RO116648B1 - Bioprocedeu pentru prepararea acidului 7-amino-3-deacetil-cefalosporanic si a acidului 7-aminocefalosporanic - Google Patents

Abstract

Inventia se refera la un bioprocedeu pentru prepararea acidului 7-amino-3-deacetil-cefalosporanic si a acidului 7-aminocefalosporanic, din acid adipic sau din una sau mai multe dintre sarurile si esterii sai, care au capacitatea sa fie asimilati si utilizati de catre tulpina Penicillium chrysogenum, pentru a produce acid adipoil-6-amino-penicilanic, urmata de transformarea unei tulpini de Penicillium chrysogenum cu o gena care codifica o expandaz-enzima derivata, preferabil, din Cephalosporium acremoniu, care va transforma, in situ, acidul adipoil-6-amino-penicilanic, in acid adipoil 7-amino-deacetoxicefalosporanic, transformarea unei tulpini de Penicillium chrysogenum care produce izopenicilina N cu o gena care codifica o enzima hidroxilaza derivata, preferabil, din Cephalosporium acremoniu, care va transforma, in situ, acidul adipoil-7-amino-deacetoxicefalosporanic, in acid adipoil 7-amino-deacetilcefalosporanic, care va fi supus, in continuare, transformarii enzimatice pentru a obtine acidul 7-amino-3-deacetil-cefalosporanic si acidul 7-aminocefalosporanic.

Description

Invenția se referă la un bioprocedeu pentru prepararea acidului 7-amino-3-deacetilcefalosporanic (7-ADAC) și a acidului 7-cefalosporanic (7-ACA), din acid adipic sau din una sau mai multe din sărurile și esterii săi, care au capacitatea să fie asimilați de către tulpina Penicilium chrysogenum, derivați cefalosporinici utilizați în domeniul metodelor de preparare, prin sinteză, a antibioticelor cefalosporinice comerciale.

Sunt cunoscute, din EP 0281391 și EP 437378, procedee pentru producerea fermentativă a derivaților de cefalosporină, cu ajutorul microorganismelor transformate, astfel încât să exprime enzime ale metabolismului cefalosporinelor. Mai exact, în EP 0281391, este descrisă izolarea și identificarea secvenței DNA a genei DAOCS/DACS, obținută de la C.acremononium ATCC 11550, împreună cu secvența de aminoacizi care corespunde enzimei, iar în EP 437378, este descrisă enzima acetil-transferaza a

C. acremononium.

Sunt cunoscute, în prezent, un număr semnificativ de antibiotice din clasa cefalosporinelor, care sunt acum la a patra generație. Marea varietate de catene găsite în cefalosporinele comerciale și importanța lor economică, semnificativă, a făcut să crească necesitatea găsirii unor metode mai economice și eficiente, pentru prepararea intermediarilor cheie, care permit sinteza imediată a diverselor cefalosporine.

Unul din acești intermediari cheie este acidul 7-amino-cefalosporanic (7-ACA), care poate fi reprezentat prin următoarea formulă generală:

h₂n_^^^s^ <Λγ^Η3

COOH

De obicei, 7-ACA se produce de la cefalosporina C. Cefalosporina, Ceste ea însăși un produs de fermentație care este punctul de plecare pentru aproape toate cefalosporinele comercializate, în mod curent. Cu toate acestea, manipularea sintetică pentru a produce diferite cefalosporine comerciale de bază pornește, în cele mai multe cazuri, cu acid 7-amino-cefalosporanic, care trebuie derivat de la cefalosporina C, prin clivarea catenei 7-aminoadipoil. Cefalosporinele comerciale tipice derivate sintetic de la 7-ACA și care au catenă 3-acetiloximetilen includ cefotaxima, cefaloglicina, cefalotina și cefapirina.

Alt intermediar cheie este acidul 7-aminodeacetil-cefalosporanic (7-ADAC), care poate fi reprezentat prin următoarea formulă generală:

De obicei, 7-ADAC este, de asemenea, produs de la cefalosporina C, prin îndepărtarea catenei 7-D-a-aminoadipoil împreună cu conversia catenei 3acetiloximetilenezidă la 3-hidroximetil. 7-ADAC este un compus intermediar, folosit în sinteza cefalosporinelor care conțin substituenți modificați la poziția C-3.

A

RO 116648 Bl în mod curent, metoda aleasă pentru clivarea catenei 7-aminoadipoil este o 35 metodă chimică. Procesul de bază imină-halidă necesită blocarea grupărilor amino și carbonil pe catena 7-aminoadipoil și pentru aceasta se folosesc de obicei mai multe metode. Cu toate acestea, așa cum este în prezent folosit, procedeul chimic de clivaj prezintă serioase dezavantaje. Printre acestea sunt cerințele unui procedeu complex, în mai multe etape, temperaturile extrem de scăzute pentru operare, reactivi scumpi, 40 cantități semnificative de produse secundare ale procedeului, rezultate în timpul tratării efluentului și purificarea unei materii prime extrem de impure, înaintea începerii tratamentului chimic. Ca urmare, s-a inițiat o cercetare pentru un procedeu microbiologic sau fermentativ, care ar putea permite deacilarea enzimatică a cefalosporinei C pentru a asigura acidul 7-amino-cefalosporanic pe o bază mai economică 45 decât procedeul chimic folosit de obicei.

Cu toate acestea, cercetarea pentru un procedeu microbiologic de succes a fost în mare măsură inutilă. Acesta este un rezultat știut clar, din literatură, structura și, în special, stereochimia catenei de aminoadipoil de la molecula cefalosporinei C, din moment ce penicilina a fost deacilată cu succes, prin clivaj enzimatic, folosind penicilin- 50 acilaza produsă de o varietate de microorganisme. Lucrări asupra deacilării enzimatice, cu succes, într-o singură etapă, ale cefalosporinei Cdin literatură, pe de altă parte, sunt adeseori nereproductibile sau furnizează numai randamente extrem de nesemnificative.

Eforturi continue în domeniu, pentru a inventa un astfel de bioprocedeu, au fost experimentate repetat și fără succes. De exemplu, EP-O 422790 descrie un DNA care 55 codifică activitatea izopenicilinei N:acil-coA acetil transferază de la Aspergillus nidulans și folosirea sa în generarea de cefalosporine, folositoare în obținerea de penicilină din fungi, care nu au fost realizate până acum, în domeniu. Dar aceasta este descrisă pe calea desprinderii sau dislocării genei acetiltransferazei, cu adăugarea genelor care codifică epimeraza și expandaza de la organisme producătoare de cefalosporine; mai 60 mult decât atât, în prezent nu s-a obținut un rezultat folositor pentru transformare și expresie. Mai mult, fiind reușită transformarea, ea încă nu ar fi folositoare pentru scopurile invenție, din moment ce rămâne încă problema de a îndepărta catena D-aaminoadipoil. Astfel, o încercare nereușită în domeniu pentru obținerea de rezultate semnificative pentru producerea de intermediari comerciali pentru cefalosporine de la 65 culturi de peniciline producătoare de fungi este într-un contrast complet față de rezultatele atinse, prin procedeul din prezenta invenție.

Etapa enzimatică a bioprocedeului de extindere a ciclului adipoil-6-ΑΡΑ se realizează cu o enzimă de extindere a ciclului, denumită expandaz-enzima care este produsul de expresie al unei gene care codifică o enzimă de mărire a ciclului cu care 70 gazda, P. Chrysogenum, nerecombinantă, a fost transformată. Folosirea unei astfel de expandaz-enzime a fost cercetată în stadiul tehnicii. De exemplu, Cantwell și colab., în Curr Genet(1990) 17: 213-221, au propus un bioprocedeu pentru prepararea 7-ADCA, prin extinderea ciclului penicilinei V, urmată de hidroliza enzimatică a deacetoxicefalosporinei V, rezultate pentru a forma 7-ADCA. Această propunere se 75 bazează pe accesibilitatea unie gene expandază (cefE) de la o clonă de penicilină N de la S. Clavuligerus: Kovacavic și colab., J. Bacteriol. (1989) 171: 754-760; și Ingolia și colab., US 5070020. Totuși, din moment ce expandaz-enzima operează asupra penicilinei N, substratul său natural, dar nu asupra penicilinei V, propunerea necesită

RO 116648 Bl inginerie genetică pentru a produce o genă care codifică expandaz-enzima modificată astfel încât să poată extinde ciclul penicilinei V. Cerința modificării nu a fost realizată de către Cantwel și colab., totuși ei au reușit numai transformarea Penicillium chrysogenum cu gena cefe de la Streptomyces clavuligerus și atingerea unui nivel scăzut de expresie al enzimei DADCS (expandaz-enzima).

Expandaz-enzima a fost bine studiată în domeniu, atât în ce privește activitatea sa, cât și secvența genetică. De exemplu, în US 4510246 și 4536476, Wolfe a izolat separat enzimele ciclază, epimerază și de extindere a ciclului dintr-un extract de celule din organisme procariote, producătoare de β-lactamă, incluzând Streptomyces clavuligerum pentru a furniza reactivi enzimatici stabili. Dotzlaf US 5082772 (EP-A-O 366354) descrie o expandaz-enzimă izolată și purificată de la S. Clavuligerus care este caracterizată inclusiv printr-un rest terminal și succesiunea de aminoacizi și se afirmă că are o greutate moleculară de aproximativ 34600 daltoni. Aceasta este în contrast cu greutatea moleculară de 29000 daltoni prezentată în US 4536476. în EP-O 233715, se descrie izolarea și structura endonucleazelor de restricție, care caracterizează gena ce codifică expandaz-enzima obținută de la S. Clavuligerus și expresia unei expandaz-enzime recombinante, care codifică DNA (expandaz-enzimă puțin activă) dintr-o tulpină S. clavuligerus lipsită de capacitatea de producere a cefalosporinei. Ingolia și colab., în US 5070020 (EP-A-O 341892), descriu secvența DNA care codifică expandaz-enzima obținută de la S. clavuligerus și transformarea unei tulpini de P. chrysogenum cu un vector de expresie care conține numita secvență DNA, prin care se obține expresia expandaz-enzimei. Deși se sugerează că această enzimă este folositoare pentru extinderea ciclurilor, altele decât penicilina N, până în prezent, nu există demonstrația unei astfel de extinderi.

Lucrarea descrisă mai sus este îndreptată asupra expandaz-enzimei derivată de la procariote ca S. clavuligerus. 0 enzimă care are, aparent, aceeași activitate de extindere a ciclului este, de asemenea, exprimată de către tulpinile eucariote Cephalosporium acremoniumm (cunoscută, de asemenea, ca Acremonium chrysogenum]. Totuși, în astfel de tulpini, activitatea de mărire a cilului este exprimată printr-o genă bifuncțională (cefEFl. care exprimă, de asemenea, activitate DACS (hidrolază) ale cărei funcții naturale sunt de a converti acidul dezacetoxicefalosporanic (DAOC) produs al expandaz-enzimei la deacetilcefalosporină C (DAC). Rezultatul acestei expresii este o singură enzimă, dar bifuncțională expandază/hidrolază. în timp ce au existat eforturi pentru a separa activitățile acestor două produse genetice, nici unul nu a avut încă succes. De exemplu, EP-O 281391 descrie izolarea și identificarea secvenței DNA a genei DAOCS/DACS obținută de la C. acremonium ATCC 11550 împreună cu secvența de aminoacizi care corespund enzimei. S-a transformat Penicillium, astfel încât să se exprime enzimele, însă, conversia așteptată a penicilinelor G și V la cefalosporinele corespunzătoare nu s-a demonstrat niciodată. în plus, în ciuda unei sugestii că tehnicile de inginerie genetică asigură mijloace sigure pentru a separa informația genetică care codifică DAOCS de DACS și separarea expresiei lor, până în prezent, nu se menționează demonstrarea unei astfel de separări.

Enzimă DAOCS/DACS (expandază/hidrolază] de la C. acremonium a fost, de asemenea, bine studiată în domeniu cu privire atât la activitatea și caracteristicile sale, cât și la secvența de nucleotide. De exemplu, în cererile US 4178210, US 4248966

A

RO 11664$ Bl

125 și US 4307192, diferite materii prime de tipul penicilinei s-au tratat cu extract liber de celule de la C. acremonium care epimerizează și extind ciclul pentru a da un produs antibiotic cefalosporinic. Wu-Kuang Yeh, în brevetul US 4753881, descrie enzima C. acremonium, punctul său izoelectric, greutăților moleculare, succesiunea de aminoacizi raportului activităților hidrolazei față de expandază și fragmentele peptidice.

Enzima acetil-transferază a C. acremonium a fost, de asemenea, descrisă în domeniu în ce privește activitatea sa, caracteristici, configurația de restricție și a secvențelor de nucleotide și aminoacizi, de exemplu, în EP 437378 și EP 450758.

Stadiul tehnicii, discutat mai sus, are comun doar un singur aspect cu prezenta invenție, adică, transformarea unei tulpini cu gene, care exprimă enzimele expandază și expandază/hidrolază și obținerea expresiei acestor enzime. Stadiul tehnicii, cu toate acestea, a folosit numai enzime exprimate pentru extinderea ciclului penicilinei N, nu și pentru penicilinele G și V. Chiar în acest caz, penicilina N are o catenă în poziția a 7-a care nu poate fi clivată enzimatic, pentru a elibera o grupare amino.

De exemplu, producerea acidului 6-adipoilpenicilanic este cunoscută în domeniu; vezi, Ballio A. și colab., Nature (1960) 185: 97-99. Extinderea enzimatică a acidului 6adipoilpenicilanic, dar numai in vitro, este, de asemenea, cunoscuta în domeniu; vezi Baldwin și colab., Tetrahedron (1987), 43: 3009-3011 și EP-A-0 268343. și clivajul enzimatic al catenelor de adipoil este cunoscut în domeniu, vezi de exemplu, Matsuda și colab., J.Bact. (1987) 169: 5815-5820.

Catena de adipoil are următoarea structură:

C00H-(CH₂)₄-C0în timp ce două catene ale structurii strâns înrudite sunt cele ale glutarilului având următoarea structură:

COOH-(CH₂)₃-COși a (D)-a-aminoadipoilului care are formula:

COOH-CH(NH₂HCH₂)₃-CO-.

Clivajul enzimatic al catenelor glutarilului este cunoscut în domeniu, vezi, de exemplu, Shibuya și colab., Agric.Biol.Chem. (1981) 45: 1561-1567 și US 3960662; Matsuda și Komatsu, J.Bact. (1985) 163: 1222-1228; Matsuda și colab., J.Bact. (1987) 169: 5815-5820; JP. 53-086084 (1978-Banyu Pharmaceutical Co.Ltd.) și JP 52-128293 (1977-Banxu Pharmaceutical Co.Ltd.). De asemenea, EP 453048 descrie metode pentru îmbunătățirea activității de clivare a adipoilului a glutarilacilazei produsă de către Pseudomonas SY-77-1. Prin substituirea diferiților aminoacizi la diferite localizări din subunitatea alfa s-a observat o rată a clivajului adipoilului de trei până la cinci ori mai ridicată (de la adipoil serină).

Ar fi de notat că, deși EP-A-0 453048 demonstrează prezența unei acilaze cu activitate îmbunătățită împotriva catenelor adipoil, ea nu descrie nici o cale (fie chimică sau printr-un bioprocedeu analog în vreun fel celui descris în descrierea de fața) în care ar putea fi generată, în primul rând, o adipoil-cefalosporină.

130

135

140

145

150

155

160

165

170

RO 116648 Bl

Este cunoscut în domeniu că prima îndepărtare enzimatică a grupării amino de la o catenă (D)-a-aminoadipoil și o scurtare a acesteia cu o (D)-aminoacid-oxidază, când păstrează o catenă glutaril (GL-7), urmată de îndepărtarea catenei glutaril printr-o a doua enzimă (glutarilacilază). Un astfel de clivaj în două etape este descris în Matsuda US 3360662; EP 275901; JP 61-218057 [1988-Komatsu, Asahi Chemical Industry Co.J; WO 90/12110 (1990, Wong, Biopure Corp.) și EP 436355, Isogai și colab., also Bio/Technology (1991) 9: 188-191.

Este cunoscută, de asemenea, în domeniu, realizarea clivajului catenei (D)-aaminoadipoil într-o singură etapă, folosind, în special, tehnicile recombinante; vezi, de exemplu Clivajul catenei (DRa-aminoadipoil Într-o etapă JP 53-94093 (Meiji, Pseudomonas sp. BN-188), JP 52-143289 (4 141 790, Meiji, Aspergilius, sp.), US 4 774 179 (Asahi 1988, Pseudomonas sp. SE-83 și SE-495), JP 61-21097 și JP 61152286; FR 2 241 557 (Aries 1975, Bacilius cereus var. Fluorescens); JP 52 082791 (Toyo Jozo 1977, Bacilius megaterium NRRL B 5385); EP A O 321 849 (Hoechst, Pseudomonas, Bac/7/us subt/7/sy-glutamy transpeptidasa); EP AO 322 032, EP A O 405 846 și US 5 104 800 (Merck, Bacilius megaterium]: ERA O 238 218 și US 4 981 789 (Merck, Agrobacterium Viscosus]: Recombinant într-o etapă: Cef C-/ACA: JP 60-110292 (Ashi 1985, Comamonas, E.coli recombinant cu genă de la Comamonas sp. SY-77-1, conversie într-o etapă), JP 61-152-286 (Asahi 1986, Pseudomonas, E.coli cu gena de la Pseudomonas sp. SE83, secvențe nucleotidice descrise și revendicare, procedeu, într-o etapă, deja revendicat în US 4 774 179, JP 63-74488 (Asahi 1988, Trigonopsis varibilis, Comamonas E.coli recombinant expresie a D-aminoacidoxidaza și construcție GL-/-ACA acilaza). EP A O 475 652 (Fujisawa, cefalosporină C acilaza și producerea sa pe calea tehnologiei recombinante).

Diferitele aspecte ale metodei pentru producerea 7-ADAC sunt cunoscute în domeniu, de exemplu, US 3 304 236 și 3 972 774 (Eli Lilly & Co.); EP A 0 454 478 (Shionogi & Co., Ltd.) și cererea japoneză publicată sub numărul 04 53 499 (Shinogi &Co., Ltd).

Prezenta invenție se referă la un bioprocedeu pentru prepararea acidului 7-amino3-deacetil-cefalosporanic (7-ADAC) și a acidului 7-cefalosporanic (7-ACA) din acid adipic sau din una din sărurile sau esteri acestuia care au capacitatea să fie asimilați de către tulpina Penicilliun chrysogenum, pentru a produce, în final, derivații cefalosporanici.

Bioprocedeul pentru prepararea acidului 7-amino-3-deacetil-cefalosporanic (7ADAC) și a acidului 7-cefalosporanic (7-ACA) din acid adipic sau din una din sărurile sau esterii săi, care au capacitatea să fie asimilați de către tulpina Penicilliun chrysogenum, pentru a produce acid adipoil-6-amino-penicilanic (adipoil-6-ΑΡΑ), conform invenției, înlătură dezavantajele de mai sus, prin aceea că cuprinde transformarea unei tulpini de Penicillium crysogenum, capabil să producă izopenicilina N, cu o genă care codifică expandaz enzima derivată, preferabil, din Cephalosporium acremonium, pentru a se obține o tulpină de Penicillium crysogenum recombinantă, care va transforma, în continuare, in situ, acidul adipoil-6-amino-penicilanic (adipoil-6-apa), în acidul adipoil 7amino-deacetoxicefalosporanic, transformarea unei tulpini de Penicilium chrysogenum care produce izopenicilina N cu o genă care codifică enzima hidroxilaza, derivată, preferabil, din Cephalosporium cremonium, pentru a se obține o tulpină de Penicililium chrysogenum recombinantă, care va transforma, în continuare in situ acidul adipoil-7

RO 116648 Bl amino-deacetoxicefalosporanic, în acid adipoil 7-amino-deacetilcefalosporanic, care ca fi supus, în continuare, transformării enzimatice pentru a obține acidul 7-amino-3-deacetilcefalosporanic și a acidul 7-cefalosporanic.

Prin aplicarea invenției, se obțin următoarele avantaje:

- simplitatea procedeului;

220

- costuri reduse;

- cantități reduse de produse secundare;

Ca urmare, prezenta invenție este deosebită în privința domeniului preparării intermediarului cheie 7-ACA pentru cefalosporină și, mai ales, în domeniul bioprocedeelor

225

Invenția de față se bazează pe descoperirea surprinzătoare că o catenă adipoil poate fi adăugată eficient printr-o tulpină P. chrysogenum, că expandaz-enzima exprimată in situ poate folosi eficient acest compus drept substrat pentru extinderea ciclului la adipoil-7-ADCA, că enzimele hidrolază și acetiltransferază exprimate, de asemenea, in situ pot folosi adipoil-7-ADCA, drept substrat pentru a produce catena a 230 3-a acetoximetil a 7-ACA și catena adipoil poate fi apoi îndepărtată eficient, prin altă enzimă pentru a da 7-ACA. în timp ce diferite fragmente izolate ale prezentei invenții pot fi găsite în stadiul anterior al tehnicii, nu a existat nici o sugestie că ele, combinate, dau rezultatele neașteptate obținute cu metoda din prezenta invenție.

Până în prezent, cercetarea privind un bioprocedeu pentru obținerea 7-ACA s-a 235 dovedit inutilă, mai ales pentru unul de scară industrială. De exemplu, în timp ce a fost posibil să se prepare acid 6-aminopenicilanic (6-APA), prin fermantație directă și/sau prin tratament enzimatic al penicilinei G, lăsând numai mărirea de ciclu necesară pentru a da 7-ADCA, s-a găsit că, din nefericire, enzimele de la Cephalosporium sau Streptomyces care realizează extinderea ciclului pe căile metabolice normale ale acestor 240 microorganisme nu acceptă drept substrat 6-APA. Aceste enzime care sunt cunoscute în domeniu sub denumirea colectivă de enzime DAOCS sau expandaz-enzime, sunt definite ca enzime care catalizează extinderea structurilor ciclului penam întâlnit în moleculele de tipul penicilinei la cicluri cef-3-em ca cele întâlnite în cefalosporine. în continuare, aceste enzime se vor denumi în mod colectiv ca “expandaz-enzime”. 245

Un substrat pe care operează expandaz-enzima este penicilina N, prin a cărui extindere de ciclu și hidroxilare dă acidul deacetilcefalosporanic (DAC]. Aici este necesar doar să se cliveze catena (D]-a-aminoadipoil pentru a obține 7-ADAC, dar această catenă s-a dovedit deosebit de rezistentă la clivajul enzimatic, dând numai randament scăzut, inacceptabil. 250 în conformitate cu invenția de față, a fost posibil să se realizeze un bioprocedeu eficient, prin care un compus de penicilină (care are o moleculă de adipoil] este produs printr-un procedeu de fermentație nou în cantități mari, numitul compus de penicilină care este un substrat acceptabil pentru expandaz-enzima, și care se produce in situ de către același microorganism, care produce compusul de penicilină care a fost transformat pentru a exprima numita expandaz-enzimă. Apoi, expandaz-enzima acționează pentru extinderea ciclului compusului de penicilină cu randamente ridicate

RO 116648 Bl pentru un compus cefalosporinic.

Adipoil-7-ADCA produs prin acțiunea in situ a expandaz-enzimei are o catenă 3metil (-CH₃), în timp ce 7-ACA, produsul final, are o catenă 3-acetiloximetil [-CH₂0C(0)CH₃]. în vederea convertirii catenei 3-metil la catena 3-acetiloximetil, în conformitate cu prezenta invenție există, de asemenea, exprimate in situ două activități enzimatice în plus față de activitatea expandazei. Acestea sunt o hidroxilază și o acetiltransferază, și ambele sunt expresia produselor genelor cu care microorganismul care produce compusul de penicilină a fost, de asemenea, transformat. Enzima hidroxilază convertește catena 3-metil a adipoil-7-ADCA la 3-hidroximetil și enzima acetiltransferază convertește această catenă 3-hidroximetil la catena 3-acetiloximetil a 7-ACA.

Important, în ultima etapă critică a bioprocedeului din prezenta invenție, este faptul că catena compusului de penicilină, acum un compus de cefalosporină, este îndepărtată prin alt sistem enzimatic cu randamente extrem de ridicate. Rezultatul neașteptat al acestui bioprocedeu unic și total pe care-l cuprinde prezenta invenție este producerea de 7-ACA cu randamente ridicate și cu suficientă economie pentru a reprezenta o alternativă, rezonabilă față de metodele folosite în mod curent, prin prelucrări chimice și biochimice.

în prezenta cerere de brevet, se face referire la cererea cu numărul 07/933 4S9 depusă în 28.08.1992 (dosar numărul 185321 A), care descrie un bioprocedeu pentru producerea 7-ADCA care se bazează pe expresia activității expandaz- enzimei întrun transformat P.chrysogenum obținut în același mod ca și pentru producerea 7-ADAC și 7-ACA descrise aici. Cu toate acestea bioprocedeul de față se utilizează pentru transformări suplimentare, transformări rezultate prin expresia activităților enzimatice suplimentare, în vederea obținerii unei rezolvări totale a diferitelor căi matabolice recombinante pentru produsele finale distincte din care nici unul nu este menționat în cererea în curs de rezolvare.

în scopul unei mai bune înțelegeri a bioprocedeului prezentei invenții și a interpretării referințelor din stadiul tehnicii, mai sus discutate, în continuare, se menționează o reprezentare a diferitelor căi metabolice care conduc la adipoil-6-ΑΡΑ, adipoil-7-ADCA, adipoil ACA și 7-ACA, produsele intermediare și enzimatice care realizează transformările implicate.

RO 116648 Bl

290

Acid L-a-aminoadipic + L-cisteină + L-valină

310

IZOPENICILIN N

SINTETAZA (IPNS)

(IPN)

IPN AMIDOLILAZA

335

RO 116648 Bl

ACETIL CoA: 6-APA ACETILTRANSFERZA

FENILACETIL CoA

O COOH

CQ

PENICILINA G

(IPN)

IPN EPIMERAZA

CD)

FENILACETIL CoA

PENICILINA N EPIMERAZA

RO 116648 Bl

385

390

395

(DAOC)

400

405

410

415 (DAC)

DAC ACETILTRANSFERAZA

425

RO 116648 Bl

CEFALOSPORINA C

în continuare, sunt prezentate semnificațiile pentru următorii termeni:

“7-ACA”, este acid 3-((acetoxi)-metil]-7-amino-8-oxo-5-tia-1-azabiciclo[4.2.0]oct-2ene-2-carboxilix;

“Adipoil-6-apa”, este acid (2S(2a, 5a, 6p)]-3,3-dimetil-7-oxo-6-[hexan-1,6dioil)amino]-4-tia-1-azabiciclic[3,2,O)heptan-2-carboxilic;

“Adipoil-7-ADCA” este acid 3-metil-7-[(hexan-1,6-dioil)amino]-3-metil-8-oxo-5-tia-1azabiciclo[4,2,O]oct-2-ene-2-carboxilic;

“Adipoil-7-ADAC” este acid 3-hidroximetil-7-[(hexan-1,6-dioil)amino]-3-metil-8-oxo-5tia-1-azabiciclo[4,2,O]oct-2-ene-2-carboxilic.

Prezenta invenție se referă, în special, la procedee noi pentru prepararea acidului 7-aminodeacetilcefalosporanic (7-ADAC) și a acidului 7-aminocefalosporanic (7-ACA) citat mai sus, în care rezerva nutritivă de adipat este adipat disodic, iar DNA-ul care codifică activitatea expandaz-enzimei, enzimei hidroxilaza, și a enzimei acetiltransferaza sunt toți derivați de la Cephalosporium acremonium și în care adipoil acilaza este derivată de la specii de Pseudomonas.

Invenția de față se referă, în continuare, la vectorii de expresie, DNA-ul recombinant care cuprind DNA-ul care codifică activitatea expandaz-hidroxilazei și a acetiltransferazei, derivate de la Cephalosporium acremoniu, și promotorii care conduc expresia genelor pentru numitele enzimele care cuprind plasmidele pPEN/CEPH-1, pPENCACT și pTS-8 care vor fi descrise în continuare.

Prezenta invenție se referă la celule gazdă Penicillium chrysogenum transformate cu vectorii de expresie DNA recombinant, care cuprind DNA-ul care codifică activitatea expandaz-enzimelor, hidroxilazei și acetiltransferazei derivate de la Cephalosporium acremonium și un promotor care conduce de la DNA-ul care codifică numita enzimă cuprinzând promotorul genei IPNS de la Penicillium chrysogenum.

în special, invenția de față se referă la celule gazdă transformate cu vectorii de expresie ce conțin DNA-ul recombinant cuprinzând plasmidele pPEN/CEPH-1, pPENCACT și pTS-8 care vor fi descrise, în continuare.

Inveția prezentă se mai referă la un procedeu pentru cultura celulelor gazdă Penicillium chrysogenum recombinante în condiții corespunzătoare pentru expresia

RO 116648 Bl

475 genetică, în care numitele celule gazdă recombinante, cuprind vectorii de expresie DNA recombinant, care cuprind DNA-ul care codifică activitatea enzimelor expandază, hidroxilază și acetiltransferază derivată de la Cephalosporium acremonium și un promotor care conduce expresia numitei enzime codificate de DNA cuprinzând promotorul genei IPNS de la Penicillium chrysogenum. în special, invenția se referă la o metodă de cultură a celulelor gazdă recombinate Penicillium chrysogenum în condițiile în corespunzătoare pentru expresia genei, în care numitele celule gazdă recombinante cuprind vectoriil de expresie DNA recombinanți care cuprind plasmidele pPEN/CEPH-1, pPENCACT și pTS-8 care vor fi descrise mai sus.

Primul aspect al invenției de față este un bioprocedeu nou pentru prepararea 7aminoccefalosporanic (7-ACA) și acidul 7-aminoacetilcefalosporanic (7-ADAC), intermediari cheie pentru prepararea cefalosporinelor comerciale, care pot fi reprezentați prin următoarele formule structurale:

480

485

490 în plus, față de nucleul cefalosporinic, trăsăturile distincte ale 7-ACA sunt gruparea 7-amino și 3-acetiloximetil (sau 3-acetoximetil, așa cum este mai frecvent denumit). Gruparea 7-amino este una dintre cele care poate fi convenabilă la numeroase alte catene derivate, aceasta fiind baza pentru sinteza diferitelor cefalosporine comerciale. Gruparea 3-acetiloximetil va fi adeseori convertită la câteva alte catene în vederea sintetizării unei cefalosporine comerciale.

Produsul final 7-ACA și produsul intermediar adipoil7-ACA din metoda prezentei invenții pot să difere de cefalosporina C, alt intermediar cefalosporanic cheie care poate fi reprezentat prin următoarea formulă structură.

495

500

505

Pentru acest intermediar, catena 7-(D)-a-aminoadipoil nu este acceptabilă pentru derivări sintetice ulterioare pentru a da o grupare 7-amino acceptabilă. Din nefericire, catena 7-{D)-a-aminoadipoil adeseori creează dificultăți la îndepărtare atât prin mijloace chimice, cât și biochimice.

Așa cum se folosesc în descrierea de față, următorii termeni au semnificațiile:

7-ACA acid 7-aminocefalosporanic

7-ADAC acid 7-aminodeacetilcefalosporanic

7-ADCA acid 7-aminodezacetoxicefalosporanic

6-APA acid 6-aminopenicilanic

DAOC acid dezacetoxicefalosporanic

DAOCS DAOC sintetaza

DAC deacetilcefalosporina C

510

515

RO 116648 Bl

DACS DAC sintetaza

IPNS izopenicilină N sintetaza

Tris Tris[(hidroximetil)]aminometan

EDTA acid etilentiaminotetraacetic

DEPC Dietilpirocarbonat

TE tampon Tris/EDTA

SSC tampon care (clorură de sodiu), citrat de sodiu

SDS dodecilsulfat de sodiu

PEG polietilenglicol

Cultura de Penicillium chrysogenium

Prima etapă a metodei din prezenta invenție cuprinde etapa menținerii într-un mediu de cultură, capabil să susțină creșterea sa, a tulpinii Penicillium chrysogenum care produce izopenicilină N și adăugarea la numitul mediu de cultură a unei rezerve nutritive adîpate constând din unul sau mai mulți derivați de acid adipic sau esterii și sărurile sale care sunt capabili să fie asimilați și utilizați de către numita tulpină Penicillium chrysogenum pentru a produce adipoil-6-ΑΡΑ. Rezerva nutritivă adipat se poate adăuga mediului de cultură după inoculare cu P. chrysogenum, dar este preferabil să fie deja prezent în mediul de cultură la mementul inoculării.

Alte genuri în afară de Penicillium, de exemplu, Aspergilius nidulans, precum și alte specii ale genului Penicillium, înrudite cu speciile chrysogenum, sunt producătoare de izopenicilină N. Cu toate acestea, de-a lungul timpului au fost dezvoltate cele mai bune tulpini producătoare de izopenicilină N prin tehnici bine cunoscute de îmbunătățire a tulpinii plecând de la speciile chrysogenum. Ca o problemă practică, invenția prezentă s-a limitat la tulpinile Penicillium chrysogenum, deși aplicabilitatea sa la alte specii este evidentă. Orice tulpină depozitată de Penicillium chrysogenum, sau altă sursă publicată accesibilă pentru o astfel de tulpină este un punct de plecare corespunzător pentru realizarea metodei din prezenta invenție.

Mediul de cultură capabil de susținerea creșterii unei tulpini Penicillium chrysogenum, producătoare de izopenicilia N este de tipul cu care o persoană de specialitate obișnuită din domeniu se poate familiariza imediat. De exemplu, cultura ar putea fi obișnuită prin metoda fermentației aerobice submerse, iar mediul folosit s-ar putea alege dintre numeroase medii accesibile potrivite. Mediile tipice folosesc surse de carbon precum sucroza, glucoza și amidonul; sursa de azot precum făina de soia și uruială ulei de semințe de bumbac, făina de arahide și diferiți aminoacizi, amestecuri ale acestora și pectonă. Producția necesită randamente crescute și izolare facilă și pentru astfel de situații, mediile de cultură preferate pot fi melasele ca surse de carbon și făina de soia și aminoacizii ca surse de azot.

Sărurile nutritive anorganice sunt adăugate, de obicei, mediului de cultură și includ sărurile apte să suplimenteze următoarele componente ionice:sodiu, potasiu, amoniu, calciu, fosfat, sulfat, clorură, bromură, nitrat, carbonat, feric, feros, magneziu, manganetc. Oligoelementele sunt, de asemenea, esențiale pentru creșterea, dezvoltarea și metabolismul Penicillium chrysogenum, și se pot adăuga direct mediului de cultură, când este mai puțin suplimentar deja prin contaminanții prezenți din celelalte ingrediente ale mediului de cultură.

RO 116648 Bl

565

Tulpinile Penicillium chrysogenum, se pot cultiva în instalații de volum mic cum ar fi baloanele agitate de 1 litru atunci când se dorește producerea de cantități mici de adipoil-7- ACA, și eventual, 7-ACA. Când se dorește obținerea de cantități mari, de adipoil-7-ACA. se vor folosi totuși fermentatoare mari plasate în condiții de fermentație aerobice submersă. La relizarea preparării pe scară largă de adipoil-7-ACA, sporii Penicilliun chrysogenum, sunt menținuți pe un gar înclinat. Sporii de pe agar folosesc pentru inocularea unui mediu vegetativ pentru a produce o cultură a microorganismului puternică, proaspătă și creștere activă. Acest inocul vegetativ se folosește apoi pentru inițierea fermentației pe scară mare. în anumite situații, poate fi de dorit să se includă un mediu vegetativ suplimentar ca inocul pentru mediul de fermentare. Un astfel de al doilea stadiu al mediului vegetativ se folosește atunci când volumul mediului de fermentație este semnificativ mai mare decăt primul mediu vegetativ. în acest mod, sporii microorganismului sunt cultivați la început într-un volum mic de mediu vegetativ în vederea obținere» inoculului pentru un mediu vegetativ de volum mai mare. Volumul mai mare de mediu vegetativ asigură apoi o concentrație suficientă de microorganism pentru a iniția intrarea rapidă în fermentație în tancurile de fermentație de scară mare. Mediul vegerativ poate avea aceeași compoziție ca mediul de fermentație sau poate conține ingrediente suplimentare pentru a grăbi creșterea și dezvoltarea microorganismului de scară mică

Tulpinile Penicillium chrysogenum, folosite în metoda prezentei invenții sunt cultivate cel mai eficient la tempetraturi de 2O...3O°C, dar randamentele optime se vor obține atunci când temperatura este între 22 și 28°C de preferință, aproximativ 25°C.

Producția maximă de adipoi-7-ACA este întâlnită când tulpina Penicillium chrysogenum, se cultivă în fermentatoare mari pentru o periodă între aproximativ 10 și 30 zile, de preferința 15 pănâ la 25 zile. Cu toate acestea, când se cultivă în instalații de scara mică, cum ar fi baloanele cu agitator de 250 ml, creșterea microorganismului este mai rapidă și se produce adipoil-7-ACA într-un timp mai scurt, de exemplu, 4-15 zile, frecvent 5-7 zile.

Dacă pH-ul final în tancurile de fermentație de scara mare atinge niveluri de 8 sau mai mari, randamentul adipoi-7-ACA poate fi afectat în mod nedorit. în asemenea situații este de dorit să se urmărească pH-ul mediului de cultură în timpul fermentației. Dacă pHul va atinge astfel de niveluri înaitea timpului la care ajunge producția maximă de adipoil7-ACA, pH-ul poate fi ajustat convenabil prin adăugarea unui acid corespunzător sau a unui agent de tamponare la mediul de fermentație.

Producția adipoil-7-ACA poate fi urmată de testarea cromatografică a probelor din mediul de fermentație.

în condiții de fermentare aerobă submersă se obțin cele mai bune condiții pentru creșterea mai eficientă a tulpinii Penicillium chrysogenum și creșterea producției de 7ACA atunci când se trece prin cultura aer steril. Volumul de aer trecut prin mediul de cultură este, de obicei, de cel puțin aproximativ 0,2 volume aer/min. pe volumul de mediu de cultură. Cu toate acestea, o rată crescută a trecerii aerului poate avea adeseori un efect benefic asupra producției de adipoil-7-ACA.

Tulpina Penicillium chrysogenum produce, de obicei, suplimentar față de adipoil-7ACA, mulți produși secundari și metaboliți. Deoarece câțiva dintre aceștia sunt instabili față de acizi, este de dorit ca la reluarea adipoil-7-ACA din mediul de fermentație să se trateze întregul mediu de fermentație până se ajunge la un pH acid pentru un timp scurt

570

575

580

585

590

595

600

605

610

RO 116648 Bl în vederea distrugerii acestora și a impurităților produse. Adipoil-7-ACA ca produs de fermentație este reluat din mediul de fermentație filtrat după acest tratament și, opțional poate fi separat de alți componenți ai mediului de fermentație pe o rășină schimbătoare de ioni și poate fi purificată în continuare prin cromatografie, dacă este necesar, înaintea etapei următoare de clivare a catenei de adipoil. Este posibil, de asemenea, să se realizeze separarea prin cromatografie de schimb ionic după realizarea clivajului catenei. Unul dintre principalele produse secundare care prezintă probleme de separare este adipoil-6-ΑΡΑ și este posibil să se degradeze chimic sau enzimatic pentru a face separarea mai ușoară. Inițial, mediul de fermentație filtrat se supune unei proceduri de purificare preliminară care poate include o extracție inițială cu un solvent organic nemiscibil în apă, precum n-butanol sau amilacetat pentru îndepărtarea impurităților. Mediul extras poate fi, apoi, purificat în mod preliminar prin cromatografie pe carbon activ.

Adăugarea rezervei nutritive adipat, de preferință, se face o dată cu stabilirea culturii de fermentație pentru Penicillium chrysogenum așa cum s-a descris mai sus, adică anterior inoculării, se adaugă la celelalte ingrediente ale mediului culturii de fermentație o rezervă nutritivă adipat. La alegere, rezerva de adipat se poate adăuga după inoculare, de exemplu, la una, două și/sau trei zile după inoculare. Rezerva de inocul este definită ca oricare unul sau mai mulți derivați adipici sau săruri sau esteri ai acidului adipic care sunt apți să fie asimilați și utilizați de către tulpina Penicillium chrysogenum care a fost cultivată în vederea producerii de adipoil-6-ΑΡΑ. Acidul adipic, sărurile și esterii pot fi utilizați singuri sau în orice combinație. Este preferată sarea disodică, deși sărurile de potasiu și amestecuri cu sodiu ar putea fi, de asemenea, adecvate. Ar putea fi folosit esterul de metil, dar esterul de etil este insolubil în apă. Sarea de acid adipic sau esterul trebuie să fie dintre cei care pot fi asimilați și utilizați de către tulpina Penicillium chrysogenum pentru a produce adipoil-6-ΑΡΑ. De exemplu, acidul adipic însuși poate fi potrivit chiar dacă este insolubil în apă, dar în condițiile specifice de pH formează o sare asimilabilă.

Enzima expandază și/sau hidroxilază adecvată se selecteazăastfel:

Tulpina Penicillium chrysogenum care a fost cultivată și asigurată cu o rezervă nutritivă adipat, așa cum s-a descris mai sus, astfel încât ea să producă adipoil-6-ΑΡΑ, este, de asemenea, o tulpină care a fost transformată cu DNA-ul care codifică activitatea enzimelor expandază și hidroxilază prin care, ca un rezultat al expresiei sale la numitul adipoil-6-ΑΡΑ in situ are loc extinderea ciclului pentru formarea de adipoil-7-ADCA și, de asemenea, catena 3-metil este convertită la 3-hidroximetil.

Adipoil-6-APA se produce intracelular de către Penicillium chrysogenum cultivat în prezență de rezervă nutritivă adipat. Deși situat intracelular, adică pe o bază in situ, Penicillium chrysogenum transformat exprimă, de asemenea, DNA-ul care codifică activitatea enzimelor expandază și hidroxilază, enzime care acționează asupra adipoil-6APA precum substrat și produc extinderea ciclului său pentru a forma adipoil-7-ADCA care este apoi hidrolizat la adipoil-7-ADAC (acid adipoil-7-aminodeacetilcefalosporanic).

Noul procedeu al invenției include în domeniul său transformarea unei tulpini Penicillium chrysogenum de tipul descris mai sus cu orice DNA care codifică activitatea enzimelor expandază și hidroxilază prin care, ca un rezultat al expresiei lor, la adipoil-6APA îi este in situ extins ciclul pentru a forma adipoil-7-ADCA și este apoi hidroxilat pentru a forma adipoil 7-ADAC. Astfel, DNA-ul cu care este transformat Penicillium

RO 116648 Bl chrysogenum trebuie să exprime enzime care au nu numai activitate de enzimă expandază așa cum este înțeles în domeniu, adică abilitatea să extindă ciclul izopenicilinei N la DAOC, dar și abilitatea să extindă ciclul adipoil-6-ΑΡΑ la adipoil-7-ADCA. în plus, enzima hidroxilază trebuie să fie capabilă să hidroxileze adipoil-7-ADCA la adipoil-7-ADAC.

Cele două altenative învecinate sunt considerate a fi realizările potrivite în cadrul invenției de față cu respectarea modului în care activitatea enzimelor expandază și hidroxilază sunt asigurate. într-una din realizări, care este preferată, funcțiile expandazei și hidroxilazei sunt îndeplinite prin activitatea exprimată de către o singură, deși în esență bifuncțională, genă de la Cephalosporium acremonium, cu care P. chrysogenum este transformată. Această genă care exprimă în același timp activitățile expandazei și hidroxilazei va fi, în continuare, denumită gena expandază/hidroxilază ca și produsul genei, enzima(le) expandază/hidroxilază.

De obicei, când P. chrysogenum este transformat cu DNA de la C. acremonium care codifică activitatea expandază/hidroxilază, expresia acestei activități va fi controlată printr-o singură secvență promotor, indicând prezența unei singure gene.

realizare alternativă a prezentei invenții, care este în mod egal corespunzătoare, cuprinde transformarea gazdei P. chrysogenum cu DNA-ul care codifică activitatea expandazei și hidroxilazei ca gene separate opus situației cu o singură genă expandază/hidroxilază. Ar fi de remarcat că gene separate expandază și hidroxilază și activitățile enzimatice corespunzătoare pe care ele le codifică se întâlnesc la microorganisme procariote precum S. clavuligerus mai degrabă decât la microorganisme eucariotice precum C. acremonium, care codifică o singură genă și respectiv enzimă expandază/hidroxilază așa cum deja s-a observat mai sus.

Secvența enzimei hidroxilază din procariote și nucleotidele care o codifică sunt descrise în EP 465189 și Kovacevic și colab., J.Bacteriol., 173 (1), 389-400 (1991), așa cum este, desigur, pentru numita enzimă izolată. Un specialist în domeniu va aprecia, plecând de la secvența hidroxilazei, posibilitatea să fie sintetizat fie prin metodele manuale binecunoscute, fie prin sintetizatoare DNA automate DNA-ul care codifică enzima hidroxilază. Compusul DNA sau secvențele alternative care codifică aceeași secvență de aminoacizi a hidroxilazei sau fragmente și derivați ale acestora care au activitate hidrolazică echivalentă, pot fi folosiți în schimb ca bază pentru prepararea a diferiți vectori de donare și expresie când se combină cu promotori și alte secvențe reglatoare, cu care este apoi posibil să se transforme gazda P. chrysogenum în vederea exprimării enzimei hidroxilază și prin care se realizează metoda invenției de față. Este posibil, de asemenea, să se folosească compusul DNA ca o sondă cu care poate fi cercetată o bancă genomică a unei tulpini candidate potențial conținând o enzimă hidroxilază folosite în scopul identificării secvețelor omoloage prin hibridizare. Activitatea oricărei presupuse hidroxilaze astfel identificate poate fi confirmată folosind substratul prezent adipoil-7-ADCA al procedeului prezentei invenții și izolarea produsului său hidroxilat prin HPLC.

Când se folosește această realizare a prezentei invenții, cu alte cuvinte o genă unică care exprimă numai activitate hidrolazică, va fi necesar apoi să se asigure separat DNA-ul care codifică activitatea enzimei expandază, astfel încât P. chrysogenum să poată fi transformat printr-un vector de expresie adecvat care permite expresia in situ a funcției de expandază pentru a asigura etapa de extidere a ciclului din metoda prezentei invenții. Sunt cunoscute mai multe enzime expandază și analizându-le pe baza similitudinii

660

665

670

675

680

685

690

695

700

RO 116648 Bl de catenă, multe enzime expandază ar fi operabile în noul bioprocedeu al prezentei invenții.

Alte realizări ale prezentei invenții se bazează pe faptul că DNA-ul care codifică activitatea a mai mult decât o expandază și/sau a mai mult decât o hidroxilază poate fi folosit pentru a transforma tulpina nerecombinantă P. chrysogenum. Este posibil ca o astfel de realizare să se obțină îmbunătățirea activității expandazei și/sau hidroxilazei deoarece se obțin cantități crescute ale proteinei enzimatice care se exprimă.

Deja s-a precizat în stadiul tehnicii, că enzima expandază derivată de la Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 a fost secvențată în întregime și caracterizată prin configurația endonucleazelor de restricție. Cu toate acestea, pentru aceeași enzimă derivată de la S. clavuligerus NRRL 3585, s-a raportat a avea o greutate moleculară diferită, însă ea nu a fost secvențată. Și așa cum s-a descris mai sus, în secțiunea în enzima DAOCS/DACS a fost secvențată de la Cephalosporium acremonium ATCC 11550 (Samson și colab., Bio/Tchnology (1987) 5: 1207-1214 și ΕΡ-ΑΌ 281391).

Aceste expandaz-enzime identificate deja în stadiul tehnicii sunt folosite în noul bioprocedeu al invenției. Alte expandaz-enzime încă neidentificate, derivate de la diferite tulpini de S. clavuligerus sau C. acremonium, sau chiar de microorganisme din genuri diferite, pot fi folosite pentru realizarea noului bioprocedeu al invenției. Procedurile pentru identificarea unor astfel de tulpini de microorganisme, folosite și pentru izolarea presupuselor expandaz-enzime și stabilirea dacă ele sunt potrivite pentru folosire în metoda prezentei invenții sunt simple pentru un specialist în domeniu. Cercetarea extractelor libere de celule de noi genuri și tulpini candidate ca microorganisme folositoare pot fi făcute în manieră sigură și reproductibilă prin adăugarea numitelor extracte la substratul adipoil-6-ΑΡΑ în prezență de co-factori DAOCS cunoscuți care includ ioni feroși (Fe²⁺), ascorbat, alfa-cetoglutarat și adenozintrifosfat (ATP). Adipoil-6APA poate fi preparat în cantități suficiente prin asigurarea unei rezerve nutritive de adipat suficiente unei tulpini Penicillium chrysogenum netransformată într-un mod analog celui descris în detaliu în continuare. Expandaz-enzima dorită (sau expandază/hidroxilază) este prezentă dacă se formează adipoil-7-ADCA și/sau adipoil-7-ADCA, a cărei prezență poate fi detectată prin cromatografie.

Este posibil, de asemena, prin folosirea tehnicilor recombinante cunoscute, să se genereze sonde DNA, bazate pe secvențele nucleotidice ale genelor expandază de la S. Clavugerus și C.acremoniu, de exemplu pentru a cerceta tipul de DNA al unui microorganism probabil candidat care să producă o expandază adecvată pentru folosirea în metoda prezentei invenții.

Sursele potențiale de enzime expandază, hidroxilază și expandază/hidroxilază pentru enzimele expandază, așa cum s-a expus deja, sunt enzime care catalizează extinderea ciclului penam (găsit în molecule de tipul penicilinei) la cicluri cef-3-em ( ca cele găsite în cefalosporine). Orice organism care produce metaboliți care conțin un ciclu cefem este prin urmare o sursă potențială pentru un DNA care codifică expandaza. Mai mult decât atât, orice organism producător de cefalosporine care conține o grupare 3hidroximetil este o sursă potențială de DNA care codifică hidroxilază-(sau expandază/hidroxilază-). Exemple de astfel de organisme sunt enumerate mai jos, dar această listă este doar pentru exemplificare și nu va fi considerată exclusivă:

RO 116648 Bl

Fungi

Cefalosporium acremonium cefalosporium sp.

Emericellopsis Paecilomyces Scopulamyopsis Diheterospora Spirodium Anoxiopsis

Actinomycetes

Strepomices clavuligerus

S.lipmanii

S. wadayamensis

S. todorominensis

S. Filipinensis cephamycini

S. Heteromorphus

S.panayensis

S.griseus

S.cattleya Nocardia lactamdurana

Alte bacterii

Falovobacterium sp.

Alcaligenes denitrificans Mycoplana bullata Providencia rettgeri Lysobacter lactamgenus

Expandazele și hidroxilazele microorganismelor prezentate mai sus sunt doar candidați pentru investigarea ulterioară dar este posibil ca nu toți să fie potriviți pentru noul procedeul nou al prezentei invenții.

Izolarea fragmentelor DNA care codifică activitatea expandazei se realizează după ce a fost detectata prezența unei enzime expandaza dorite urmând maniera de lucru descrisă mai sus, procedurile pentru izolarea DNA-ului care codifică activitatea enzimei expandaza sunt, de asemenea simple și binecunoscute în domeniu. Sonde DNA bazate pe secvențe cunoscute și secvențe parțiale ale genelor care codifică enzimele expândază sunt construite și vor hibridiza la DNA-ul care codifică enzima dorită ce urmează a fi izolata. Construcția unor astfel de sonde se bazează pe cunoașterea secvenței de aminoacizi și a secvenței de baze nucleotidice care codifică expandaz-enzima, precum și preferințele codonilor microorganismului implicat. 0 descriere detaliată a procedurilor specifice de acest tip aplicată DNA-ului genomic de la Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 se prezintă în continuare.

Izolarea DNA-ului care codifică activitatea enzimei expandază este realizată folosind proceduri de restricție și ligare binecunoscute în tehnologia DNA-ului recombinant. Este necesar să existe o hartă a endonucleazelor de restricție a genomului microorganismului implicat astfel încât fragementul de restricție dorit să poată fi produs și izolat. Hărțile de restricție pentru S. clavuligerus și C.acremoniu sunt deja accesibile, astfel sunt folosite

750

755

760

765

770

775

780

785

790

RO 116648 Bl enzimele de restricție Bam HI și Sal I, electroforeza asigurând fragmentele dorite de mărimi de 1,8 până la 2,2kb.

Surse de enzime acetiltransferaza și izolarea fragmentelor DNA care codifică numita enzimă se aleg prin donarea genei acetiltransferaza a C.acremonium DAC care poate fi realizată în conformitate cu tehnicile recombinante binecunoscute în domeniu, care sunt descrise, în continuare, în termeni generali.

în vederea donării genei acetiltransferaza mutanții de C.acremonium deficienți în abilitatea de a converti acidul deacetilcefalosporanic (DAC) la cefalosporina C trebuie să fie inițial generați. Un astfel de procedeu impune supunerea celulelor C.acremonium la mutageni precum N-nitrozoguanidina (NTG), acid nitros sau lumină ultravioletă, care permite reluarea de pe un mediu de creștere adecvat și apoi cercetarea acumulării de DAC prin metode cromatografice sau biologice de exemplu.

Etapa următoare bazată pe identificarea unui mutant adecvat identificat ca mutant care codifică gena teacetil-transferaza este izolarea DNA-ului de la C.acremoniu de la o tulpină care produce cefalosporina C. După clivaj, fie prin digestie endonucleazică de restricție fie prin desfacere mecanică, în fragmente de mărimi adecvate, se încorporează în plasmide, sau cosmide, vectori de transformare care conțin, de asenenea, un marker genetic adecvat cum ar fi cel pentru rezistență la higromicină sau fleomicină. Vectorul ar trebiu să conțină, de asemenea, secvența DNA pentru a facilita recunoașterea ulterioară a insertului DNA, de exemplu, situsuri lamda (fag)cos care permit păstrarea DNA-ului donat prin împachetare in vitro urmată de infecarea E.coli care poate fi realizată prin proceduri binecunoscute.

Protoplaști ai tulpinii mutante acetiltransferaza-minus sunt apoi transformate folosind vectorii care conțin fragmente întâmplătoare ale DNA-ului genomic și transformați sunt apoi selectați pe baza rezistenței la antibiotice. Transformați pot fi apoi cercetați pentru refacerea producerii cefalosporinei C, aceasta fiind o indicație a complementarității reușite printr-un vector care conține gena acetiltransferaza. Mutanții suspecți că prezintă copii donate ale genei pot fi apoi crescuți, DNA-ul lor este izolat și vectorul DNA este recuperat prin metoda subliniată mai sus. Confirmarea că vectorul conține într-adevăr gena acetiltransferaza se obține prin subclonarea în E. coli, folosind procedurile standard și vectori rapid accesibili, urmată de retransformarea mutantului acetiltransferza-minus. Gena poate fi apoi izolată, secvențată și manipulată cum este descris în exemplele de realizare, folosind tehnicile de realizare de rutină din cele □bișniute în domeniul geneticii moleculare.

Folosind proceduri alternative cunoscute, de asemenea, în domeniu, Matsuda și colab., au izolat și secvențat gama care codifică activitatea acetiltransferazei la C.acremonium și a dedus secvența de aminoacizi a enzimei însăși așa cum este descris în EP 450 758. Aceste proceduri alternative constau în izolarea enzimei acetiltransferaza secvențarea aminoacidului N-terminal, și de la această informație, deducerea secvenței nucleotidice care codifică această porțiune a enzimei. De la această informație s-au generat sonde care hibridizează la secvențe de codificare integrală permițând astfel izolarea sa.

Transformarea tulpinii Penicillium chrysogenum începe odată ce fragmentele DNA care codifică activitățile expandază/hidroxilază, expandază, hidroxolază și acetil transferază au fost obținute.Acestea pot fi introduse (ligate) într-o plasmidă sau alți vectori de expresie, împreună cu fragmente DNA care cuprind promotori, secvențe de

RO 116648 Bl

840 activare translatională, markeri de rezistență, secvențe reglatoare precursori de cosmide și orice alte secvențe DNA care permit sau inițiază transformarea, conduc expresia produselor genei, și facilitează izolarea transformanților. Vectorul de expresie care a fost astfel construit este folosit apoi pentru obținerea transformării tulpinii Penicillium chrysogenum și expresia intracelulară a activității enzimelor expandază/hidroxilază, expandază și hidroxilază și acetiltransferază. Tehnicile folosite pentru a obține transformarea și expresia sunt binecunoscute în domeniu, și o descriere detaliată a unor astfel de proceduri specifice se menționează în continuare.

Așa cum s-a detaliat mai sus, tulpina transformată Penicillium chrysogenum exprimă activitatea enzimelor expandază/hidroxilază, expandază și hidroxilază și acetiltransferază intracelular care apoi operează respenctiv in situ asupra substratului adipoil-6-ΑΡΑ pentru extinderea ciclului său la adipoil-7-ADCA, hidrolizat mai târziu la adipoil-7-ADCA, care este apoi acetilat la adipoil-7-ACA.

Transformanții specifici Penicillium chrysogenumc&re exprimă activitățile codificate prin genele expandază/hidroxilază, expandază, hidroxilază și acetiltransferază care sunt realizări preferate ale invenției de față, sunt noi față de construcțiile similare din stadiul tehnicii, precum cea din Cantwell și colab., (1990) Curent Genetics 17 213-321, EP 0281391 și EP 0437378. Construcția Cantwell are gena expandază de la Streptomices clavuligerus plasată sub sontrolul promotorului izopenicilin N sintetazei (IPNS) de la P.crysogenum și astfel diferă de construcțiile cazului de față prin lipsa oricărui DNA care codifică activitățile hidroxilazei sau acetiltransferazei.

Ingnolia și colab., în EP 0281391 descriu vectori de transformare O. chrysogenum care conțin DNA-ul care codifică enzima bifuncțională expandază/hidroxilază de la C.acremonium a cărei expresie este condusă de către promotorul IPNS de la Penillium. într-una dintr aceste construcții (pPS62), gena expandază/hidroxilază este fuzionată în aval și în cadrul cu gena higromicin fosfotransferaza. Produsul genei, o proteină de fuziune higromicintransferază; expandază/hidroxilază diferă de produsul invenției, o enzimă expandază/hidroxilază în esență identică cu cea produsă în C.acremonium. Alt vector descris în EP 0291391 a fost construit printr-o serie extensivă de manipulări moleculare, care includ folosirea de linkeri DNA sintetici. Construcția finală (pPS61) utilizează fragmentul Nco I de 1,2 kb al promotorului IPNS de Penicillium pentru a exprima gena expandază/hidroxilază, și gena acetamidază de la Aspergilius nidulansca marker de selecție pentru transformare la Penicilium. Secvența codonilor nouă și zece din gena expandază/hidroxilază, care codifică arginina și respectiv, leucina sunt schimbate de la CGTCTC la CGCCTA, și care nu schimbă secvența aminoacizilor codificați.

în construcția prezentei invenții, fragmentul promotor IPNS Ncol de 1,2 kb s-a fuzionat la gena expandază/hidroxilază fără alternarea secvenței native a genei expandază/hidroxilază. Promotorul IPNS folosit pentru construcția invenției de față are două grupuri de câte patru baze duplicate corespunzătoare promotorului nativ, unul la situsul Sal I 760 bp în amonte de codonul de start ATG și altul Xbal cinci perechi de baze în amonte de codonul de start și în secvența lider netranslatată 5'. Aceste schimbări nu afectează nivelul ridicat de expresie al genei expandază/hidroxilază.

O diferență în plus se află în vectorii din markerii de selecție folosiți. Construcțiile descrise în EP 0291391 folosesc ca marker de selecție acetamidază și higromicină.

845

850

855

860

865

870

875

880

RO 116648 Bl

Aceasta este în contrast cu vectorul de transformare expandază/hidroxilază de Penicillium (pPEN/CEPH-1 ] folosit în prezenta invenție care conține markerul de rezistență la fleomicină. 0 tulpină Penicillium chrysogenum transformată cu vectorul pPEN/CEPH-1 și capabilă să exprime activitate expandază/hidroxilază a fost identificat ca PC2OO. Trăsăturile ei taxonomice include producerea de colonii extinse puternic răspândite, de culoare albastru-verde până la verde cu aspect catifelat cu puncte galbene iar partea inferioară este galbenă și difuzează în agar, capetele conidiale ramificate cu toate părțile netede; conidii eliptice până la sferice în lungime de 3-4 pm. Condițiile de cultură acceptabile pentru P. chrysogenum utilizează un mediu solid care cuprinde lactoză, 1,5% (g/v) monohidrat, 0,5% (v/v) suc de tulpină de porumb, 0,5% (g/v) peptonă, 0,4% (g/v) NaCI, 0,05%(g/v) MgS0₄x7H_a0, 0,06% (g/v) KH₂P0₄, 0,0005% (g/v) FeCI₃-6H₂0, 0,0002% (g/v) CuS0₄-5H₂0, 3,0% (g/v) agar, într-un litru de apă distilată pH 4,8. Tulpina P. chrysogenum descrisă și denumită PC200 s-a depozitat în Colecția Americană de Culturi (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, sub numărul de acces ATCC 74186 (data de depozit: 23 septembrie 1992).

Al doilea transformant nou Penicillium chrysogenum al prezentei invenții, capabil să producă adipoil-7-ACA exprimă ambele activități expandază/hidroxilază și acetiltransferază datorită faptului că a fost transformat cu un singur vector [pTS-8] care cuprinde DNA-ul care codifică în același timp aceste două enzime. Prin urmare, acest vector diferă de acei vectori de transformare Penicillium menționați în EP 0437378 care cuprinde DNA care codifică fie acetiltransferaza C. acremonium singură, fie în legată de o secvență DNA care codifică o polipeptidă mutantă expandază/hidroxilază. în construcția pTS-8, expresia genelor expandază/hidroxilază și acetiltransferază sunt induse fiecare prin copii separate ale promotorului IPNS al P. chrysogenum: o a treia copie a promotorului IPNS se folosește pentru a conduce transcrierea genei de rezistență la fleomicină folosită ca marker de selecție.

într-o realizare alternativă a invenției de față, genele expandază/hidroxilază și acetiltransferază pot fi încorporate în vectori separați și introduse într-o tulpină gazdă Penicillium în mod secvențial. Scopul prin care fragmentele DNA care codifică activitățile enzimelor expandază/hidroxilază și acetiltransferază sunt introduse în tulpina Penicillium este important numai din punct de vedere practic. De preferință, transformarea Penicillium cu gena(le) expandază/hidroxilază va precede inserția genei acetiltransferază, deoarece aceasta este ordinea în care enzimele lucrează in vivo. Deci, expresia expandază/hidroxilază poate fi urmărită prin testarea producției de adipoil-7-ADAC. Cantitatea de dipoil-7-ADAC din substratul pentru enzima acetiltransferază expresie rezultată introducerii genei care codifică acetiltransferaza este indicată prin producerea de adipoil-7-ACA. Folosind o căutare adecvată in vitro pentru acetiltransferază este posibil să se transforme mai întâi Penicillium cu gena acetiltransferază, să se confirme expresia sa folosind căutarea in vitro și apoi să se continue cu introducerea genei expandază/hidroxilază. De aceea, oricare ar fi calea este un mod adecvat pentru procedeul prezentei invenții pentru a obține 7-ACA.

Totuși, modul preferat este procedeul prin care toate cele trei activități enzimatice sunt introduse simultan și construirea unei singure plasmide vector care să cuprindă DNA-ul care codifică activitățile expandază/hidroxilază și acetiltransferază ale C. acremonium. 0 tulpină Penicillium chrysogenum transformată cu un astfel de vector plasmidă unic, vectorul pTS-8 și capabil să exprime activitatea expandază/hidroxilază și

RO 116648 Bl acetiltransferază s-a identificat a fi PC300. Trăsăturile sale taxonomice sunt aceleași cu 930 cele descrise mai sus pentru PC2OO. Tulpina P. chrysogenum denumită PC3OO s-a depozitat în Colecția Americană de Tipuri de Culturi (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, sub numărul de acces ATCC 74187 (data de depozit: 23 septembrie 1992).

Penicillium chrysogenum transformat specific cu vectorul pPenFTSO care exprimă 935 activitatea genei expandază din S. clavuligerus, un mod preferat de realizare a prezentei invenții, este nou fața de astfel de construcții din stadiul tehnicii precum cea din Cantwell și colab., (1990), Current Genetic, 17, 213-221. în ambele construcții, se folosește mutageneza in vitro pentru a lega promotorul la gena expandază. în construcția Cantwell, transformarea introduce un situs Ndel la ATG-ul genei expandază care este ligat la situsul 940 Xbal la capătul 3' al promotorului IPNS printr-un linker Xbal/Ndel. în construcția invenției de față se creează un situs Ncol la ATG-ul genei expandază și se leagă la situsul Ncol la capătul 3' a linkerului IPNS. Aceasta creează următoarele secvențe împrejurul joncțiunilor promotor-genă din aceste construcții:

Xbal Ncol 945

promotor IPNS	5'	TCTAGACACCATGG	3'	Secv.	nr.1
Strepexpandază	5'	GTGAGAGTTGATGGAC	3'	Secv.	nr.2
Cantwell	5'	TCTAGACACȚATGGAC	3'	Secv.	nr.3
Invenția de față	5'	TCTAGACACCATGGAC	3'	Secv.	nr.4

950

Construcția Cantwell înlocuiește o bază C cu o bază T, în timp ce, în construcția invenției de față o bază C este păstrată, astfel, secvența promotorului IPNS imediat adiacent codonului de start ATG este exact complementară, ceea ce se găsește și în gena IPNS întâlnită în mod natural. Este posibil ca promotorul din stadiul tehnicii, deși diferă doar printr-o singură bază nucleotidică, să poată conduce la o eficiență mai 955 scăzută a translației și, ca urmare, la un nivel mai scăzut al expresiei genei expandază. Alte diferențe sunt în regiunile promotorului sau genei inclusă în construcții. Construcția Cantwell conține regiunea BamHI 5' până la Xbal 3' a promotorului IPNS, în timp ce vectorul invenției de față conține regiunea Ncol 5' până la Ncol 3' a promotorului (Diez și colab., (1990), J.Biol.Chem., 265, 16358-16365). Astfel rezultă aproximativ 250 960 bp suplimentare pe capătul 5' al promotorului IPNS din construcția Cantwell. Cu toate acestea, această regiune este în cadrul deschis de citire al genei ACV sintetază în amonte de gena IPNS.

Construcția Cantwell conține, de asemenea, gena Streptomyces de la ATG până la situsul BamHI 3' al genei, în timp ce vectorul prezentei invenții conține ATG-ul până la 965 situsul Sall 3' al genei (Kovacevic și colab., (1989), J.Bateriol. 171, 754-760). Astfel rezultă aproximativ 100 bp suplimentare pe secvența 3' terminală a construcției Cantwell. Construcția prezentei invenții mai conține regiunea din amonte a genei expandază până la situsul BamHI 5' al ATG; cu toate acestea, este separat de cadrul de citire al genei expandază prin promotorul IPNS. 970

Altă diferența a construcției pPenFTSO din prezenta invenție față de cea descrisă în stadiul tehnicii se referă la markerul de selecție care este folositus. Folosirea fuziunii promotor IPNS Penicillium:gena fleomicinei în construcția din prezenta invenție are tendința să selecteze pentru integrarea de copii multiple sau integrare la loci care permit

RO 116648 Bl un nivel ridicat de expresie și astfel poate da potențial un procent mai ridicat de transformanți care exprimă gena expandază la nivel ridicat.

Clivajul catenei adipoil are loc în ultima etapă a bioprocedeului prezentei invenții de la adipoil-7-ADAC sau adipoil-7-ACA, care necesită tratamentul produselor etapelor anterioare cu o enzimă adipoil amidază. Așa cum s-a menționat deja mai sus, o realizare semnificativă a prezentei invenții, este capacitatea realizării tuturor etapelor care conduc la formarea de adipoil-7-ADAC și adipoil-7-ACA într-o singură cultură de fermentație. Această realizare asigură o creștere a eficienței excepționale nefiind nevoie să se izoleze și, parțial, să se purifice produsele intermediare de la o etapă la alta a procedeului. în această ultimă etapă, totuși, sistemul enzimatic adipoil-amidază nu este prezent, adică nu a fost generat in situ în cultura de fermentație originală, fie natural sau ca expresie a genelor recombinante de P. chrysogenum.

Dacă noul procedeu al prezentei invenții se realizează în șarje, atunci va fi necesar să se izoleze și, parțial, să se purifice produsul primei etape iar procedurile preliminare au fost deja descrise mai sus.

Cu toate acestea, procedeul prezentei invenții poate fi realizat pe orice cale care aduce efectiv în contact adipoil amidaza cu adipoil-7-ADAC sau adipoil-7-ACA astfel încât conversia enzimatică a acestor compuși la 7-ADAC sau 7-ACA să poată avea loc. Aceasta este definiția termenului contactarea” în contextul său cel mai larg. Este posibil să se folosească un mediu fără celule de adipoil-7-ADAC sau adipoil-7-ACA brut ca flux de alimentare și să se trateze în maniera șarjă cu mediul adipoil amidază brut. Această abordare realizează aceleași eficiențe deoarece nu necesită nici o purificare substanțială a reactanților inițiali.

Desigur, sunt posibile și modificări. De exemplu, reactanții pot fi purificați atât cât se dorește înainte de ai aduce în contact unul cu altul. De asemenea, ar fi posibil să se realizeze procedeul în mod continuu decât în maniera șarjă. Contactarea reactanților poate fi modificată în diferite moduri luând în considerare avansarea tehnologiei procedeului. Astfel, poate fi folosită o enzimă imobilizată, de exemplu, sub forma unei coloane care conține adipoil acilază cu adipoil-7-ADAC sau adipoil-7-ACA să fie trecut prin coloană. Enzima imobilizată poate, de asemenea, să fie adăugată la soluția adipoil-7ADAC sau adipoil-7-ACA ca suspensie. Astfel de sisteme de enzime imobilizate oferă avantajele recuperării ușoare a enzimei și folosirea multiplă. Alt exemplu de astfel de proces tehnologic este cel în legătură cu reactoarele cu membrană. Metoda preferată de contactare a reactanților este pe calea coloanei cu enzimă imobilizată.

Enzime adipoii amidază folositoare în etapa de clivare.

Există numeroase enzime cu specificitate cunoscută față de catenele adipoil. Rezultatele obținute cu o adipoil amidază comercial accesibilă de la RAEV Corp, sunt detaliate în exemplele de lucru de mai jos. în literatură au fost raportate alte șapte enzime care îndepărtează catena adipoil de la moleculele de tipul cefalosporinei. Șase din aceste enzime sunt de la specii de Pseudomonas, iar a șaptea este de la o specie de Bacillus. Există câteva asemănări între anumite enzime de la Pseudomonas, dar toate șapte diferă prin câteva proprietăți fizico-biologice. Câteva dintre caracteristicile lor sunt prezentate, pe scurt, în continuare:

RO 116648 Bl

1020

Enzimă (Tulpini de Bacillus și Pseudomonas]	Referința	Greutatea moleculară Aprox. (Subunit.)
PSY-77-1 (Toyo Jozo)	Shibuya și colab.,(1981)	Aparent aceeași ca GK 16 de mai
P.GK16 (Asahi)	Matsuda, Komatsu (1985)	16000 54000
P.SE83 (acil) (Asahi)	Matsuda și colab.,(1987)	38200 19900
P.SE83 (acill) (Asahi)	Matsuda și colab., (1987)	25400 58200
P. diminuta N176 (Fujisawa)	Aramori și colab., (1991a)*	58000 26000
P. diminuta V22 (Fujisawa)	Aramori și colab., (1991a)*	P P
Bacillus laterosporusdl (Fuji.)	Aramori și colab., (1991b)**	70000 (monomeric)
Pseudomonas sp.		16000
(RAEV Corp.)		54000

* Aramori și colab., J.Fermet.Bioeng. (1991) 72: 232-243 ** Aramori și colab., J.Bacteriol. (1991) 173: 7849-7855.

1025

1030

1035

1040

Toate enzimele adipoil amidază de mai sus sunt utile în bioprocedeul invenției. Alte adipoil amidaze utile în bioprocedeul prezentei invenții pot fi descoperite imediat prin testarea enzimei candidat împotriva adipoil-7-ACA și adipoil-7-ADAC, substratele actuale asupra cărora ele trebuie să acționeze. Un rezultat pozitiv se obține în metoda realizabilă și reproductibilă pentru determinarea unei enzime candidat este fără îndoială utilă în metoda prezentei invenții. Substratul poate fi preparat din reacția anhidridei adipice cu 7-ACA folosind o modificare a procedurii descrisă de către Szewczuk și WellmanBednawska în “Clin.Chim.Acta (1978), 84, 19-26. De asemenea, este posibil să se adapteze metoda descrisă în ''Agric.Biol.Chem. (1981) 45(7), 1562-1567, o metodă destinată preparării de glutaril-7-ACA. Anhidrida adipică poate fi preparată conform metodei lui Alberson și Lundmark descrisă în “J.Macromol.Sci.Chem.'’ (199O)A27, 397412. 7-ACA este accesibilă din mai multe surse comerciale, incluzând Sigma Chemical Co.

Dacă este de dorit să se realizeze o căutare estimativă a enzimelor candidate folosind o metodă colorimetrică rapidă, se poate substitui substratul adipoil-7-ACA cu un substrat colorimetric precum adipoil-PABA (acid paraaminobenzoic) sau adipoil-pNA (paranitroanilină). Astfel, o metodă poate fi adaptată din cea descrisă pentru gamaglutaril PABAîn Szewczuk și colab., “Clinica Chimica Acta”, 84 (1978) 19-26. Clivajul catenei laterale dă specii generatoare de culoare a căror prezență și concentrație este determinată imediat prin folosirea unui colorimetru. Pentru informații mai detaliate privind aceasta, precum și alte metode colorimetrice corespunzătoare, vezi Marelli, L.P.

1045

1050

1055

1060

RO 116648 Bl (1968) “ J.Pharm.Sci. 57:2172-2173; Szasz, G. (1969) “Clin.Chem.” 15: 124-136; Szewczuk, A. Și colab., (1989) “J.Pharma.Pharmacol. 41: 136-137.

S-a făcut o comparație între secvențele aminoacide ale enzimei RAEV cu subunitățile mari ale enzimelor acill și GK16 menționate în tabelul de mai sus. Rezultatele comparației sunt prezentate mai jos (unde parantezele indică mai puțin decât distribuțiile definitive):

RAEV-Secv. nr.5 (S)N(S)(G)AVAPGKTANGNAL(L)LQN(P)

GK16-Secv. nr.6

S N S W AVAPGKTANGNAL L LQN P acill-Secv. nr.7

S N N W AVAPGRTATGRPI L AGD P

Din secvențele prezentate apare că toate aceste trei peptide sunt înrudite. Cu toate acestea, o proteină care are o secvență N terminală similară cu cele prezentate mai sus, nu va poseda în mod necesar activitate de adipoil-amidază, cum este cazul cu penicilin G acilaza produsă de către o tulpină Arthrobacter. Pe de altă parte, există adipoil amidaze folositoare în metoda prezentei invenții care nu prezintă homologie semnificativă față de secvența N terminală de mai sus. De exemplu, acilazele Asahi acil și Fujisawa B.laterosporus J1 menționate în tabelul de mai sus, care au arătat că au aceeași activitate adipoil-7-ACA acilază, nu au nici o homologie de secvență cu nici o enzimă menționată mai sus. Ca urmare, întinderea prezentei invenții față de adipoil amidazele folositoare în ultima etapă a noului bioprocedeu este determinată dacă o enzimă candidată este sau nu aptă să cliveze catena laterală de la adipoil-7-ACA, o problemă care poate fi determinată rapid, așa cum s-a detaliat mai sus.

în continuare, se prezintă 18 exemple de realizare a invenției:

Exemplul 1. Condițiile de cultură pentru Penicillium chrysogenum

Tulpinile de Penicillium chrysogenum folosite în aceste proceduri se mențin pe plăci care conțin mediu LCSB compus din 15% (g/v) lactoză; O,5%(v/v)sirop de tulpină de porumb; 0,5% (g/v) peptonă; 0,4%(g/v) Nacl; O,O55(g/v) MgS0₄x7H₂0; 0,06%(g/v) KH₂P0₄; 0,0005% (g/v) FeCI₃x6H₂O; 0,0002% (g/v) CuS0₄x5H₂0; 3,0% (g/v)agar; într-un litru de apă distilată, pH 4,8. După 12 zile la 25°C și umiditatea relativă de 65%, coloniile izolate se reiau și se adaugă în 2 ml apă sterilizată într-o eprubetă cu dop filetat care conține bile de sticlă. După marcarea culturii prin turbionare, suspensia se folosește pentru a inocula baloane de orez. Baloanele cu orez conțin 25 g/balon 250 ml de orez convertit Uncie Ben, bob natural lung, care se spală cu trei până la patru volume de apă distilată, pentru șapte min., se amestecă la fiecare 30 sec. și apoi se usucă până când conținutul de apă în orez rămâne de aproximativ 25%. După 12 zile la 25°C și umiditate relativă 65%, sporii se spală de pe orez cu 50 ml apă sterilă. Suspensia de spori se folosește pentru a inocula culturi lichid și, de asemenea, pentru a asigura liofilizarea de culturi pentru păstrare la 4°C. Sporii se adaugă la un volum egal de 5% lapte degresat și se liofilizează în fiole sterile.

Un al doilea stadiu de fermentație al tulpinii în baloane agitate pentru producerea de peniciline se folosește pentru produceea de micelui ca sursă de AND sau ARN. Stadiul de inocul se inițiază prin adăugarea de 1x10⁸ spori în baloane de 500 ml care conțin 50 ml de mediu compus din 3% (g/v) glucoză; 1,0% (g/v)farmamediu; 3,O%(v/v)sirop

RO 116648 Bl

1110 de tulpină de porumb; 0,2% (g/v) sulfat de amoniu; 0,5%(g/v) CaCo₃; 0,05%(g/v) fosfat monopotasic anhidru; 1,0% (g/v) lactoză; 1% (g/v) drojdie uscată într-un litru de apă distilată. Se incubează la 25° și umiditatea relativă de 65% pe un agitator rotativ cu un diametru de amplitudine 70 mm, la 220 rot/min. După 48 h de incubare se inițiază stadiul de producție prin transferarea a 2 ml inocul vegetativ în baloane de 500 ml la 35 ml mediu având următoarea compoziție: 0,05% (g/v) KH₂P0₄; 0,5% (g/v) KgS0₄; 1,0% (g/v) (NH₄)₂S0₄; 12% (g/v)lactoză; 2,75% (g/v) farmamediu; 1,0% (g/v) CaCo₃, (precipitat); 1,0% (v/v) ulei de grâu (lors oii), într-un litru de apă distilată, pH 6,6. După autoclavare, dar înaintea inoculării, se adaugă 25% adipat de sodiu steril pH 6,6 pentru a obține o concentrație finală de adipat de sodiu de 2,5%. Incubarea care urmează incubării se continuă în aceleași condiții ca și stadiul de inocul timp de 5-7 zile.

Când este nevoie de micelui pentru a genera protoplaști pentru transformare sau ca sursă de AND, tulpina este crescută în baloane de 250 ml conținând 50 ml de mediu complet (CM) compus din: 50 ml din 20x săruri clutterbuck (120 g Na₂N0₄, 10,4 KCI; 10,4 g MgS0₄x7H₂0; 30,4 g KH₂P0₄) 2,0 ml microelemente Vogel, (0,3 M acid citric, 0,2 M ZnS0₄, 25mM Fe(NH₄)₂(S0₄)₂x6H₂0, 10 mM CuSO₄, 3mM MnS0₄, 8mM acidboric, 2mM Na₂MoO₄x2H2O), 5 g triptonă, 5 g extract de drojdie, 10 g, glucoză întrun litru de apă distilată. Se inoculează la 25°C pe un agitator rotativ la 220 rot/min.

Exemplul 2. Condițiile de cultură pentru Cephalosporium acremonium

Tulpinile de Cephalosporium acremonium se mențin pe medii înclinate care conțin un mediu complet compus din 20 g sucroză; 20 g agar; 4 g peptonă; 4 g extract de drojdie; 3 g NaN0₃; 0,5g KH₂P0₄; 0,5 g KG; 0,5 g MgS0₄x7H₅0; 0,01 g FeSC^x7l-^0; într-un litru de apă distilată, pH 6,6. După 10 zile la 28°C și umiditatea relativă de 66%, se adaugă 6 ml apă sterilizată și cultura crescută se desprinde de pe suprafațe agarului. Suspensia rezultată se transferă într-o eprubetă strilă cu dop filetat care conține bile de sticlă. După macerarea culturii prin turbionare timp de câteva min., se folosește 3,5 ml din suspensia rezultată pentru a inocula culturi lichide. Această suspensie se utilizează, de asemenea, și pentru a asigura liofilizate de culturi pentru a fi păstrate la 4°C. Suspensia culturi macerate se centrifughează, depunerea se suspendă în 5% lapte degresat și se liofilizează alicotele în fiole sterile.

Se folosește un al doilea stadiu de fermentație a tulpinii în baloane agitate pentru producerea de cefalosporine sau pentru producerea de micelii ca sursă de AND și ARN. Stadiul de sămânță se inițiază prin adăugarea inocului la balone de 250 ml fiecare conținând 15 ml de mediu cu următoarea compoziție; 5 g glucoză,; 40 g sucroză; 30 g amidon de porumb; 50 g melasă de sfeclă; 65 g făină de soia; 15, 8 g CaS0₄/2H₂0; 8 g acetat de amoniu; 5 g CaC0₃ (precipitat); 7,5 g (NH₄))₂S0₄; 3,5 g MgS0₄/7H₂0; 1 g KH₂P0₄; 0,15 ulei de soia/balon într-un litru de apă distilată la pH 6,2. Se incubează la 25°C și umiditatea relativă 65% pe un agitator rotativ cu amplitudinea diametrului 70 mm la 220 rpm. După 96 ore de incubare se inițiază stadiul de producție prin transferarea a 2 ml de inocul vegetativ la un balon de 250 ml conținând 15 ml de mediu proaspăt ca cel descris mai sus. Incubarea se continuă pentru încă 96 h în aceleași condiții.

Când este nevoie de miceliu ca sursă de DNA pentru transformare, tulpinile se cresc în baloane de 500 ml în 100 ml mediu complet compus din: 20 g glicerol; 4 g peptonă; 4 g extract de drojdie; 0,5 g KH₂P0₄; 0,5 g KCI; 1 g MgS0₄/7H₂0; 3 g

1115

1120

1125

1130

1135

1140

1145

1150

RO 116648 Bl

NaN0₃; 0,01 g FeSo₄//H₂O într-un litru apă distilată. Se incubează la 30°C pe un agitator rotativ la rpm.

Exemplul 3. Izolarea DNA-ului genomic și RNA-ului total de Penicillium și Cephalosporium

Miceliul vegetativ crescut de la o cultură de 48 de ore preparat cum s-a descris mai sus, se corectează prin filtrare prin tifon, se îngheață în azot lichid și se liofilizează peste noapte. Miceliul uscat este mojarat cu nisip într-un mojar cu pistil și se resuspendă în 25 ml LiCI, 1OO mM, EDTA 50mM, Tris 10 mM, pH și SDS 4%. După încălzirea suspensiei la 5O-55°C, într-o baie de apă la 6O°C se extrage amestecul mai întâi cu

Tris 1M (pH 8)saturat cu fenol, urmat de Tris-saturat cu fenol: cloroform (1:1, v/v) și apoi cu cloroform. Se precipită ARN-ul din faza apoasă prin adăugarea unui volum egal de LiCI răcit și, apoi se lasă amestecul la -2O°C timp de 2-3 h. După centrifugare la 12 000 x g timp de 20 min. la 4°C se diluiază supernatantul la 66% (v/v) cu etanol și se răcește la -2O°C timp de 15 min. pentru a precipita DNA-ul. După centrifugare, cum s-a descris mai sus, peletul DNA se spală cu etanol 70%, se usucă și se resusupendă în tampon TE (Tris-HCI 10mM, pH 7,5, EDTA 1mM). Concentrația DNA-ului se estimează prin comparație față de standarde DNA cunoscute după colorare cu bromură de etidiu prin electroforeză pe gel.

Pentru extracția RNA-ului, culturile de Penicillium crysogenuium și Cephalosporium acremonium obținute cum s-a descris mai sus în exemplele 1 și 2, sunt crescute timp de 96 h în 35 ml mediu de fermentație (concentrațiile de fermentație au fost descrise anterior), la 25°C pe un agitator rotativ la 220 rot/min. Se colectează miceliul prin filtrare printr-un filtru Whatman sub vid și se spală cu aproape 50 ml apă. Miceliul se desprinde imediat de pe filtru și s-a reusupendat în 5 ml de “tampon breaking” (Tri-HCI 50 mM, pH 7,4, Hcl 150 mM, EDTA 5mM, pH 8,05% SDS), se îngheață în azot lichid și se liofilizează. După liofilizare peste noapte, se adaugă 5 ml apă care conține 0,1% DPEC și 5 ml Tris 1M (pH 8) saturat cu fenol: cloroform: alcool izopropilic (50:50:1) și amestecul este lăsat să se dezghețe la 37°C timp de 20 min. cu agitare. Amestecul se centrifigheză la 12 000 x g pentru 10 min. la 4°C, se îndepărtează stratul apos și se reextrage mai întâi cu Tris 1M (pH 8) saturat cu fenol: cloroform: alcool izoamilic (50:50:1), și a doua oară cu Tris 1M (pH 8) saturat cu fenol și a treia oară cu cloroform. Se combină un volum egal de LiCI 6M cu stratul apos final și soluția se lasă la -20°C pentru minim 4 ore. Se concentrează ARN-ul total prin centrifugare la 12 000 x g, timp de 20 min. la 4°C, peleta se dizolvă în tampon TE la care se adaugă 0,3 ml acetat de sodiu, 3 M, și apoi se adaugă 2,5 volume etanol pentru a reprecipita RNA-ul. Peleta finală se dizolvă în 0,1 ml tampon TE și se determină concentrația RNA-ului spectrofotometric folosind absorbanța la 260 nm.

Exemplul 4. Construcția unei bănci de gene a Cephalosporium acremonium și izolarea genelor expandază/hidroxilează șu acetiltransferaza de la C. acremonium.

Izolarea genei expandază/hidroxilază a C. acremonium.

DNA-ul genomic al C. Cremonium se digeră parțial cu Sau3AI pentru a realiza un fragment cu mărime medie de 10 până la 20 kb și această gamă de mărime se îmbogățește prin centrifugarea digeratului pe un gradient de densitate de 5-20% NaCI DNA-ul fracționat se folosește pentru a crea o bancă genomică DNA a C. acremonium pe calea ligării în situsul BamHI a vectorului 2001, conținut în particule fagice folosind Gigapak(Stratagene) și infecție cu E.coli. Plăcile rezultate se transferă pe microceluloză

RO 116648 Bl

1200 și se cercetează prin hibridizare la o sondă oligonucleotidică complementară la capătul 3' al secvenței genei expandază/hidroxilază cunoscută (Samson și colab., 1987)., Sonda a fost marcată la capătul cu (τ-³²Ρ)ΑΤΡ folosind T4 polinucleotid kinaza. Clonele pozitive se izolează, se determină locurile de restricție endonucleazică și se stabilește orientarea genei prin hibridizare Southern la oligonucleitida de mai sus și cu altă secvență comlementară la capătul 5' a genei.

Izolarea genei acetiltransferaza a C. Acremonium

Deși nu a fost procedura folosită în izolarea genei acetiltransferaza pentru construcțiila vectorului ulterior descris mai jos în exemplele 11 și 12, următoarea procedură ar putea fi folosită de către oricare specialist în domeniu, folosind informația despre secvența DNA publicată, de obicei, accesibilă. De la o bancă genomică C. acremonium se selectează o clonă care codifică gena acetiltransferaza pe baza hibridizării la sonde oligonucleotidice sintetice complementare secvenței transferazei, așa cum s-a descris în Matsuda și colab., (1992) “Biochem. Biophys. Res. Commun. 182: 995-1001.

Exemplul 5. Condiții de cultură pentru Streptomyces clavuligerum.

Tulpina Streptomyces clavuligerum folosita în aceste proceduri este ATCC 27164. Tulpina este menținută pe plăci constând din 4 g extract de drojdie: 10 g extract de malț; 4 g glucoza; 20 g agar; într-un litru de apă distilată, pH 7,2. După 5 zile de creștere la 30°C se adaugă la plăci 2 ml apă sterilă și cultura crescută este îndepărtată de pe suprafața agarului. Suspensia rezultată se transferă într-o epribetă sterilă cu dop filetat care conține bile de sticlă. După macerarea culturii prin turbionare, folosește suspensia pentru a inocula culturi lichide. Suspensia se folosește, de asemenea pentru păstrarea permanentă a culturii la-70°C prin adăugarea de glicerol pănâ la un volum final de 15%.

Când este nevoie de miceliu, pentru a genera protoplaști necesare transformării sau pentru o sursă DNA tulpinile se cresc în baloane de 1 litri în 200 ml mediu YEME compus din extract de drojdie, 5 g peptone, 3 g extract de malț, 10 g glucoză, 340 g sucroză, 1,02 g MgCIgxSHgO, 5 g glicină, 18 g agar, într-un litru de apă distilată. Incubarea se face la 29°C pe un agitator rotativ la 220 rpm.

Exemplul 6. Izolarea DNA-ului genomic Streptomyces.

Se colectează un inocul vegetativ de la o cultură de 48h preparată cum d-a descris mai sus, prin centrifugare la 22 100 x g, timp de 10 min.Celulele sunt resuspendate în 10 ml tampon TE, se adaugă 10 mg lizozim și se incubează amestecul la 30°C timp de 15 min. Se adaugă apoi, 1 ml de 20 % SDS, urmată imediat 10 ml tampon TE (pH 8), saturat cu fenol și 1,5 ml de NaCI 5 M, amestecul apoi este agitat blând pentru 20 min. Se separă fazele la 12 x g, pentru 10 min, după care se recuperează stratul apos și se transferă într-o eprubetă curată. în continuare, se adaugă un volum egal de cloroform, continuându-se agitarea blândă pentru încă 10 min. Se separă din nou fazele prin centrifugare la 12 000 x g, timp de 10 min, se reia stratul apos și se transferă din nou într-o eprubetă curată. Se adaugă, cu multă grijă, două volume de izopropanol și DNA-ul precipitat se colectează și s-a redizolvat în minimum un volum tampon TE. Se adaugă ARN-ază A pentru o concentrație finală de 20pg/ml și se incubează soluția timp de o oră la 50°C. Se adaugă apoi, proteaza K până la o concentrție finală de 100 pg/ml împreună cu NaCI 100mMși 0,4%SDS, amestecul, apoi

1205

1210

1215

1220

1225

1230

1235

1240

RO 116648 Bl se incubează la 37°C timp de o oră. Se extrage soluția, din nou, cu un volum egal de TE (pH 8) saturat cu fenol, urmată de o altă extracție cu cloriform. DNA-uldin extrasul final se colectează după adăugarea a două volume de izopropanol și se determină concentrația spectrofotometric folosind o absorbanță de citire de 26 nm.

Exemplul 7. Construcția unei bănci de gene și izolarea fragmentelor DNA care conține genele expandază și hidroxilază de la Streptomyces clavuligerus.

Izolarea genei expandază de la Streptomyces clavuligerus.

DNA-ul genomic de la Streptomyces clavuligerus obținut de la procedura descrisă anterior, se digeră cu enzimele de restricție BamHI și Sall. DNA-ul digerat este supus electroforezei pe un gel de agaroză 0,8% și se eluează fragmentele cu mărimi între 1,8 până la 2,2 kb, fiind apoi ligate la puC18 DNA care este digerat anterior cu BamHI și Sall. Diluții ale amestecului de ligare se folosesc pentru transformarea celulelor competente JM1D9, folosind electroporarea (Gene Pulser, Bio-Rad, Richmond, CA). Prepararea celulelor competente și condițiile pentru electroporare sunt conforme cu recomandările fabricantului. Amestecul transformat se depune pe plăci LB care conțin 1OO pg/ml ampicilină și 75 pl de 2% X-Gal. Urmează incubarea peste noapte la 37°C, coloniile recombinante fiind identificate prin pierderea de culoare datorită activității genei β-galactozidazei vectorului plasmidă.Coloniile mai puțin colorate se depun pe plăci noi LB care conțin 100 pg/ml ampicilină. După ce sunt lăsate să crescă peste noapte, la 37°C, coloniile se transferă pe nitroceluloză și se hibridizează cu o sondă produsă pein reacția polimerazecă de lanț care corespunde expandazei publicate de la Steptomyces clavuligerus de la bazele 52 la 918 ( Kovacevic și colab., 1989) J. Bacteriol. 171: 754760; și Ingolia și colab., US 5 070 020. Marcarea produsului reacției polimerazei de lanț se realizează prin reacție de extensie a primerului cu (³²P) dCTP și un oligolabelling Kit, conform instrucțiilor fabricantului (Pharmacia, Piscataway, New Jersey). Reacția de hibridizare se realizează în prezența a 1O⁶sondă radiomarcată, 30% formamidă, 5 x SSC (NaCI 0,15 M citrat de sodiu 0,015 M, pH 7), 0,1% SDS. 6 x Denhardt (ficol 5 g, polivinilpirolidonă 5g, și BSA 5g, pentru 500 ml de 50 x stoc) și 100 pg/ml DNA din timus de vițel, la 37°C peste noapte. Mai mulți transformați au hibridizat strâns la sondă. Se confirmă o colonie pentru conținutul unui vector purtător al genei prin analize cu enzime de restricție și această plasmidă s-a depozitat pFTSO-1.

Izolarea genei hidroxilază de la S. Clavuligerus

DNA-ul genomic Streptomyces clavuligerus este parțial digerat cu BamHI și ligat cu vectorul lamda Dash II de la Stratagene. Banca genomică rezultată se cercetează prin hibridizare la o oligonucleotidă de 30 baze care are o secvență identică cu acele prime 30 baze ale secvenței publicate pentru gena hidroxilază (Kovacevic and Miller, 1991, J. Bact. 173:398). Hibridizarea Southern cu DNA digerat BamHI de la două clone fagice pozitive prezintă fragmentul așteptat de 6 kb, care s-a supus subclonării. Această subclonă dă un set de fragmente de restricție publicată pentru regiunea care este împrejurul genei hidroxilază (Kovavic and Miller, 1991).

Exemplul 8. Izolarea plasmidei DNA.

Culturi de E.coli conținând plasmida de interes, sunt crescute în 500 ml bulion LB (20 g/l de bulin bază LB) Gibco, Paisley, Scotland), cu 15 pg/ml tetraciclină pe un agitator rotativ la 220 rot/min timp de 12-16 h la 37°C. Celulele sunt compactate prin centrifugare la 4 000 x g, pentru 10 min. la 4°C. Peleta conținând celulele se resuspendă în 18 ml tampon glucoza (glucoză 50 ml, Tris 25 mM, pH 8,0, EDTA 10

RO 116648 Bl

1290 mM) și 2 ml de 40 mg/ml lizozim (Sigma, St. Louis, MO), după amestecare se incubează la temperatura camerei timp de 15 min. Se adaugă 40 ml de soluție proaspăt preparata NaOH 0,2 N, 0,1% SDS, amestecul se învârte ușor plasându-se apoi pe gheață pentru 10 min. Apoi, se adaugă 30 ml de acetat de potasiu 5M, pH 4,8, se amestecă bine, amestecul rezultat fiind plasat pe gheața pentru 10 min.. Fragmentle celulare sunt compacte pentru centrifugare la 4 000 x g, pentru 10 min. la 4°C și supernatantul rezultat se filtrează printr-un filtru de tifon. Se adaugă izoptopanol (0,6 volume] pentru clarificarea supernatantului până precipitarea plasmidei AND și se formează un precipitat în timpul incubării la temperatura camerei pentru 20 min. Plasmida DNA se peletează la 4 000 x g, pentru 20 min. la 4°C, se spală, apoi, cu etanol 70 % și se usucă rapid. Peletele se resuspendă în 9 ml tampon TE adăugându-se, apoi, 10 g CsCI și 0,387 ml soluție de bromură de etidiu 10 mg/ml. Această soluție, se centrifughează la 313 100xg, pentru 24 h. Banda plasmidică rezultată în gradientul de clorură de cesiu, se vizualizează cu lumină ultravioletă, se izolează și apoi, bromură de etidiu se îndepărtează folosind soluție butanol în apă pentru extracție. Clorura de cesiu de la prepararea plasmidei se îndepărtează apoi prin dializă contra tampon TE și în final, DNA-ul se concentrează folosind PEG (MW 8000). Se determină concentrația de DNA spectrofotometric folosind citirea absorbanței la 260nm.

Exemplul 9. Construcția vectorului de transformare pPen-TSO de Penicillium. încorporarea genei de rezistența la fleomicină.

Se construiește un vector de transformare Penicillium cu o genă de rezistență la fleomicină ca marker de selecție dominant. Aceasta se realizează mai întâi prin izolarea unui fragment de 660 bp, care conține gena de rezistență la fleomicină (gena fleomicinei legata la o proteină de la Streptoalloteichus hindustanus] și, de asemenea, se cuplează la un terminator C1 de la citocromul drojdiei dintr-un digest Bam Hl/Bg1 II al plasmidei pUT713 (CAYLA Toulouse Cedex, France] prin electroforeză și eluție de pe gelul de agaroză. Fragmentul s-a ligat in situsu BamHI al vectorului pSELECT⁸ (Promega Corporation) și se determină orientarea genei prin analiza cu enzime de restricție. Situsul Hind III unic din plasmidă rezultată este îndepărtat prin restricție cu Hind II, depus în polimerază Klenow și religat. Imediat se introduce un fragment Pst I din 550 bp, care conținea situsul lamda cos care face ca vectorul să fie capabil să poată fi folosit pentru formare de plasmide când sunt incluse inserturi de mărime corespunzătoare. Acest vector este denumit pSCP4.

DNA-ul genomic P.Chrysogenum se digeră parțial cu Sau3A și se folosește pentru a prepara o bancă în fagul vectorului lamda EMBL3. Se izolează o clonă care conține gena izopenicilin N sintetaza (IPNS) și se folosește pentru a prepara o serie de subclone, dintre care una conține un fragment de 3,6 bp de la primul situs Bam HI în amontele genei IPNS până la primul situs Hind II în avalul genei. Situsul unic Sal I din această subclonă se îndepărteză prin restricționare cu Sal I, completare la capete cu enzima Klenow (polimeraza) și religare. Imediat, unicul situs Xbal se îndepărtează în mod asemănător prin restricționare cu Xbal, completare și religare. A rezultat o plasmidă care este denumita pSXF-1. Promotorul IPNS prelucrat se izolează de la pSXF-1 ca un fragment Ncol de 1,2 kb și se leagă la situsul Ncol al pSCP4 descris mai sus. Se determină orientarea prin digestie de restricție, alegându-se astfel încât promotorul să fie fuzionat la gena de restricție la fleomicină codonul de start ATG. Aceasta plasmidă este denumită pUTZ-2.

1295

1300

1305

1310

1315

1320

1325

1330

1335

RO 116648 Bl încorporarea genei expandază de S claculigerus.

Fragmentul de 1,645 kb care conține gena expandază de Streptomices clavuligerus se purifică de la un digerat Bam HI și Sal I al lui pFTSO-1 (vector descris anterior] prin electroforeză și eluție de pe un gel de agaroză 0,8%. Fragmentul izolat este ligatîn vectorul pSELECT (Promega Corporation) digerat de asemenea, cu Bam HI și Sal I. Acest vector este denumit pFTSO-8. Se creează un situs nou Nco I la codonul de start ATG al genei expandazei prin mutageneză direct în situs a pFTSO-8 folosind Altered Sites, in situ, Mutagenesis System (Promega Corporation). Mutageneza se realizează după instrucțiile fabricantului. Se construește o oligonucleotidă drept complement la secvența de codificare a regiunii DNA a codonului de start ATG după secvența publicată a genei expandază de la Streptomyces (Kovacevic și colab., (1990) Journal of Bacteriology, 171, p.3952-3958). Oligonucleotidă se sintetizează prin chimia cianoetilfosforamiditelor (Pharmacia Gene Assembler instrumentation), și oligosecvența este după cum urmează:

Secv. nr.8

3' CGAGAGGACCAGCGAGAGTCCATGGACACGACGG 5'

Mutageneza se confirmă prin analiza cu gene de restricție. Imediat, fragementul Ncol de 1,2kb de la pUTZ-2 care conține regiunea promotoare prelucrată a IPNS de la P. Chrysogenum se izolează prin restricție cu Ncol, urmată de electroforeză în gel de agaroză. Regiunea promotorului IPNS este ligată în vectorul pFTSO-8 la noul situs Ncol creat prin mutageneză la codonul de start ATG al genei expandazei, se stabilește prin analize cu enzime de restricție. Această casetă promotor-IPNS:gena expandază, se îndepărtează apoi ca fragment Bam Hl/Sall în vectorul de transformare pUTZ-2 în BamHI/Sall descris mai sus. Construcția finală este denumită pPenFTSO.

Exemplul 10. Construcția vectorului de transformare pPEN/CEPH-1 de al Penicillium.

încorporarea regiunii promotoare IPNS.

Regiunea promotorului IPNS se izolează de la PUTZ-2 descris mai sus în exemplul nr.9 prin digestia cu Xho l/Smal. Vectorul pUTZ-2 este tăiat cu Bam HI și capetele adezive sunt completate folosind dNTP și fragment Kleonow obținându-se capete netede și apoi se digeră cu Xho I iar fragmentul promotorului IPNS izolat Xhol/Smal este ligat în acest vector, apoi este tăiat rezultând o construcție care conține două regiuni promotor IPNS. Acest vector este denumit pUTZ-7.

încorporatea genei expandază/hidroxilază de la C.acremonium.

Una din regiunile promotor IPNS se izolează (prin electroforeză și eluție de pe geluri de agaroză) din pUTZ-7 ca un fragment Xho l/Xba I și este ligat în Xho l/Xba I în vectorul pBluescript IISK tăiat (Stragene, La Jolla, CA). Acest vector este denumit pIPNSp/blue.

Gena expandază/hidroxilază de la Cephalosporium este izolată (prin electroforeză și eluție de pe geluri de agaroză] ca un fragment Hind lll/Xbal de 1,6 kb de la o astfel de clonă identificată mai sus și este ligată în vectorul pSELECT Hind lll/Xbalal digerat. Se creează un situs nou Bsp HI la codonul de start ATG al genei expandază/hidroxlază prin mutageneză directă în situs in vitro, folosind Altered™ mutagenesis System (pomega Corporation). Mutageneza se realizează conform instrucțiunile fabricantului. Oligopeptida este construită ca secvență complementară la secvența care codifică regiunea DNA la codonul de start al secvenței genei expandază/hidroxilază publicată a Cephalosporium

RO 116648 Bl acremonium (Samson și colab., “Bio/Technology, vol.5, November, 1987). Oligonucleotida se sintetizează prin chimia cianoetil fosforamidică (Pharmacia Gene Assemblerjinstrumentation) și oligosecvența are următoarea secvență:

Secv. nr.9

3’ GTTTTGGTGTCGTAGTAGTACTGAAGGTTCCAG 5'

Mutageneza se confirmă prin analiză cu enzimă de restricție. Gena expandază/hidroxilază a Cephalosporium acremonium se izolează apoi (prin electroforeză și eluție de pe geluri de agaroză) ca un fragment Bsp Hl/Xba I și este ligată în digeratul Nco l/Xba I al vectorului pIPNSp/blue descris în exemplul de mai sus. Acest vector conține acum promotorul IPNS de la Penicillium la ATG-ul genei expandază/hidroxilază a Cephalosporium acremonium. Acest vector este desemnat ca pIPNSp/EXP/blue. Această casetă promotor IPNS: expandază/hidroxilază se digeră parțial cu Xho I și se digeră complet cu Xba I, se izolează fragmentul (prin electroforeză pe și eluție de pe geluri de agaroză) și este ligat în digeratul Xho l/Xba I al vectorului pUTZ-2 descris în exemplul de mai sus, ajungându-se la vectorul final de transformare pPEN/CEPH-1.

Exemplul 11. Construcția vectorului de transformare al Penicillium pentru exprimarea atât a expandazei, cât și hidroxilazei de S. clavuligerus

Se donează gena β-tobulinei P. chrysogenum dintr-o bancă genomică lamda folosind gena β-tubulină de la Aspergilius niger ca sondă de hibridizare. Un fragment Xbal/Hind III de 2,0 kb care conține promotorul β-tubulină de Penicillium este ligat la situsurile Xbal/Hind III ale pSELECT (Promega). Se introduce un situs Ncol la codonul de start ATG prin mutageneza directă în situs, a secvenței AAAATGGGT la ACCATGGGT. De la vectorul rezultat se izolează pe gel un fragment BamHI/Ncol de 1,4 kb care este ligat între situsurile BamHI și Ncol ale pUTZ-2 /descris anterior) pentru generarea vectorului pCI-6. Se izolează pe gel de la o clonă genomică P.chrysogenum un fragment Sall de 5,1 kb care conține atât gena IPNS cât și cea de acetiltransferază și este ligat în situsul Sall al pUTZ-2 pentru a crea pUTZ-5. Secvența terminală 3' a genei IPNS se izolează de la pUTZ-5 prin restricțiile cu BamHI și Hind III urmată de izolarea pe gel a fragmentului de 1,3 kb care este ligat între situsurile BamHI și Hind III ale R pCI-6 (descris mai sus) pentru a da pCI-13. Unicul situs Sall de pe lângă situsul BamHI din pCI-13 este îndepărtat prin restricție, se definitivează cu polimeraza Klenow și este religat. Pe de altă parte, se introduce un nou situs Sall al situsului BamHI prin mutagenză directă în situs a secvenței GGAAGACG la GGTCGAGG. Se ia apoi gena de rezistență la ampicilina de la plasmidă prin restricționare cu Pvul, se izolează pe gel a fragmentului mai mare, este supus religării pentru a da pCI-15. în final, caseta promotor IPNS:expandază este izolată pe gel de la pPENFTSO ca un fragment BamHI/Sall de 2,4 kb și este ligat în pCI-15 pentru a da pEXP-1.

Construcția unui vector pentru expresia ambelor gene hidroxilază și expandază ale S. clavuligerus cuprinde următoarele etape: Fragmentul 1 Kpnl de 2,9 kb care conține gena hidroxilază se subclonează în pSELECT astfel încât situsul EcoRI din polilinker este în apropierea capătului 5' al genei. Unicul Ncol din plasmidă este reluat prin mutageneză directă în situs al secvenței TCCATGGGC la secvența TCGATGGGC și simultan se introduce un situs nou Ncol la codonul de start prin schimbarea secvenței AACATGGC la ACCATGGC. Ambele schimbări păstreză secvența aminoacidă codificată. Fragmentul EcoRI/Ncol care conține promotorul IPNS prelucrat se izolează pe gel de la pUTZ-2 și se leagă între situsurile EcoRI și Ncol ale vectorului de mai sus care conține gena

1385

1390

1395

1400

1405

1410

1415

1420

1425

RO 116648 Bl modificata a hidroxilazei. Imediat, unicul situs EcoRI din vectorul rezultat este schimbat la un situs Hindlll prin mutageneză direct în situs. Construcția de fuziune 5 IPNS: hidroxilază se izolează de la vectorii rezultați ca fragment Hindlll, care apoi se leagă în situsul unic Hind III al vectorului pEXP-1 descris mai sus. Vectorul final conține genele expandază și hidroxilază fiecare condusă de promotorul IPNS, și markerul de rezistență fleomicină condus de către promotorul β-tubulină.

Exemplul 12. Construcția vectorului de transformare pPenCACT a Penicillium.

încorporarea genei de rezistență la higromicină

Se construiește un vector de transformare Penicillium cu o genă de rezistență la higromicină ca marker de selecție dominant. Se izolează gena fosfotransferază E.coli higromicină B (prin electroforeză și eluție de pe geluri de agaroză) sub forma unui fragment BamHI de 1,5 kb de la vectorul pHph-1 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) și este ligat la digeratul BamHI al vectorului mp19. Orientarea genei de rezistență la higromicină din mp19 se determină prin analiză cu enzima de restricție a DNA RF. Situsul BamHI 5' este lângă codonul de start ATG al genei de rezistență la higromicină. Pentru a ușura poziționarea unui promotor alternativ la acest situs BamHI 5', situsul BamHI 3' este reluat prin mutagenză direcționată în situs folosind Mutator™Situse Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolle, CA) Mutageneza se realizează conform instrucțiunilor fabricantului. Se construiește o oligonucleotidă cu secvență complementară la regiunea DNA de la secvența publicată a genei fosforilază E.coli higromicină B la situsul 3' BamHI (Gritz, L. And Davies, J., 1983, Gene 25, 179). Oligonucleotidă este sintetizată prin chimia cianoetil fosforamiditei (Pharmacia Gene Assembler instrumention), și oligosecvența este:

Secv. nr. 10:

5' TACCCGGGGTTCCCGCGGAACT 3'

Mutageneza se confirmă prin analiza cu enzimă de restricție. Gena de rezistență la higromicină la care s-a produs mutageneza este izolată apoi ca un fragment Sam/Xbal (prin electroforeză și eluție pe geluri de agaroză), și este ligat în digeratul Smal/Xbal a vectorului pUC 18.

Se izolează promotorul IPNS Penicillium (prin electroforeză și eluție de pe geluri de agaroză) ca un fragment Ncol de 1,2 kb de la Ncol al vectorului tăiat pUTZ-2 (Vector descris anterior). Se izolează linkeri oligonucleotidici sintetici pentru a crea un situs BamHI de la situsurile Ncol pe terminațiile fragmentului IPNS astfel încât să se poziționeze promotorul IPNS în situsul 5' BamHI lângă ATG-ul genei de rezistență la higromicină. Oligonucleotidele se sintetizează prin chimia cianoetil fosforamidită (Pharmacia Gene Assembler Instrumentation), și oligosecvențele sunt cele care urmează: Secv. nr. 11

5' CATGAAGAAG 3'

Secv. nr. 12

3' TTCTTCCTAG 5'

Această secvență păstrează secvența nativă a promotorului IPNS dar introduce doi aminoacizi din gena de rezistență la higromicină. Oligonucleotidele sunt normalizate, fosforilate și ligate la fragmentul promotorului IPNS la Ncol care rezultă din situsurile BamHI tăiate la ambele capete 5' și 3' ale fragmentului de promotor IPNS. Acest promotor este ligat la BamHI al genei de rezistență la higromicină tăiat din pUC18, și orientarea se confirmă prin analiza cu enzima de rstricție. Această casetă promotor

RO 116648 Bl

IPNS: genă de rezistență la higromicină se izolează apoi (prin electroforeză și eluție pe geluri de agaroză) ca un fragment Xhol/Sall de 2,1kb (Xhol este localizat la capătil 5' al promotorului IPNS și situsul Sall este de la polilinkerul pUC) și este ligat într-un digerat Sall al vectorului pSELECT. Orientarea casetei se determină prin analiză cu enzimă de restricție. Acest vector este denumit pIPNS/HYG.

încorporarea genei acetiltransferază a Cephalosporium acremonium

Gena acetiltransferaza Cephalosporium se izolează de la o clonă genomică (descrisă mai sus) ca un fragment Bglll/Sal I de 1,8kb prin electroforeză și eluție pe geluri de agaroză. Gena acetiltransferaza este ligată într-un digerat BamHI/Sall al vectorului pSELECT. Pentru a facilita poziționarea promotorului IPNS Penicillium la ATG-ul genei acetiltransferaza Cephalosporium se creează un situs nou Ncol intern în gena structurală prin mutageneză directă în situs folosind Alteres Sites™ in vitro Mutagenesis System (Promega Corporation). Mutageneza se realizează conform instrucțiilor fabricantului. Se construiesc oligonucleotide complementare la regiunile DNA care codifică secvența de interes a secvenței de interes de la secvența genei acetiltransferaza Cephalosporium menționată mai sus în Secv. 1 și 2. Secvența oligonucleotidică este folosită pentru a relua situsul intern Ncol din gena structurală și este:

Secv. nr. 13

3' GTCGGCGCATCGATGGGTGGAAT 5'

Secvența oligonuceiotidică folosită pentru a crea noul situs Ncol la codonul de start ATG este:

Secv. Nr. 14

3' CGCCCACCATGGCGCCTCAGAT 3'

Aceste oligonucleotide se sintetizează prin chimia cianoetil fosforamiditei (Pharmacia Gene Assembler instrumentation). Mutageneza se confirmă prin anliza cu enzima de restricție. Acest vector este denumit pMUTACT.

Promotorul IPNS de Penicillium se izolează (prin electroforeză și eluție pe geluri de agaroză) ca fragement Ncol de 1,2 kb de la vectorul pUTZ-2 descris într-un exemplu de realizare de mai sus. Acest fragment promotor este ligat la Ncol al vectorului pMUTACT tăiat care acum poziționează promotorul IPNS direct la ATG-ul genei acetiltransferaza a Cephalosporium acremonium. Orientarea promotorului se confirmă prin analiză cu enzima de restricție. Aceasta casetă promotor IPNS.genă acetiltransferază este digerată cu Xhol/Sall (situsul Xho I este localizat la capătul 5' al promotorului IPNS și situsul Sall este la capătul 3' al genei acetiltransferază) și este ligat în digeratul Sall al vectorului pSELECT. Orientarea fragmentului se determină prin analiză cu enzima de restricție. Acest vector este denumit pMUTACT/IPNS.

Mutageneza folosită pentru a crea noul situs Ncol al ATG-ului genei acetiltransferaza are ca rezultat o schimbare a celui de-al doilea aminoacid de la o serină la o alanină.în vederea păstrării secvenței de codificare identică genei native se face o mutageneză direct în situs folosind Alteres Sites™ in vitro Mutagenesis System. Oligonucelotida se construiește ca find complementară la secvența de codificare a regiunii DNA de interes de la secvența genei acetiltransferaza menționată mai sus ca secvența nr. 1 și 2. Secvența oligonuceiotidică folosită pentru a schimba al doilea aminoacid de la alanină la serină este:

Secv. nr. 15

3' TCTAGCTAGACACCATGTCGCCTCAGAT 5'

1475

1480

1485

1490

1495

1500

1505

1510

1515

RO 116648 Bl

Oligonucleotida se sintetizează chimic folosind cianoetil fosfor amidită (Pharmacia Gene Assembler instrumentation). Se confirmă mutageneza prin secvențarea DNA folosind USB Sequenase Version 2,0 DNA Sequencing Kit (USB, Cleveland, Ohio.J. Sinteza secvențeide primer se face folosind chimia cianoetil fosforamidită. Acest vector este denumit pMUTACT/IPNS-2.

Caseta promotor IPNS:genă de rezistență la higromicină se reia prin vectorul pIPNS/HYG ca fragment Xbal și este ligat într-un digerat Xbal al vectorului pMUTACT/IPNS-2 pentru a da vectorul final de transformare pPenCACT. Orientarea casetei higromicinei este determinată prin analiză cu enzimă de restricție.

Exemplul 13. Construcția vectorului pTS-8 de Penicillium pentru exprimarea genelor expandază/hidroxilază și acetiltransferază de Cephalosporium acremonium.

Gena acetiltransferază Cephalosporium se izolează (prin electroforeză și eluție de pe geluri de agaroză) ca fragment Bg1 ll/Sal Ide 1,8 kb de la o clonă genomică și este legat într-un digerat BamHI/Sal I al vectorului pSELECT (Promega Corporation). Pentru a facilita poziționarea promotorului IPNS Penicillium la un ATG al genei acetiltransferază a Cephalosporium, se creează un nou situs Ncol la un codon ATG localizat la baza -42 (Mathison și colab., Current Genetics, examinat) și un situs Ncol intern în gena structurală este îndepărtat prin mutageneză direct în situs folosind Alteres Sites in vitro Mutagenesis System (Promega Corporation). Mutageneza se realizează conform instrucțiilor fabricantului. S-au construit oligonucleotide complementare la secvența de codificare a regiunilor DNA de interes, dar care au încorporat câteva schimbări pentru a crea sau îndepărta un situs Ncol. Secvența oligonucelotidică folosita pentru a îndepărta situsul Ncol din gena structurală este:

Secv. nr. 16

3' GTCGGCGCATCGATGGGTGGAAT 5'

Secvența oligonucelotidică folosită pentru a crea noul situs Ncol la ATG la baza -42 este:

Secv. nr. 17

5' CTCCGATAGGGCGTGGTACCCGGCCCTACTCTTAT 3'

Oligonucleotidele se sintetizează prin chimic cianoetil fosforamidită (Pharmacia Gene Assembler instrumentation).

Ambele mutageneze produse se confirmă prin analiză cu enzime de restricție. Acest vector este denumit pMUTACT. Promotorul IPNS Penicillium se izolează (prin electroforeză și eluție de pe geluri de agaroză) ca un fragment Nco I de 1,2 kb de la vectorul pUTZ-2 descris anterior mai sus. Acest fragment promotor este ligat la Ncol al vectorului pMUTACT tăiat care acum s-a poziționat direct la ATG-42 al genei acetiltransferază Cephalosporium. Orientarea promotorului se confirmă prin analiză cu enzime de restricție. Acest vector este denumit pMUTACT/IPNS. Se izolează un fragment Xho l/Sal I de 2,5 kb (prin electroforeze și eluție de pe geluri de agaroză) de la vectorul pMUTACT/IPNS care conține caseta promotor IPNS: acetiltransferază și este ligat la un digerat Sal I al vectorului pUTZ-2 (descris anterior). Acest vector intermediar este apoi digerat cu Xba I și este ligat cu un fragment Xba I de 2,1 kb de la vectorul pPEN/CEPH-1 (descris anterior) care conține caseta promotor IPNS:expandază/hidrolază pentru a se ajunge la vectorul final de transformare pTS-8.

RO 116648 Bl

Exemplul 14. Transformarea Penicillium chrysogenum.

Se generează protoplaști de la tulpina Penicillium chrysogenum descrisă mai sus prin inocularea a 50 ml bulion CM cu 1x10⁷ spori pentru 67 h la 25°C pe un agitator rotativ la 220 rot/min. Se colectează miceliul prin filtrare pe filtre de tifon, se transferă în baloane de 500 ml și se resuspendă în 25 ml KMP (KCI 0,7 M, manitol 0,8 M și KP04 0,02 M pH 6,3), care conține 100 mg Novozim 234 (Novo Bio Labs, Bagsvaerd, Denmark) și se incubează la 30°C la 100 rot/min. Se separă sferoplaști prin filtrare pe tifon/vată de sticlă și se peletează prin centrifugare la 350 x g pentru 10 min. Sferoplaștii sunt spălați apoi de trei ori cu 10 ml tampon KMP și apoi se resuspendă în KMPC (KMP cu CaCI2 50mM) până la o concentrație de 5 x 10⁷ celule/ml și se lasă la temperatura camerei timp de 20 min. Pentru transformarea Penicillium se adaugă 200 pl suspensie de sferoplaști la DNA (5 pg vector DNA în 6,2 μΙ KMPC cu 5 mg/ml heparină) împreună cu 50 μΙ de PPC (PEG MW 3500 40%, KP04 20 mM, pH 6,3, înainte de utilizare adăugându-se CaCI₂ 5%) și amestecul de transformare se incubează pe gheață 30 min. Se adaugă 1 ml BPC proaspăt preparat și amestecul se transferă la 50 ml de agar moale pentru regenerare (50^eC) (CM plus manitol 1,3 M și 3% agar). Amestecul de transformare este apoi împărțit în cinci plăci Petri. După regenerare timp de 24 h la 25°C, plăcile se acoperă cu OL (1% peptonă în 1% agar) care conține 100 pg/50 ml OL de fleomicină. Cantitatea de acoperire este egală cu cantitatea agarului de regenerare. Plăcile se incubează la 25°C timp de 7-14 zile și se urmăresc pentru generarea de colonii transformante.

Exemplul 15. Cercetarea bioactivitâții.

Se folosește un agar de difuzie pentru biocercetare pentru a determina activitatea antibiotică a produselor izolate adipoil-6-ΑΡΑ și adipoil-7-ADCA prin HPLC. Se aplică 20 μΙ de produs de izolat la discuri de 5 mm pe o placă cu agar LB(20 g/l de bulion de bază LB cu 3% agar (Gibco, Paisley, Scotland) însămânțat cu Bacilius subtilus ATCC 33677 sau E. coli tulpină supersenzitivă (asigurată de către Prof. Arnold L. Demain, MIT). Se folosește ca tulpină indicatoare Bacilius subtilus pentru testarea produsului adipoil-6-ΑΡΑ și tulpina E. coli supersenzitivă se folosește ca tulpină indicatoare pentru testarea produsului adipoil-7-ADCA. După 15 h de incubare la 37°C un halou de inhibare a creșterii bacteriilor indicatoare împrejurul discurilor indică faptul că produsele prezintă bioactivitate. Controalele în acest experiment includ deacetoxicefalosporină C, cefalosporină C, penicilină V și agar care conține sau nu penicilinază drept control pentru confirmarea structurilor β-lactamice.

Exemplul 16. Metoda HPLC pentru analize simultane a adipoil-6-ΑΡΑ, 7-ADCA, 7-ADAC și 7-ACA.

Produsele de fermentație de la tulpinile transformate Penicillium (adipoil-6-ΑΡΑ, adipoil-7-ADCA, adipoil-7-ADAC și adipoil -7-ACA) sunt analizate simultan prin cromatografie în lichid de înaltă performanță (HPLC). Sistemul HPLC constă din următoarele componente Waters:Sistem de eliberare solvent 620, detector de lungime de undă variabil 409E (reglat la 220 nm și 260 nm), sistem de date Maxima 825. Faza staționară este un cartuș cu compresie radială Nova-Pak C₁₈ 5x100 mm cu un insert Nova-Pak C₁₈ Guard-Pak. Faza mobilă (la curgere 1 ml/1 minut) constă dintr-un gradient linear a 10 min. de la condițiile inițiale de 5% metanol și 95% KP0₄ 10 mM, pH 5 până la 40% metanol și 60% KP0₄, pH 5. Adipoil-6-APA se cuantifică prin comparație față de

1565

1570

1575

1580

1585

1590

1595

1600

1605

RO 116648 Bl o curbă standard de penicilină N la 220 nm. Produsele extinse se interpretaeză prin comparație față de curba standard la 260 nm de adipoil-7-ADCA și adipoil-7-ACA sintetice.

Exemplul 17. Testarea enzimei RAEV.

Se folosesc ca substraturi pentru determinarea activității specifice a enzimei RAEV (accesibilă comercial de la RAEV Corp.) adipoil-7-ADCA și adipoil-7-ACA sintetizate chimic. Amestecul de reacție conține 10 mM substrat 1 pg enzimă RAEV, 5% glicerol în KH₂P0₄ 0,16 M într-un volum total de 50 pl și se incubează la 37°C. (Condiții de reacție mai bune includ folosirea a 20 mM substrat sau mai mult în 20-50 mM fosfat de potasiu tamponat). Se iau 5 pl alicote la momentele O, 1,3, 5, 10, 20 și 30 min. se diluează cu 35 μΙ KH₂P0₄ 0,010 M pH 3,5 și se îngheață la -70°C înaintea analizei prin HPLC în condițiile descrise anterior.

Activitatea enzimei RAEV față de un substrat colorimetric adipoil-acid-Paminobenzoic se testează folosind 5 mM substrat, 8,25 pg enzimă RAEV, glicerol 10% în KH_aP0₄ 0,065 M pH 7, într-un volum total de 50 μΙ, timp de 30 min. la 37°C. Reacția se realizează într-o placă de microtitrare cu 96 godeuri. Se adaugă 50 μΙ dintr-o diluție 1/100 NaN0₂ în acid acetic 25 M, pentru terminarea reacției amestecul se lasă la temperatura camerei 3 min. Se adaugă 100 μΙ dintr-o diluție de 10 mg/ml acid 4-amino5-hidroxi-2,7-naftalen-disulfonic, sare hidratată de monosodiu în H₂0 în NaC0₃ 5M și culoarea dezvoltată se înregistrează imediat la 515 nm folosind un EL 312 Bio-kinetics Plate Reader (BioTek Instruments).

Exemplul 18. Evaluarea adipoil acilazelor alternative.

în plus față de studiile care folosesc enzimă RAEV, îndepărtarea catenelor laterale adipoil de la adipoil-7-ADCA (și alți adipoili compuși) se face cu enzime produse de o multitudine de surse microbiene. într-un studiu inițial tulpinile Asahi Pseudomonas sp. SE83 și SE-495 (depozitate la Institutul de Cercetare a Fermentației sub numărul de acces FERM BP-817 și, respectiv, FERM BP-818) și tulpina Toyo Jozo Pseudomonas SY-77-1 (depozitată la Laboratorul Regional de Cercetări din Nord, sub numărul de acces NRRL B-8070) se cresc 72 h într-un mediu care conține HyCase SF, 2% (g/v); glutamat de monosodiu 0,5% (g/v); extract de drojdie 0,5% (g/v); pudră de tulpină de porumb 0,2 % (g/v); ulei de semințe de bumbac 0,5% (g/v) și acid glutaric 0,1% (g/v). Se recoltează celulele prin centrifugare și se spală cu 50 mM tampon fosfat pH 8,0; ele sunt apoi resuspendate și trecute prin membrane prin adăugarea unui volum mic de cloroform. Alicote din suspensia celulară sunt apoi amestecate cu adipoil-para-nitroanilidă (ad-pNA) și se incubează la 30°C pentru perioade de 2-18 h. După incubare, amestecurile sunt acidulate prin adăugare de acid acetic 10% (v/v). Para-nitroanilina eliberată se detectează apoi prin mijloace colorimetrice ca urmare a conversiei sale la un compus diazo utilizând reactivi furnizați sub formă de kit de către Sigma Chemical Company pentru cercetarea gama-glutamil-transferază (produsul Sigma numărul 545-A). Activitățile relative ale celor trei tulpini sunt 100%, 85,5% și 48% pentru SE-495, SE-83 și, respectiv, SY-77-1. Folosind metode similare celor descrise mai sus pentru enzimă RAEV se demonstrează, de asemenea, activitatea enzimelor SE-83 și SE-495 asupra adipoil-7-ADCA. Producția de β-lactamază de către SY-77-1 a împiedicat demonstrarea activității de deacilare prin această tulpină a adipoil-7-ADCA.

Prin mijloace similare se demonstrează, de asemenea, producerea de adipoilacilază pentru două tulpini fungice [Altenaria sp. MA-133, ATCC nr. 20492 și Aspergillus

RO 116648 Bl sp. MA-13, ATCC nr. 20491; ref. U.S. 4141790 pentru Meiji Seika Kaisha Ltd.) și trei tulpini bacteriene suplimentare (un Brevibacterium, ATCC nr. 14649, un Achromobacterium, ATCC nr. 14648 și un Flavobacterium, ATCC nr. 14650, care sunt descrise ca producători de Cephalosporin C acilază în U.S. 3239394 pentru Merck & Co., Inc.).

Revendicări

Claims (6)

1. Bioprocedeu pentru prepararea acidului 7-amino-3-ileacetil-cefalosporanic și a acidului 7-aminocefalosporanic, din acid adipic sau una sau mai multe din sărurile și esterii săi, care au capacitatea să fie asimilați și utilizați de către tulpina Penicillium chrysogenum, pentru a produce acidul adipoil-6-amino-penicilanic, caracterizat prin aceea că cuprinde:

- transformarea unei tulpini de Penicillium chrysogenum capabil să producă izopenicilina N, cu o genă care codifică expandaz enzima derivată, preferabil, din Cephalosporium acremonium, pentru a se obține o tulpină de Penicillium chrysogenum recombinantă, care va transforma, în cotinuare, in situ, acidul adipoil-6-amino-penicilanic, în acidul adipoil 7-amino-deacetoxicefalosporanic,

- transformarea unei tulpini de Penicillium chrysogenum care produce izopenicilina N cu o genă care codifică enzima hidroxilază, derivată, preferabil, din Cephalosporium acremoniu, pentru a se obține o tulpină de Penicillium chrysogenum recombinantă, care va transforma, în continuare, in situ, acidul adipoil-7-amino-deacetoxicefalosporanic, în acid adipoil 7-amino-deacetilcefalosporanic, care va fi supus, în continuare, transformării enzimatice pentru a obține derivații de acizi cefalosporanici.

2. Bioprocedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că acidul adipoil 7-amino-deacetilcefalosporanic este pus, în continuare, în contact cu enzima adipoil amidaza, derivată, preferabil de la o specie de Pseudomonas, când se îndepărtează catena laterală de adipoil și se formează acidul 7-aminodeacetilcefalosporanic care se izolează.

3. Bioprocedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că acidul adipoil 7-amino-deacetilcefalosporanic este pus, în continuare, în contact cu enzima acetil transferaza, derivata, preferabil, de la Cephalosporium acremonium și se formează acidul adipoil-7-aminocefalosporanic, care este pus, în continuarea, în contact cu enzima adipoil amidaza, derivată, preferabil, de la o specie de Pseudomonas sau Cephalosporium acremonium când se îndepărtează catena laterală de adipoil și se formează acidul 7aminocefalosporanic care se izolează.

4. Bioprocedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea rezerva nutritivă de adipat este adipat de disodiu.

5. Bioprocedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea tulpina de Penicillium chrysogenum este Penicillium chrysogenum PC 200, ATCC 74182 sau Penicillium chrysogenum PC 300, ATCC 74182.

6. Bioprocedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea transformarea tulpinii de Penicillium chrysogenum se realizează prin introducerea în celula gazdă de Penicillium chrysogenum a vectorului DNA de expresie recombinant, vector care constă

1660

1665

1670

1675

1680

1685

1690

1695

RO 116648 Bl din plasmida PEN/CEPH-1, pPen CACT sau pTS-8, gena care codifică enzima expandaz/hidroxilază și/sau acetiltransferaza din Cephalosporium acremonium și un promotor care constă, în principal din promotorul genei IPNS de la Penicillium chrysogenum.