekspandase/hydroksylase- og acetyltransferase-aktivitetene fra C. acremonium. En Penicillium chrysogenum-stamme transformert med en slik enkelt plasmidvektor, vektoren pTS-8, og i stand til å uttrykke ekspandase/hydroksylase- og acetyltranserfase-aktivitet har blitt gitt navnet PC300. Dens taksonomiske egenskaper er de samme som dem beskrevet ovenfor for PC2 00. Akseptable dyrkningsbetingelser for PC300 er de samme som dem beskrevet ovenfor for PC200. P. chrysogenum-stammen kalt PC300 er deponert hos American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 under akse-sjonsbetegnelsen ATCC 74187 {deponeringsdato: 23. september 1992) .

Den spesifikke Penicillium chrysogenum som er transformert med vektoren pPenFTSO og som uttrykker aktiviteten av ekspandasegenet fra S. clavuligerus, som er en foretrukket utførelse av foreliggende oppfinnelse, er ny med hensyn på slike konstruksjoner innen teknikkens stand, som f.eks. den Cantwell et al. (1990) Current Genetics, 17, 213-221. I begge konstruksjoner benyttes in vitro-mutagenese for å koble promoteren til ekspandasegenet. I Cantwell-konstruksjonen inn-føres et Ndel-sete ved ATG i ekspandasegenet, som er ligert til Xbal-setet ved IPNS-promoterens 3' ende via en Xbal/Ndel-linker. I konstruksjonen av foreliggende oppfinnelse dannes et Ncol-sete ved ATG i ekspandasegenet og ligeres til Ncol-setet ved IPNS-Iinkerens 3' ende. Dette gir følgende sekvenser rundt promoter-genkoblingen i disse konstruksjoner:

Cantwell-konstruksjonen erstatter en C med en T mens C er bibeholdt i konstruksjonen ifølge foreliggende oppfinnelse, sekvensen til IPNS-promoteren like ved ATG-startkodonet tilsvarer således nøyaktig den som finnes i det naturlig fore-kommende IPNS-gen. Det er mulig at promoteren ifølge teknikkens stand, selv om den bare avviker med en enkelt nukleotid-base, kan gi lavere translasjonseffektivitet og følgelig et lavere ekspresjonsnivå av ekspandasegenet.

Andre forskjeller synes i promoter- eller genområdene som inngår i konstruksjonene. Cantwell-konstruksjonen inneholder 5' BamHI til Xbal 3 *-området fra IPNS-promoteren mens vektoren ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder 5' Ncol til Ncol 3'-området av promoteren [Diez et al., (1990), J. Biol. Chem. 265, 16358-16365]. Dette fører til tilnærmet 250 ekstra basepar i den 5' ende av IPNS-promoteren i Cantwell-konstruksjonen. Dette område ligger imidlertid i den åpne leseramme av ACV syntetasegenet oppstrøms for IPNS-genet.

Cantwell-konstruksjonen inneholder Streptomyces-genet fra ATG til BamHI-setet 3' for genet, mens vektoren ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder ATG til Sall-setet 3' for genet [Kovacevic et al. (1989), J. Bacteriol. 171, 754-760], Dette fører til tilnærmet 1000 ekstra basepar i den 3' ende i Cantwell-konstruksjonen. Konstruksjonen ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder fortsatt oppstrømsområdet fra ekspandasegenet til BamHI-setet 5' for ATG, dette området er imidlertid atskilt fra ekspandasegenets leseramme av IPNS-promoteren.

Nok en forskjell mellom pPenFTSO-konstruktet ifølge foreliggende oppfinnelse og det beskrevet innen teknikkens stand gjelder den benyttede seleksjonsmarkør. Bruk av en Penicillium IPNS-promoter: pleomycingenfusjon i konstruktet ifølge foreliggende oppfinnelse vil selektere for integrasjon av flere kopier eller integrasjon i loci som tillater ekspre-sjonsnivåer, og kan således potensielt gi en høyere prosent transformanter med et høyt nivå av ekspandasegenekspresjon.

Kløyving av adipoyl- sidekjeden

Det siste trinn i den nye bioprosess ifølge foreliggende oppfinnelse er kløyvingen av adipoylsidekjeden fra adipoyl-7-ADAC eller adipoyl-7-ACA, noe som krever behandling av produktene fra de foregående trinn med et adipoylamidase-enzym. Som allerede bemerket ovenfor er en av de vesentlige resultater av foreliggende oppfinnelse evnen til å utføre alle trinn som fører til opp til dannelse av adipoyl-7-ADAC og adipoyl-7-ACA i én enkelt fermenteringskultur. Dette resultat gir en eksepsjonelt forbedret effektivitet, da det er unød-vendig å isolere og delvis rense mellomprodukter fra trinn til trinn i prosessen. I dette siste trinn foreliggende imidlertid ikke adipoylamidaseenzymsystemet, dvs. det har ikke blitt dannet in situ i den opprinnelige fermenteringskultur, verken ved naturlig eller rekombinant ekspresjon av genene i P. chrysogenum.

Dersom den nye bioprosess ifølge foreliggende oppfinnelse utføres porsjonsvis vil det være nødvendig å isolere og delvis rense produktet fra første trinn, og foreløpige fremgangsmåter for å gjøre dette er allerede beskrevet ovenfor.

Ikke desto mindre kan prosessen ifølge foreliggende oppfinnelse utføres på enhver måte som effektivt bringer adipoylamidasen i kontakt med adipoyl-7-ADAC eller adipoyl-7-ACA, slik at enzymatisk omdannelse av denne forbindelse til 7-ADAC eller 7-ACA kan finne sted. Dette er definisjonen på begrepet "bringe i kontakt med", i dets bredeste forstand. Det er mulig å benytte et cellefritt brugg med urenset adipoyl-7-ADAC eller adipoyl-7-ACA og behandle dette porsjonsvis med urenset adipoylamidaseløsning. Denne utførelse er på visse måter respektiv, da den i utgangspunktet ikke krever vesentlig rensing av reaktantene. Modifikasjoner er naturligvis mulige. F.eks. kan reaktantene renses i ønsket grad før de bringes i kontakt med hverandre. Det ville også være mulig å utføre prosessen på kontinuerlig vis snarere enn porsjonsvis. Reaktantene kan settes i kontakt med hverandre på forskjellige måter, i tråd med fremskritt innen prosessteknologi. Således kan et immobilisert enzym benyttes, f.eks. i form av en kolonne som inneholder adipoylacylase, mens adipoyl-7-ADAC eller adipoyl-7-ACA passeres gjennom kolonnen. Det immobiliserte enzym kan også tilsettes adipoyl-7-ADAC- eller adipoyl-7-ACA-løsningen som en suspensjon. Slike immobiliserte enzym-systemer har fordelen ved enkel gjenvinning av enzymet og gjentatt bruk. Et annet eksempel på slik prosessteknologi gjelder membranreaktorer. Den foretrukne måte å bringe reaktantene i kontakt med hverandre er ved hjelp av kolonnen med immobilisert enzym.

Adipoylamidase- enzymer anvendbare i kløyvingstrinnet

Det finnes flere enzymer med kjent spesifisitet mot adipoyl-sidekjeder. Resultater oppnådd med en adipoylamidase som er kommersielt tilgjengelig fra RAVE Corp. er beskrevet i arbeidseksemplene nedenfor. Syv andre enzymer som fjerner adipoyl-sidekjeder fra molekyler av cefalosporintype er beskrevet i litteraturen. Seks av disse syv enzymer er fra Pseudomonas-arter, og det syvende er fra en Bacillus-art. Noen likheter forekommer mellom visse av Pseudomonas-enzymene, men alle syv er til en viss grad ulike når det gjelder fysi-kalske/biologiske egenskaper. Noen av disse egenskaper er opp-summert nedenfor:

Alle adiopylamidaseenzymene ovenfor er anvendbare i den nye bioprosess ifølge foreliggende oppfinnelse. Andre adipoylamidaser som er anvendbare i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan lett oppdages ved å analysere kandidatenzymet mot adipoyl-7-ACA og adipoyl-7-ADAC, sub-stratene på hvilke det må kunne virke. Et positivt resultat gir en pålitelig og reproduserbar fremgangsmåte for å fastslå at et kandidatenzym virkelig er anvendbart i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. Substratet kan fremstilles fra reaksjonen mellom adipinsyreanhydrid og 7-ACA, ved bruk av en modifikasjon av fremgangsmåten beskrevet av Szewczuk og Wellman-Bednawska i Clin. Chim. Acta (1978) 84, 19-26. Det er også mulig å benytte fremgangsmåten beskrevet i Agric. Biol. Chem. (1981) 45(7), 1561-1567, som beskriver fremstilling av glutaryl-7-ACA. Adipinsyreanhydrid kan fremstilles ifølge fremgangsmåten til Albertson og Lundmark beskrevet i J. Macromol. Sei. Chem. (1990) A27, 397-412. 7-ACA er tilgjengelig fra flere kommersielle kilder, heriblant Sigma Chemical Co..

Dersom det ønskes å utføre en grov gjennomsøkning av kandidatenzymer ved hjelp av en rask kolorimetrisk metode kan en erstatte adipoyl-7-ACA-substratet med et kolorimetrisk substrat, f.eks. adipoyl-PABA (para-aminobenzosyre) eller adipoyl-pNa (para-nitroanilin). En slik fremgangsmåte kan adopteres fra den beskrevet for Y-9lutamyl-PABA i Szewczuk et al., Clinica Chemica Acta, 84 (1978) 19-26. Kløyving av side-kj eden gir et farget produkt hvis nærvær og konsentrasjon lett kan bestemmes med et kolorimeter. For mer detaljert informasjon angående disse og andre egnede kolorimetriske metoder, se Marelli, L. P. (1968) J. Pharm. Sei. 57: 2172-2173; Szasz, G.

(1969) Clin. Chem. 15: 124-136; Szewczuk, A. et. al. (1980) Anal. Biochem. 103: 166-169; og Reyes, F. et. al. (1989) J. Pharma. Pharmacol. 41: 136-137.

En sammenligning ble utført mellom de N-terminale aminosyresekvenser fra RAVE-enzymet og de store subenheter av acyll- og GK16-enzymene angitt i tabellen ovenfor. Resultatene av sammenligningen er vist nedenfor (hvor parenteser angir usikre posisjoner):

RAEV - Sekvensid. nr. 5

(S) N (S) (G) A V A P G K T A N G N A L (L) L Q N (P)

GK16 - Sekvensid. nr. 6

S N S W AVAPGKTANGNAL L LQN P

acyll - Sekvensid. nr. 7

S N N W AVAPGRTATGRPI L AGD P

Fra de viste sekvenser er det åpenbart at alle tre peptider er beslektet. Et proten med en N-terminalsekvens som ligner på dem vist ovenfor vil imidlertid ikke nødvendigvis besitte adipoylamidaseaktivitet, noe som er tilfelle med en penicillin G acylase produsert av en ArthroJbacter-stamme. På den annen side finnes adipoylamidaser som er anvendbare i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse som ikke viser signifikant homologi til den N-terminale sekvens ovenfor. F.eks. viser acylasene fra Asahi acyl og Fujisawa B. laterosporus JI angitt i tabellen ovenfor, som begge er vist å besitte noe adipoyl-7-ACA acylaseaktivitet, ingen sekvens-homologi med de andre enzymer beskrevet ovenfor. Følgelig bestemmes foreliggende oppfinnelses område når det gjelder adipoylamidaser som er anvendbare i siste trinn i den nye bioprosess av hvorvidt et kandidatenzym er i stand til å kløyve adipoylsidekjeden fra adipoyl-7-ACA eller ikke, noe som kan bestemmes enkelt og pålitelig som beskrevet ovenfor.

Beskrivelse av foretrukne utførelser

I det følgende gis en detaljert beskrivelse av visse foretrukne utførelser av foreliggende oppfinnelse, men disse er kun ment å være illustrerende, og skal på ingen måte be-grense foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 1

Dyrkningsbetingelser for Penicillium chrysogenum Penicillium chrysogenum-stammene benyttet i disse fremgangsmåter ble bibeholdt på skåler som inneholdt LCSB-medium sammensatt av 1,5 % (vekt/vol) laktose-monohydrat, 0,5 % (vol/vol) maisekstrakt, 0,5 % (vekt/vol) pepton, 0,4 %

(vekt/vol) NaCl, 0,05 % (vekt/vol) MgS04-7H20, 0,06 %

(vekt/vol) KH2P04, 0,0005 % (vekt/vol) FeCl3-6H20, 0,0002 %

(vekt/vol) CuS04-5H30, 3,0 % (vekt/vol) agar i én liter destillert vann, pH 4,8. Etter 12 dager ved 25 °C og 65 % relativ fuktighet ble enkeltkolonier fjernet og tilsatt 2 ml destil-

lert vann i et rør med skrukork, inneholdende glasskuler. Etter finfordeling av kulturen ved vorteksering ble suspensjonen benyttet til inokulering av risflasker. Risflaskene inneholder 25 g/250 ml flaske med Uncle Ben's konverterte ris, naturlig langkornet, som er vasket med 3-4 volumer destillert vann i 7 minutter, blandet hvert 30 sekund, og så avsilt inn-til vannopptaket i risen var tilnærmet 25 %. Etter 12 dager ved 25 °C og 65 % fuktighet ble sporene vasket fra risen med 50 ml sterilt vann. Sporesuspensjonen ble benyttet til inokulering av flytende kulturer, og også til erholdelse av fryse-tørkede preparater av kulturene for lagring ved 4 °C. Sporene ble tilsatt et likt volum 5 % skummet melk og frysetørket i sterile ampuller.

En to-trinns fermentering av stammen i risteflasker ble benyttet for produksjon av penicilliner og for produksjon av mycelia som kilde for RNA eller DNA. Utsåingstrinnet ble initiert ved tilsetning av 1 x 10° sporer til 50 ml/500 ml flaske med medium sammensatt av 3,0 % (vekt/volum) glukose, 1,0 % (vekt/vol) farmamedia, 3,0 % (vol/vol) maisekstrakt,

0,2 % (vekt/vol) ammoniumsulfat, 0,5 % (vekt/vol) CaC03,

0,05 % (vekt/vol) vannfritt monokaliumfosfat, 1,0 % (vekt/vol) laktose, 1,0 % (vekt/vol) primær tørrgjær i én liter destillert vann. Inkubasjonen var ved 25 °C og 65 % relativ fuktighet på en rotatorisk ristemaskin med 70 mm diameter amplitude ved 22 0 rpm. Etter 48 timers inkubering ble produksjonstrinnet innledet ved overføring av 2 ml vegetativ kultur til 35 ml/500 ml flaske med medium med følgende sammensetning: 0,05 % (vekt/vol) KH2P04, 0,5 % (vekt/vol) K2S04, 1,0 %

(vekt/vol) (NH4)2S04, 12,0 % (vekt/vol) laktose, 2,75 %

(vekt/vol) farmamedia, 1,0 % (vekt/vol) CaC03 (utfelt), 1,0 % spekkolje i én liter destillert vann pH 6,6. Etter auto-klavering, men forut for inokulering ble steril 25 % natrium-adipat (pH 6,6) tilsatt til en sluttkonsentrasjon av natrium-adipat på 2,5 %. Etter inokulering ble inkubasjonen fortsatt under samme betingelser som i utsåingstrinnet i 5 til 7 dager.

Når mycelia trengtes for dannelse av protoplaster til transformasjon eller som DNA-kilde ble stammen dyrket i 50 ml/250 ml flaske med komplett medium (CM) sammensatt av: 50 ml 20 x Clutterbuck'3 salter (120 g Na2N03, 10,4 g KCl, 10,4 g MgS04-7H20, 30,4 g KH2P04) , 2,0 ml Vogel1 s sporelementer (0,3M sitronsyre, 0 , 2M ZnS04, 24 mM Fe (NH4) 2 (S04) 2-6H20, 10 mM CuS04, 3 mM MnS04, 8 mM borsyre, 2 mM Na2Mo04-2H20) , 5 g tryp-ton, 5 g gjærekstrakt, 10 g glukose i én liter destillert vann. Inkubasjonen var ved 25 °C på en rotatorisk ristemaskin ved 220 rpm.

Eksempel 2

Dyrkingsbetingelser for Cephalosporium acremonium.

C. acremonium-stammer ble bibehold på skråagar med komplett medium sammensatt av 20 g sukrose, 20 g agar, 4 g pepton, 4 g gjærekstrakt, 3 g NaNo3, 0,5 g KH2P04, 0,5 g K2HP04, 0,5 g KCl, 0,5 g MgSO4/7H30, 0,01 g FeS04/7H20 i én liter destillert vann, pH 6,6. Etter 10 dagers vekst ved 28 °C og 66 % relativ fuktighet ble 6 ml sterilt vann tilsatt skrå-agaren, og kulturen ble skrapt av agaroverflaten. Den resulterende suspensjon ble overført til et sterilt rør med skrukork inneholdende glasskuler. Etter finfordeling av kulturen ved vorteksering i et par minutter ble 3,5 ml av den resulterende suspensjon benyttet til inokulering av flytende kulturer. Denne suspensjon ble også benyttet til erholdelse av fryse-tørkede preparater av kulturene for lagring ved 4 °C. Suspensjonen med finfordelt kultur ble sentrifugert, pelleten resuspendert i 5 % skummet melk og porsjoner frysetørket i sterile ampuller.

En to-trinns fermentering av stammene i risteflasker ble benyttet for produksjon av cefalosporiner eller for produksjon av mycelia som kilde for DNA og RNA. Utsåings-stadiet ble startet ved tilsetning av inokulum til 250 ml flasker, hver med 15 ml medium med følgende sammensetning: 5 g glukose, 40 g sukrose, 30 g maisstivelse, 50 g sukkerroesirup, 65 g soyamel, 15,8 g CaS04/2H20, 8 g ammoniumacetat, 5 g CaC03 (utfelt) , 7,5 g (NH4)2S04, 3,5 g MgS04/7H20, 1 g KH2P04, 0,15 ml soyabønneolje pr. flaske i én liter destillert vann ved pH 6,2. Inkubering foregikk ved 25 °C og 65 % relativ fuktighet i en rotatorisk ristemaskin med 70 mm diameter amplitude ved 220 rpm. Etter 96 timers inkubering ble produksjonsstadiet innledet ved overføring av 2 ml vegetativ kultur til en 250 ml flaske med nye 15 ml av mediet beskrevet ovenfor. Inkubasjonen ble fortsatt i ytterligere 96 timer under samme betingelser.

Når mycelia trengtes som kilde for DNA for transformasjon ble stammene dyrket i 100 ml/500 ml flaske med komplett medium sammensatt av: 20 g glyserol, 4 g pepton, 4 g gjærekstrakt, 0,5 g KH2P04, 0,5 g K2HP04, 0,5 g KCL, 1 g MgS04/7H020, 3g NaNC-3, 0,01 g FeS04/7H20 i én liter destillert vann. Inkubasjonen var ved 30 °C i en rotatorisk ristemaskin ved 200 rpm.

Eksempel 3

Isolering av genomisk DNA og total-RNA fra Penicillium og Cephalosporium.

Den vegetative mycelie vekst fra en 48 timers kultur fremstilt som beskrevet ovenfor ble oppsamlet ved filtrering gjennom osteklede, frosset i flytende nitrogen og frysetørket over natten. Det tørkede mycelium ble malt med sand i en morter med pistill og resuspendert i 25 ml 100 mM LiCl, 50 mM EDTA, 10 mM Tris pH 8,0, 4 % SDS. Etter oppvarming av suspensjonen til 50-55 °C i et 60 °C vannbad ble blandingen ekstra-hert, først med 1 M Tris (pH 8)-mettet fenol, fulgt av Tris-mettet fenol: kloroform (1:1, vol/vol) og så kloroform. RNA ble utfelt fra vannfasen ved tilsetning av et likt volum kald 6 M LiCl og henstand av blandingen ved -2 0 °C i 2 til 3 timer. Etter sentrifugering ved 12000 x g i 20 minutter ved 4 °C ble supernatanten tilsatt etanol til 66 % (vol/vol) og nedkjølt til -20 °C i 15 minutter for utfelling av DNA. Etter sentrifugering som beskrevet ovenfor ble DNA-bunnfallet vasket med 70 % etanol, tørket og resuspendert i TE-buffer (10 mM Tris-HC1, pH 7,5, 1 mM EDTA). DNA-konsentrasjonen ble anslått ved sammenligning med kjente DNA-standarder etter agarosegelelektroforese og farging med etidiumbromid.

For RNA-ekstraksjon ble kulturer av Penicillium chrysogenum og Cephalosporium acremonium dyrket som beskrevet ovenfor i eksemplene 1 og 2 i 96 timer i 35 ml fermenterings-medium (fermenteringsbetingelser som tidligere beskrevet) ved 25 °C i en rotatorisk ristemaskin ved 220 rpm. Mycelium ble oppsamlet ved filtrering gjennom et Whatman nr. 1-filter under vakuum og vasket med tilnærmet 50 ml vann. Myceliet ble umiddelbart skrapt av filteret, resuspendert i 5 ml "oppbryt-ingsbuffer" (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA pH 8,0, 5 % SDS), frosset i flytende nitrogen og frysetørket. Etter frysetørking over natten ble 5 ml vann med 0,1 % DEPC og 5 ml fenol:kloroform:isoamylalkohol (50:50:1) mettet med 1 M Tris (pH 8,0) tilsatt, og blandingen fikk tine ved 37 °C i 20 minutter med risting. Blandingen ble sentrifugert ved 12000 x g i 10 minutter ved 4 °C, og vannfasen ble fjernet og re-ekstrahert, først med fenol:kloroform:isoamylalkohol (50:50:1) mettet med 1 M Tris (pH 8,0), og deretter med fenol mettet med 1 M Tris (pH 8), og endelig med kloroform. Et likt volum 6 M LiCl ble tilsatt den endelige vannfase, og løsningen fikk stå ved -20 °C i minst 4 timer. Total-RNA ble nedsentrifugert ved 12000 x g i 20 minutter ved 4 °C, bunnfallet oppløst i 0,3 ml TE-buffer og 0,03 ml 3 M natriumacetat, og 2,5 volumer etanol ble tilsatt for ny utfelling av RNA. Det endelige bunnfall ble løst i 0,1 ml TE-buffer, og RNA-konsentrasjonen ble bestemt spektrofotometrisk ut fra absorbansen ved 260 nm.

Eksempel 4

Konstruksjon av et genbibliotek fra Cephalosporium acremonium og isolering av ekspandase/hydroksylase- og acetyl-transf erase -genene fra C. acremonium

Isolering av ekspandase/ hydroksylasegenet fra C. acremonium

Genomisk DNA fra C. acremonium ble ufullstendig kuttet med Sau3AI slik at en gjennomsnittsfragmentstørrelse på 10 til 20 kb ble oppnådd, og dette størrelsesområde ble an-riket ved sentrifugering av prøven i en tetthetsgradient fra en 5 til 20 % NaCl. Det størrelsesfraksjonerte DNA ble benyttet til fremstilling av et C. acremonium genomisk DNA-bibliotek via ligering inn i BamHl-setet i vektoren A 2001, pakking i fagpartikler ved bruk av Gigapack (Stratagene), og infeksjon av E. coli. De resulterende plakk ble overført til nitrocellulose og gjennomsøkt ved hybridisering til en oligo-nukleotidprobe komplementær til den 3<1->ende av den publiserte sekvens av ekspandase/hydroksylase-genet (Samson et al., 1987) . Proben var endemerket med [x-<32>P]ATP og T4 polynukleo-tidkinase. Positive kloner ble isolert, kartlagt med hensyn på restriksjonsendonukleaseseter, og genets orientering etablert ved Southern-blothybridisering til oligonukleotidet beskrevet ovenfor og nok et oligonukleotid med sekvens komplementær til den 5'-ende av genet.

Isolering av acetyltransferasegenet fra C . acremonium

Selv om dette ikke var fremgangsmåten benyttet for isolering av acetyltransferasegenet til de påfølgende vektor-konstruksjoner beskrevet nedenfor i eksemplene 11 og 12, kunne følgende fremgangsmåte blitt benyttet av en gjennomsnittfag-kyndig ved bruk av publisert DNA-sekvensinformasjon tilgjengelig i dag. Fra et C. acremonium genomisk bibliotek fremstilt som beskrevet ovenfor utvelges en klon som koder for acetyl-transf erasegenet basert på hybridisering til syntetiske oligo-nukleotidprober komplementære til acetyltransferasesekvensen, som beskrevet i Matsuda et al. (1992) Biochem. Biophys. Res. Commun. 182: 995-1001.

Eksempel 5

Dyrkningsbetingelser for Streptomyces clavuligerus

Streptomyces clavuligerus-stammen benyttet i disse fremgangsmåter var ATCC 27064. Stammen ble bibeholdt på skåler som bestod av: 4 g gjærekstrakt, 10 g maltekstrakt, 4 g glukose, 2 0 g agar i én liter destillert vann, pH 7,2. Etter 5 dagers vekst ved 30 °C ble 2 ml sterilt vann tilsatt skålene, og kulturen ble skrapet av agaroverflaten. Den resulterende suspensjon ble overført til et sterilt rør med skrukork inneholdende glasskuler. Etter finfordeling av kulturen ved vorteksering ble suspensjonen benyttet til inokulering av flytende kulturer. Suspensjonen ble også benyttet for permanent lagring av kulturer ved -70 °C ved tilsetning av glyserol i en sluttkonsentrasjon på 15 % (vol/vol)

Når mycelium trengtes for dannelse av protoplaster for transformasjon eller som DNA-kilde ble stammene dyrket i 200 ml/l liter flaske med YEME-medium sammensatt av 3 g gjærekstrakt, 5 g pepton, 3 g maltekstrakt, 10 g glukose, 340 g sukrose, 1,02 g MgCl2-6H20, 5 g glysin, 18 g agar i én liter destillert vann. Inkubasjonen var ved 28 °C i en rotatorisk ristemaskin ved 220 rpm.

Eksempel 6

Isolering av genomisk DNA fra Streptomyces

Den vegetative vekst fra en 48 timers kultur fremstilt som beskrevet ovenfor ble oppsamlet ved sentrifugering ved 22100 x g i 10 minutter. Cellene ble resuspendert i 10 ml TE-buffer, 10 mg lysozym ble tilsatt og blandingen inkubert ved 30 °C i 15 minutter. 1 ml 20 % SDS ble så tilsatt, umiddelbart fulgt av 10 ml TE {pH 8)-mettet fenol og 1,5 ml 5 M NaCl, og blandingen ble varsomt invertert i 2 0 minutter. Pasene ble separert ved 12000 x g i 10 minutter, hvoretter vannfasen ble fjernet og overført til et nytt rør. Et likt volum kloroform ble tilsatt, og blandingen varsomt invertert i 10 minutter. Fasene ble igjen separert ved sentrifugering ved 12000 x g i 10 minutter, vannfasen fjernet og igjen overført til et nytt rør. To volumer isopropanol ble forsiktig tilsatt, og det utfelte DNA ble surret opp og løst i et minimalt volum TE-buffer. RNAse ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 20 ug/ml, og løsningen ble inkubert ved 50 °C i én time. Protease K ble så tilsatt til en sluttkonsentrasjon på

100 ug/ml sammen med 100 mM NaCl og 0,4 % SDS, og blandingen ble inkubert ved 37 °C i én time. Løsningen ble igjen ekstra-hert med et likt volum TE (pH 8)-mettet fenol, fulgt av nok en kloroformekstraksjon. DNA i sluttekstraktet ble surret opp etter tilsetning av 2 volumer isopropanol, og konsentrasjonen ble bestemt spektrofotometrisk ved avlesning av absorbansen ved 260 nm.

Eksempel 7

Konstruksjon av et genbibliotek og isolering av DNA-fragmenter som inneholder ekspandase- og hydroksylase-genene fra Streptomyces clavuligerus.

Isolering av ekspandasegenet fra S . clavuligerus

Genomisk DNA fra S. clavuligerus erholdt ved fremgangsmåten tidligere beskrevet ble kuttet med restriksjonsenzymene BamHI og Sali. Det kuttede DNA ble fraksjonert ved elektroforese i en 0,8 % agarosegel, og fragmenter med stør-relse fra 1,8 til 2,2 kb ble eluert og ligert til pUC18-DNA som på forhånd var beskyttet med BamHI og Sali. Fortynninger av ligeringsblandingen ble benyttet til transformasjon av kompetente JM109-celler ved hjelp av elektroporering (Gene Pulser, Bio-Rad, Richmond, CA). Fremstilling av de kompetente celler og elektroporeringsbetingelser var begge i henhold til produsentens anbefalinger. Transformasjonsblandingen ble utsådd på LB-skåler med 100 ug/ml ampicillin sammen med 75 ul 2 % X-Gal. Etter inkubering over natten ved 37 °C ble rekombinante kolonier identifisert ved sin fargeløshet, grunnet inaktivering av plasmidvektorens p-galaktosidasegenaktivitet. De fargeløse kolonier ble utsådd på en ny LB-skål med

100 ug/ml ampicillin. Etter dyrking over natten ved 37 °C ble koloniene overført til nitrocellulose og hybridisert med en probe fremstilt ved polymerasekjedereaksjon som tilsvarte den publiserte ekspandasegensekvens fra Streptomyces clavuligerus fra base 52-918 [Kovacevic et al. (1989) J. Bacteriol. 171, 754-760, og Ingolia et al. US 5 070 020]. Merking av poly-merasekj edereaksjonsproduktet ble oppnådd ved en ekstensjons-reaksjon med tilfeldige primere med (<32>P) dCTP og et Oligo-labelling Kit, ifølge produsentens instruksjoner (Pharmacia, Piscataway, New Jersey). Hybridiseringsreaksjonen ble utført i nærvær av IO<6> CPM med radioaktivt merket probe, 30 % formamid, 5 X SSC (0,15 M NaCl, 0,015 M natriumsitrat pH 7), 0,1 % SDS, 5 X Denhart<1>s (g ficoll, 5 g polyvinylpyrrolidon og 5 g BSA til 500 ml 50 X lagringsløsning) og 100 ug/ml kalvetymus-DNA, ved 37 °C over natten. Flere transformanter hybridiserte sterkt til proben. Én koloni ble ved restriksjonsenzymanalyse vist å inneholde en vektor som inneholdt ekspandasegenet, og dette plasmid ble kalt pFTSO-1.

Isolering av hydroksylasegenet fra S . clavuligerus

Genomisk DNA fra Streptomyces clavuligerus ble ufullstendig kuttet med BamHI og ligert inn i lamba Dash II-vektoren fra Stratagene. Det resulterende genomiske bibliotek ble gjennomsøkt ved hybridisering med et 30 baser langt oligonukleotid med sekvens identisk til de første 30 baser av den publiserte hydroksylasegensekvens (Kovacevic og Miller, 1991, J. Bact. 173:398). Southern-hybridisering med BamHI-kuttet DNA fra to positive fagkloner viste det forventede fragment på 6 kb, som ble subklonet. Denne subklon ga et fragmentsett etter kutting med Kpnl som stemte med det publiserte restriksjonskart for området rundt hydroksylasegenet (Kovacevik og Miller, 1991) .

Eksempel 8

Isolering av plasmid-DNA

E. coli-kulturer som inneholdt plasmidet av interesse ble dyrket i 500 ml LB-medium (2 0 g/l LB Broth Base (Gibco, Paisly, Skottland) med 15 ug/ml tetrasyklin i en rotatorisk ristemaskin ved 220 rpm i 12-16 timer ved 37 °C. Cellene ble nedsentrifugert ved 4000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Celle-bunnfallet resuspendert i 18 ml glukosebuffer (50 mM glukose, 25 mM Tris pH 8,0, 10 mM EDTA), og 2 ml lysozym (40 mg/ml)

(Sigma, St. Louis, MO) i glukosebuffer ble tilsatt, innblandet og blandingen ble inkubert ved romtemperatur i 15 minutter.

40 ml nylaget løsning av 0,2 normal NaOH, 1 % SDS ble tilsatt, og blandingen ble ristet forsiktig og plassert på is i 10 minutter. 30 ml 5 M kaliumacetat pH 4,8 ble så tilsatt, innblandet, og den resulterende blanding ble plassert på is i ytterligere 10 minutter. Cellerester ble nedsentrifugert ved 4000 x g i 10 minutter ved 4 °C, og den resulterende supernatant filtrert gjennom et osteklede. Isopropanol (0,6 volumer) ble tilsatt den klarnete supernatant for utfelling av plasmid-DNA, og utfellingen ble dannet under inkubasjon ved romtemperatur i 2 0 minutter. Plasmid-DNA ble nedsentrifugert ved 4000 x g i 20 minutter ved 4 °C, vasket med 70 % etanol og tørket i kort tid. Bunnfallet ble resuspendert i 9 ml TE-buffer, hvoretter 10 g CsCl og 0,387 ml etidiumbromidløsning

(10 rag/ml) ble tilsatt. Denne løsning ble sentrifugert ved 313 100 x g i 24 timer. Det resulterende plasmidbånd i cesium-kloridgradienten ble synliggjort med ultrafiolett lys, isolert, og etidiumbromid fjernet ved ekstraksjon med vannmettet butanol. CsCl i plasmidpreparatet ble så fjernet ved dialyse mot TE-buffer, og DNA ble til slutt konsentrert ved hjelp av PEG (molekylvekt 8000). DNA-konsentrasjonen ble bestemt spektrofotometrisk ved måling av absorbansen ved 260 nm.

Eksempel 9

Konstruksjon av Penicillium-transformasjonsvektoren pPenFTSO

Innføring av pleomycinresistensgenet

En Penicillium-transformasjonsvektor ble konstruert med et pleomcinresistensgen som dominant seleksjonsmarkør. Dette ble oppnådd ved først å isolere et fragment på 660 bp som inneholdt pleomycinresistensgenet (et pleomycinbindende proteingen fra Streptoalloteichus hindustanus), og også koblet til en cytokrom Cl-terminator fra gjær, fra et plasmid pUT713 (CAYLA, Toulouse Cedex, Frankrike) kuttet med BamHI/Bglll, ved elektroforese i og eluering fra agarosegeler. Det isolerte fragment ble ligert inn i BamHI-setet i vektoren "pSELECT" 1 (Promega Corporation), og orienteringen av genet ble bestemt ved restriksjonsenzymanalyse. Det unike HindiII-sete i det resulterende plasmid ble fjernet ved kutting med Hindlll, innfylling med Klenow-polymerase og religering. Deretter ble et Pstl-fragment på 550 bp som inneholdt lambd kos-setet innsatt, noe som tillater vektoren benyttet til kosmiddannelse når den inneholder innskudds-DNA av passende størrelse. Denne vektor kalles pSCP4.

Genomisk DNA fra P. chrysogenum ble ufullstendig kuttet med Sau3A og benyttet til fremstilling av et bibliotek i fagvektoren lambda EMBL3. En klon som inneholdt isopenicillin N syntetase (IPNS)-genet ble isolert fra dette bibliotek og benyttet til fremstilling av en serie med subkloner, en av hvilke inneholdt et 3,6 kb fragment fra det første BamHI-sete oppstrøms for IPNS-genet til det første Hindlll-sete nedstrøms for genet. Det unike SalI-sete i denne subklon ble fjernet ved kutting med Sali, innfylling av de klebrige ender med Klenow-polymerase og religering. Deretter ble det unike Xbal-sete fjernet på tilsvarende måte ved kutting med Xbal, innfylling og religering. Det resulterende plasmid kalles pSXF-1. Den modifiserte IPNS-promoter ble gelisolert fra pSXF-1 som et 1,2 kb stort Ncol-fragment og ligert inn i Ncol-setet i pSCP4, beskrevet ovenfor. Orienteringen, bestemt ved restriksjons-kutting, ble valgt slik at promoteren var koblet til pleomycinresistensgenet ved startkodonet ATG. Dette plasmid kalles pUTZ-2.

Innføring av ekspandasegenet fra S. clavuligerus

Fragmentet på 1,645 kb som inneholder ekspandasegenet fra Streptomyces clavuligerus ble renset fra pFTSO-1 (vektor tidligere beskrevet) kuttet med BamHI og Sali ved elektroforese i og eluering fra en 0,8 % agarosegel. Det isolerte fragment ble ligert inn i vektoren pSELECT (Promega Corporation), likeledes kuttet med BamHI og Sali. Denne vektor kalt pFTS0-8. Et nytt Ncol-sete ble lagt ved ekspandasegenet ATG-startkodon ved setestyrt mutagenese av pFTSO-8 ved bruk av in vitro-mutagenesesystemet "Altered Sites" (Promega Corporation). Mutagenesen ble utført ifølge produsentens instruksjoner. Et oligonukleotid ble konstruert for å komplementere den kodende sekvens i DNA-området ved ATG-startkodonet fra den publiserte sekvens av ekspandasegenet fra Streptomyces (Kovacevic et al, (1990) Journal of Bacteriology, 171, s. 3952-3958). Oligonukleotidet ble syntetisert ved cyanoetyl-fosforamidittkjemi (Pharmacia Gene Assembler-instrumentering), og oligosekvensen var som følger:

Sekvensid. nr. 8

Mutagenesen ble bekreftet ved restriksjonsenzymanalyse. Deretter ble Ncol-fragmentet på 1,2 kb fra pUTZ-2, som inneholder den modifiserte IPNS-promoterregion fra P. chrysogenum, isolert ved kutting med Ncol fulgt av agarosegelelektroforese. IPNS-promoterområdet ble ligert inn i pFTS0-8-vektoren i det nye Ncol-sete dannet ved mutagenesen ved ATG-startkodonet i ekspandasegenet. Promoterens orientering i forhold til ekspandasegenet ble fastslått ved restriksjonsenzymanalyse. Denne IPNS-promoter:ekspandasegensett ble så fjernet som et BamHI/Sall-fragment inn i den BamHI/Sali-kuttede Penicillium-transformasjonsvektor pUTZ-2 beskrevet ovenfor. Den endelige konstruksjon ble kalt pPenFTSO.

Eksempel 10

Konstruksjon av Penicillium-transformasjonsvektoren pPEN/CEPH-1

Inkorporering av IPNS- promoterområdet

IPNS-promoterområdet ble isolert fra pUTZ-2 beskrevet ovenfor i eksempel 9, ved kutting med Xhol/Smal. pUTZ-2-vektoren ble kuttet med BamHI og de klebrige ender gjenfylt med dNTPer og Klenow-fragment slik at butte ender ble dannet, og så kuttet med Xhol, og det isolerte XhoI/Smal-IPNS-promoterfragment ble ligert inn i denne kuttede vektor, noe som førte et konstrukt som inneholdt to IPNS-promoterområder. Denne vektor ble kalt pUTZ-7.

Inkorporering av ekspandase/ hydroksylasegenet fra C.

acremonium

Ett av IPNS-promoterområdene ble så isolert (ved elektroforese i og eluering fra agarosegeler) fra pUTZ-7 som Xhol/Xbal-fragment og ligert inn i den Xhol/Xbal-kuttede vektor pBluescript II SK (Stratagene, La Jolla, CA). Denne vektor ble kalt pIPNSp/blue.

Ekspandase/hydroksylasegenet fra Cephalosporium ble isolert (ved elektroforese i og eluering fra agarosegeler) som et HindiII/Xbal-fragment på 1,6 kb fra en slik genomisk klon identifisert ovenfor, og ligert inn i en HindiII/Xbal-kuttet vektor pSELECT. Et nytt BspHI-sete ble dannet ved ATG-startkodonet i ekspandase/hydroksylasegenet ved setestyrt mutagenese, ved bruk av "Altered Sites" in vitro-mutagenesesystemet (Promega Corporation). Mutagenesen ble utført ifølge produsentes instruksjoner. Et oligonukleotid ble konstruert for å komplementere den kodende sekvens i DNA-orarådet ved ATG-startkodonet fra den publiserte sekvens av ekspandase/hydroksylasegenet fra Cephalosporium acremonium (Samson et al., Bio/Technology, bind 5, november 1987). Oligonukleotidet ble syntetisert ved cyanoetyl-foaforamidittkjemi (Pharmacia Gene Assembler-instrumentering), og oligosekvensen var som følger:

Sekvensid nr. 9

Mutagenesen ble bekreftet ved restriksjonsenzymanalyse. Ekspandase/hydroksylasegenet fra Cephalosporium acremonium ble så isolert (ved elektroforese i og eluering fra agarosegeler) som et BspHI/Xbal-fragment og ligert inn i den Ncol/Xbal-kuttede vektor pIPNSp/blue beskrevet i eksemplet ovenfor. Denne vektor inneholdt nå IPNS-promoteren fra Penicillium ved ATG i ekspandase/hydroksylasegenet fra Cephalosporium acremonium. Denne vektor ble kalt pIPNSp/EXP/blue. Denne IPNS-promoter/ekspandase/hydroksylase-kassett ble ufullstendig kuttet med Xhol og fullstendig kuttet med Xbal, og fragmentet isolert (ved elektroforese i og eluering fra agarosegeler), og ligert inn i en Xhol/Xbal-kuttet vektor pUTZ-2 beskrevet i eksemplet ovenfor, slik at den endelige transformasjonsvektor pPEN/CEPH-1 ble dannet.

Eksempel 11

Fremstilling av en Penicillium-transformasjonsvektor for ekspresjon av både ekspandase- og hydroksylasegenet fra S. clavuligerus

p-tubulingenet fra P. chrysogenum ble klonet fra et genomisk bibliotek i lambda, med p-tubulingenet fra Aspergillus niger som hybridiseringsprobe. Et Xbal/Hindlll-fragment på 2,0 kb som inneholdt p-tubulinpromoteren fra Penicillium ble ligert inn i Xbal/Hindlll-setene i pSELECT (Promega). Et Ncol-sete ble innført ved ATG-startkodonet ved setestyrt mutagenese av sekvensen AAAATGCGT til ACCATGGGT. Fra den resulterende

vektor ble et BamHI/Ncol-fragment på 1,4 kb gelisolert og ligert mellom BamHI og Ncol-setene i pUTZ-2 (beskrevet tidligere) , slik at vektoren pCI-6 ble dannet. Fra en genomisk klon fra P. chrysogenum ble et Sall-fragment på 5,1 kb som inneholdt både IPNS- og acyltransferasegenet gelisolert og ligert inn i Sall-setet i pUTZ-2 slik at pUTZ-5 ble dannet. Den 3' terminatorsekvens i IPNS-genet ble isolert fra pUTZ-5 ved kutting med BamHI og Hindlll, fulgt av gelisolering av 1,3 kb-fragmentet, som ble ligert inn mellom BamHI- og Hindlll-setet i pCI-6 (beskrevet ovenfor), slik at pCI-13 ble dannet. Det unike Sall-sete nær BamHI-setet i pCI-13 ble fjernet ved kutting, gjenfylling med Klenow-polymerase og religering. Et nytt Sall-sete ble innført på den andre siden av BamHI-setet ved setestyrt mutagenese av sekvensen GGAAGACG til GGTCGACG. Ampicillinresistensgenet ble så fjernet fra plasmidet ved kutting med Pvul, gelisolering av det største fragmentet og religering slik at pCI-15 ble dannet. Endelig ble IPNS-promoter:ekspandasegenkassetten gelisolert fra pPENFTSO som et BamHI/Sall-fragment på 2,4 kb og ligert inn i pCI-15, slik at pEXP-1 ble dannet.

Konstruksjonen av en vektor for ekspresjon av både hydroksylase- og ekspandasegenet fra S. clavuligerus omfatter følgende trinn. Kpnl-fragmentet på 2,9 kb som inneholder hydroksylasegenet subklones i pSELECT slik at EcoRI-setet i polylinkeren ligger nærmest den 5' ende av genet. Det unike Ncol-sete i plasmidet fjernes ved setestyrt mutagenese av sekvensen TCCATGGGC til sekvensen TCGATGGGC, og samtidig inn-føres et nytt Ncol-sete ved startkodonet ved endring av sekvensen AACATGGC til ACCATGGC. Begge endringer bevarer den kodete aminosyresekvens. EcoRI/NcoI-fragmentet på 1,0 kb som inneholder den modifiserte IPNS-promoter gelisoleres fra pUTZ-2, og ligeres inn mellom EcoRI- og Ncol-setet i vektoren ovenfor, med det endrede hydroksylasegen. Deretter endres det unike EcoRI-sete i den resulterende vektor til et Hindlll-sete ved setestyrt mutagenese. 5' IPNSihydrokylsasefusjons-konstruktet isoleres fra den resulterende vektor som et HindiII-fragment, som så ligeres inn i det unike Hindlll-sete i vektoren pEXP-1 beskrevet ovenfor. Den endelige vektor inneholder ekspandase- og hydroksylasegenet, hvert drevet av en IPNS-promoter, og pleomycinresistensmarkøren drevet av p-tubulinpromoteren.

Eksempel 12

Konstruksjon av Penici11 ium-transformasjonsvektoren pPenCACT

Inkorporering av hygromycinresistensgenet

En Penicillium-transformasjonsvektor ble konstruert med et hydromycinreistensgen som dominant seleksjonsmarkør. Hygromycin B-fosfortransferasegenet fra E. coli ble isolert (ved elektroforese i og eluering fra agarosegeler) som et BamHI-fragment med 1,15 kb fra vektor pHph-1 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) og ligert til BamHI-kuttet vektor mpl9. Orienteringen av hygromycinresistensgenet i mpl9 ble bestemt ved restriksjonsenzymanalyse av RF-DNA. Det 5' BamHI-sete ligger nær ATG-startkodonet i hygromycinresistensgenet. For å forenkle plassering av en alternativ promoter ved dette 5' BamHI-sete ble det 3' BamHI-sete fjernet ved setestyrt mutagenese, ved bruk av "Mutator" Site Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA). Mutagenesen ble utført ifølge produsentens instruksjoner. Et oligonukleotid ble konstruert for komplementering av DNA-området fra det 3' BamHI-sete, fra den publiserte sekvens av hygromycin B fosfotransferasegenet fra E. coli (Gritz, L. og Davis, J., 1983, Gene 25, 179). Oligonukleotidet ble syntetisert ved cyanoetyl-fosforamiditt-kjemi (Pharmacia Gene Assembler-instrumentering), og oligosekvensen var som følger:

Sekvensid. nr. 10

Mutagenesen ble bekreftet ved restriksjonsenzymanalyse. Det muterte hygromycinresistensgen ble så isolert som et Smal/Xbal-fragment (ved elektroforese i og eluering fra agarosegeler), og ligert inn i Smal/Xbal-kuttet vektor pUC 18. IPNS-promoteren fra Penicillium ble isolert (ved elektroforese i og eluering fra agarosegeler) som et Ncol-fragment på 1,2 kb fra den Ncol-kuttede vektor pUTZ-2 (vektor tidligere beskrevet). Syntetiske oligonukleotidlinkere ble syntetisert for å danne et BamHI-sete fra Ncol-setene i endene av IPNS-promoterfragmentet, for å kunne plassere IPNS-promoteren i det 5' BamHI-sete nær ATG i hygromycinresistensgenet. Oligoene ble syntetisert ved cyantoetyl-fosforamiditt-kjemi (Pharmacia Gene Assembler-instrumentering), og oligoenes sekvens er som følger:

Sekvensid. nr. 11

Sekvensid. nr. 12

Denne sekvens bibeholder den native sekvens av IPNS-promoteren, men innsetter to aminosyrer i hygromycinresistensgenet. Oligoene ble hybridisert, fosforylert og ligert til Ncol-kuttet IPNS-promoterfragment, og ga BamHI-seter i både den 5' og 3' ende av IPNS-promoterfragmentet. Denne promoter påsatt linkere ble ligert til BamHI-kuttet hygromycinresistensgen i pUC 18, og orienteringen ble bekreftet ved restriksjonsenzymanalyse. Denne IPNS-promoter:hygromycinresistensgenkassett ble så isolert (ved elektroforese i og eluering fra agarosegeler) som et Xhol/SalI-fragment på 2,1 kb (Xhol-setet ligger ved den 5' ende av IPNS-promoteren, og Sall-setet er fra pUC-polylinkeren), og ligert inn i Sali-kuttet vektor pSELECT. Orienteringen av kassetten ble bestemt ved restriksjonsenzymanalyse. Denne vektor ble kalt pPINS/HYG.

Inkorporering av acetyltransferasegenet fra Cephalosporium acremonium

Acetyltransferasegenet fra Cephalosporium ble isolert fra en genomisk klon (beskrevet ovenfor) som et Bglll/Sall-fragment på 1,8 kb, ved elektroforese i og eluering fra agarosegeler. Acetyltransferasegenet ble ligert inn i BamHI/SalI-kuttet vektor pSELECT. For å forenkle plasseringen av IPNS-promoteren fra Penicillium ved ATG i acetyltransferasegenet fra Cephalosporium ble et nytt Ncol-sete dannet ved ATG i acetyltransferasegenet, og et internt Ncol-sete i det strukturelle gen fjernet ved setestyrt mutagenese ved bruk av "Altered Sites" in vitro mutagenesesystemet {Promega Corporation). Mutagenesen ble utført ifølge produsentens instruksjoner. 01igonukleotidene ble konstruert for å komplementere den kodende sekvens i de angjeldende DNA-områder fra sekvensen av acetyltransferasegenet fra Cephalosporium gitt ovenfor i sekvensid. nr. 1 og 2. Oligonukleotidsekvensen som ble benyttet for fjerning av det interne Ncol i det strukturelle gen var som følger:

Sekvensid. nr. 13

Oligonukleotidsekvensen som ble benyttet for å danne det nye Ncol-sete ved ATG-startkodonet var som følger:

Sekvensid. nr. 14

Disse oligonukleotider ble syntetisert ved cyanoetyl-fosfor-amidittkjemi (Pharmacia Gene Assembler-instrumentering). Mutagenesen ble bekreftet ved restriksjonsenzymanalyse. Denne vektor ble kalt pMUTACT.

IPNS-promoteren fra Penicillium ble isolert (ved elektroforese i og eluering fra agarosegeler) som et Ncol-fragment på 1,2 kb fra vektor pUTZ-2 beskrevet i et eksempel ovenfor. Dette promoterfragment ble ligert til Ncol-kuttet vektor pMUTACT, som nå plasserte IPNS-promoteren direkte ved ATG i acetyltransferasegenet fra Cephalosporium acremonium. Promoterens orientering ble bekreftet ved restriksjonsenzymanalyse. Denne IPNS-promoter:acetyltransferasegenkassett ble kuttet med Xhol/Sall (Xhol-setet er plassert ved IPNS-promoterens 5' ende, og Sall-setet er ved acetyltransferase-genets 3') og ligert inn i Sall-kuttet vektor pSELECT. Orienteringen av fragmentet ble bestemt ved restriksjonsenzymanalyse. Denne vektor ble kalt pMUTACT/IPNS.

Mutagenesen som ble benyttet for å danne det nye Ncol-sete ved ATG i acetyltransferasegenet førte til en endring i den annen aminosyre fra serin til alanin. For å beholde den kodende sekvens identisk med det native gen ble en setestyrt mutagenese utført ved hjelp av "Altered Sites" in vi tro mutagenesesystemet. Oligonukleotidet ble konstruert for å komplementere den kodende sekvens i det angjeldende DNA-område fra sekvensen av acetyltransferasegenet vist ovenfor som sekvensid. nr. 1 og 2. Oligonukleotidsekvensen som ble benyttet for å endre den annen aminosyre fra alanin til serin var som følger:

Sekvensid. nr. 15

Oligonukleotidet ble syntetisert ved bruk av cyanoetyl-fosfor-amidittkjemi (Pharmacia Gene Assembler-instrumentering). Mutagenesen ble bekreftet ved DNA-sekvensering ved bruk av USB sekvenase, versjon 2.0 DNA Sequencing Kit (USB, Cleveland, Ohio). Sekvenseringsprimere ble syntetisert ved bruk av cyanoetyl-fosforamidittkjemi (Pharmacia Gene Assembler-instrumentering) . Denne vektor ble kalt pMUTACT/IPNS-2.

IPNS-promoter:hygromycinresistensgenkassetten ble fjernet fra vektor plPNS/HYG som et Xbal-fragment og ligert inn i Xbal-kuttet vektor pMUTACT/IPNS-2 slik at den endelige transformasjonsvektor pPenCACT ble dannet. Orienteringen av hygromycinkassetten ble bestemt ved restriksjonsenzymanalyse.

Eksempel 13

Konstruksjon av en Penicillium-transformasjonsvektor pTS-8 for ekspresjon av både ekspandase/hydroksylase- og acetyltransferase-genet fra Cephalosporium acremonium

Acetyltransferasegenet fra Cephalosporium ble isolert (ved elektroforese i og eluering fra agarosegeler) som et Bglll/Sall-fragment på 1,8 kb fra en genomisk klon og ligert inn i en BamHI/SalI-kuttet vektor pSELECT (Promega Corporation). For å forenkle plassering av IPNS-promoteren fra Penicillium ved en ATG i acetyltransferasegenet fra Cephalosporium ble et nytt Ncol-sete dannet ved et ATG-kodon plassert ved base -42 (Mathison et al., Current Genetics, innsendt), og et internt Ncol-sete i det strukturelle gen ble fjernet ved setestyrt mutagenese ved bruk av "Altered Sites" in vi tro mutagenesesystemet (Promega Corporation). Mutagenesen ble ut-ført ifølge produsentens instruksjoner. Oligonukleotidene ble konstruert for å komplementere til den kodende sekvens i de angjeldende DNA-områder, men flere endringer ble innført for å danne eller fjerne et Ncol-sete. Oligonukleotidsekvensen som ble brukt for å fjerne det interne Ncol-sete i det strukturelle gen var som følger:

Sekvensid. nr. 16

Oligonukleotidsekvensen som ble benyttet for å danne det nye Ncol-sete ved ATG ved base -42 var som følger:

Sekvensid. nr. 17

Oligonukleotidene ble syntetisert ved cyanoetyl-fosforamiditt-kjemi (Pharmacia Gene Assembler-instrumentering). Begge muta-genesenhendelser ble bekreftet ved restriksjonsenzymanalyse. Denne vektor ble kalt pMUTACT. IPNS-promoteren fra Penicillium ble isolert (ved elektroforese i og eluering fra agarosegeler) som et Ncol-fragment på 1,2 kb fra vektor pUTZ-2, beskrevet nærmere ovenfor. Dette promoterfragment ble ligert til Ned-kuttet vektor pMUTACT, noe som plasserte IPNS-promoteren direkte ved ATG i posisjon -42 i acetyltransferasegenet fra Cephalosporium. Promoterens orientering ble bekreftet ved restriksjonsenzymanalyse. Denne vektor ble kalt pMUTACT/IPNS. Et Xhol/Call-fragment på 2,5 kb som inneholdt IPNS-promoter:acetyltransferasegenkassett ble isolert (ved elektroforese i og eluering fra agarosegeler) fra vektor pMUTACT/IPNS, og ligert til en Sali-kuttet vektor pUZT-2 (beskrevet tidligere). Dette vektorintermediat ble så kuttet med Xbal og ligert til et Xbal-fragment på 2,1 kb fra vektor pPEN/CEPH-1 (beskrevet tidligere) som inneholdt IPNS-promoter:ekspandase/hydroksylasekassetten, slik at den endelige transformasjonsvektor pTS-8 ble dannet.

Eksempel 14

Transformasjon av Penicillium chrysogenum

Protoplaster fra Penicillium chrysogenum-stammen beskrevet ovenfor ble dannet ved inokulering av 50 ml CM-medium med 1 x IO<7> sporer i 67 timer ved 25 °C i en rotatorisk ristemaskin ved 220 rpm. Myceliet ble oppsamlet ved filtrering gjennom osteklede, overført til 500 ml flasker og resuspendert i 25 ml KMP (0,7 M KCl, 0,8 M mannitol, 0,02 M KP04 pH 6,3), med 100 mg Novozym 234 (Novo BioLabs, Bagsværd, Danmark), og inkubert ved 30 °C ved 100 rpm. Sfæroplastene ble isolert ved filtrering gjennom osteklede/glassullfilter, og nedsentrifugert ved 350 x g i 10 minutter. Sfæroplastene ble så vasket tre ganger med 10 ml KMP-buffer, og så resuspendert i KMPC (KMP med 50 mM CaCl2) til en konsentrasjon på 5 x 10<7 >celler/ml, og hensatt ved romtemperatur i 20 minutter. For transformasjon av Penicillium ble 200 ul sfæroplastsuspensjon tilsatt DNA (5 ug vektor-DNA i 6,2 ul KMPC med 5 mg/ml heparin), sammen med 50 ul PPC (40 % PEG MW 3500, 20 mM KP04, pH 6,3, 5 % CaCl2 ble tilsatt like før bruk), og transformasjonsblandingen ble inkubert på is i 30 minutter. 1 ml nylaget PPC ble tilsatt, og blandingen ble overført til 50 ml smeltet (50 °C) regenerasjonsagar (CM + 1,3 M mannitol og 3 % agar). Transformasjonsblåndingen ble så fordelt på fem petriskåler. Etter regenerering i 24 timer ved 25 °C ble skålene overlagt med OL (1 % pepton i 1 % agar) med 100 ug/50 ml pleomycin. Mengden overlagt løsning var lik mengden regenerasjonsagar. Skålene ble inkubert ved 25 °C i 7-14 dager, og observert for dannelse av transformante kolonier.

Eksempel 15

Bioaktivitetsanalyser

En agardiffusjonsbioanalyse ble benyttet for å bestemme antibiotisk aktivitet av de HPLC-isolerte adipoyl-6-

APA- og adipoyl-7-ADCA-fermenteringsproduktene. 20 ul isolert produkt ble påsatt 5 mm papirsirkler på en LB-agarskål (20 g/l LB-mediumbase med 3 % agar (Gibco, Paisley, Skottland) inoku-lert med Bacillus subtilis ATCC 33677, eller en supersensitiv E. coli-stamme (erholdt fra Prof. Arnold L. Demain, MIT). Bacillus subtilis ble benyttet som indikatorstamme for analyse av adipoyl-6-APA-produktet, og den supersensitive E. coli-stamme ble benyttet som indikatorstamme for analyse av adipoyl-7-ADCA-produktet. Etter 15 timers inkubering ved 37 °C viste en halo med hemmet vekst av indikatorbakterien rundt papirsirkelen at produktene hadde bioaktivitet. Kontrollene i dette forsøk omfattet deacetoksycefalosporin C, cefalosporin C, penicillin V og agar med penicillinase eller uten penicillinase som kontroll for bekreftelse av p-laktamstrukturer.

Eksempel 16

HPLC-metode for samtidig analyse av adipoyl-: 6-APA, 7-ADCA, 7-ADAC og 7-ACA

Fermenteringsprodukter fra transformerte Penicillium-stammer (adipoyl-6-APA, adipoyl-7-ADCA, adipoyl-ADAC og adipoyl-7-ACA) ble samtidig analysert ved væskekromatografi med høy yteevne (HPLC). HPLC-systemet bestod av følgende komponenter fra Waters: 625 løsemiddelleveringssystem, 409E variabel bølgelengdedetektor (innstilt på 220 nm og 260 nm), 825 Maxima datasystem. Den stasjonære fase var en Nova-Pak CiB 5 x 100 mm radialkompresjonspatron med innsatt Nova-Pak Ci8 Guard-Pak. Den mobile fase (ved 1 ml/minutt gjennomstrømnings-hastighet) bestod av en 10 minutters lineær gradient fra ut-gangsbetingelsene med 5 % metanol og 95 % 10 mM KP04, pH 5 til 40 % metanol og 60 % KP04, pH 5. Adipoyl-6-APA ble kvantitert ved sammenligning med en standardkurve av penicillin N ved 220 nm. De ekspanderte produkter ble kvantitert ved sammenligning med standardkurver ved 260 nm av syntetisk adipoyl-7-ADCA og adipoyl-7-ACA.

Eksempel 17

RAEV-enzymanalyser

Kjemisk syntetisert adipoyl-7-ADCA og adipoyl-7-ACA ble benyttet som substrater for å bestemme den spesifikke aktivitet av RAEV-enzymet (kommersielt tilgjengelig fra RAEV Corp.). Reaksjonsblandingen inneholdt 10 mM substrat, 1 ug RAEV-enzym, 5 % glyserol i 0,16 M KH2P04 i et totalvolum på 50 ul, og ble inkubert ved 37 °C. (Mer optimale reaksjons-betingelser omfattet bruk av 20 mM eller mer substrat i 20-50 mM kaliumfosfatbuffer). Porsjoner på 5 ul ble tatt ut ved tidspunktene 0, 1, 3, 5, 10, 20 og 30 minutter, fortynnet med 35 ul 0,010 M KH2P04 pH 3,5, og nedfrosset ved -70 °C før analyse ved HPLC under betingelser beskrevet ovenfor. Aktivitet av RAEV-enzymet mot et kolorimetrisk adipoyl-P-aminobenzosyresubstrat ble analysert ved bruk av 5 mM substrat, 8,25 ug RAEV-enzymet, 10 % glyserol i 0,065 M KH2PO4 pH 7,0, i et totalvolum på 50 ul i 3 0 minutter ved 37 °C. Reaksjonen ble utført i en 96-brønners mikrotiterplate. 50 ul av 1/100-fortynning av en molar NaN02 i 0,25 M eddiksyre ble tilsatt for terminering av reaksjonen, og blandingen fikk stå ved romtemperatur i 3 minutter. 100 ul av en 1/100-fortyn-ning i 0,5 M NaC03 av en 10 mg/ml løsning av 4-amino-5-hydroksy-2,7-naftalen-disulfonsyre, mononatriumsalt-hydrat i H20 ble tilsatt og fargeutviklingen ble målt umiddelbart ved 515 nm ved bruk av en EL 312 Bio-Kenetics plateleser (BioTek Instruments).

Eksempel 18

Vurdering av alternative adipoyl-acylaser

I tillegg til undersøkelsene hvor RAEV-enzymet ble benyttet kunne fjerning av adipoyl-sidekjeden fra adipoyl-7-ADCA (og andre adipoylforbindelser) påvises med enzymer produsert fra en rekke mikrobielle kilder. I en innledende under-søkelse ble Asahi-stammene SE-83 og SE-495 av Pseudomonas sp.

(deponert hos Fermentation Research Institute under aksesjons-numrene FERM BP-817 henholdsvis FERM BP-818) og Toyo Jozo-stammen SY-77-1 av Pseudomonas (deponert hos Northern Regional Research Laboratory under aksesjonsnummer NRRL B-8070) dyrket i 72 timer i et medium som inneholdt 2,0 % (vekt/vol) HyCase SF, 0,5 % (vekt/vol) mononatriumglutamat, 0,5 % (vekt/vol) gjærekstrakt, 0,2 % (vekt/vol) maisekstraktpulver, 0,5 %

(vekt/vol) bomullsfrøolje og 0,1 % (vekt/vol) glutarsyre. Celler ble festet ved sentrifugering og vasket med 50 mM fosfatbuffer, pH 8,0, de ble så resuspendert i buffer og de ytre membraner permeabilisert ved tilsetning av et lite volum kloroform. Porsjoner med cellesuspensjon ble så blandet med adipoyl-para-nitroanilid (ad-pNA) og inkubert ved 3 0 °C i tidsrom fra 2 til 18 timer. Etter inkuberingen ved blandingene surgjort ved tilsetning av 10 % (vol/vol) eddiksyre. Frigjort p-nitroanilin ble så påvist ved kolometriske metoder etter overføring til en diazoforbindelse ved bruk av reagensene erholdt som et sett fra Sigma Chemical Company for analyse av y-glutamyltransferase (Sigma produkt nr. 545-A). De relative aktiviteter av de tre stammer var 100 %, 85,5 % og 48 % for henholdsvis SE-495, SE-83 og SY-77-1. Ved bruk av fremgangsmåter som tilsvarer den beskrevet for RAEV-enzymet ovenfor ble også aktivitet av SE-83- og SE-495-enzymet på adipoyl-7-ADCA påvist. Produksjon av p-laktamase av SY-77-1 forhindret påvis-ning av deacyleringsaktivitet av denne stamme på adipoyl-7-ADCA.

Ved tilsvarende metoder ble adipoyl-acylaseproduksjon også påvist i to soppstammer ( Alternaria sp. MA-133, ATCC nr. 20492 og Aspergillus sp. MA-13, ATCC nr. 20491, se US

4 141 790 til Meiji Seika Kaisha Ltd.) og ytterligere tre bakteriestammer (en Brevibacterium, ATCC nr. 14649, en Achromobacterium, ATCC nr. 14648 og en Flavobacterium, ATCC nr. 14650, som ble beskrevet som cefalosporin C acylase-produsenter i US 3 239 394, til Merck & Co., Inc.).

Claims (6)

1. Biologisk fremgangsmåte for fremstilling av 7-aminodeacetylcefalosporansyre (7-ADAC), karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: a) dyrking i et dyrkingsmedium som kan opprettholde dens vekst av en stamme av Penicillium chrysogenum som produserer isopenicillin N, og tilsetning til dyrkingsmediet av et adipatfor som omfatter én eller flere av adipinsyre, eller dets salter og estere som kan tas opp og benyttes av Penicillium chrysogenum-stammen for produksjon av adipoyl-6-aminopenicillansyre (adipoyl-6-APA), hvorved adipoyl-6-APA dannes, b) utførelse av følgende enzymatiske omdannelser ved in situ-ekspresjon av det tilsvarende gen: i) adipoyl-6-APA ringekspanderes in situ av ekspandaseenzym slik at adipoyl-7-aminodesacetoksycefalosporansyre (adipoyl-7-ADCA) dannes, hvori P. chrysogenum-stammen er transformert med DNA som koder for aktiviteten av ekspandaseenzymet som aksepterer adipoyl-6-APA som substrat, hvorpå, som en følge av dets ekspresjon, adipoyl-6-APA produsert av stammen også deretter ringekspanderes in situ slik at adipoyl-7-ADCA dannes, ' ii) 3-metylsidekjeden i adipoyl-7-ADCA hydroksyleres in situ av hydroksylaseenzym slik at adipoyl-7-aminodeacetylcefalosporansyre (adipoyl-7-ADAC) dannes, hvori P. chrysogenum-stammen er transformert med DNA som koder for aktiviteten av hydroksylaseenzymet som kan akseptere adipoyl-7-ADCA som substrat, hvorpå, som en følge av dets ekspresjon, adipoyl-7-ADCA produsert av stammen også deretter hydroksyleres in situ slik at adipoyl-7-ADAC dannes, og c) adipoyl-7-ADAC bringes i kontakt med en adipoylamidase, hvorved adipoylsidekjeden fjernes og 7-ADAC-produktet dannes, hvoretter dette produkt isoleres.

2. Biologisk fremgangsmåte for fremstilling av 7-amino-cefalosporansyre (7-ACA), karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: a) dyrking i et dyrkingsmedium i stand til å opprettholde dens vekst av en Penicillium chrysogenum-stamme som produserer isopenicillin N, og tilsetning til dyrkingsmediet av et adipatfor som omfatter én eller flere av adipinsyre, eller dets salter og estere, som kan assimileres og utnyttes av Penicillium chrysogenum-stammen for produksjon av adipoyl-6-aminopenicillansyre (adipoyl-6-APA), hvorved adipoyl-6-APA produseres, b) utførelse av følgende enzymatiske omdanninger ved in situ-ekspresjon av det tilsvarende gen: i) adipoyl-6-APA ringekspanderes in situ av ekspandaseenzym slik at adipoyl-7-aminodesacetoksycefalosporansyre (adipoyl-7-ADCA) dannes, hvori P. chrysogenum-stammen er transformert med DNA som koder for aktiviteten av ekspandaseenzymet som kan akseptere adipoyl-6-APA som substrat, hvorpå, som en følge av dets ekspresjon, adipoyl-6-APA produsert av stammen også deretter ringekspanderes in situ slik at adipoyl-7-ADCA dannes, ii) 3-metylsidekjeden i adipoyl-7-ADCA hydroksyleres in situ av hydroksylaseenzym slik at adipoyl-7-aminodeacetylcefalosporansyre {adipoyl-7-ADAC) dannes, hvori P. chrysogenum-stammen er transformert med DNA som koder for aktiviteten av hydroksylaseenzymet som kan akseptere adipoyl-7-ADCA som substrat, hvorpå, som en følge av dets ekspresjon, adipoyl-7-ADCA produsert av stammen også deretter hydroksyleres in situ slik at adipoyl-7-ADAC dannes, og iii) adipoyl-7-ADAC acetyleres in situ av acetyltransferaseenzym slik at adipoyl-7-aminocefalosporansyre (adipoyl-7-ACA) dannes, hvori P. chrysogrenum-stammen er transformert med DNA som koder for aktiviteten av acetyltransferasegenet, som kan akseptere adipoy1-7-ADAC som substrat, hvorpå, som en resultat av dets ekspresjon, adipoyl-7-ADAC produsert av stammen også deretter acetyleres in situ slik at adipoyl-7-ACA dannes, og c) adipoyl-7-ACA bringes i kontakt med en adipoylamidase, hvorved adipoylsidekjeden fjernes og 7-ACA-produktet dannes, hvoretter dette produkt isoleres.

3. Biologisk fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at adipatforet er dinatriumadipat.

4. Biologisk fremgangsmåte ifølge krav 1, 2 eller 3, karakterisert ved at det DNA som koder for aktiviteten av ekspandase-, hydroksylase- og acetyltransferase-enzymet er avledet fra Cephalosporium acremonium.

5. Biologisk fremgangsmåte ifølge krav 1 til 4, karakterisert ved at et enkelt, bifunksjonelt ekspandase/hydroksylaseenzym benyttes.

6. Biologisk fremgangsmåte ifølge krav 1 til 5, karakterisert ved at ved at adipoylamidasen er avledet fra en Pseudomonas-art.