BG62261B1 - Биометод за получаване на 7-аса и 7-adac - Google Patents

Description

Изобретението се отнася до биометод за получаване на 7-АСА и 7-ADAC. Изобретението е от областта на методите за синтез на търговски цефалоспоринови антибиотици, от които понастоящем съществуват голям брой, като тези терапевтични агенти сега са от четвърто поколение. Голямото разнообразие от странични вериги, което се среща в търговските цефалоспорини и значителното икономическо значение на цефалоспорините поставя от особена важност въпроса за създаване на по-икономични и по-ефективни методи за получаване на ключовите междинни съединения, които да позволят бърз синтез на различните цефалоспорини.

Едно от тези ключови междинни съединения е 7-амино-цефалоспориновата киселина (7-АСА), която може да се представи със следната формула

Обикновено 7-АСА се получава от цефалоспорин С. Самият цефалоспорин С е ферментационен продукт, който е изходната точка за почти всички продавани понастоящем цефалоспорини. Обаче синтетичната обработка за получаването на тези различни търговски цефалоспорини в основата си започва в повечето случаи от 7-амино-цефалоспорановата киселина, която трябва да се получи от цефалоспорин С чрез отцепване на 7-амино-адипоиловата странична верига. Типичните търговски цефалоспорини, получени синтетично от 7-АСА, и които поради тази причина имат

3-ацетилоксиметиленова странична верига, включват цефотаксим, цефалоглицин, цефалотин и цефапирин.

Друго ключово междинно съединение е

7-амино-деацетилцефалоспоранова киселина (7-ADAC), която може да се представи с формулата

Понастоящем 7-ADAC се получава също така от цефалоспорин С, чрез отстраняване на 7-О-а-аминоадипоиловата странична верига, едновременно с превръщането на 3ацетилоксиметиленовата странична верига в

3-хидроксиметил. 7-ADAC е полезно междинно съединение в синтеза на цефалоспорини, съдържащо модифицирани заместители на С3 мястото.

Нормално, методът, който се избира за отцепване на 7-аминоадипоиловата странична верига, е химичен. Основният иминохалогениден метод изисква блокиране на амино и карбоксилната групи в 7-аминоадипоиловата странична верига и понастоящем се използват няколко метода за това. Известните химични методи имат сериозни недостатъци, по-специално изискванията за многостепенния и сложен процес, изключително ниските работни температури, скъпите химикали, получаването на значителни количества странични продукти с проблемите за изхвърлянето им и пречистването на силно онечистения изходен материал преди началото на химичната обработка. Необходим е микробиологичен или ферментационен процес, който би могъл да даде ензимно деацилиране на цефалоспорин С и да даде 7-амино-цефалоспоранова киселина на поикономична основа от досега използвания химичен процес.

Търсенето на удачен микробиологичен процес е безуспешно, защото, както е изяснено в литературата, структурата, по-специално стереохимията на аминоадипоиловата странична верига на молекулата на цефалоспорин С, защото пеницилин е бил успешно деацилиран с ензимно отцепване, като се използва пеницилин ацилаза, получена от голям брой микроорганизми. От друга страна, данните в литературата за успешно еднофазно ензимно деацилиране на цефалоспорин С са често не повторими или дават твърде ниски добиви.

Изобретението се отнася, по-специално до получаването на ключово цефалоспориново междинно съединение 7-АС А, по-специално до биопроцесите за получаване на 7-АСА.

Търсенето на удачен биопроцес за получаване на 7-АСА се е оказало безрезултатно, особено в промишленото производство. Например, докато е възможно получаването на 6аминопеницилинова киселина (6-АРА) чрез директна ферментация и/или с ензимна обработка на пеницилин G, що се отнася до необходимото разширение на пръстена, за да се достигне до 7-ADCA, е установено, че за съжаление ензимите на Cephalosporium или Streptomyces, които извършват разширяването на пръстена при нормалния метаболитен ход на тези микроорганизми, не възприемат 6-АРА като субстрат. Тези ензими, които имат общо обозначение DAOCS или експандазни-ензими, се дефинират като ензими, които катализират разширяването на пръстенните структури на пенам-а, срещащи се в пеницилиновия тип молекули до пръстените цеф-3-ем, които са открити в цефалоспорините. По-нататък тези ензими ще се наричат общо “експандазни ензими”.

Субстрат ензимът, върху който експандазата действа, е пеницилин N, който при разширяването на пръстена и хидроксилиране, дава деацетилцефалоспоранова киселина (DAC). Необходимо е само да се отцепи (О)-а-аминоадипоиловата странична верига, за да се получи 7-ADAC, но тази странична верига се е оказала крайно неподатлива на ензимно отцепване, водейки само до неприемливо ниски добиви.

Съгласно изобретението е възможно да се достигне до ефективен биометод, при който пеницилиново съединение (имащо адипоилна странична верига) е получено по нов ферментационен процес с високи титри, като споменатото пеницилиново съединение е приемлив субстрат за ензима експандаза, който е получен in situ от същия микроорганизъм, който продуцира пеницилиновото съединение, като е трансформиран, за да експресира споменатия експандаза ензим. След това експандаза ензимът действа, за да разшири пръстена на пеницилиновото съединение до цефалоспориново съединение с високи добиви.

Адипоил-7-ADCA, получен от in situ действието на експандаза ензима, има З-метил (-СН₃) странична верига, докато 7-АСА, крайният продукт, има 3-ацетилоксиметил [-СН₂ОС(О)СН₃] странична верига. За да се превърне 3-мети5 ловата в 3-ацетилоксиметилова странична верига съгласно изобретението in situ се експресират активностите още на два други ензима в допълнение на активността на експандазата. Те са последователно следните: хидроксилаза 10 и ацетилтрансфераза, като и двата са експресионни продукти на гени, с които са трансформирани микроорганизмите, продуциращи пеницилиновото съединение. Ензимът хидроксилаза превръща 3-метиловата странична ве15 рига на адипоил-7-ADCA в 3-хидроксиметил, а ензимът ацетилтрансфераза превръща тази

3-хидроксиметилова странична верига в 3-ацетилоксиметиловата странична верига на 7-АСА.

И, което е най-важно, в последния, кри20 тичен етап на метода от изобретението страничната верига на пеницилиновото съединение, сега вече цефалоспориново съединение, е отстраняема от друга ензимна система, с много високи добиви. Неочакваният резултат от то25 зи уникален, тотален биопроцес, който е включен в представеното изобретение, е получаването на 7-АСА учудващо високи добиви, при това достатъчно икономично, за да представлява разумна алтернатива на известните из30 ползвани методи на химична и биохимична обработка.

Предшестващо състояние на техниката

В патент на ЕР-А-0 422 790 е описана

ДНК, кодираща активността на изопеницилин ЬЕацил-СоА ацилтрансфераза от Aspergillus nidulans и приложението й при получаването на полезни цефалоспорини в пеницилинпродуци40 ращи гъбички, което досега не е извършено. Но това е описано като деструкция или изместване на гена на ацилтрансферазата едновременно с прибавянето на гени, кодиращи ензимите епимераза и експандаза от цефалоспоринпроду45 циращи микроорганизми; още повече, не е постигната действително никаква полезна трансформация и експресия. Освен това, ако трансформацията е била успешна, тя все още не би могла да бъде полезна за целите на представе50 ното изобретение, тъй като проблемът за отстраняването на D-а-аминоадипоиловата странична верига, все още остава. Такъв неспо лучлив опит в тази област за постигане на значителни резултати в промишленото получаване на цефалоспоринови междинни съединения от пеницилинпродуциращи гьбични култури е в пълен контраст с резултатите, постигнати при метода от изобретението.

Първият етап от ензимния биометод съгласно изобретението е разширяването на пръстена на адипоил-6-АРА, проведено с ензима експандаза, която е продукт на експресията на експандазния ген, с който е трансформиран нерекомбинантният приемник Р. chrysogenum. Използването на такъв експандазен ензим е изследвано и преди. Например, Cantwell et al. Curr Genet (1990) 17 & 213-221 са предложили биопроцес за получаване на 7-ADCA чрез разширяване на пръстена на пеницилин V, последвано от ензимна хидролиза на получения деацетоксицефалоспорин V за получаване на

7-ADCA. Това предложение се базира на наличието на клониран пеницилинов експандазен ген (cefE) от S. clavuligerus: Kovacevic et al.

J. Bacteriol. (1989) 171 : 754-760; Ingolia et al.

U. S. Patent 5,070,020. Ho, тъй като експандазата действа на пеницилин N, нейният естествен субстрат, а не на пеницилин V, предложението изисква генно инженерна намеса за получаването на модифициран експандазен ген, който ще може да разшири пръстена на пеницилин V. Необходимата модификация не е постигната от Cantwell et al., като е постигнат успех само в трансформирането на Penicillium chrysogenum с cef Е ген от Streptomyces clavuligerus и е получена слаба експресия на DAOCS (експандаза) ензима.

Ензимът експандаза е добре изследван, както по отношение на активността му, така и по отношение на генетичната последователност. Например, Wolfe в U.S. Pat. 4,510,246 и 4,536,476 е описал изолирането на циклаза, епимераза и ензими, разширяващи пръстена от свободен от клетки екстракт на микроорганизми продуценти на прокариотичен β-лактам, вкл. Streptomyces clavuligerus за получаването на стабилни ензимни реагенти. Dotzlaf в U.S. Pat. 5,082,772 (ЕР-А-0 366 354) описва изолиран и пречистен ензим експандаза от S. clavuligerus, който е охарактеризиран, вкл. чрез крайния остатък и аминокиселинния състав и е определено молекулно тегло от около 34,600 D. Но това е в противоречие с молекулното тегло 29,000, присъден, както изглежда като същия ензим в

U.S. Pat. 4,536,476. ЕР-А-0 233 715 описва изолирането и охарактеризирането с ендонуклеазна рестрикционна карта на експандаза ген, получен от S. clavuligerus и експресията на рекомбинантна експандаза кодираща ДНК (даваща активен експандаза ензим) в щам от S. clavuligerus, при който липсва способността за продуциране на цефалоспорин. Ingolia et al. в U.S. Pat. 5,070,020 (ЕР-А-0 341 892) описват ДНК последователност, кодираща експандаза ензим, получена от S. clavurigerus, и описва превръщането на щам от Р. chrysogenum с експресионен вектор, съдържащ споменатата последователност на ДНК, при което по този начин се получава отделянето на ензима експандаза. Въпреки че се предполага, че този ензим е полезен за разширяването на пръстена на други субстрати, освен пеницилин N, досега няма действително демонстриране на такова разширяване.

Описаната по-горе работа е фокусирана върху ензима експандаза, получен от прокариотични S. clavuligerus. Ензим с привидно същото действие на разширяване на пръстена, е експресиран също така от щамове на еукариотични Cephalosporium acremonium (също така означаван и като Acremonium chrysogenum). Обаче в такива щамове активността на експандазата е експресирана от бифункционален ген (cefEF), който също така експресира DACS (хидроксилазна) активност, но чиято естествена функция е да превърне дезацетоксицефалоспорановата киселина (DAOC) - продукт на ензима експандаза, в деацетилцефалоспорин С (DAC). Резултатът от тази експресия е един, но бифункционален експандазо/хидроксилазен ензим. При все че са правени усилия за разделяне активностите на тези два генни продукта, досега нито едно от тях не е било успешно. Например ЕР-А-0 281 391 описва изолирането и определянето на ДНК последователността на гена DAOCS/DACS, получен от С. acremonium АТСС 11550, заедно със съответната аминокиселинна последователност на ензима. Penicillium е трансформиран и експресира ензимите, обаче опитаното превръщане на пеницилини G и V в съответните цефалоспорини никога не е било демонстрирано. Освен това, въпреки предположението, че техниките на генното инженерство дават готови средства, за да се раздели генетичната информация, кодираща DAOCS от DACS и отдел ното им експресиране, досега не е показано такова разделяне.

Ензимът DAOCS/DACS (експандаза/ хидроксилаза) от С. acremonium е също така добре изследван, както по отношение на активността му и характеристиките, така и по отношение на генна последователност. Например Demain в U.S. Pat. 4,178,210; 4,248,966 и 4,307,192 описва обработката на различни пеницилинов тип изходни материали със свободен от клетки екстракт от С. acremonium, който епимеризира и разширява пръстена за получаване на цефалоспоринов антибиотичен продукт. Wu-Kuang Yeh U.S. Pat. 4,753,881 описва ензима на С. acremonium по отношение на изоелектричната му точка, молекулно тегло, аминокиселинни остатъци, отношение на активностите хидроксилаза към експандаза и пептидни фрагменти.

Ензимът ацетилтрансфераза от С. acremonium също така е описан по отношение на активността му, характеристиките му, рестрикционното му картиране и нуклеотидната и аминокиселинна последователност. Виж например ЕР-А-О 437 378 и ЕР-А-0 450 758.

Разгледаните по-горе изследвания се занимават само с един единствен аспект на представеното изобретение, т.е. трансформирането на щама Р. chrysogenum с гени, експресиращи ензимите експандаза и експандазо/хидроксилаза и осъществяването експресията на тези ензими. В тези разглеждания експресираните ензими са използвани за разширяване на пръстена на пеницилин N, но не и за пеницилините G и V. Дори и в този случай пеницилин N има странична верига на 7-позиция, която не може да бъде отцепена ензимно, за да даде свободна аминогрупа.

Представеното изобретение е на базата на изненадващото откритие, че адипоиловата странична верига може да бъде ефективно добавена от щама Р. chrysogenum, че ензимът експандаза, експресиран in situ, може да използва това съединение като субстрат за разширяване на пръстена до адипоил-7-ADCA, че ензимите хидроксилаза и ацетилтрансфераза, също така експресирани in situ, могат да използват адипоил-7-ADCA като субстрат за получаването на 3-ацетоксиметилова странична верига на 7-АСА и че адипоиловата странична верига може след това да бъде отстранена ефективно от друг ензим за получаване то на 7-АСА. Докато в предишните описания могат да бъдат открити отделни фрагменти от представеното изобретение, то досега няма никаква идея, те да се обединят, за да се получат неочакваните резултати, постигнати с метода от представеното изобретение.

Известно е получаването на 6-адипоилпеницилиновата киселина, виж Ballio, A. et al., Nature (1960) 185, 97-99. Ензимното разширение на 6-адипоилпеницилиновата киселина е също така известно, но само in vitro, виж Balwin et al., Tetrahedron (1987) 43, 3009-3014 и EPA-0 268 343. Също така известно е и ензимното отцепване на адипоилови странични вериги, например Matsuda et al., J. Bact. (1987) 169, 5815-5820. Адипоиловата странична верига има следната структура СООН-(СН₂)₄-СО-, докато други две странични вериги с близки структури са тези на глутарила и със следната формула СООН-(СН₂)₃-СО- и на (D)-а-аминоадипоила с формула COOH-CH(NH₂)-(CH₂)₃-CO-. Известно е ензимното отцепване на глутариловите странични вериги, виж Shibuya et al., Agric. Biol. Chem. (1981) 45, 1561-1567 и U.S. Pat. 3,960,662; Matsuda & Komatsu, J. Bact. (1985) 163, 1222-1228; Matsuda et al., J. Bact. (1987) 169, 5815-5820; Jap. Pat. 53-086084 (1978 - Banyu Pharmaceutical Co.) и Jap. Pat. 52-128293 (1977 - Banyu Pharmaceutical Co.). Също така в ΕΡΑ-Α-0 453 048 са описани методи за подобряване на адипоилотцепващата активност на глутарилацилаза, получена от Pseudomonas SY-77-1. Чрез заместване на различни аминокиселини на определени места в α-подверигата е наблюдавано от три до пет пъти по-висока степен на адипоилово отцепване (от адипоил-серин). Трябва да се отбележи, че в ЕР-А-0 453 048, въпреки че е демонстрирана ацилаза с подобрена активност спрямо адипоиловите странични вериги, никъде не са описани методи (нито химически, нито чрез биопроцес, аналогичен на този в представеното изобретение), при които може да се получи на първо място адипоил-цефалоспорин.

Известно е, че там, където е налице (D) α-аминоадипоилова странична верига, първо се отстранява ензимно аминогрупата и се скъсява страничната верига с (D) -аминокиселинна оксидаза, оставяйки глутарилова (GL-7) странична верига, като отстраняването на страничната глутарилова верига се извършва с втори ензим (глутарил-ацилаза). Такова двусте пенно отцепване е описано от Matsuda в U.S. Pat. 3,960,662; ΕΡ-Α-0 275 901; Jap. Pat. 61218057 (1988 - Komatsu, Asahi Chemical Industry Co.); WO 90/12110 (1990 - Wong, Biopure Corp.) и EP-A-0 436 355, Isogai et al. Bio/Technology (1991) 9, 188-191.

Известно е също така провеждането на едностепенно отцепване на (D) -а-аминоадипоилова странична верига, по-специално с използването на рекомбинантни техники. Например виж за едностепенно отцепване на (D) -ааминоадипоилова странична верига следните лит.източници JP 53-94093 (Meiji, Pseudomonas sp. BN-188); JP 52-143289 (= US 4,141,790, Meiji, Aspergillus sp.); US 4,774,179 (Asahi 1988 Pseudomonas sp. SE-83 и SE-495) = JP 61-21097 и 61152286; FR 2,241,557 (Aries 1975, Bacillus cereus var. fluorescens); JP 52-082791 (Toyo Jozo 1977, Bacillus megaterium NRRL B 5385); EP 321 849 (Hoechst, Pseudomonas, Bacillus subtilis, -глутамил транспептидаза); ЕР 322 032, ЕР 405 846 и US 5,104,800 (Merck, Bacillus megaterium); EP 283 218 и US 4,981,789 (Merck, Arthrobacter viscosus);

За едностепенно рекомбинантно: Ceph C - 7-ACA виж лит.източници: JP 60-110292 (Asahi 1985, Comamonas, рекомбинантни E.coli c ген от Pseudomonas sp. SE 83, генната последователност е описана и защитена, едностепенен процес, вече заявен в U.S. Pat. 4,774,179); JP 63-74488 (Asahi 1988, Trigonopsis Variabilis, Comamonas, рекомбинантни E.coli отделяне на D-аминокисела оксидаза и GL-7_TACA ацилаза); ЕР 475 652 (Fujisawa, цефалоспорин С ацилаза и нейното получаване по рекомбинантна технология).

Известни са различни аспекти на методите за получаване на 7-ADCA. Например описаните в патентите на US 3,304,236 и 3,972,774 (Eli Lilly & Co.); ЕР 454 478 (Shionogi & Co. Ltd.); и публикувания патент на JP 53-499 (Shionogi & Co., Ltd.).

Справка за съпътстващи приложения

Направена е справка за съпътстващо приложение, сериен No. 07/933,469, заявено на 28 август 1992, което описва биометод за получаване на 7-ADCA, основаващ се на експресията на активността на експандазния ензим в Р. chrisogenum, трансформиран по същия начин, както и биометода за получаване на 7-ADCA и 7-АСА, описан тук. Обаче, в представения биометод са използвани допълнител ни трансформации за експресията на допълнителни ензимни активности, за да се постигне напълно различен рекомбинантен метаболичен път до крайните продукти, като нито един от тях не е използван в съпътстващото приложение.

За да се улесни по-доброто разбиране на метода от представеното изобретение и уроците от предишните публикации, разгледани по-горе, по-долу са дадени различните етапи на метаболитните пътища, водещи до получаването на адипоил-6-АРА, адипоил-7-ADCA, адипоил-7-АСА и 7-АСА, междинните продукти и ензимите, които извършват включените трансформации.

Същност на изобретението

Представеното изобретение се отнася до нов биометод за получаване на 7-аминодеацетилцефалоспоранова киселина (7-ADAC), включващ следните етапи:

1) поддържане в културална среда, способна да поддържа растежа му, на щам от Penicillium chrysogenum, продуциращ изопеницилин N, и прибавяне на адипатна хранителна среда, включваща адипинова киселина, отделно или с нейните соли и естери, които са способни да бъдат асимилирани и оползотворени от щама на Penicillium chrysogenum за продуцирането на адипоил-6-аминопеницилинова киселина (адипоил-6-АРА), при което се получава споменатият адипоил-6-АРА,

2) провеждане на следните ензимни превръщания чрез in situ експресиране на съответния ген:

а) на адипоил-6-АРА се разширява in situ пръстенът до образуването на адипоил-7аминодезацетоксицефалоспоранова киселина (адипоил-7-ADCA) чрез ензима експандаза, при което споменатият щам от Р. chrysogenum е трансформиран чрез ДНК, кодираща активността на ензима експандаза, така че да възприеме споменатата адипоил-6-АРА като субстрат, върху който, в резултат на експресията на адипоил-6-АРА, получена от посочения щам, също така in situ се разширява пръстенът, за да се образува адипоил-7-ADCA;

б) 3-метиловата странична верига на адипоил-7-ADCA се хидроксилира in situ за получаването на адипоил-7-аминодеацетилцефалоспоранова киселина (адипоил-7-ADAC) чрез ензима хидроксилаза, при което споменатият щам е трансформиран чрез ДНК, кодираща активността на ензима хидроксилаза, за да може да приеме адипоил-7-ADCA като субстрат, върху който в резултат на експресията адипоил-7-ADCA, получена от посочения щам, след това също така се хидроксилира in situ до образуването на адипоил-7-ADAC; и

3) осъществяване на контакт между адипоил-7-ADAC и адипоиламидаза, при което адипоиловата странична верига се отстранява и се получава продуктът 7-ADAC, който след това се изолира.

Изобретението се отнася и до биометод за получаване на 7-аминоцефалоспоранова киселина (7-АСА), включващ следните етапи:

1) поддържане в културална среда, способна да поддържа растежа му, на щам от Penicillium chrysogenum, продуциращ изопеницилин N и прибавяне към споменатата културална среда на адипатна хранителна среда, включваща адипинова киселина, отделно или с нейните соли и естери, които са способни да бъдат асимилирани и оползотворени от щама на Penicillium chrysogenum за продуцирането на адипоил-6-аминопеницилинова киселина (адипоил-6-АРА), при което се получава ади поил-6-АРА,

2) провеждане на следните ензимни превръщания чрез in situ експресиране на съответния ген:

а) на адипоил-6-АРА се разширява in situ пръстенът до образуването на адипоил-7аминодезацетоксицефалоспоранова киселина (адипоил-7-ADCA) чрез ензима експандаза, при което щамът от Р. chrysogenum е транс10 формиран чрез ДНК, кодираща активността на ензима експандаза, така че да възприеме споменатата адипоил-6-АРА като субстрат, върху който, в резултат на експресирането, на споменатата адипоил-6-АРА, получена от 15 споменатия щам също така in situ се разширява пръстенът, за да се образува адипоил-7ADCA;

б) 3-метиловата странична верига на адипоил-7-ADCA се хидроксилира in situ за 20 получаването на адипоил-7-аминодеацетилцефалоспоранова киселина (адипоил-7-ADAC) чрез ензима хидроксилаза, при което споменатият щам от Penicillium chrysogenum е трансформиран чрез ДНК, кодираща активността 25 на ензима хидроксилаза, за да може да приеме споменатата адипоил-7-ADCA като субстрат, върху който в резултат на

L - алфа - аминоадипинова киселина L - цистеин + Lвалин

CO

(IPN)

IPN АМИДОЛИАЗА

АЦИЛ CoA: 6 - APA АЦИЛТРАНСФЕРАЗА

ФЕНИЛАЦЕТИЛ CoA

O COOH

ПЕНИЦИЛИН G

(IPN)

ИЗОПЕНИЦИЛИН Ν (IPN)

IPN ЕПИМЕРАЗА ( D) фЕНИЛАЦЕТИЛ CoA

ПЕНИЦИЛИН N

ПЕНИЦИЛИН Ν ЕКСПАНДАЗА

CD)

ДЕЗАЦЕТОКСИЦЕфАЛОСПОРАНОВА КИСЕЛИНА (DAOC)

DAOC 3* - ХИДРОКСИЛАЗА

ДЕАЦЕТИЛЦЕФАЛОСПОРАНОВА КИСЕЛИНА (DAC)

DAC АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗА

CD)

ЦЕфАЛОСПОРИН С експресирането адипоил-7-ADCA, продуцирана от посочения щам, след това също така се хидроксилира in situ до образуването на адипоил-7-ADAC; и

в) адипоил-7-ADAC се ацетилира in situ до получаването на адипоил-7-аминоцефалоспоранова киселина (адипоил-7-АСА) с ензима ацетилтрансфераза, при което щамът от Р. chrysogenum е трансформиран чрез ДНК, кодираща активността на ензима ацетилтрансфераза, способен да приеме адипоил-7-ADAC като субстрат, върху който в резултат на експресирането адипоил-7-ADAC, продуцирана от споменатия щам, се ацетилира след това in situ, за да се получи адипоил-7-АСА, и

3) осъществяване на контакт на адипо ил-7-АСА с адипоиламидаза, при което адипоиловата странична верига се отстранява и се получава продуктът 7-АС А, който след това се изолира.

Така, както са използвани тук, термините имат значенията, дадени по-долу:

7-АСА означава 3-[ (ацетоилокси)-метил] -7-амино-8-оксо-5-тиа-1-азабицикло [4.2.0] окт-2-ен-2-карбонова киселина;

адипоил-6-АРА означава [2S- (2 а,5 а, 6 β) ] 3,3-диметил-7-оксо-6- [ (хексан-1,6-диоил) амино] -4-тиа-1-азабицикло [3.2.0] хептан-2-карбонова киселина;

адипоил-7-ADCA означава З-метил-7[ (хексан-1,6-диоил) амино] -3-метил-8-оксо-5тиа-1-азабицикло [4.2.0] окт-2-ен-2-карбонова киселина и адипоил-7-ADAC означава 3-хидроксиметил-7- [ (хексан-1,6-диоил)амино] -3-метил-

8-оксо-5-тиа-1-азабицикло [4.2.0] окт-2-ен-2карбонова киселина.

По-специално изобретението се отнася до биопроцеси за получаване на 7-аминодеацетилцефалоспоранова киселина (7-ADAC) и 7-аминоцефалоспоранова киселина (7-АСА), посочени по-горе, при които адипатната хранителна среда е двунатриев адипат, при които (процеси) ДНК, кодиращи активностите на ензимите експандаза, хидроксилаза и ацетилтрансфераза, са произлезли от Cephalosporium acremonium, в които (процеси) адипоилацилазата е получена от Pseudomonas sp.

Изобретението се отнася и до рекомбинантни ДНК експресионни вектори, включващи ДНК, кодиращи активностите на ензимите експандаза, хидроксилаза и ацетилтрансфераза, получени от Cephalosporium acremonium и промотори, които управляват експресията на гените, кодирани за посочените ензими, включващи плазмидите pPEN/CEPH-1, pPENCACT и pTS-8, както са описани по-нататък.

Изобретението се отнася също така и до клетки гостоприемници на Penicillium chrysogenum, трансформирани с рекомбинантни ДНК експресионни вектори, включващи ДНК, кодиращи активността на ензимите експандаза, хидроксилаза и ацетилтрансфераза, получени от Cephalosporium acremonium и промотор, който управлява експресията на споменатата ензимкодираща ДНК, включващ промотор на гена на Penicillium chrysogenum IPNS. По-точно, представеното изобретение се отнася до клетки гостоприемници от Penicillium chrysogenum, трансформирани с рекомбинантни ДНК експресионни вектори, включващи плазмидите pPEN/CEPH-1, pPENCACT и pTS-8, които са описани по-нататък.

Представеното изобретение се отнася и до метод за култивиране на рекомбинантни клетки гостоприемници от Penicillium chrysogenum при условия, подходящи за генна експресия, при което рекомбинантните клетки гостоприемници, включват експресионни вектори от рекомбинантна ДНК, включващи ДНК, кодиращи активността на ензимите експандаза, хидроксилаза и ацетилтрансфераза, получени от Cephalosporium acremonium и промотор, който управлява експресията на ензимкодиращи те ДНК, включващ промотора на Penicillium chrysogenum IPNS гена.

По-специално изобретението се отнася до метод за култивиране на рекомбинантни клетки гостоприемници от Penicillium chrysogenum при условия, подходящи за генна експресия, при който метод, рекомбинантните клетки гостоприемници включват рекомбинантни ДНК експресионни вектори, включващи плазмидите pPEN/CEPH-1, рРепСАСТ и pTS-8, както са описани по-нататък.

Първият аспект на представеното изобретение е нов биометод за получаване на 7аминоцефалоспоранова киселина (7-АСА) и 7аминодеацетилспоранова киселина (7-ADAC) - ключови междинни съединения при получаването на синтетични търговски цефалоспорини, които могат да бъдат представени със следните структурни формули

В допълнение към цефалоспориновото ядро са отличителните особености на 7-АСА са 7-аминогрупата и 3-ацетилоксиметиловата (или 3-ацетоксиметил, както по-често се означава) група. 7-аминогрупата е тази, която може да се превърне в определен брой производни странични вериги, при което се създава база за синтезиране на различни търговски цефалоспорини. 3-ацетилоксиметиловата група често ще бъде превръщана в някаква друга странична верига с цел да се синтезира търговски цефалоспорин.

Крайният продукт 7-АСА и междинният продукт адипоил-7-АСА от метода съгласно изобретението могат да бъдат противопоставени на цефалоспорин С, друг ключов цефалоспоринов междинен продукт, който може да бъде представен със следната структурна формула

При това междинно съединение 7-(D)α-аминоадипоиловата странична верига не е приемлива за по-нататъшни синтетични производни и трябва да се отцепи, за да се полу62261 чи приемливата 7-аминогрупа. За съжаление 7-Щ)-а-аминоадипоиловата странична верига се е оказвала винаги трудна за отстраняване, както с химични, така и биохимични средства.

Дефиниции

Така, както са използвани в даденото описание и особено в глава “Описание на предпочитаните варианти на изпълнение”, използваните съкращения имат следните значения:

7-АСА	7-аминоцефалоспоранова ки селина
7-ADAC	7-амино деацетилцефалоспо ранова киселина
7-ADCA	7-аминодезацетоксицефалос поранова киселина
6-АРА	6-аминопенициланова кисе лина
DAOC	дезацетоксицефалоспорано ва киселина
DAOCS	DAOC синтетаза
DAC	деацетилцефалоспорин С (деацетилцефалоспоранова киселина)
DACS	DAC-синтетаза
IPNS	изопеницилин N синтетаза
Tris	три [хидроксиметил] амино метан
EDTA	етилендиаминотетраоцетна киселина
DEPC	диетилпирокарбонат
ТЕ	Tris/EDTA буфер
ssc	буфер натриев хлорид/нат риев цитрат
SDS	натриев додецилсулфат
PEG	полиетиленгликол

Култура Penicillium chrysogenum

Първият етап от метода съгласно изобретението включва поддържането в културална среда, способна да поддържа растежа му, на щам от Penicillium chrysogenum, продуциращ изопеницилин N, и прибавянето на адипатна хранителна среда, включваща адипинова киселина или нейните соли и естери, които са способни да бъдат асимилирани и оползотворени от споменатия щам на Penicillium chrysogenum, за да се получи адипоил-6-АРА. Адипатната хранителна среда може да се добави към културалната среда след инокулацията с Р. chrysogenum, но за предпочитане е да бъде вече в културалната среда по времето, когато се извършва инокулацията.

Други родове освен Penicillium, напр.

Aspergillus nidulans, както и други видове от рода Penicillium, освен видовете chrysogenum, също така продуцират изопеницилин N. Известно е, че най-високо продуктивните щамове на изопеницилин N, разработени с добре известните техники за подобряване на щамовете, са щамовете от видовете chrysogenum. Ето защо, от практическа гледна точка изобретението е ограничено до щамовете на Penicillium chrysogenum, въпреки че приложимостта на изобретението спрямо други щамове е явна. Всеки депозиран щам от Penicillium chrysogenum или от друг достъпен източник на такъв щам е подходящ изходен материал за изпълнение на метода съгласно изобретението.

Културалната среда, способна да поддържа растежа на щама от Penicillium chrysogenum, продуцент на изопеницилин N, е от типа, който е добре известен на специалистите в тази област. Например култивирането ще се проведе по метода на вътрешна (дълбока) аеробна ферментация, а използваната среда може да се подбере от голям брой налични подходящи среди. Типични такива среди са тези, използващи източници на въглерод като захароза, глюкоза и нишесте, източници на азот, като соево брашно и шротове, масло от памучно семе, фъстъчено брашно и различни аминокиселини, техните смеси и пептони. Изискванията на производството са висок добив и лесно изолиране и поради тази причина предпочетените среди могат да бъдат меласите като източник на въглерод и соевото брашно и аминокиселини като източници на азот.

Към културалната среда обикновено се прибавят и хранителни неорганични соли, включващи соли, способни да доставят следните йони: натриеви, калиеви, амониеви, калциеви, фосфатни, сулфатни, хлоридни, бромидни, нитратни, карбонатни, фери, феро, магнезиеви, манганови и др. Следи от някои елементи също така са от значение за растежа, развитието и метаболизма на Penicillium chrysogenum и могат да бъдат прибавени директно в културалната среда, освен ако не са попаднали като онечиствания, главно съпътстващи другите съставки на средата.

Щамовете Penicillium chrysogenum могат да бъдат култивирани в съоръжения с малък обем, например в еднолитрови колби с разклащане, когато е желателно да се получат малки количества адипоил-7-АСА и евен12 туално 7-АСА. Когато се преследва получаването на големи количества адипоил-7-АСА, тогава ще се използват големи ферментори за провеждане на дълбока аеробна ферментация.

При провеждане на едромащабно получаване на адипоил-7-АСА, спорите на щама Penicillium chrysogenum се поддържат върху наклонен агар. Спорите от агара се използват за заразяване на вегетативна среда с малък обем. Вегетативната среда се инкубира, за да се получи тежка, прясна, активно растяща култура от микроорганизми. Тази вегетативна среда след това се използва като инокулат за голямата ферментационна среда. В някои случаи е желателно да се включи и втора вегетативна среда като инокулат за ферментационната среда. Такива втори вегетативни среди обикновено се използват, когато обемът на ферментационната среда е значително по-голям от първата вегетативна среда. В този случай спорите от микроорганизмите първоначално се култивират в малък обем вегетативна среда, за да се получи инокулат за вегетативна среда с по-голям обем. Втората, по-голямата вегетативна среда, има достатъчно висока концентрация от микроорганизми, за да предизвика бързо начало на ферментацията в големите ферментори. Вегетативната среда може да има същия състав, както и ферментационната среда, или може да съдържа допълнителни съставки за стимулиране растежа и развитието на микроорганизмите в малък мащаб.

Използваните при метода съгласно изобретението щамове от Penicillium chrysogenum се култивират най-ефективно при температура приблизително от 20 до 30°С, но оптимални добиви ще бъдат получени при около 22°С и 28°С, за препоръчване - около 25°С.

Максимално продуциране на адипоил-7АСА се получава, когато щамът от Penicillium chrysogenum се култивира в големи ферментори за период приблизително от 10 до 30 дни, за предпочитане между 15 и 20 дни. Когато е култивиран в малка апаратура, например 250 ml колба, растежът на микроорганизмите е побърз, при това продуцират адипоил-7-АСА за по-малко време, например 4 до 15 дни, почесто 5-7 дни.

Ако крайното pH в големите ферментори достигне стойност 8,0 или по-висока, добивът на адипоил-7-АСА ще бъде повлиян негативно. Желателно е да се следи pH на култу ралната среда по време на ферментацията. Ако pH на средата достигне тези нива преди достигане на времето за максимална продукция на азипоил-7-АСА, pH на средата може съответно да се намали с прибавянето във ферментационната среда на подходящ киселинен агент или буфер.

Продуцирането на адипоил-7-АСА може да се следи чрез хроматографско тестуване на проби от ферментационната среда.

Както при повечето дълбоки аеробни ферментации, през културалната среда се пропуска стерилен въздух за получаване на поефективен растеж на щама Penicillium chrysogenum и повишаване производството на адипоил-7-АСА. Обемът въздух, преминаващ през средата, обикновено е около 0,2 обема въздух на минута за обем културална среда. Обаче, по-голям обем преминаващ въздух често оказва благоприятен ефект върху продукцията на адипоил-7-АСА.

Обикновено щамът Penicillium chrysogenum продуцира, наред с адипоил-7-АСА и много други странични продукти и метаболити. Тъй като някои от тях са лабилни спрямо киселина, желателно е при извличането на адипоил-7-АСА от ферментационната среда, цялата ферментационна хранителна среда да се обработи за кратко време при ниска стойност на pH (кисела), за да се разрушат някои от получените онечиствания. Продуктът на ферментацията - адипоил-7-АСА се извлича от така обработената и филтрувана ферментационна среда и обикновено може да бъде разделен от останалите съставки на ферментацията хроматографски или с йонообменна смола и по-нататък може да се пречисти, ако е необходимо, хроматографски, преди следващия етап на ензимно отцепване на адипоиловата странична верига. Също така е възможно това йонообменно или хроматографско пречистване да се извърши, след като е проведено отцепването на страничната верига. Един от основните странични продукти, които представляват проблем при разделянето, е адипоил-6-АРА и, за да се улесни разделянето, възможно е този страничен продукт да бъде химично или ензимно разграден. Първоначално филтруваната ферментационна хранителна среда се подлага на предварително пречистване, което може да включва начална екстракция с несмесваем с водата органичен разтворител, като п бутанол или амилацетат, за да се отстранят онечистванията. След това екстрахираната хранителна среда може да се пречисти допълнително хроматографски или върху активен въглен.

Прибавяне на адипатната хранителна среда

Препоръчително е по времето, когато се създава ферментационната среда за Penicillium chrysogenum, както е описано по-горе, т.е. преди инокулацията, към другите съставки на ферментационната културална среда да се прибави адипатна хранителна среда. Обикновено адипатната хранителна среда може да се прибави известно време след инокулацията, например след 1, 2 и/или 3 ден. Адипатната хранителна среда се дефинира като съставена от адипинова киселина отделно или в смес със солите й или естерите й, които са способни да бъдат асимилирани и оползотворени от щама на Penicillium chrysogenum, който е култивиран, за да произведе адипоил-6-АРА. Адипиновата киселина, солите и естерите й могат да се използват поотделно или в комбинация. Предпочетена е двунатриевата й сол, въпреки че калиевата и смесени соли с натрия ще бъдат също така подходящи. Би могъл да се използва метиловият естер, но етиловият естер е водонеразтворим. Солта или естерът на адипиновата киселина трябва да бъдат такива, че да бъдат асимилирани и оползотворени от щама на Penicillium chrysogenum, за да се получи адипоил-6-АРА. Например и самата адипинова киселина би могла да бъде подходяща, въпреки че е водонеразтворима, ако при дадено pH се образува асимилиращата й се сол.

Подходящи експандазни и/или хидроксилазни ензими

Щамът Penicillium chrysogenum, който е култивиран и осигурен с адипатна хранителна среда, както е описано по-горе, така че да продуцира адипоил-6-АРА, е също така този, който е трансформиран от ДНК, кодираща активностите на ензимите експандаза и хидроксилаза, при което в резултат от неговата експресия, пръстенът на споменатата адипоил-6-АРА се разширява in situ, за да се получи адипоил-7ADCA, а също така 3-метиловата странична верига се превръща в 3-хидроксиметилова.

Адипоил-6-АРА се продуцира вътрешноклетъчно от култивирания с адипатна хранителна среда Penicillium chrysogenum. В тази вътрешноклетъчна среда, т.е. на база in situ, трансформираният Penicillium chrysogenum също така експресира ДНК, кодиращи активността на ензимите експандаза и хидроксилаза, при което ензимите действат върху адипоил-

6-АРА като субстрат и разширяват пръстена й за образуване на адипоил-7-ADCA, която след това се хидроксилира до адипоил-7-ADAC (адипоил-7-аминодеацетилцефалоспоранова киселина).

Новият биометод от представеното изобретение включва в обхвата си трансформирането на щама Penicillium chrysogenum от типа, описан по-горе, с някакви ДНК, кодиращи активностите на ензимите експандаза и хидроксилаза, при което в резултат на експресията им пръстенът на адипоил-6-АРА in situ се разширява за превръщането й в адипоил-7-ADCA и след това се хидроксилира до образуването на адипоил-7-ADAC. По такъв начин ДНК, с която е трансформиран Penicillium chrysogenum, трябва да експресира ензими, имащи не само активността на ензима експандаза, както се подразбира, т.е. способността да разширява пръстена на изопеницилин N до DAOC, но и способността да разширява пръстена на адипоил-6-АРА до адипоил-7-ADCA. В допълнение, ензимът хидроксилаза трябва да бъде способен да хидроксилира адипоил-7-ADCA до адипоил-7-AD АС.

Два алтернативни пътя се разглеждат като подходящи варианти на изпълнение в обхвата на представеното изобретение по отношение на начина, по който се създават активностите на ензимите експандаза и хидроксилаза. В един от вариантите на изпълнение, което е предпочетено, функциите на експандазата и хидроксилазата да се осъществяват от активността, експресирана от един, въпреки че по същество е бифункционален ген от Cephalosporium acremonium, с който е трансформиран Р. chrysogenum. Този ген, който експресира едновременно и двете активности на експандазата и хидроксилазата, ще бъде означен като експандаза/хидроксилаза ген, а неговият продукт - като експандазо/хидроксилазен ензим (и). Типично, когато Р. chrysogenum е трансформиран с ДНК от С. acremonium, кодираща активността на експандаза/хидроксилаза активността, експресията на тази активност ще се контролира от един единствен промотор, което показва наличието на един ген.

Алтернативно изпълнение на представеното изобретение, което е еднакво подходящо, включва трансформирането на Р. chrysogenum-гостоприемник с ДНК, кодираща активностите на експандазата и хидроксилазата, като отделни гени, противно на единичния експандазо/хидроксилазен ген. Трябва да се отбележи, че отделните експандаза и хидроксилаза гени и съответните ензимни активности, които те кодират, са установени в прокариотични микроорганизми, такива като S. clavuligerus, отколкото в еукариотични микроорганизми, като С. acremonium, които кодират единичния експандазо/хидроксилазен ген и ензим, както вече бе наблюдавано по-горе.

Последователността на прокариотичния хидроксилаза ензим и кодиращите го нуклеотиди, са описани от Kovacevic et al. в J. Bacteriol., 173 (1), 398-400 (1991) и ΕΡ-Α-0 465 189, като средство за изолиране на този ензим. Очевидно е, че от последователността на хидроксилазата е възможно да се синтезира с известните ръчни методи или с автоматични ДНК синтезатори, ДНК, кодираща ензима хидроксилаза. ДНК или съответната последователност, кодираща същата аминокисела последователност на хидроксилазата или техни фрагменти или производни, имащи еквивалентна хидроксилазна активност, на свой ред, могат да бъдат използвани като основата за получаване на различни клониращи и експресионни вектори, когато се комбинират с промотор и други регулиращи последователности, с които след това е възможно да се трансформира Р. chrysogenum гостоприемник, за да се експресира ензимът хидроксилаза и по такъв начин да се изпълни методът от изобретението. Възможно е също така ДНК да се използва като сонда, с която да се провери генната библиотека на кандидат-щама, потенциално съдържащ полезния ензим хидроксилаза, с цел да се идентифицират хомоложните последователности чрез хибридизиране. Активността на всяка предполагаема хидроксилаза, идентифицирана по този начин, може да се потвърди, като се използва действителен адипоил-7-АОСА-субстрат по метода на представеното изобретение и изолиране на продукта от хидроксилирането с HPLC (високо чувствителна течна хроматография).

Когато се приложи това изпълнение на изобретението, т.е. отделен ген, експресиращ само хидроксилазна активност, след това ще бъде необходимо също така отделно да се достави ДНК, кодираща активността на ензима експандаза, така че Р. chrysogenum може да бъде трансформиран с подходящ експресионен вектор, който позволява in situ експресия на функцията експандаза, за да се осигури етапът на разширяване на пръстена по метода от изобретението. Известни са много експандаза-ензими и е установено, че на базата на приликата на страничните вериги много експандаза ензими са годни за осъществяване на биопроцеса съгласно изобретението.

Други полезни изпълнения на изобретението почиват на факта, че ДНК, кодираща активността на повече от една експандаза и/ или повече от една хидроксилаза, може да бъде използвана, за да трансформира нерекомбинантен Р. chrysogenum щам. Възможно е с такива изпълнения да се постигне повишена експандаза и/или хидроксилаза активност, поради повишените количества експресиран ензимен протеин.

Както е посочено по-горе, ензимът експандаза, получен от Streptomyces clavuligerus ATCC 27064, е напълно секвениран, както и охарактеризиран чрез картиране с рестрикционни ендонуклеази. Обаче, това, което изглежда, че е същият ензим, получен от S. clavuligerus NRRL 3585, е докладвано, че има различно молекулно тегло, но не е бил секвениран. Както е описано по-горе, ензимът DAOCS/DACS от Cephalosporium acremonium ATCC 11550 е бил секвениран [Samson et al., Bio/Technology (1987) 5: 1207-1214 и EP-A-0 281 391].

Тези експандазни ензими, вече идентифицирани по-рано, са полезни в новия биометод от изобретението. Други експандазни ензими, все още неидентифицирани, произлезли от различни щамове на S. clavuligerus или С. acremonium, или дори от микроорганизми от различни родове, могат също така да покажат, че са подходящи за провеждане на новия биометод от представеното изобретение. Процедурите за идентифициране на такива нови щамове и родове полезни микроорганизми и за изолиране на предполагаеми експандаза ензими и установяване, че те са подходящи за приложение по метода от изобретението, са добре известни на специалистите в тази област. Скринингьт на безклетъчните екстракти на новите кандидат-щамове и родове полезни мик15 роорганизми може да бъде извършен по надежден и възпроизводим начин, чрез прибавяне на тези екстракти към адипоил-6-АРА субстрат в присъствието на известни DAOCS кофактори, които включват феро (Fe²⁺) йони, аскорбат, α-кетоглутарат и аденозинтрифосфат (АТР). Адипоил-6-АРА може да се получи в достатъчни количества чрез захранване с адипатна хранителна среда на трансформиран щам от Penicillium chrysogenum по начин, аналогичен на подробно описания по-нататък. Желаният ензим експандаза (или експандаза/хидроксилаза) е налице, ако се е образувала адипоил-7-ADCA и/или адипоил-7-ADAC, чието наличие се установява хроматографски.

Възможно е също така, като се използват добре известните рекомбинантни техники, да се създадат ДНК сонди на базата на нуклеотидните последователности на гените на експандазата от S. clavuligerus и С. acremonium, например за скрининг на ДНК съдържимото на кандидат-микроорганизма, който евентуално би могъл да продуцира експандаза, подходяща за използване в метода на изобретението.

Възможни източници на ензимите експандаза, хидроксилаза и експандазо/хидроксилаза

Експандазните ензими, както е посочено, се ензими, които катализират разширяването на пенамовите пръстенни структури (установени в пеницилиновия тип молекули), до цеф3-ем пръстени (установени в цефалоспорините). Следователно, всеки организъм, продуциращ метаболити, съдържащи цефемов пръстен, е потенциален източник на експандазакодираща ДНК. По същия начин всеки организъм, който продуцира цефалоспорини, съдържащи 3-хидроксиметилова група, е потенциален източник на хидроксилаза- (или експандаза/хидроксилаза), кодираща ДНК. Следват примери за такива микроорганизми, но този списък не трябва да се смята за изчерпателен:

Гъбички: Cephalosporium acremonium, Cephalosporium sp., Emericellopsis, Paecilomyces, Scopulariopsis, Diheterospora, Spiroidium, Anoxiopsis; Актиномицети: Streptomyces clavuligerus, S. lipmanii, S. wadayamensis, S. todorominensis, S. filipinensis cephamycini, S. heteromorphus, S. panayensis, S. griseus, S. cattleya, Nocardia lactamdurans; Други бактерии: Flavobacterium sp., Alcaligenes denitrificans, Mycoplana bullata, Providencia rettgeri, Lysobacter lactamgenus.

Експандазите и хидроксилазите от организмите, изброени по-горе, са просто кандидати за по-нататъшни изследвания и може да се окаже, че не всяка от тях ще бъде подходяща за новия метод от изобретението.

Изолиране на ДНК-фрагменти, кодиращи активността на експандазата

След като веднъж е открито наличието на желания ензим експандаза, по начина, описан по-горе, процедурите за изолиране на ДНК, кодираща активността на ензима експандаза, са също така добре известни на специалистите в тази област. Конструирани са ДНК сонди на базата на познати последователности и частични последователности на гените, кодиращи ензимите експандаза, които от своя страна ще хибридизират до желаната ензимкодираща ДНК, за да бъде изолирана. Конструирането на такива сонди е на базата на познанията за последователността на аминокиселините и нуклеотидите, кодиращи ензима експандаза, както и на кодоновите преференции на отделния включен микроорганизъм. Подробно описание на типичните процедури от този тип, приложени към геномна ДНК на Streptomyces clavurigerus ATCC 27064, са описани по-долу.

Изолирането на ДНК, кодираща активността на ензима експандаза, се извършва, като се използват рестрикционни и лигиращи процедури, добре известни в рекомбинантната ДНК техника. Необходимо е да се притежава ендонуклеазна рестрикционна карта на генома на включения микроорганизъм, така че да могат да бъдат получени и изолирани правилни рестрикционни фрагменти. Рестрикционни карти за S. clavuligerus и С. acremonium са вече налице, например за първия са използвани рестрикционните ензими Bam Hal и Sal I и електрофорезата дава желаните 1,8 до 2,2 кб (килобази) фрагменти.

Източници на ензима ацетилтрансфераза и изолиране на ДНК фрагменти, кодиращи споменатата активност

Клонирането на гена на С. acremonium DAC ацетилтрансфераза може да се извърши по добре известни рекомбинантни техники, които са описани непосредствено по-долу.

С цел да се клонира гена ацетилтрансфераза, първо трябва да се създадат мутанти на С. acremonium с недостиг в способността да превръщат деацетилцефалоспорановата ки16 селина (DAC) в цефалоспорин С. Такъв процес се състои в подлагане на клетки от С. асгеmonium на действието на мутагени, каквито са N-нитрозогванидин, азотиста киселина или ултравиолетово облъчване, позволяващи събирането им върху подходяща хранителна среда и оценката им, например хроматографски или с биологични средства за натрупването на DAC.

След определянето на подходящ мутант, следващата стъпка в идентифицирането на гена, кодиращ ацетилтрансферазата, е изолирането на С. acremonium ДНК от щам, продуцент на цефалоспорин С. След разцепването чрез рестрикционно ендонуклеазно смилане или с механично разкъсване на подходящо оразмерени фрагменти, тя се включва в плазмид или козмид, трансформационни вектори, съдържащи също така подходящ доминантен ген-маркер, като резистентен на хигромицин или флеомицин. Векторът трябва също така да съдържа ДНК последователности, за да улесни последващото възстановяване на вмъкнатата ДНК, напр. ламбда cos места, които позволяват спасяване на клонираната ДНК чрез in vitro опаковане, последвано от инфектиране на Е. coli, което може да се извърши по добре разработените процедури.

Протопластите на щама мутант на ацетилтрансферазата-минус, след това се трансформират, като се използват вектори, съдържащи случайни фрагменти от геномната ДНК и трансформанти, подбрани на базата на антибиотичната резистентност. След това трансформантите могат да бъдат проверени за възстановяване на продукцията на цефалоспорин С, като това е индикация за успешното комплементиране с векторсъдържащия ацетилтрансфераза ген. След това мутантите, които се очаква, че са приели клонирани копия от гена, могат да бъдат култивирани, тяхната ДНК се изолира и векторната ДНК да се събере по метода, описан по-горе. Потвърждение, че векторът наистина съдържа ацетилтрансфераза ген, се получава чрез субклониране в Е. coli, като се използват стандартните процедури и лесно достъпните вектори, последвано от ретрансформация на ацетилтрансфераза-минус мутанта. След това генът може да се изолира, секвенира и манипулира, както е описано в работните примери по-долу, като се използват рутинните техники, известни в молекулярната генетика.

Следвайки алтернативни процедури, също известни в науката, Matsuda et al. изолират и секвенират гена, кодиращ ацетилтрансферазната активност на С. acremonium и извеждат аминокиселинната последователност на самия ензим, което е описано в ЕР-А-0 450 758. Тези алтернативни процедури се състоят в изолиране на ензима ацетилтрансфераза, секвениране на аминокиселината от N-края и от тази информация е извадено заключение за нуклеотидната последователност, кодираща тази част на ензима. От тази информация на свой ред са генерирани сонди, които хибридизират до пълната кодираща последователност, позволяваща изолирането й.

Трансформиране на щама Penicillium chrysogenum

След като веднъж са получени фрагментите ДНК, кодиращи активностите на експандазо/хидроксилаза, експандаза и хидроксилаза и ацетилтрансфераза, те могат да бъдат вкарани (лигирани) в плазмид или друг експресионен вектор, заедно с ДНК фрагментите, включващи промотори, транслационни активиращи секвенции, резистентни маркери, регулиращи секвенции и всички други ДНК секвенции, които позволяват или промотират трансформацията, управляват експресията на гениите продукти и улесняват изолирането на трансформантите. Експресионните вектори, които са конструирани по този начин, след това се използват за постигане на трансформиране на щама Penicillium chrysogenum и вътрешноклетъчна експресия на активността на ензимите експандаза/хидроксилаза, експандаза и хидроксилаза и ацетилтрансфераза. Използваните техники за постигане на трансформирането и експресията са добре известни и подробно описание на тези типични процедури е дадено понататък. Както е посочено подробно по-горе, трансформираният щам Penicillium chrysogenum експресира вътрешноклетъчно активността на ензимите експандаза/хидроксилаза, експандаза и хидроксилаза и ацетилтрансфераза, които след това действат in situ върху адипоил-6АРА, за да разширят пръстена й до адипоил-

7-ADCA, хидроксилират последната до адипоил-7-ADAC, която след това се ацетилира до адипоил-7-АСА.

Нови трансформанти

Специфичните трансформанти на Penicillium chrysogenum, експресиращи активностите, кодирани от гените експандазо/хидроксилаза и експандаза/хидроксилаза плюс ацетилтрансферазни гени, които са предпочитаните изпълнения на изобретението, са нови по отношение на подобни структури, описани по-рано, като тези на Cantwell et al. (1990) Current genetics, 17, 213-221, EP-A-0 281 391 и EP-AO 437 378. Структурата no Cantwell има експандаза ген на Streptomyces clavuligerus, поставен под контрола на Р. chrysogenum изопеницилин N синтетазен промотор, и по този начин се различава от структурите съгласно изобретението в липсата на всякаква ДНК, кодираща активностите на хидроксилаза или ацетилтрансфераза.

Ingolia et al. в патент ЕР 0 281 391 описват трансформационни вектори на Р. chrysogenum, които съдържат ДНК кодираща експандаза/ хидроксилаза бифункционалния ензим на

С. acremonium с експресия, управлявана от Penicillium IPNS промотор. В една от тези структури (pPS62), експандазо/хидроксилаза генът е свързан в посока на репликацията и е в рамките на хигромицинфосфотрансфераза гена. Генният продукт, хигромицинфосфотрансфераза:експандаза/хидроксилаза свързан протеин, се различава от продукта съгласно изобретението - експандаза/хидроксилаза ензим, всъщност идентичен с продукта на С. acremonium. Друг вектор, описан в ЕР-А-0 281 391, е структуриран чрез екстензивни серии от молекулярни манипулации, включващи използването на синтетични ДНК-линкери. Крайната структура (pPS61) използва 1,2 кб Ncol фрагмент на Penicillium IPNS промотора, за да експресира експандаза/хидроксилаза гена, както и Aspergillus nidulans ацетамидазния ген, като подбран маркер за трансформация на Penicillium. Последователността на кодоните девет и десет в експандазо/хидроксилазния ген, кодиращи съответно аргинин и левцин, се променят от CGTCTC до CGCCTA, което не променя кодираната аминокиселинна последователност.

В структурата съгласно изобретението 1,2 кб Ncol IPNS промоторния фрагмент е слят към експандаза/хидроксилаза ген, без да променя природната експандазо/хидроксилазна генна последователност. IPNS промоторът, използван за структурата съгласно изобретението, има две отделни четирибазови дупликации по отношение на естествения промотор, една на мястото Sall 760 бази двойки нагоре от ATG стар товия кодон, а другата на мястото Xbal, пет бази двойки нагоре от стартовия кодон и в 5' нетранслируемата лидерна последователност. Тези промени не оказват влияние върху високото ниво на експресия на експандазо/хидроксилазния ген.

Друга разлика във векторите лежи в използваните подбрани маркери. Структурите, описани в ЕР-А-0 281 391, използват ацетамидаза и хигромицин като подбрани маркери. Това е в пълен контраст с експандаза/хидроксилаза трансформационния вектор, използван в представеното изобретение (pPEN/ СЕРН-1), който съдържа флеомицин (phleomycin) резистентен маркер. Щамът Penicillium chrysogenum, трансформиран с вектора pPEN/ СЕРН-1 и способен да експресира експандазо/хидроксилазна активност, е идентифициран като РС200. Неговите таксономии характеристики включват продуциране на широко разпространяващи се колонии, синьо-зелени до зелени на цвят, кадифено гладки с жълти капчици, жълто дифундиращи в агара, конидийни глави, разклонени, като всички части са гладки, конидиини, елиптични до сферични с дължина 3-4 т. Приемливи условия за култивиране на Р. chrysogenum са използването на твърда среда, включваща монохидратирана лактоза 1,5% (об.); екстракт от царевица 0,5% (об.); пептон, 0,5% (об.); NaCl, 0,4% (o6.);MgSO₄.7H₂0, 0,05% (об.); КН₂РО₄, 0,06% (об.); FeCl₃.6H₂0 , 0,00 05% (об.); CuSO₄.5H₂0, 0,0002% (об.); агар, 3,0% (об.) в 1 1 дестилирана вода, рН 4,8. Току-що описаният щам Penicillium chrysogenum и обозначен като РС200, е депозиран в American Type Culture Collection (АТСС), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, под номер на достъп АТСС 74186 (дата на депозиране: 23.09.1992).

Вторият нов трансформант Penicillium chrysogenum съгласно изобретението, способен да продуцира адипоил-7-АСА, експресира двете активности експандаза/хидроксилаза и ацетилтрансфераза, поради това че е трансформиран с един вектор (pTS-8), включващ ДНК, кодираща и двата ензима. Този вектор следователно се различава от онези Penicilliumтрансформиращи вектори, споменати в ЕР-АО 437 378, които включват ДНК, кодираща или само ацетилтрансферазата на С. acremonium, или във връзка с ДНК последователно18 стта, кодираща мутантен експандаза/хидроксилаза полипептид. В конструкцията pTS-8 експресията на гените експандаза/хидроксилаза и ацетилтрансфераза се управляват поотделно от отделни копия на Р. chrysogenum IPNS 5 промотор; трето копие на IPNS промотора се използва, за да управлява транскрипцията на флеомицин резистентния ген, използван като селективен маркер.

В алтернативно изпълнение на представеното изобретение гените на експандаза/хидроксилаза и на ацетилтрансфераза могат да бъдат включени в отделни вектори и въведени в щама гостоприемник Penicillium последователно. Редът, по който ДНК фрагментите, кодиращи активностите на ензимите експандаза/ хидроксилаза и ацетилтрансфераза, са въведени в щама Penicillium, е от значение само от практична гледна точка. Препоръчително е трансформирането на Penicillium-a с експандаза/хидроксилаза гена (гените) да предхожда въвеждането на ацетилтрансфераза гена, тъй като това е порядъкът, по който ензимите действат in vivo. Следователно експресията на експандазо/хидроксилазния ген може да се следи чрез проверка за продуциране на адипоил7-ADAC. Тъй като адипоил-7-ADAC е субстратът за ензима ацетилтрансфераза, експресията на последващо въведения ацетилтрансфераза-кодиращ ген се индицира от получаването на адипоил-7-АСА. Като се използва подходящ in vitro анализ за ацетилтрансфераза, е възможно да се трансформира Penicillium първо с ацетилтрансфераза, да се потвърди експресията с in vitro анализ и след това да се премине към въвеждането на експандазо/хидроксилазния ген. Следователно, този път ще бъде подходящо изпълнение на метода от представеното изобретение за получаване на 7-АС А.

IPNS промотор Strep експандаза Cantwell Изобретението

Структурата на Cantwell заменя С с Т, докато в конструкцията на изобретението С се запазва; по такъв начин последователността на IPNS промотора, непосредствено съседна на ATG стартовия кодон, съвпада точно с тази, която е установена в природния IPNS ген. Възможно е промоторът, описан в предишноXbal

5' TCTAGACACCATGG 3'

5’ GTGAGAGTTGATGGAC 3’

5' TCTAGACACTATGGAC 3'

5' TCTAGACACCATGGAC 3’

Обаче при предпочетеното изпълнение на изобретението и трите ензимни активности се въвеждат едновременно чрез конструкцията на единичен плазмиден вектор, включващ ДНК кодираща експандаза/хидроксилаза и ацетилтрансфераза активностите на С. acremonium. Щамът на Penicillium chrysogenum, трансформиран с такъв единичен плазмиден вектор, векторът pTS-8 и способен да експре10 сира експандаза/хидроксилаза и ацетилтрансфераза активност, е идентифициран като РСЗОО. Неговите таксономии характеристики са същите, както на описания по-горе РС200. Приемливите условия за култивирането на 15 РСЗОО са същите, както тези за описания вече РС200. Щамът Penicillium chrysogenum, обозначен като РСЗОО, е депозиран в АТСС под номер АТСС 74187 (дата на депозиране; 23.09.1992 г.).

Специфичният Penicillium chrysogenum, трансформиран с вектора pPenFTSO, експресиращ активността на S. clavuligerus експандаза гена, който е предпочитано изпълнение от изобретението, е нов по отношение на та25 кива конструкции, описани по-рано, като например тази на Cantwell et al. (1990) Current Genetics, 17, 213-221. И в двете структури е използвана in vitro мутагенеза, за да се свърже промоторът с експандазния ген. В конст30 рукцията на Cantwell манипулирането въвежда Nde I място при ATG на експандаза гена, който е свързан към Xba I място на 3' края на IPNS промотора с Xbal/Ndel линкер. В конструкцията от представеното изобретение е съз35 дадено Ncol място при ATG на експандаза гена и лигирано към Ncol мястото на 3' края на IPNS линкера. Това създава следващите последователности около промотор-ген преходите в тези структури.

Ncol

Seq. ID No: 1 Seq. ID No: 2 Seq. ID No: 3 Seq. ID No: 4 то състояние на техниката, въпреки това, че се различава само с една единствена нуклеотидна база, да може да доведе до по-ниска транслационна ефективност и оттук - до пониска степен на експресия на експандаза гена. Други разлики са в областите на промотора или гена, включен в конструкциите.

Структурата на Cantwell съдържа 5' Bam Hl до Xbal 3' област от IPNS промотора, докато векторът на представеното изобретение съдържа 5' Neo 1 до Neo 1 3' област от промотора. [Dietz etal. (1990), J. Biol. Chem., 265, 16358-16365]. В резултат на това се получават около 250 базови двойки допълнително в 5' края на IPNS промотора в конструкцията на Cantwell. Обаче, тази област е в отворената рамка на четене на ACV синтетаза гена нагоре от IPNS гена.

Структурата на Cantwell съдържа също така Streptomyces ген от ATG до Bam Н1 мястото 3' на гена, докато векторът от изобретението съдържа ATG до Sal I място 3' на гена [Kovacevic et al. (1989), J. Bacteriol., 171, 754760]. Това резултира в приблизително 1000 основни двойки допълнително 3' края секвенцията в конструкцията на Cantwell. Структурата на представеното изобретение съдържа горната част на експандаза гена до Bam Н1 място 5' на ATG; обаче, е отделена от четящата рамка на експандаза гена от IPNS промотора.

Друга разлика между структурата рРепFTSO от изобретението в сравнение с тази, описана по-рано, се отнася до селективния използван маркер. Използването на Penicillium IPNS промотор:флеомицин ген фузията в структурата от изобретението се стреми да подбере за интегриране на повторяеми копия или интегриране на локуса, което позволява висока степен на експресия и по този начин - потенциално по-висок процент трансформанти, които експресират експандаза гена на високо ниво.

Отцепване на адипоиловата странична верига

Последният етап в новия биопроцес от изобретението е отцепването на адипоиловата странична верига от адипоил-7-ADAC или адипоил-7-АСА, което изисква обработка на продуктите от предшестващите етапи с ензима адипоиламидаза. Както е отбелязано по-горе, едно от значителните постижения от изобретението е способността му всички етапи, водещи до образуването на адипоил-7-ADAC и на адипоил-7-АСА, да се провеждат в една и съща ферментационна културална среда. Това постижение осигурява изключително висока ефективност, поради това, че не се налага изолирането и частичното пречистване на междинните продукти в различните етапи от процеса. В този последен етап, обаче системата на ензима адипоиламидаза не се намира в разтвора, т.е. не е генерирана in situ в първоначалната ферментационна среда, както от естествена, така и от рекомбинантна експресия на гените на Р. chrysogenum.

Ако новият биопроцес от изобретението се провеждаше в отделни етапи, тогава щеше да бъде необходимо да се изолира и пречисти частично продуктът от първия етап, а предварителните процедури за извършване на това са описани вече по-горе.

Въпреки това, процесът от изобретението може да се проведе по всеки метод, който осигурява ефективно осъществяване на контакт на адипоиламидазата с адипоил-7-ADAC или адипоил-7-АСА, така че да може да протече ензимно превръщане на тези съединения в 7-ADAC или 7-АСА. Това е дефиницията на термина “контакт” в най-общия му смисъл. Възможно е като хранителна среда да се използва безклетъчна среда от суров адипоил7-ADAC или адипоил-7-АСА и тази среда да се обработи в отделен етап с разтвор на адипоиламидаза. Това решение има някои добри страни, тъй като не изисква основно пречистване на изходните реагенти. Разбира се, възможни са модификации. Например реагентите могат да бъдат пречистени до известна желана степен, преди да бъдат смесени. Също така, би било възможно процесът да се проведе непрекъснато, а не поотделно. Контактът между реагентите може да се осъществи по различни начини, като се запазват предимствата на технологията на метода. Така например може да се използва имобилизиран ензим, например под формата на колона, съдържаща адипилацилаза, като адипоил-7-ADAC или адипоил-7-АСА се прекарват през колоната. Обездвиженият ензим може също така да се прибави под формата на суспензия към разтвор на адипоил-7-ADAC или адипоил-7-АСА. Тези системи на обездвижен ензим предлагат предимството на лесно възстановяване на ензима и многократното му използване. Друг пример за технология е свързан с мембранни реактори. Препоръчителният метод на осъществяване на контакт между реагентите е метода на колона с обездвижен ензим.

Адипоиламидаза ензими, полезни в етапа отцепване

Съществуват голям брой ензими с позната специфичност спрямо адипоиловите странични вериги. Резултатите, получени с тър20 говски достъпната адипоиламидаза от фирмата RAEV Corp., са описани подробно в примерите, дадени по-долу. В литературата са докладвани седем други ензима, които отстраняват адипоиловите странични вериги от цефалоспоринов тип молекули. Шест от тези седем ензима са от видовете Pseudomonas, и седмият е от вида Bacillus. Съществуват известни прилики между някои от ензимите Pseudomonas, но всички седем се различават в известна степен по отношение физичните и биологични 5 свойства. Някои от характеристиките им са следните:

ЕНЗИМ (Щамове Pseudomonas и Bacillus)	ЛИТ. ИЗТОЧНИК- 38 -	ПРИБЛ. МОЛ. ТЕГЛО
Р. SY-77-1	Shibuya et al.	Привидно същото както
(Toyo Jozo)	(1961)	GK 16 по-долу
Р. GK 16	Matsuda, Komatsu	16000
(Asahi)	(1985)	54 000
Р. SE 83 (ацил)	Matsuda et al.	3Θ200
(Asahi)	(1987)	19 900
Р. SE 83 (ацил I)	Matsuda et al.	25 400
(Asahi)	(1967)	56 200
Р. diminuta N 176	Aramori, et al.	58 000
(Fujisawa)	(1991a)*	26 000
Р. diminuta V 22	Aramori, et al.	?
(Fujisawa)	(1991a)*	?
Bacillus latero-	Aramori, et al.	70 000
sporus J1 (Fuji)	(1991b)**	(мономерен)
Pseudomonas sp.		16000
(RAEV Corp.)		54 000

* Aramori at al., J. Ferment. Bioeng. (1991) 72: 232 - 243. ** Aramori et al., J. Bacteriol. (1991) 173: 7848 - 7855.

Всички посочени адипоиламидазни ензими са полезни за новия биопроцес от представеното изобретение. Други адипоиламидази, използвани по метода от изобретението, могат да бъдат лесно открити, чрез тестуване на кандидат-ензимите спрямо адипоил-7-ADAC и адипоил-7-АСА, действителните субстрати, върху които той трябва да действа. Един положителен резултат дава надежден и възпроизводим метод за определяне, че кандидат-ензимът е наистина полезен за метода от изобретението. Субстратът може да се получи при взаимодействието на адипинов анхидрид с 7АСА, като се използва модификация на процедурата, докладвана от Szewczuk and WellmanBednawska - Clin. Chim. Acta (1978) 84, 19-26.

Възможно е също така да се пригоди и метода, описан в Agric. Biol. Chem. (1981), 45(7), 15611567, който се отнася до получаването на глу40 тарил-7-АСА. Адипиновият анхидрид може да се получи и съгласно метода на Albertson & Lundmark, описан в J. Macromol. Sci. Chem. (1990) А(27), 397-412. 7-АСА може да се получи от няколко търговски източника, вкл. и 45 от фирмата Sigma Chemical Co.

Ако е желателно да се проведе груб скрининг на кандидат-ензимите, като се използва бърз колориметричен метод, адипоил-7-АСА субстратът може да се замени с колориметри50 чен субстрат, например адипоил-РАВА (пара-аминобензоена киселина) или адипоил-pNA (пара-нитроанилин). Като такъв метод може да бъде адаптиран описаният за гама-глутамил РАВА от Szewczuk et al., Clinica Chimica Acta, 84 (1978) 19-26. Отцепването на страничната верига дава видове, генериращи цветове, чието присъствие и концентрация се из- 5 мерват лесно колориметрично. За по-подробна информация, отнасяща се до тези и други подходящи колориметрични методи, вижте Marelli, L.P. (1968) J. Pharm. Sci. 57: 2172-2173; Szasz, G. (1969) Clin. Chem. 15: 124-136; Szewczuk, 10

A. et al. (1980) Anal. Biohem. 103: 166-169; Reyes, F. et al. (1989) J. Pharma. Pharmacol. 41: 136-137.

Направено е сравнение на N-края на аминокиселинната последователност на ензима от фирма RAEV с големи субединици на acyll и GK16 ензимите, дадени в таблицата по-горе. Резултатите от сравнението са следните, като скобите показват незавършена оценка:

RAEV - идентиф. послед. No. 5:

(S) N (S) (G) A V А Р G К Т А N G N A L (L) L Q N (Р) GK16 - идентиф. послед. No. 6

SNSWAVAPGKTANGNALLLQNP acyll - идентиф. послед. No. 7

SNNWAVAPGRTATGRPILAGDP

От показаните последователности е ясно, че всичките тези три пептида са сродни. Обаче протеин, имащ последователност на N-края, подобна на посочените по-горе, няма да има задължително адипоиламидазна активност, ка къвто е случаят с пеницилин G-ацилаза, получена от щам на Arthrobacter. От друга страна, съществуват адипоиламидази, полезни за метода от изобретението, които не показват забележима хомология с цитираната по-горе пос ледователност на N-края. Например, ацилазата acyl на Asahi и В. laterosporus J1 на Fujisawa, дадени в таблицата по-гора, които са показали, че имат известна адипоил-7-АСА ацилазна активност, не споделят нито една от хомоложни те последователности с другите ензими, цитирани по-горе. Следователно обсегът на действие на представеното изобретение по отношение на адипоиламидазите, полезни в последния етап на новия биопроцес, се определя от това дали даден кандидат-ензим е способен да отцепи адипоиловата странична верига от адипоил-7-АСА или не, като това е способност, която може да се определи бързо и лесно, както е описано подробно по-горе.

Примери за изпълнение на изобретението

Следват подробни описания на някои предпочитани изпълнения на изобретението, но те са само илюстративни и в никакъв случай не ограничават представеното изобретение.

Пример 1. Условия за култивиране на Penicillium chrysogenum

Щамовете Penicillium chrysogenum, използвани при тези процедури, се поддържат върху плаки, съдържащи среда, съставена от монохидрат лактоза, 1,5% (об.); царевичен екстракт, 0,5% (об.); пептон, 0,5% (об.); NaCl, 0,4% (o6.);MgSO₄.7H₂0, 0,05% (об.); КН₂РО₄, 0,06% (об.); FeCl₃.6H₂0 , 0,00 05% (об.); CuSD₄.5H₂0, 0,0002% (об.); агар, 3,0% (об.) в един литър дестилирана вода, pH 4,8. След 12 дни при температура 25°С и 65% относителна влажност отделните колонии бяха отстранени и прибавени в 2 ml стерилизирана вода в епруветки с винтови запушалки, съдържащи стъклени перли. След мацерация на културалния растеж със завихряне суспензията се използва за инокулация на оризови колби. Оризовите колби съдържат 25 g в 250 ml колба хидролизиран ориз Uncle Ben’s с естествена дължина на зърната, промит с три до четири обема дестилирана вода в продължение на 7 min, разбъркван всеки 30 s и след това отцеден, докато задържаната вода в ориза остане около 25%. След 12 дни при 25°С и 64% относителна влажност спорите се отмиват от ориза с 50 ml стерилна вода. Споровата суспензия се използва за заразяване на течните културални среди и за лиофилизат, който се съхранява при 4°С. Спорите се прибавят към равен обем 5% обезмаслено мляко и се лиофилизират в стерилни ампули.

Използва се двуетапна ферментация на щама в разклащащи се колби за получаване на пеницилини или мицели, като източник на

РНК или ДНК. Етапът на засяване се започ22 ва с прибавянето на 1.10’ спори към 50 ml/500 ml колби със среда, съставена от следните компоненти в об.%: глюкоза 3,0; фармасреда 1,0; царевичен екстракт 3,0; амониев сулфат 0,2; СаСО₃ 0,5; безводен монокалиев фосфат 0,05; лактоза 1,0; първична суха мая 1,0, в 1 1 дестилирана вода. Инкубирането се извършва при 25°С и 65 % относителна влажност върху въртяща се клатачна машина с амплитуда 70 mm при 220 об./min. След 48 h инкубиране етапът на продуциране се инициализира чрез прехвърляне на 2 ml от вегетативната зародишна среда в 35 ml/500 ml колба със среда със следния състав в об.%: КН₂РО₄, 0,05; K₂SO₄ 0,5; (NH₄)₂SO₄1,0; лактоза 12,0; фармасреда 2,75; СаСО₃ (преципитат) 1,0; течна фракция от свинска мас 1,0 в 1 1 дестилирана вода с pH 6,6. След автоклавирането, но преди инокулацията, се прибавя стерилен 25 % натриев адипат (pH 6,6), за да се получи крайна концентрация на натриевия адипат 2,5%. Инкубирането, последващо инокулацията, се продължава при същите условия, както и стадия на посяване в продължение на 5 до 7 дни.

Когато са необходими мицели за генериране на протопласти за трансформиране или като източник на ДНК, щамът се култивира в 50 ml/250 ml колба от пълна среда (СМ), съставена от: 50 ml от 20 X соли на Clutterbuck (120 g Na₂NO₃, 10,4 g KC1, 10,4 g MgSO₄.7H₂0,

30,4 g KH₂PO₄), 2,0 ml следи на елементи Vogel, 0,03 M лимонена киселина, 0,2 М ZnSO₄, 25 mM Fe(NH₄)₂(SO₄)₂.6H₂0, 10 тМ CuSO₄, 3 тМ MnSO₄, 8 тМ борна киселина, 2 тМ Na₂MoO₄. 2Н₂0, 5 g триптон, 5 g дрождев екстракт, 10 g глюкоза в 1 1 дестилирана вода. Инкубира се при 25°С върху ротационна клатачна машина при 220 об./min.

Пример 2. Условия за култивиране на Cephalosporium acremonium

Щамовете от С. acremonium се поддържат върху полегат агар, съдържащ пълна среда, съставена от следните компоненти в g: захароза 20, агар 20; пептон 4; дрождев екстракт 4; NaNO₃ 3; КН₂РО₄ 0,5; К₂НРО₄ 0,5; КС1 0,5; MgSO₄.7H₂O 0,5; FeSO₄.7H₂0 0,01, в 1 1 дестилирана вода, pH 6,6. След 10 дни растеж при 28°С и 66% относителна влажност към плаките се прибавя 6 ml стерилизирана вода и израсналата култура се изстъргва от повърхността на агара. Получената суспензия се прехвърля в стерилна епруветка с пълнеж от стък лени перли и винтова запушалка. След мацерация на културата чрез завихряне в продължение на няколко минути, 3,5 ml от получената суспензия се използва за инокулиране на течните култури. Тази суспензия се използва също така и за получаване на лиофилизати от културите за съхранение при 4°С. Суспензията от мацерирана култура се центрофугира, утайката се ресуспендира в 5 % обезмаслено мляко и аликвотите се лиофилизират в стерилни ампули.

Използва се двуетапен процес на ферментация на щамовете в колби от клатачна машина за продуцирането на цефалоспорини или за получаването на мицел като източник на ДНК и РНК. Етапът на закваска се инициализира с прибавянето на инокулат в 250 ml колби, всяка съдържаща 15 ml хранителна среда със следния състав в g: глюкоза 5; захароза 40; царевично нишесте 30; цвеклова меласа 50; соево брашно 65; CaSO₄.2H₂0 15,8; амониев ацетат 8; СаСО₃ (преципитат) 5; (NH₄)₂SO₄ 7,5; MgSO₄.7H₂0 3,5; КН₂РО₄ 1; соево масло 0,15 ml за колба, в 1 1 дестилирана вода при pH 6,2. Инкубирането се извършва при 25°С и 65 % относителна влажност върху ротационна клатачна машина със 70 mm амплитуда по диаметъра и скорост 220 об./min. След инкубиране в продължение на 96 h продукционният етап се инициализира с прехвърляне на 2 ml от вегетативната зародишна среда в 250 ml колба, съдържаща 15 ml свежа хранителна среда, описана по-горе. Инкубирането продължава допълнителни 96 h при същите условия.

Когато е необходим мицел като източник на ДНК за трансформиране, щамовете се култивират в 100 ml/500 ml колби със среда със следния състав в g: глицерол 20; пептон 4; дрождев екстракт 4; КН₂РО₄ 0,5; К₂НРО₄ 0,5; КС1 0,5; MgSO₄.7H₂0 1; NaNO₃ 3; FeSO₄.7H₂0 0,01 в 1 1 дестилирана вода. Инкубирането е при 30°С върху ротационна клатачна машина при 200 об./min.

Пример 3. Изолиране на геномна ДНК и пълна РНК от Penicillium и Cephalosporium

Вегетативна мицелна среда от 48-часова култура, получена, както е описано по-горе, се събира чрез филтруване през сиренарско платно, замразява се в течен азот и се лиофилизира една нощ. Изсушеният мицел се стрива в хаван с пясък и се ресуспендира в 25 ml

100 mM LiCl, 50 тМ EDTA, 10 тМ Tris pH

8,0, 4% SDS. След нагряване на суспензията до 50-55°С в 60°С водна баня, сместа се екстрахира първо с 1М Tris (pH 8) наситен фенол, последвано от Tris-наситен фенол:хлороформ (1:1 об.) и накрая с хлороформ. РНК се утаява от водната фаза чрез прибавянето на равен обем студен 6М LiCl и след това сместа се оставя при -20°С в продължение на два до три часа. След центрофугиране при 12000 g в продължение на 20 min при 4°С, супернатантът се прави 66% (об.) етанол и се охлажда до -20°С в продължение на 15 min, за да се утаи ДНК. След центрофугирането, както е описано погоре, ДНК-утайката се промива със 70% етанол, суши се и се ресуспендира в ТЕ-буфер (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 тМ EDTA). Концентрацията на ДНК се оценява чрез сравняване с известни ДНК-стандарти при багрене с етидиум бромид в агарозна гелна електрофореза.

За екстракция на РНК, културите от Penicillium chrysogenum и Cephalosporium acremonium, както описаните по-горе в пример 1 и 2, се култивират в продължение на 96 h в 35 ml ферментационна среда (условията на ферментация са описани по-горе), при 25°С върху въртяща се клатачна машина при 220 об./min. Мицелите се събират чрез филтруване през филтърна хартия Whatman No. 1 под вакуум и се промиват с около 50 ml вода. Непосредствено след филтруването мицелите се изстъргват от филтъра, ресуспендират се в 5 ml “спирачен буфер” (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1-50 тМ NaCI, 5 тМ EDTA pH 8,0, 5% SDS), замразяват се в течен азот и се лиофилизират. След лиофилизиране в продължение на една нощ, се прибавят 5 ml вода, съдържаща 0,1% DEPC и 5 ml IM Tris (pH 8) наситен фенол:хлороформ:изоамил алкохол (50:50:1) и сместа се оставя при 37°С в продължение на 20 min с разклащане. Сместа се центрофугира при 12000 g в продължение на 10 min при 4°С и водният слой се отстранява и реекстрахира първоначално с 1М Tris (pH 8) наситен фенол :хлороформ:изоамил алкохол (50:50:1) след това с IM Tris (pH 8) наситен фенол и накрая с хлороформ. Крайният воден слой се смесва с равен обем 6М LiCl и разтворът се оставя при -20°С за min 4 h. Тоталната РНК се утаява при 12000 g в продължение на 20 min при 4°С, утайката се разтваря в 0,3 ml ТЕ-буфер плюс 0,03 ml ЗМ натриев ацетат и се прибавят 2,5 об. етанол, за да се утаи отново РНК. Крайните гранули се разтварят в 0,1 ml ТЕ-буфер и концентрацията на РНК се определя спектрофотометрично, като се използва поглъщане при 260 nm.

Пример 4. Конструкция на генната библиотека на Cephalosporium acremonium и изолиране на С. acremonium експандаза/хидроксилаза и ацетилтрансфераза гените

Изолиране на С. acremonium се разгражда частично с Sau3Al, за да се постигне средна големина на фрагментите от 10 до 20 кб и този диапазон от размери се обогатява чрез центрофугиране на разтвора върху 5 до 20% NaCI плътност на градиента. Така фракционираната ДНК се използва, за да се създаде геномна ДНК библиотека на С. acremonium през лигиране в Ват Hl-мястото на λ 2001 вектор, опаковайки във фага ДНК частиците с използването на Gigapak (Stratagene) и заразяване на Е. coli. Получените пакети се трансферират в нитроцелулоза и се извършва скрининг чрез хибридизация до олигонуклеотидна сонда, комплементарна на 3' края на публикуваната последователност на експандазо/хидроксилазния ген (Samson et al. 1987). Края на сондата е маркиран с [τ-³²Ρ] ATP с използването на Т4 полинуклеотид киназа. Положителните клонове се изолират, картират за места на рестрикционна ендонуклеаза и ориентацията на гена се установява чрез Southern blot хибридизация на горния олигонуклеотид и на друг с последователност, комплементарна на 5' края на гена.

Изолиране на С. acremonium ацетилтрансферазен ген

Въпреки че това не е процедурата, използвана за изолиране на ацетилтрансферазния ген за следващите векторни структури, описани по-долу в примери 11 и 12, следващата процедура може да бъде използвана от всеки специалист, като се използва информация от наличната в момента публикувана последователност на ДНК. От създадената геномна библиотека на С. acremonium, както е описано по-горе, се подбира клон, който кодира гена на ацетилтрансферазата на базата на хибридизация със синтетични олигонуклеотидни сонди, комплементарни на последователността на ацетилтрансферазата, както е описано от Matsuda et al. (1992) Biochem. Biophys. Res. Commun. 182: 995-1001.

Пример 5. Условия за култивиране на

Streptomyces clavuligerus

Щамът Streptomyces clavuligerus, използван при тези процедури, е АТСС 27064. Щамът се поддържа върху плаки, съдържащи в g: дрождев екстракт 4; малцов екстракт 10; глюкоза 4; агар 20 в 1 1 дестилирана вода, pH 7,2. След 5 дни растеж при 30°С към плаките се прибавят 2 ml стерилна вода и културалната среда се изстьргва от повърхността на агара. Получената суспензия се прехвърля в стерилна епруветка със стъклени перли и винтова запушалка. След хомогенизиране на културалната среда чрез въртене суспензията се използва за инокулиране на течни култури. Суспензията се използва също така за перманентно съхраняване на култура при -70°С чрез прибавяне на глицерол до 15% краен обем.

Когато мицелът е необходим за получаване на протопласти за трансформиране или за източник на ДНК, щамовете се култивират в 200 ml/1 1 колба със среда YEME, съставена от следните компоненти в g: дрождев екстракт 3; пептон 5; малцов екстракт 3; глюкоза 10; захароза 340; MgCl₂.6H₂0 1,02; глицин 5; агар 18, в 1 1 дестилирана вода. Инкубирането е при 28°С върху ротационна клатачна машина при 220 об./min.

Пример 6. Изолиране на геномна ДНК от Streptomyces

Вегетативна бактериална култура от 48часова култура, приготвена по описания погоре метод, се събира при центрофугиране при 22100 g в продължение на 10 тш.Клетките се ресуспендират в 10 ml ТЕ-буфер и се прибавят 10 mg лизозим, след което сместа се инкубира при 30°С в продължение на 15 min. Прибавя се 1 ml 20% SDS, последвано непосредствено от 10 ml ТЕ (pH 8) наситен фенол и

1,5 ml 5М NaCl и сместа се инвертира бавно в продължение на 20 min. Фазите се разделят при 12000 g в продължение на 10 min, след което водният слой се отстранява и прехвърля в чиста епруветка. Внимателно се прибавят два обема изопропанол и утаената ДНК се спирализира и разтваря отново в минимален обем ТЕ-буфер. Прибавя се RNAseA до получаване на крайна концентрация 20 \ig/ml и разтворът се инкубира при 50°С в продължение на 1 h. След това се прибавя Протеаза К до достигане на крайна концентрация 100 ng/ml, заедно със 100 mM NaCl и 0,4% SDS и сместа се инкубира при 37°С в продължение на 1 h.

Разтворът се екстрахира отново с равен обем ТЕ (pH 8) наситен фенол, последвано от ново екстрахирате с хлороформ. След прибавянето на изопропанол ДНК от крайната екстракция се навива и концентрацията се определя спектрофотометрично, като се използва абсорбционно отчитане при 260 nm.

Пример 7. Конструирате на генна библиотека и изолиране на ДНК-фрагменти, съдържащи Streptomyces clavuligerus експандаза и хидроксилаза гени

Изолиране на S. clavuligerus експандазния ген

Геномна ДНК, получена от Streptomyces clavuligerus по описания по-горе начин, се разгражда с рестрикционни ензими Bam HI и Sal I. Така обработената ДНК се подлага на електрофореза върху 0,8% агароза гел и се елюират фрагменти с размер 1,8 до 2,2 кб и се лигират към pUC18 ДНК, която е била ензимно разградена преди това с Bam HI и Sal I. Използват се разреждания на лигационната смес за трансформиране на компетентните JM109 клетки, като се използва електротерапия (Gene Pulser, Bio-Rad, Richmond, СА). Приготвянето на компетентните клетки и условията на електропорация са съгласно препоръките на производителя. Трансформационната смес се нанася върху LB плаки, съдържащи 100 ng/ml ампицилин и 75 μ 1 2% X-Gal. След инкубиране в продължение на една нощ при 37°С, рекомбинантните колонии се идентифицират по безцветния им вид, дължащ се на инактивирането на активността на плазмидния ген за вектор на бета-галактозидазния ген. Безцветните колонии се прехвърлят върху свежи LB плаки, съдържащи 100 ng/ml ампицилин. След култивиране в продължение на една нощ при 37°С колониите се прехвърлят върху нитроцелулоза и хибридизират със сонда, получена от полимеразна верижна реакция със съответстващите на публикуваната за Streptomyces clavuligerus експандаза-генна последователност от базите 52-918 [Kovacevic et al. (1989) J. Bacteriol. 171: 754-760; Ingolia etal. U.S.Pat. 5,070,020]. Маркирането на продуктите от верижната реакция на полимеразата се извършва с реакция със случайно удължаване на праймера с (³²Р) dCTP и комплект за олигомаркиране съгласно инструкциите на производителя (Oligolabelling Kit; Pharmacia, Piscataway, New Jersey). Хибридизиращата peak ция се провежда в присъствието на 10⁶ СРМ радиомаркирана проба, 30% формамид 5Х SSC (0,15М натриев хлорид, 0,015 М натриев цитрат, pH 7), 0,1% SDS, 5Х Денхард (5 g фикол, 5 g поливинилпиролидон и 5 g BSA за 500 ml от 50 х материал) и 100 pg/ml ДНК от телешки тимус при 37°С в продължение на една нощ. Няколко трансформанти хибридизират силно към сондата. Потвърдено е, че една колония съдържа вектор, носещ експандазен ген, чрез рестрикционен ензимен анализ и този плазмид е обозначен pFTSO-1.

Изолиране на S. clavuligerus хидроксилазен ген

Геномната ДНК от S. clavuligerus се разгражда частично с Bam HI и лигира в λ Dash II вектор от фирмата Stratagene. Получената геномна библиотека се скринира чрез хибридизация до 30 базов олигонуклеотид, имащ идентична последователност с първите 30 бази на публикуваната последователност на хидроксилазния ген (Kovacevic & Miller, 1991, J. Bact. 173: 398). Southern хибридизация, разградена c Bam HI ДНК от два позитивни фагови клона, показва очаквания 6 кб фрагмент, който е субклониран. Този субклон дава набор от фрагменти след разграждане с Kpnl съгласно публикуваната рестрикционна карта за областта около хидроксилазния ген (Kovacevic & Miller, 1991).

Пример 8. Изолиране на плазмид на ДНК

Култури от Е. coli, съдържащи интересуващия ни плазмид, са култивирани в 500 ml хранителна среда (20 g/l LB основа от фирмата Gibco, Paisley, Scptland) и 15 p.g/ml тетрациклин върху ротационна клатачна машина при 220 об./min в продължение на 12-16 h при 37°С. Клетките се утаяват чрез центрофугиране при 4000 g за 10 min при 4°С. Утаените клетки се ресуспендират в 18 ml глюкозен буфер (50 тМ глюкоза, 25 тМ Tris pH 8,0; 10 тМ EDTA) и 2 ml от 40 mg/ml лизозим (Sigma, St. Louis, МО), смесват се и сместа се инкубира при стайна температура в продължение на 15 min. Прибавя се 40 ml свежо приготвен разтвор на 0,2N NaOH, 1% SDS и сместа се завихря внимателно и се поставя върху лед за 10 min. След това се прибавя 30 ml 5М калиев ацетат pH 4,8, смесват се добре и получената смес се поставя върху лед за още 10 min. Клетъчните остатъци се утаяват чрез центрофугиране при 4000 g за 10 min при 4°С и полученият супернатантен разт вор се филтрува през сиренарско платно. Прибавя се изопропанол (0,6 об.) към избистрения супернатант, за да се утаи плазмидДНК, и утайката се образува по време на инкубирането при стайна температура в продължение на 20 min. Плазмид-ДНК се утаява при 4000 g в продължение на 20 min при 4°С и след това се промива с 70% етанол и се суши за кратко време. Утайката се ресуспендира в 9 ml ТЕ-буфер, след което се прибавят 10 g CaCl и 0,387 ml от 10 mg/ml разтвор на етидиум бромид. Този разтвор се центрофугира при 313,100 g в продължение на 24 h. Получената плазмидна област в градиента от цезиев хлорид се визуализира с ултравиолетова светлина, изолира се, етидиум бромидът се отстранява, като се използва наситен с вода бутанол за екстракция. CsCl в плазмидния препарат се отстранява чрез диализа спрямо ТЕбуфер и накрая ДНК се концентрира, като се използва PEG (MW 8000). ДНК-концентрацията се измерва спектрофотометрично с отчитане на абсорбцията при 260 nm.

Пример 9. Структура на трансформиращия Penicillium вектор pPenFTSO

Включване на флеомицин резистентен ген

Penicillium трансформиращият вектор се конструира с флеомицин резистентен ген, като доминиращ избираем маркер. Това се извършва първо чрез изолиране на фрагмент от 600 базови двойки, съдържащ флеомицин резистентен ген (флеомицин свързващ протеинов ген от Streptoalloteichus hindustanus), и се свързва също така към дрождев цитохром С1 терминатор от Bam HI/Bgl II смилането на плазмид pUT713 (CAYLA, Toulouse Cedex, France), чрез електрофореза върху и елюиране от агароза гелове. Изолираният фрагмент се лигира в Bam Н1 мястото на вектора pSELEСТ R 1 (Promega Corporation) и ориентацията на гена се определя чрез рестрикционно ензимен анализ. Уникалното място Hind III в получения плазмид се отстранява чрез рестриктиране с Hind III, запълване с полимераза на Кленов и повторно лигиране. След това се въвеждат 550 базови двойки от Pst I фрагмент, съдържащ λ cos място, който позволява векторът да бъде използван за образуване на козмид, когато се включат включения със съответния размер. Този вектор се означава с pSCP4.

Геномна ДНК от Р. chrysogenum се разгражда частично с Sau ЗА и се използва за приготвяне на библиотека във фаговия вектор EMBL3. Клон, съдържащ изопеницилин N синтетазен ген, се изолира от тази библиотека и 5 се използва за получаването на серия от субклонове, един от които съдържа 3,6 килобазов фрагмент от първото Bam HI място по посока на реплицирането на IPNS гена до първото Hind III място в обратната посока на гена. Уникалното Sall място в този субклон се отстранява с рестриктиране със Sall, запълване на вдлъбнатите краища с Klenow полимераза и повторно лигиране. След това уникалното ХЬа I място се отстранява по подобен начин, чрез 15 рестриктиране с Xba I, запълване и повторно лигиране. Полученият плазмид се обозначава като pSXF-Ι. Създаденият IPNS промотор е изолиран от гел от pSXF-Ι, като 1,2 кб Ncol фрагмент и лигиран в Ncol мястото на pSCP4, 20 описан по-горе. Ориентацията, определена чрез рестрикционно смилане, е подбрана така, че промоторът е слят към флеомицин резистентния ген при ATG стартовия кодон. Този плазмид е обозначен с pUTZ-2. 25

Включване на S. clavuligerus експандаз1,645 кб фрагмент, съдържащ експандазния ген на Streptomyces clavuligerus, се пречиства от Bam HI и Sal I разграждането на pFTSO-Ι (вектор, описан по-рано) чрез електрофореза и се елюира от 0,8% агароза гел. Изолираният вектор се лигира във вектора pSELECT (Promega Corporation), също така смлян с Bam HI и Sal I. Този вектор се обозначава като pFTSO-1. Ново Neo I място се съз10 дава на ATG стартовия кодон на експандаза гена чрез насочена към мястото мутагенеза на pFTSO-8, чрез използването на Altered Sites (запазена марка) in vitro Mutagenesis System (Promega Corporation). Мутагенезата се осъществява съгласно инструкциите на производителя. Структурира се олигонуклеотид, комплементарен на кодиращата последователност на ДНК областта в мястото на ATG стартовия кодон от публикуваната последователност на експандазния ген на Streptomyces (Kovacevic et al. (1990) Journal of Bacteriology, 171, p. 3952-3958). Олигонуклеотидът се синтезира чрез цианоетил фосфорамидитна химия (оборудването е Pharmacia Gene Assembler) и олигопоследователността е следната:

Идентиф. последователност No: 8 ния ген

3' CGAGAGGATCAGTGAGAGTCCATGGACACGACGG 5’.

Мутагенезата се потвърждава с рестрикционен ензимен анализ. След това 1,2 кб Neo I фрагмент от pUTZ-2, съдържащ създадената Р. chrysogenum IPNS промоторна област, се изолира чрез рестрикция с Ncol, последвано от електрофореза в агарозен гел. IPNS-npoмоторната област се лигира в pFTSO-8 вектора на новото Neo I място, създадено с мутагенеза на ATG стартовия кодон на експандазния ген. Ориентирането на промотора към експандазния ген се установява чрез рестрикционен ензимен анализ. Тази IPNS-промотор: експандазна генна касета, след това се отстранява като Bam HI/Sal I фрагмент в Bam Ш/ Sal I отрязан Penicillium трансформационен вектор pUTZ-2, описан по-горе. Крайната конфигурация се обозначава като pPenFTSO.

Пример 10. Структура на Penicillium трансформиращия вектор pPEN/CEPH-1

Включване на IPNS промоторната област

IPNS промоторната област се изолира от pUTZ-2, описан по-горе в пример 9, чрез ензимно смилане с Xho I/Sma I. pUTZ-2 век торът се отрязва с Bam HI и стърчащите краища се запълват, като се използват dNTP и фрагмент от Кленов, създаващи обли краища, след това се смила с Xho I и изолираният Xho I/Sma IIPNS промоторен фрагмент се лигира в този отрязан вектор, давайки структура, която съдържа две IPNS промоторни области. Този вектор се обозначава като pUTZ-7.

Включване на С. acremonium експандазо/хидроксилазен ген

След това една от IPNS промоторните области се изолира (чрез електрофореза и елюиране от агарозни гелове) от pUTZ-7 като Xho Ι/Xba I фрагмент и се лигира в Xho Ι/Xba I орязания вектор pBluescript II SK (Stratagene, La Jolla, СА). Този вектор се обозначава като pIPNSp/blue.

Изолира се Cephalosporium експандазо/ хидроксилазен ген (чрез електрофореза и се елюира от агарозни гелове), като 1,2 кб

HindIII/Xba I фрагмент от един такъв геномен клон, идентифициран по-горе и лигиран в смляния с Hind Ш/Xba I вектор pSELECT. Създава се ново Bsp HI място на ATG стартовия кодон на експандазо/хидроксилазен ген чрез насочена към място мутагенеза, като се използва системата Altered Sites (зап. марка) in vitro Mutagenesis System (Promega Corp.). Мутагенезата се извършва съгласно инструкциите на 5 производителя. Конструира се олигонуклеотид, комплементарен на кодиращата последователност на ДНК областта при ATG стартовия кодон от публикуваната последователност на Cephalosporium acremonium експандазо/хидроксилазен ген (Samson et al., Bio/Technology, Vol. 5, November, 1987). Олигонуклеотидът се синтезира чрез цианоетил фосфорамидитна химия (оборудване: Pharmacia Gene Assembler) и олигопоследователността е следната:

Seq. ID No: 9

3' GTTTTGGTGTCGTAGTAGTACTGAAGGTTCCAG 5'.

Мутагенезата се потвърждава чрез рестрикционен ензимен анализ. След това Cephalosporium acremonium генът се изолира чрез електрофореза и се елюира от агарозни гелове 15 като Bsp HI/Xba I фрагмент и се лигира в смлян с Neo I/Xba I вектор pIPNSp/blue, описан в примера по-горе. Този вектор в случая съдържа промотора на Penicillium IPNS при ATG на Cephalosporium acremonium експандазо/хидрок- 20 силазния ген. Този вектор е обозначен като pIPNSp/EXP/blue. Тази IPNS промотор:експандазо/хидроксилазна касета се смила частично с Xho I и напълно с Xba I и изолираният фрагмент се лигира в разградения с Xho I/Xba I вектор pUTZ-2, описан в примера по-горе, за да се получи крайният трансформационен вектор pPEN/CEPH-1.

Пример 11. Структура на Penicillium трансформационен вектор, експресиращ експандазния и хидроксилазния ген

Бета-тубулин ген от Р. chrysogenum се клонира от геномна библиотека, като се използва β-тубулин ген на Aspergillus niger като хибридизационна сонда. 2,0 кб Xba 1/Hind III фрагмент, съдържащ Penicillium β-тубулин промотор, се лигира в Xba I/Hind III местата на pSELSCT (Promega). Neo I място се въвежда при ATG стартовия кодон чрез насочена към място мутагенеза на последователността AAAATGCGT до ACCATGGGT. От получения вектор се изолира от гел 1,4 кб Bam HI/Nco I фрагмент и се лигира между местата Bam HI и Neo I на pUTZ-2 (описан преди това), за да се генерира векторът рС1-6. От геномния клон на Р. chrysogenum се изолира от гел 5,1 кб Sall фрагмент, съдържащ двата гена - IPNS и ацетилтрансфераза, и се лигира в Sall мястото на pUTZ-2, за да създаде pUTZ-5. Изолира се 3' крайната последователност на IPNS гена от pUTZ-5 чрез рестрикция с Bam HI и Hind III, последвано от изолиране от гел на 1,3 кб фрагмент, който се лигира между Bam HI и Hind III местата на рС1-6 (описано по-горе), за да се получи рС1-13. Уникалното Sal I място близо до мястото Bam HI в рС1-13 отново се отстранява чрез рестрикция, запълва се с полимераза на Klenow и се лигира. От другата страна на Bam HI мястото се въвежда ново място Sal I, чрез насочена към място мутагенеза на последователността GGAAGACG до GGTCGACG. След това ампицилин резистентният ген се отстранява от плазмида чрез рестрикция с Pvu I, гелно изолиране на по-големия фрагмент и повторно лигиране за получаване на рС1-15. Накрая касетата IPNS промотор:експандазен ген се изолира от гел от pPENFTSO като 2,4 кб Bam HI/Sal I фрагмент и се лигира в рС1-15, за да даде рЕХР-1.

Създаването на структурата на вектор за експресия на хидроксилазните и експандазни гени на S. clavuligerus включва следните етапи. 2,9 кб Κρη I фрагмента, съдържащ хидроксилазен ген, се субклонира в pSELECT, така че Eco RI мястото в полилинкера е близо до 5' края на гена. Уникалното Ncol I място в плазмида се отстранява чрез насочена мутагенеза на последователността TCATGGGC до последователността TCGATGGGC и едновременно в стартовия кодон се въвежда ново Neo I място чрез промяна на последователността AACATGGC до ACCATGGC. Двете промени запазват кодираната аминокиселинна последователност. 1,0 кб фрагмент Eco RI/Nco I, съдържащ конструирания IPNS промотор, се изолира гелно от pUTZ-2 и се лигира между местата Eco RI и Neo I на горния вектор, съдържащ променения хидроксилазен ген. След това уникалното място Eco RI в получения вектор се променя до Hind III място чрез насочена мутагенеза. Конструкцията от сливането 5' 1РН8:хидроксилаза се изолира от получения вектор като Hind III фрагмент, който се лигира в уникалното Hind III място на вектора рЕХР-1, описан по-горе. Крайният вектор съдържа експандаза и хидроксилазните гени, всеки управляван от IPNS промотор и флеомицин резистентен маркер, управляван от βтубулин промотора.

Пример 12. Структура на пеницилин трансформационния вектор рРепСАСТ

Включване на хигромицин резистентен ген

Трансформационният вектор на Penicillium се структурира с хигромицин резистентен ген като доминиращ селективен маркер. Е. coli хигромицин В фосфотрансферазен ген се изолира като 1,15 кб Bam HI фрагмент от вектор pHph-1 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) и се лигира в Bam HI смлян вектор mpl9. Ориентацията на хигромицин резистентния ген в тр19 се определя от рестрикционния ензимен анализ на RF ДНК. 5' Bam HI мястото е близо до ATG стартовия кодон на хигромицин резистентния ген. За да се улесни позиционирането на съответен промотор на това 5' Bam Ш място, 3' Bam HI мястото се отстранява чрез насочена към място мутагенеза, като се използва Mutator ТМ Site Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolie, CA). Мутагенезата се провежда съгласно инструкциите на производителя. Олигонуклеотидът се структурира така, че да е комплементарен на ДНК областта при 3' Bam HI мястото от публикуваната последователност на Е. coli хигромицин В фосфотрансфераза ген (Gritz, L. and Davies, J., 1983, Gene, 179). Олигонуклеотидът се синтезира чрез цианоетил фосфорамидитен метод (Pharmacia Gene Assembler оборудване) и олиго-последователността е следната:

Seq ID No: 10

5' TACCCGGGGTTCCCGCGAATC 3'.

Мутагенезата се потвърждава с рестрикционен ензимен анализ. Мутантният хигромицин резистентен ген след това се изолира като Sma I/Xba I фрагмент (чрез електрофореза върху и елюиране от агарозни гелове) и се лигира в Sma I/Xba I смления вектор pUC 18.

Penicillium IPNS промотора се изолира (чрез електрофореза и елюиране от агарозни гелове) като 1,2 кб фрагмент от Neo I отрязания вектор pUTZ-2 (векторът е описан по-рано). Синтезират се синтетични олигонуклеотидни линкери за създаване на Bam HI място от Neo I местата в краищата на IPNS промо торния фрагмент, така че промоторът IPNS да се позиционира в 5' Bam HI мястото, близо до ATG на хигромицин резистентния ген. Олигонуклеотидите се синтезират чрез цианоетил фосфорамидитна химия, както е описано погоре, а последователностите на олигонуклеотидите е следната:

Seq ID No: 11

5’ CATGAAGAAG 3'

Seq ID No: 12

3' TTCTTCCTAG 5’

Тази последователност запазва природната последователност на IPNS промотора, но вкарва две аминокиселини в хигромицин резистентния ген. Олигонуклеотидите се отвръщат, фосфорилират и лигират в Neo I отрязания IPNS промоторен фрагмент и като резултат се получават Bam HI места в двата края 5' и 3' на IPNS промоторния фрагмент. Този промотор с линкери се лигира в отрязания с Bam Н1 хигромицин резистентен ген в pUC 18 и ориентацията се потвърждава с рестрикционен ензимен анализ. Тази касета - IPNS промотор:хигромицин резистентен ген след това се изолира като 2,1 кб Xho I/Sal I (Xho I мястото е разположено в 5' края на IPNS промотора, a Sal I мястото е от pUC полилинкера) и се лигира в разградения със Sal I вектор pSELECT. Ориентацията на касетата се определя с рестрикционен ензимен анализ. Този вектор е обозначен като pIPNS/HYG.

Инкорпориране на Cephalosporium acremonium ацетилтрансферазния ген

Ацетилтрансферазният ген от Cephalosporium acremonium се изолира от геномен клон (описан по-горе) като 1,8 кб Bgl II/Sal I фрагмент чрез електрофореза върху и елюиране от агарозни гелове. Ацетилтрансферазният ген се лигира в разграден с Bam HI/Sal I вектор pSELECT. За да се улесни позиционирането на Penicillium IPNS промотора при ATG на ацетилтрансфераза гена от Cephalosporium, в ATG на ацетилтрансферазния ген се създава ново място Neo I, а вътрешното място Neo I в структурния ген се отстранява чрез сайт-насочена мутагенеза по описания в предишните примери метод и оборудване. Конструират се олигонуклеотиди, комплементарни на кодиращата последователност на ДНК-областите от интерес, от последователността на Cephalosporium ацетилтрансфераза гена, посочена погоре под идентификационни номера 1 и 2.

Използваната олигонуклеотидна последователност за отстраняване на вътрешното Neo I място в структурния ген е следната:

Seq ID No: 13

3’ GTCGGCGCATCGATGGGTGGAAT 5' Използваната последователност на олигонуклеотида за създаването на ново място Neo I в ATG стартовия кодон е следната:

Seq ID No: 14

3' CGCCCACCATGGCGCCTCAGAT 5’

Тези олигонуклеотиди са синтезирани по описания по-горе начин. Мутагенезата е потвърдена от рестрикционен ензимен анализ. Този вектор е обозначен като pMUTACT.

Penicillium IPNS промоторът е изолиран (чрез електрофореза и елюиране от агарозни гелове) като 1,2 кб Neo I фрагмент от вектора pUTZ-2, описан в примера по-горе. Този промоторен фрагмент се лигира в Neo I отрязания вектор pMUTACT, който сега позиционира промотора директно при ATG на ацетилтрансфераза гена от Cephalosporium acremonium. Ориентирането на промотора се потвърждава с рестрикционен ензимен анализ. Тази касета IPNS промотор:ацетилтрансферазен ген се разгражда с Xho I/Sal I (мястото Xho I е разположено на 5' края на IPNS промотора и Sal I мястото е на 3' края на ацетилтрансфераза гена) и се лигира в Sal I разградения вектор pSELSCT. Ориентацията на фрагмента се определя с рестрикционен ензимен анализ. Този вектор се обозначава като pMUTACT/IPNS.

Използваната мутагенеза за създаването на ново Neo I място при ATG на ацетилтрансфераза гена води до промяна във втората аминокиселина от серин в аланин. За да се запази кодиращата последователност, идентична с естествения ген, се провежда насочена към място мутагенеза по описания в предишните примери метод. Олигонуклеотидът се структурира така, че да бъде комплементарен на кодиращата последователност на представляващата интерес ДНК-област, от последователността на ацетилтрансфераза гена, дадена погоре под идентификационни номера 1 и 2. Използваната последователност на олигонуклеотида, за да промени втората аминокиселина от аланин в серин, е следната:

Seq ID No: 15 3TCTAGCTAGACACCATGTCGCCTCAGA5'.

Олигонуклеотидът е синтезиран по дадената в предишните примери методология и оборудване. Мутагенезата е потвърдена от ДНК последователността, като е използвана USB секвеназа, версия 2.0 на ДНК-секвениращ комплект (USB, Clicland, Ohio).

Секвениращите праймери са синтезирани при използването на цианоетил фосфорамидитен метод (оборудване Pharmacia Gene Assembler instrumentation). Този вектор е обозначен като pMUTACT/IPNS.

Касетата IPNS промотор:хигромицин резистентен ген се отстранява от вектора pIPNS/ HYG като Xba I фрагмент и се лигира в Xba I разграден вектор pMUTACT/IPNS-2, за да се получи крайният трансформационен вектор pPEN/CACT. Ориентацията на хигромициновата касета се определя с рестрикционен ензимен анализ.

Пример 13. Структуриране на трансформационния вектор на Penicillium - pTS-8, експресиращ едновременно експандазо/хидроксилазните и ацетилтрансферазните гени на Cephalosporium acremonium

Ацетилтрансферазният ген на Cephalosporium се изолира (чрез електрофореза и елюиране от агарозни гелове) като 1,8 кб Bgl II/ Sal I фрагмент от геномен клон и се лигира в Bam HI/Sal I разграден вектор pSELECT (Promega Corp.). За да се улесни позиционирането на Penicillium IPNS промотора при ATG на Cephalosporium ацетилтрансферазния ген, се създава ново място Neo I на ATG кодона, разположен при база -42 (Mathison et al., Current Genetics, предоставена), и вътрешното Neo I място на структурния ген се отстранява чрез сайт-насочена мутагенеза, като се използва методът, описан в предишните примери. Мутагенезата се провежда съгласно инструкциите на производителя. Олигонуклеотидите се структурират така, че да бъдат комплементарни на кодиращата последователност на интересната за нас ДНК-област, но включват няколко промени, за да се създаде или отстрани Neo I мястото. Последователността на олигонуклеотида, използвана, за да се отстрани вътрешното Neo I място в структурния ген, е следната:

Seq ID No: 16

3' GTCGGCGCATCGATGGGTGGAAT 5'.

Последователността на олигонуклеотида, използвана, за да се създаде ново Neo I място на ATG при база -42, е следната:

Seq ID No: 17

5' CTCCGATAGGGCGTGGTACCCGGCCCTACTCTTAT 3'.

Олигонуклеотидите са синтезирани по метода и с оборудването, описани в предишните примери. Двете мутагенези са потвърдени с рестрикционен ензимен анализ. Този вектор е означен с pMUTACT. Penicillium IPNSпромоторът се изолира (чрез електрофореза и елюиране от агарозни гелове) като 1,2 кб Neo фрагмент от вектора pUTZ-2, описан по-горе. Този промоторен фрагмент се лигира в отрязания с Neo I вектор pMUTACT, който в случая позиционира IPNS промотора директно на -42 ATG място на Cephalosporium ацетилтрансфераза гена. Ориентирането на промотора се потвърждава с рестрикционен ензимен анализ. Този вектор се означава с pMUTACT/IPNS. От този вектор по описания по-горе начин, се изолира 2,5 кб Xho I/Sal I фрагмент, който съдържа касета IPNS промотор: ацетилтрансфераза и се лигира в смлян с Sal I вектор pUTZ- (описан преди). Този междинен вектор след това се смила с Xba I и се лигира с 2,1 кб ХЬа I фрагмент от вектора pPEN/CEPH-1 (описан преди), съдържащ касетата IPNS промотор:експандаза/хидроксилаза, за да се получи крайният трансформационен вектор рТ-8.

Пример 14. Трансформация на Penicillium chrysogenum

Протопласти от щам на Penicillium chrysogenum, описани по-горе, се генерират чрез инокулация на 50 ml пълна хранителна среда с 1.10⁷ спори в продължение на 67 h при 25°С върху ротационна клатачна машина при 220 об./min. Мицелите се събират чрез филтруване върху сиренарско платно, прехвърлят се в 500 ml колби и се ресуспендират в 25 ml среда (КМР, със следния състав: 0,7 М КС1, 0,8 М манитол, 0,02 М КРО₄, pH 6,3), съдържаща 100 mg Novozyme 234 (Novo BioLabs, Bagsvaerd, Denmark) и се оставят да се инкубират при ЗО°С и 100 об./min. Сферопластите се отделят чрез филтруване през филтри от сиренарско платно/стъклена вата и се утаяват чрез центрофугиране при 350 g в продължение на 10 min. След това се промиват трикратно с по 10 ml КМР-буфер (вижте по-горе) и се ресуспендират в КМРС (КМР + 50 ml СаС1₂) до концентрация 5.10’ клетки/ml и се оставят при стайна температура в продължение на 20 min. За трансформацията на Penicillium 200 μΐ от суспензията на сферопластите се прибавят към ДНК (5 g векторна ДНК в 6,2 μΐ КМРС с 5 μg/ml хепарин) заедно с 50 μΐ РРС (40% PEG MW 3500, 20 тМ КРО₄, pH 6,3, 5% СаС1₂ се прибавят непосредствено преди употреба) и трансформационната смес се инкубира върху лед в продължение на 30 min. Прибавя се 1 ml свежо приготвен РРС и сместа се прехвърля в 50 ml стопен (50°С) регенерационен агар (пълна хранителна среда плюс 1,3 М манитол и 3 % агар). След това трансформационната смес се разпределя в 5 петриеви стъкла. След регенериране в продължение на 24 h при 25°С, плаките се заливат с покритие (1% пептон и 1 % агар), съдържащо 100μg/50 ml флеомицин. Количеството на покритието е равно на количеството на регенерационния агар. Плаките се инкубират при 25°С в продължение на 7-14 дни и се наблюдават за генерирането на трансформантни колонии.

Пример 15. Оценки на биоактивността

За определяне на антибиотичната активност на изолирани с HPCL адипоил-6-АРА и адипоил-7-ADCA ферментационни продукти, е използвана биооценка с дифузия в агар. 20 μΐ от изолирания продукт се нанася в 5 mm дискове върху LB агарни плаки (20 g/l хранителна среда LB с 3% агар (Gibco, Paisley, Scotland), засят с Bacillus subtilus АТСС 33677 или с Е. coll - супер чувствителен щам (доставен от проф. Arnold L. Demain, MIT). Bacillus subtilus се използва като индикаторен щам за оценка на адипоил-6-АРА продукта, а Е. coli - супер чувствителен щам е използван като индикаторен щам за оценка на продукта адипоил-7ADCA. След 15 h инкубиране при 37°С ореол на инхибиран растеж на индикаторните бактерии около диска е показателен за биоактивността на продукта. Контролите в този експеримент включват дезацетокси-цефалоспорин С, цефалоспорин С, пеницилин V и агар, съдържащ пеницилиназа или без пеницилиназа, като контрол за потвърждаване на β-лактамни структури.

Пример 16. HPLC-метод за едновременен анализ на адипоил-: 6-АРА, 7-ADCA, ΊADAC и 7-АСА

Ферментационните продукти от трансформираните щамове Penicillium (адипоил-6АРА, адипоил-7-ADCA, адипоил-7-ADAC и адипоил-7-АСА) са анализирани едновременно с използването на висококачествена течна хроматография (HPLC). Системата за HPLC се състои от следните компоненти на фирмата Waters: подаваща разтворителя система 625, детектор с променлива дължина на вълната 409Е (настроен на 220 nm и 260 nm), Система за данни Maxima 825. Стационарната фаза е Nova-Pak C_lg 5 х 100 mm радиален компресионен патрон с пълнеж Nova-Pak C_lg Guard-Pak. Подвижната фаза (при поток 1 ml/min) обхваща 10 min линеен градиент от началните условия на 5% метанол и 95% 10 mM КРО₄, pH 5 до 40% метанол и 60% КРО₄, pH 5. Адипоил-

6-АРА се определя количествено чрез сравняване със стандартна крива на пеницилин N при 220 nm. Продуктите с разширен пръстен се определят количествено чрез сравняване със стандартни криви при 260 пт на синтетичен адипоил-7-ADCA и адипоил-7-АСА.

Пример 17. Оценка с ензим Raev

Използвани са химично синтезирани адипоил-7-ADCA и адипоил-7-АСА като субстрати за определяне на специфичната активност на ензима RAEV (търговски достъпен от RAEV Corp.). Реакционната смес, съдържаща 10 тМ субстрат, 1 pg RAEV ензим, 5% глицерол в 0,16 М KjPO,, в общ обем 50 pl се инкубира при 37°С. (По-оптимални реакционни условия са използването на 20 тМ или повече субстрат в 20-50 тМ калиев фосфатен буфер). 5 pl аликвотни количества се вземат на 0, 1, 2, 3, 5, 10, 20 и 30 min, разреждат се с 35 pl 0,010 М КН₂РО₄, pH 3,5 и се замразяват при -70°С преди анализа с HPLC при условия, описани по-горе.

Активността на ензима RAEV спрямо субстрат от колориметрична адипоил-р-аминобензоена киселина се оценява, като се използва 5 тМ субстрат, 8,25 pg RAEV ензим, 10% глицерол в 0,065 М КН₂РО₄, pH 7,0 в общ обем 50 pl в продължение на 30 min при 37°С. Реакцията се провежда в 96-гнездова микротитрова плочка. 50 pl от 1/100 разреждане на IM NaNO₂ в 0,25 М оцетна киселина се прибавят, за да се прекрати реакцията, след което реакцията се оставя при стайна температура още 3 min. 100 pl 1/100 разреден 10 mg/ml 4-амино-5-хидрокси-2,7-нафтален-дисулфонова киселина - мононатриева сол във вода в 0,5 М Na₂CO₃ се прибавя и се наблюдава цветовото развитие, първоначално при 515 nm, като се използва устройство за отчитане на биокинетиката EL 312 на фирмата Bio-Тек Instruments.

Пример 18. Оценка на алтернативни адипоилацилази

В допълнение към изследванията, използващи RAEV ензима, отстраняването на адипоиловата странична верига от адипоил-

7-ADCA (и други адипоилови съединения) е демонстрирано с ензими, получени от голям брой микробиологични източници. В едно ранно изследване на Asahi щамове Pseudomonas sp. SE-83 и SE-495 (депозирани в Fermentation Research Inst, под номера FERM ВР-817 и FERM ВР-818) и щам Pseudomonas SY-77-1 на Toyo Jozo (депозиран в Northern Regional Research Laboratory под номер NRRL В-8070) са култивирани в продължение на 72 h в среда, съдържаща следните компоненти в об.%: HyCase SF 2,0; натриев глутамат 0,5; дрождев екстракт 0,5; царевично масло 0,2; масло от памучно семе 0,5 и глутарова киселина 0,1. Клетките се събират чрез центрофугиране и се промиват с 50 тМ фосфатен буфер, pH 8,0; след това се ресуспендират в буфер и външните мембрани се правят пропускливи чрез прибавянето на малък обем хлороформ. Аликвотни количества от клетъчната суспензия се смесват с адипоил-пара-нитроанилид (adpNA) и се инкубират при 30°С в продължение на 2 до 18 h. След инкубацията смесите се подкисляват с прибавянето на 10% об. оцетна киселина. Освободеният пара-нитроанилин след това се открива колориметрично, следвайки превръщането му в диазосъединение, като се използват реагенти под формата на комплект реактиви, доставяни от фирмата Sigma Chemical Company за оценка на γ-глутамил-трансфераза (продукт на Sigma номер 545-А). Относителните активности на трите щама са: 100%, 85% и 48%, съответно за Se495, SE-83 и SY-77-1. Като се използват методи, описани за ензима на RAEV, се демонстрира също така активността на ензимите SE-83 и SE-495 върху адипоил-7-ADCA. Продуцирането на β-лактамаза от SY-77-1 предотвратява демонстрирането на деацилиращата активност на този щам върху адипоил-7-ADCA.

С подобни средства е демонстрирано също така продуцирането на адипоилацилаза за два гъбични щама (Alternaria sp. МА-133,

ATCC № 20492 и Aspergillus sp. МА-13, ATCC № 20491; U.S.Pat. 4,141,790 - Meiji Seika

Kaisha Ltd.) и три допълнителни бактериални щама (Brevibacterium, АТСС № 14649; Achromobacterium, АТСС № 14648; Flavobacterium, АТСС № 14650, които са описани ка то продуценти на цефалоспорин С ацилаза в U.S.pat. 3,239,394 - Merck & Co., Inc.).

СПИСЪК HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ

1) ОБЩА ИНФОРМАЦИЯ

I ЗАЯВИТЕЛ: Conder, Michael J.

McAda, Phyllis

Ramboseck, John

Reeves, Christopher D.

II ЗАГЛАВИЕ HA ИЗОБРЕТЕНИЕТО: Новй биометоди за получаване на 7-АСА и 7-ADAC

III БРОЙ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ: 17

IV АДРЕС ЗА КОРЕСПОНДЕЦИЯ:

(A) АДРЕСАТ: Merck & Co., Inc.

(Б) УЛИЦА: 126 Е. Lincoln Ave (B) ГРАД: Rahway (Г) ЩАТ: New Jersey (Д) СТРАНА: USA (Е) ПОЩЕНСКИ КОД: 07065

V КОМПЮТЪРНА ФОРМА НА ДОСТЪП:

(A) СРЕДА: флопи диск (Б) КОМПЮТЪР: IBM PC Съвместим (B) ОПЕРАЦИОННА СИСТЕМА: PC-DOS/MS-DOS (0 СОУФТУЕЪР: Patentin Release # 1.0, Version # 1.25

VI ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ:

(A) НОМЕР НА ПРИЛОЖЕНИЕ:

(Б) ДАТА НА ЗАПЪЛВАНЕ:

(B) КЛАСИФИКАЦИЯ:

зз

VIII ОТОРИЗАЦИЯ/ИНфОРМАЦИЯ ЗА АГЕНТА:

(A) ИМЕ: Speer, Raymond Μ.

(Б) РЕГИСТРАЦИОНЕН НОМЕР: 26,810 (B) РЕфЕРЕНТЕН/ДОКУМНТ. НОМЕР: 18572ΙΑ

IX ТЕЛЕКОМУНИКАЦИОННА ИНФОРМАЦИЯ:

(А) ТЕЛЕФОН: (908) 594-4481 (Б) ТЕЛЕФАКС: (908) 594-4720

2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИДЕНТИф. ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ Νο.1:

I ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 14 базови двойки (Б) ТИП: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: двойна (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна

II МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна)

XI ОЗНАЧЕНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:1

TCTAGACACCATGG

2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИДЕНТИф. ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ No. 2:

I ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 16 базови двойки (Б) ТИП: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: двойна (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна

II МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна)

XI ОЗНАЧЕНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:2:

GTGAGAGTTG ATGGAC

2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИДЕНТИф. ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ No. 3 ’ ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 16 базови двойки (Б) ТИП: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: двойна (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна

II МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна)

XI ОЗНАЧЕНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:3

TCTAGACACT ATGGAC

2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИДЕНТИф. ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ No. 4 I ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 16 базови двойки (Б) ТИП: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: двойна (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна

II МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна)

XI ОЗНАЧЕНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:4

TCTAGACACC ATGGAC

2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИДЕНТИф. ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ No. 5 I ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 22 аминокиселини (Б) ТИП: аминокиселинен (B) ВЕРИЖНОСТ: единична (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна

II МОЛЕКУЛЕН ТИП: пептид

XI ОЗНАЧЕНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:5

Ser Asn Ser Gly Ala Vai Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn Ala Leu

5 10 15

Leu Leu Gin Asn Pro

2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИДЕНТИф. ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ No. 6

I ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 22 аминокиселини (Б) ТИП: аминокиселинен (B) ВЕРИЖНОСТ: единична (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна

II МОЛЕКУЛЕН ТИП: пептид

XI ОЗНАЧЕНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:6:

Ser Asn Ser Trp Ala Vai Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn Ala Leu

10 15

Leu Leu Gin Asn Pro

2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИДЕНТИф. ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ No. 7:

I ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 22 аминокиселини (Б) ТИП: аминокиселинен (B) ВЕРИЖНОСТ: единична (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна

II МОЛЕКУЛЕН ТИП: пептид

XI ОЗНАЧЕНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:7 Ser Asn Asn Trp Ala Vai Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro lie 15 10 15

Leu Ala Gly Asp Pro

ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИДЕНТИФ. ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ No: 8:

ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 34 базови двойки (Б) ТИП: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: единична (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна '11 МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна)

XI ОЗНАЧЕНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:8:

CGAGAGGATC AGTGAGAGTC CATGGACACG ACGG

2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИДЕНТИФ. ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ No. 9:

I ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 33 базови двойки (Б) ТИП: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: единична (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна

II МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна)

XI ОЗНАЧЕНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:9:

GTTTTGGTGT CGTAGTAGTA CTGAAGGTTC CAG

2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИДЕНТИф. ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ No. 10:

I ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 21 базови двойки (Б) ТИП: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: единична (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна

II МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна)

XI ОЗНАЧЕНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:10:

TACCCGGGGT TCCCGCGAAC Т

2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИДЕНТИф. ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ No. 11:

I ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 10 базови двойки (Б) ТИП: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: единична (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна

II МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна)

XI ОЗНАЧЕНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:11:

CATGAAGAAG

2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИДЕНТИф. ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ No. 12:

I ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 10 базови двойки (Б) ТИП: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: единична (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна

II МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна)

XI ОЗНАЧЕНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:12:

TTCTTCCTAG

2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИДЕНТИф. ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ No. 13:

I ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 23 базови двойки (Б) ТИП: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: единична (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна

II МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна)

XI ОЗНАЧЕНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:13:

GTCGGCGCAT CGATGGGTGG ААТ

2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИДЕНТИф. ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ No.14:

I ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 22 базови двойки (Б) ТИП: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: единична (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна

II МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна)

XI ОЗНАЧЕНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 14:

CGCCCACCAT GGCGCCTCAG AT

2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИДЕНТИф. ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ No. 15:

I ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 28 базови двойки (Б) ТИП: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: единична (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна

II МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна)

XI ОЗНАЧЕНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:15:

TCTAGCTAGA CACCATGTCG CCTCAGAT

2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИДЕНТИф. ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ No.16:

I ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 23 базови двойки (Б) ТИП: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: единична (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна

II МОЛЕКУЛЕН ТИП: кДНК до ср.РНК

XI ОЗНАЧЕНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:16

GTCGGCGCAT CGATGGGTGG ААТ

2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ИДЕНТИф. ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ No. 17.

ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА: 35 базови двойки (Б) ТИП: нуклеинова киселина (B) ВЕРИЖНОСТ: единична (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна

II МОЛЕКУЛЕН ТИП: кДНК до ср.РНК

XI ОЗНАЧЕНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:17:

CTCCGATAGG GCGTGGTACC CGGCCCTACT СТТАТ

Claims (13)

1. Биологичен метод за получаване на 7-аминодеацетилцефалоспоранова киселина (7ADAC) и 7-аминоцефалоспоранова киселина (7-АСА), характеризиращ се с това, че за получаване на 7-ADAC се преминава през следните етапи: 1) щам от вида Penicillium chrysogenum, продуциращ изопеницилин N, се поддържа в културална среда и към нея се добавя адипатна хранителна среда, включваща адипинова киселина отделно или с нейни соли и естери, които могат да бъдат асимилирани и оползотворени от посочения щам, за продуциране на адипоил-6-аминопеницилинова киселина (адипоил-6-АРА); 2) осъществяване на ензимни превръщания чрез in situ експресия на съответния ген, както следва: а) пръстенът на адипоил-6-АРА се разширява in situ до образуване на адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоранова киселина (адипоил-7-ADCA) чрез ензима експандаза, при което посоченият щам от вида Penicillium chrysogenum се трансформира с ДНК, кодираща активността на ензима експандаза, и който от своя страна е способен да приеме адипоил-6-АРА като субстрат, върху който в резултат на експресията пръстенът на адипоил-6-АРА, продуцирана от щама, също се разширява in situ до образуване на адипоил-7-ADCA;

б) хидроксилиране in situ на 3-метиловата странична верига на адипоил-7-ADCA за получаване на адипоил-7-аминодеацетилцефалоспоранова киселина (адипоил-7-ADAC) чрез ензима хидроксилаза, при което посоченият щам Penicillium chrysogenum се трансформира чрез ДНК, кодираща активността на ензима хидроксилаза, способен да приеме споменатата адипоил-7-ADCA като субстрат, върху който в резултат на експресията му адипоил7-ADCA, продуцирана от посочения щам, след това също се хидроксилира in situ до образуване на адипоил-7-ADAC; 7-ADCA, продуцирана от посочения щам след това също се хидроксилира in situ до образуване на адипоил-7ADAC; 3) осъществяване на контакт между получената адипоил-7-ADAC с адипоиламидаза, при което адипоиловата странична верига се отстранява и се получава продуктът 7-ADAC с последващото му изолиране.

2. Биометод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че адипатната хранителна среда е двунатриев адипат.

3. Биометод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че ДНК, кодираща активността на ензимите експандаза и хидроксилаза, е получена от Cephalosporium acremonium.

4. Биометод съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че е използван единичен бифункционален ензим експандаза/хидроксилаза.

5. Биометод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че адипоиламидазата е получена от видовете Pseudomonas.

6. Биометод за получаване на 7-АС А съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че след етапа 2) б) се провежда ацетилиране in situ на получената адипоил-7-ADAC до адипоил-7-аминоцефалоспоранова киселина (адипоил-7-АСА) чрез ензима ацетилтрансфераза, при което посоченият щам Penicillium chrysogenum е трансформиран с ДНК, кодираща активността на ензима ацетилтрансфераза, способен да приеме активността на адипоил7-ADAC като субстрат, върху който в резултат на експресията му адипоил-7-ADAC се ацетилира in situ до образуване на адипоил-7-АСА и след това се осъществява контакт между адипоил-7-АСА с адипоиламидаза, при което адипоиловата странична верига се отстранява и се получава продуктът 7-АСА с последващото му изолиране.

7. Биометод съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че адипатната хранителна среда е двунатриев адипат.

8. Биометод съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че ДНК, кодираща активността на ензимите експандаза, хидроксилаза и ацетилтрансфераза, е извлечена от Cephalosporium acremonium.

9. Биометод съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че е използван единичен бифункционален ензим експандаза/хидроксилаза.

10. Биометод съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че адипоиламидазата е извлечена от видовете Pseudomonas.

11. Рекомбинантни ДНК експресионни вектори, плазмиди (1) PEN/CEPH-1, (2) pPENCACT и (3) pTS-8, които са способни да бъдат интегрирани в хромозомна ДНК от рекомбинантен щам на Penicillium chrysogenum, съставени главно от ДНК, кодираща експандазно/хидроксилазна и/или ацетилтрансферазна активност, получени от Cephalosporium acremonium и промотор, който управлява експресията на споменатата експандазно/хидроксилазна и/или ацетилтрансферазна активност, кодираща ДНК, съставен главно от промотора на Penicillium chrysogenum изопеницилин N синтетазния ген.

12. Клетка гостоприемник от Penicillium chrysogenum, означена като РС200, АТСС 74186 или РС300, АТСС 74187, трансформирана съответно с рекомбинантна ДНК експресионен вектор, плазмид pPEN/CEPH-1 или плазмид pTS-8, интегриран в хромозомна ДНК на споменатата клетка гостоприемник и е съставен главно от съответно ДНК-кодираща експандазно/хидроксилазна активност и споменатата активност, заедно с ацетилтрансферазната активност, получена от Cephalosporium acremonium и промотор, който управлява експресията на експандазната/хидроксилазната и ацетилтрансферазната активност, кодираща ДНК, съставен главно от промотора на Penicillium chrysogenum изопеницилин N синтетазен ген.

13. Метод, включващ етап на култивиране на рекомбинантна клетка гостоприемник от Penicillium chrysogenum при условия, подходящи за генна експресия, характеризиращ се с това, че рекомбинантната клетка гостоприемник включва рекомбинантен ДНК експресионен вектор, плазмид pPEN/CEPH-1 или плазмид pTS-8, интегриран в хромозомна ДНК на клетката гостоприемник и съставен главно от съответно ДНК-кодираща експандазна/хидроксилазна активност и споменатата активност, заедно с ацетилтрансферазната активност, получена от Cephalosporium acremonium и промотор, който управлява експресията на споменатата експандазно/хидроксилазна и ацетилтрансферазна активност, кодираща ДНК, съставен главно от промотора на Penicillium chrysogenum изопеницилин N синтетазен ген.