KR100227711B1 - 7-아미노세팔로스포란산 및 7-아미노데아세틸세팔로스포란산 제조를 위한 신규한 생물학적 공정 - Google Patents

Abstract

세팔로스포린 항생제 제조에 중요한 중간체인 7-아미노-세팔로스포란산(7-ACA) 및 7-아미노데아세틸 세팔로스포란산(7-ADAC)은, 형질전환된 페니실리움 크리소게늄(Penicillium Chrysogenum) 균주를 아디페이트 영양 원액의 존재하에 배양하여 아디포일-6-APA(6-아미노페니실란산)를 생산하고; 1) 아디포일-7-ADCA를 생성시키는 엑스팬다제 유전자; 2) 7-ADAC를 생성시키는 하이드록실라제 유전자; 및 3) 아디포일-7-ACA를 생성시키는 아세틸트랜스퍼라제 유전자로 형질전환된 피.크리소게늄의 상기 유전자들을 동일계 발현시키는 신규한 생물학적 공정에 의해 제조된다. 그런 다음, 최종 생성물 7-ACA는 아디포일 아실라제를 사용하여 아디포일 측쇄를 절단하여 제조한다. 따라서, 전체 합성은 생물학적 공정에 따라 수행되므로 효율적이고 경제적이다.

Description

[발명의 명칭]

7-아미노세팔로스포란산 및 7-아미노데아세틸세팔로스포란산 제조를 위한 신규한 생물학적 공정

[발명의 상세한 설명]

[발명의 분야]

본 발명은 현재 그의 상당수가 시판중이며, 제4세대 치료제라고 할 수 있는 시판중인 세팔로스포린 항생제 제조를 위한 합성방법 분야에 속한다. 시판되는 세팔로스포린에서 발견되는 다양한 측쇄 및 세팔로스포린의 상당한 경제적 중요성은 다양한 세팔로스포린을 즉시 합성할 수 있도록 하는 중요한 중간체 제조를 위한 보다 경제적이고 효율적인 방법을 성취하는데 있어 주안점을 두고 있다.

이들 중요한 중간체중 하나는 하기 구조식의 7-아미노-세팔로스포란산(7-ACA)이다 :

보통, 7-ACA는 세팔로스포린 C로부터 제조된다. 세팔로스포린 C 자체는 발효 산물로서, 거의 모든 현재 시판되는 세팔로스포린에 있어서 출발점이 된다. 하지만, 이들 다양한 시판 세팔로스포린을 제조하기 위한 합성 조작법은 대부분의 경우 기본적으로 7-아미노-세팔로스포란산으로 출발하는데, 이는 7-아미노아디포일 측쇄 절단에 의해 세팔로스포린 C로부터 유도되어짐에 틀림없다. 7-ACA로부터 합성적으로 유도됨으로써 3-아세틸 옥시메틸렌 측쇄를 갖는 일반적인 시판 세팔로스포린에는 세포 탁심, 세팔로글리신, 세팔로틴 및 세파피린을 포함한다.

또 다른 중요한 중간체는 하기 구조식의 7-아미노데아세틸 세팔로스포란산(7-ADCA)이다 :

보통, 7-ADCA는 또한 3-아세틸옥시메틸렌 쇄의 3-하이드록시메틸로의 전환과 함께, 세칼로스포린 C로부터 7-D-α-아미노아디포일 측쇄를 제거함으로써 제조된다. 7-ADCA는 C-3 위치에서 변형된 치환체를 함유하는 세팔로스포린 합성에 있어 유용한 중간체 화합물이다.

일반적으로, 7-아미노아디포일 측쇄를 절단하기 위해 당해 분야에서 선택하는 방법은 화학적이다. 기본적인 아미노-할라이드 방법은 7-아미노아디포일 측쇄 상에는 아미노 및 카복실 그룹의 차단을 필요로 하고, 이를 수행하기 위한 몇몇 방법을 일반적으로 사용한다. 하지만, 현재 사용되는 화학적 절단 방법은 심각한 불리점을 갖고 있다. 여기에는 다단계 및 복잡한 공정, 매우 낮은 작동 온도, 고가의 시약, 배출물 처리 문제를 야기하는 상당량의 공정 부생성물 및 화학적 처리 개시 이전 고도의 불순물 출발물질의 정화를 필요로 한다. 결과적으로, 현재 사용하고 있는 화학적 방법보다 훨씬 경제적인 기반으로 7-아미노-세팔로스포란산을 제공하기 위하여 세팔로스포린 C를 효소적으로 탈아실화시킬 수 있는 미생물학적이거나 발효적 공정에 대한 연구가 시작되고 있다.

하지만, 성공적인 미생물학적 공정에 대한 이러한 연구는 대부분 무익한 것으로 입증되었다. 이는 문헌으로부터 명백하게 나타나는 바와 같이, 다양한 미생물에 의해 생성되는 페니실린 아실라제를 사용한 효소적 절단에 의해 페니실린을 성공적으로 탈아실화시켜 왔기 때문에, 세팔로스포린 C 분자의 아미노아디포일 측쇄의 구조, 특히 입체화학으로부터 기인한다. 다른 한편으로, 세팔로스포린 C의 성공적인 1단계 효소적 탈아실화가 종종 비재생적이거나 매우 한계적인 수율만을 제공하는 것으로 문헌에 보고되어 있다.

따라서, 본 발명은 특히 중요한 세팔로스포린 중간체 7-ACA의 제조분야, 보다 특정하게는, 7-ACA의 제조를 위한 생물학적 공정 분야에 속한다.

현재까지, 7-ACA 제조를 위한 성공적인 생물학적 공정에 대한 연구는 시판규모상 대부분 무익한 것으로 입증되었다. 예를 들면, 페니실린 G의 효소적 처리 및/또는 직접적인 발효에 의해 7-ADCA를 수득하는데 있어 필요한 환 연장만을 잔류시키며 6-아미노 페니실란산(6-APA)을 제조할 수 있었으나, 불행하게도, 이들 미생물의 정상적인 대사 경로에 있어 환 연장을 수행하는 세팔로스포리움(Cephalosporium) 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 효소는 기질로서 6-APA를 허용하지 않는다. 당해 분야에서 DAOCS 또는 엑스팬다제(expandase) 연장 효소로서 통칭되는 이들 효소는, 세팔로스포린에서 발견되는 바와 같이, 페니실린-타입 분자에서 발견되는 펜암 환 구조를 세프-3-엠 환으로 연장시키는 것을 촉매하는 효소로서 일컬어진다. 하기에서, 이들 효소를 통칭하여 "엑스팬다제 효소"로서 언급한다.

엑스펜다제 효소가 작용하는 기질은 페니실린 N으로서, 환 연장 및 하이드록실화에 의해 데아세틸세팔로스포란산(DAC)이 수득된다. 본원에서는, (D)-α-아미노아디포일 측쇄를 절단하여 7-ADCA를 수득해야 하는데, 이러한 측쇄는 효소적 절단에 있어 매우 내성이 있어 불합리적인 낮은 수율로 수득되는 것으로 입증되었다.

본 발명에 따라, 페니실린 화합물(아디포일 측쇄를 갖는) 이 고도의 역가로 신규한 발효 공정에 의해 제조되는 효율적인 생물학적 공정이 성취될 수 있는데, 여기서 페니실린 화합물은, 엑스팬다제 효소를 발현하도록 형질전환된, 페니실린 화합물을 생산하는 동일 미생물에 의해 동일계에서 생산되는 엑스팬다제 효소에 대한 허용 가능한 기질로서 작용한다. 그런 다음 엑스 팬다제 효소는 페니실린 화합물을 고수율로 세팔로스포린 화합물로 환 연장시키도록 작용한다.

엑스팬다제 효소의 동일계 작용에 의해 생산되는 아디 포일-7-ADCA는 3-메틸(CH₃) 측쇄를 지니는 반면, 최종 생성물은 7-ACA는 3-아세틸옥시메틸[-CH₂OC(O)CH₃] 측쇄를 지닌다. 3-메틸을 3-아세틸옥시메틸 측쇄로 전환하기 위하여, 본 발명에 따라 엑스팬다제 활성 이외에 2가지 추가의 효소 활성이 동일계 발현된다. 그들은 하이드록실라제 및 아세틸트랜스퍼라제로서, 둘다 페니실린 화합물을 생산하는 미생물을 형질 전환시키는 유전자의 발현 생성물이다. 하이드록실라제 효소는 아디포일-7-ADCA의 3-메틸 측쇄를 3-하이드록시메틸로 전환시키고 아세틸 트랜스퍼라제 효소는 이러한 3-하이드록시메틸 측쇄를 7-ACA의 3-아세틸옥시메틸 측쇄로 전환시킨다.

또한, 본 발명의 방법의 마지막 중요 단계에 있어 중요한 것은, 세팔로스포린 화합물이 된 페니실린 화합물의 측쇄가 놀랍게도 고수율로 또다른 효소 시스템에 의해 제거될 수 있다는 사실이다. 본 발명의 특징인 이러한 독특한 전체적 생물학적 공정의 예기치 않은 결과는 놀랍게도 고수율로 7-ACA를 생산한다는 점으로, 화학적이고 생화학적인 공정에 있어 일반적으로 사용되던 방법의 합리적 대안으로서 충분히 경제적이다.

[선행분야의 간단한 기술]

본 발명의 신규한 생물학적 공정은 현행 화학적 합성 방법에 대한 경제적으로 중요한 대안으로서 7-ACA 제조를 위한 독특한 놀라운 효율적인 방법을 제공한다. 이러한 생물학적 공정을 고안하는 당해 분야의 지속적 노력은 실패를 반복해왔다. 예를 들면, 유럽 특허원 제0 422 790호는 아스퍼질러스 나이둘란스(Aspergillus nidulans)의 이소페니실린 N : 아실-CoA 아실 트랜스 퍼라제 활성을 암호화하는 DNA 및 페니실린-생산 진균 내에서 유용한 세팔로스포린을 생성시키는 이의 용도에 대해 기술하고 있는데, 이는 당해 분야에서는 성취되지 않았던 업적이었다. 하지만, 이는 세팔로스포린-생산 유기체로부터 에피머라제 및 엑스팬다제 효소를 암호화하는 유전자 부가와 함께 아실트랜스퍼라제 유전자의 분해 또는 분리를 통해 이루어지는 것으로 기술되어 있고; 더구나 유용한 형질전환 및 발현 결과는 실질적으로 명백히 성취되지 않았다. 또한, 형질전환이 성공적이어도, D-α-아미노아디포일 측쇄를 제거하는 방법의 문제가 여전히 잔존하기 때문에 본 발명의 목적에 있어 여전히 유용하진 않다. 페니실린-생산 진균 배양물로부터 시판되는 세팔로스포린 중간체를 생산하는데 있어서 중요한 결과를 수득하기 위한 당해 분야에서의 상기와 같은 실패된 시도는 본 발명의 방법으로 성취된 결과와 완전히 상반된다.

본 발명의 방법에 있어 첫 번째 효소적 생물학적 공정 단계는, 비-재조합 피.크리소게늄(P. Chrysogenum) 숙주를 형질전환시킨 엑스팬다제 유전자의 발현 생성물인 엑스팬다제 효소에 의해 수행되는, 아디포일-6-APA의 환 연장이다. 이러한 엑스팬다제 효소의 사용은 선행 분야에서 실시된 바 있다. 예를 들면, 문헌[참조 : Cantwell et al., in Curr Genet (1990) 17 : 213-221]은 페니실린 V의 환 연장 이후 수득된 데아세톡시세팔 로스포린 V를 효소적으로 가수분해하여 7-ADCA를 형성함으로써 7-ADCA를 생산하는 생물학적 공정을 제시하였다. 이러한 제안은 에스. 클라불리게루스(S. clavuligerus)로부터 클로닝된 페니실린 N 엑스팬다제 유전자(cefE)의 유용성에 근거한다[참조 : Kovacevic et al., J. Bacteriol. (1989) 171; 754-760; and Ingolia et al. U.S. 5,070,020]. 하지만, 엑스팬다제는 그의 천연 기질인 페니실린 N상에 작용하고 페니실린 V에는 작용하지 않기 때문에, 이러한 제안은 페니실린 V를 환-연장할 수 있는 변형된 엑스팬다제 유전자를 생산하는 유전 공학을 필요로 한다. 필요한 변형법은 칸트웰(Cantwell) 등에 의해 성취되지 않았으나, 이들은 단지 스트렙토마이세스 클라불리게루스(Streptomyces clavuligerus)로부터 cefE 유전자로 페니실리움 크리소게늄을 형질전환시켜 DAOCS(엑스팬다제) 효소를 저수준으로 발현시켜 수득하는데 성공하였을 뿐이다.

엑스팬다제 효소는 그의 활성 및 유전자 서열 측면 모두에서 널리 연구되었다. 예를 들면 올프(Wolfe)의 미합중국 특허 제4,510,246호 및 제4,536,476호에서는, 스트렙토마이세스 클라부리게루스를 포함한 원핵성 β-락탐 생산 유기체의 세포-유리 추출물로부터 사이클라제, 에피머라제 및 환 연장 효소를 별도로 분리하여 안정적인 효소 시약을 제공하였다. 도쯔라프(Dotzlaf)의 미합중국 특허 제5,082,772호(EP-A-0 366 354)는 에스. 클라불리게루스로부터의 분리되어 정제된 엑스팬다제 효소를 기술하고 있는데, 이는 말단 잔기 및 아미노산 조성 등에 있어서 특징이 있고 분자량은 약 34,600달톤으로 밝혀졌다. 하지만, 이는 미합중국 특허 제4,536,476호에서 동일 효소로 보이는 분자량 29,000의 효소와는 차이를 보인다. 유럽 특허원 제0 233 715호는 에스. 클라불리 게루스로부터 수득한 엑스팬다제 유전자의 분리 및 엔도뉴클레 아제 제한 지도 특성화 및, 세팔로스포린 생산 수행력이 결여된 에스. 클라불리게루스 균주내에서의 재조합 엑스팬다제-암호화 DNA(활성 엑스팬다제 효소를 수득케 함)의 발현을 기술하고 있다. 인골리아(Ingolia) 등은 미합중국 특허 제5,070,020호(EP-A-0 341 892)에서 에스. 클라불리게루스로부터 수득한 엑스팬다제 효소를 암호화하는 DNA 서열을 기술하고 있고, 상기 DNA 서열을 함유하는 발현 벡터로 피. 클리소게늄 균주를 형질전환시켜 엑스팬 다제 효소를 발현시키는 것을 기술하고 있다. 이러한 효소가 페니실린 N 이외의 기질 연장에 유용한 것으로 제시되었으나, 이러한 연장에 대한 실질적 입증은 나타나 있지 않다.

상기 연구는 원핵성 에스. 클라불리게루스로부터 유도된 엑스팬다제 효소에 집중되었다. 명백히 동일한 환 연장 활성을 갖는 효소 또한 진핵성 세팔로스포리움 아크레모니움(Cephalosporium acremonium)[아크레모니움 크리소게늄(Acremonium Chrysogenum)으로도 언급됨] 균주에 의해 발현되기도 한다. 하지만, 이들 균주에서 엑스팬다제 활성은 이작용성 유전자(cefEF)에 의해 발현되는데, 이는 또한 그의 천연 기능이 엑스팬다제 효소의 데아세톡시세팔로스포란산(DAOC) 생성물을 데아세틸 세팔로스포린 C(DAC)로 전환시키는 DACS(하이드록실라제) 활성을 발현한다. 이러한 발현 결과는 단일성이나 이작용성인 엑스팬다제/하이드록실라제 효소이다. 이들 두 가지 유전자 생성물의 활성을 분리시키는 노력이 경주되었으나, 아직까지 성공적이지 않았다. 예를 들면, 유럽 특허원 제0 281 391호는, 씨. 아크레모니움 ATCC 11550으로부터 수득된 DAOCS/DACS 유전자의 분리 및 DNA 서열 동정을 상기 효소의 상응하는 아미노산 서열과 함께 기술하고 있다. 페니실리움을 형질전환시켜 상기 효소를 발현시키지만, 페니실린 G 및 V의 상응하는 세팔로스포린으로의 전환은 시도되었으나 입증된 바 없다. 추가로, 유전공학 기술이 DACS로부터 DAOCS를 암호화하는 유전 정보를 분리시키기 위한 즉각적인 수단을 제공한다는 제안에도 불구하고 이러한 분리의 실제적인 입증은 설명되어 있지 않다.

씨. 아크레모니움의 DAOCS/DACS(엑스팬다제/하이드록실라제) 효소 또한 그의 활성 및 특성과 유전자 서열의 측면에서 당해 분야에 있어 널리 연구된 바 있다. 예를 들면, 드메인(Demain)의 미합중국 특허 제4,178,210호, 제4,248,966호 및 제4,307,152호에서는 다양한 페니실린-타입 출발물질을, 환을 에피머화하고 연장시키는 씨. 아크레모니움의 세포-유리 추출물로 처리하여 세팔로스포린 항생제 생성물을 수득한다. 우-쾅 예(Wu-Kuang Yeh)는 미합중국 특허 제4,753,881호에서 씨. 아크레모니움 효소를 그의 등전점, 분자량, 아미노산 잔기, 엑스팬다제 활성에 대한 하이드록실라제의 활성비 및 펩타이드 단편의 측면에서 기술하고 있다.

씨. 아크레모니움의 아세틸트랜스퍼라제 효소 또한 그의 활성, 특성, 제한지도 및 뉴클레오타이드와 아미노산 서열에 대하여 당해 분야에 기술되어 있다[참조 : 유럽 특허원 제0 437 378호 및 제0 450 758호].

상기 선행 분야는 본 발명의 단일 양태, 즉 피. 크리소게늄 균주를 엑스팬다제 및 엑스팬다제/하이드록실라제 효소를 발현하는 유전자로 형질전환시켜 이들 효소의 발현물을 수득하는 것만을 다루고 있다. 하지만 당해 분야는 페니실린 G 및 V가 아닌 페니실린 N을 환-연장시키는 발현 효소만을 사용하였다. 이 경우조차, 페니실린 N은 유리 아미노 그룹을 잔류시키도록 효소적으로 절단될 수 없는 7-위치 측쇄를 갖는다. 본 발명은 아디포일 측쇄가 피.크리소게늄 균주에 의해 효율적으로 부가될 수 있고, 동일계 발현된 엑스팬다제 효소가 그러한 화합물을 아디포일-7-ADCA로 환 연장시키기 위한 기질로서 효율적으로 사용할 수 있으며, 또한 동일계 발현된 하이드록실라제 및 아세틸 트랜스퍼라제 효소가 7-ACA의 3-아세톡시메틸 측쇄를 제조하기 위한 기질로서 아디포일-7-ADCA를 사용할 수 있고, 아디포일 측쇄가 또다른 효소에 의해 효율적으로 제거되어 7-ACA를 수득할 수 있다는 놀라운 발견을 근거로 하고 있다. 본 발명의 다양하게 분리된 일부 양태를 선행 분야에서 발견할 수 있으나, 이들을 합하여 본 발명의 방법으로 수득되는 예기치 않은 결과를 낳을 수 있다는 사실은 제시된 바 없다.

예를 들면, 6-아디포일 페니실란산은 당해 분야에 공지되어 있다[참조 : Ballio, A. et al., Nature(1960) 185, 97-99]. 단지 시험관내만을 기본으로 한 6-아디포일 페니실란산의 효소적 연장 또한 당해 분야에 공지되어 있다[참조 : Baldwin et al., Tetrahedron(1987) 43,3009-3014 및 EP-A-0 268 343]. 또한, 아디포일 측쇄의 효소적 절단도 당해 분야에 공지되어 있다[참조 : Matsuda et al., J. Bact.. (1987) 169, 5815-5820].

아디포일 측쇄는 하기 구조를 갖는다: COOH-(CH₂)₄-CO-. 반면 밀관된 구조의 2가지 측쇄는, 구조식 COOH-(CH₂)₃-CO-의 글루타릴의 측쇄, 및 구조식 COOH-CH(NH₂)-(CH₂)₃-CO-의 (D)-α-아미노아디포일의 측쇄이다. 글루타릴 측쇄의 효소적 절단은 당해 분야에 공지되어 있다[참조 : Shibuya et al., Agric. Biol. Chem. (1981) 45, 1561-1567, and U.S. 3, 960, 662; Matsuda and Komatsu, J. Bact. (1985) 163, 1222-1228; Matsuda et al., J. Back. (1987) 169, 5815-5820; Jap. 53-086084(1978-Banyu Pharmaceutical Co. Ltd.); and Jap. 52-128293(1977-Banyu Pharmaceutical Co. Ltd.)]. 또한 유럽 특허원 제0 453 048호는 슈도모나스(Pseudomonas) SY-77-1에 의해 생산된 글루타릴 아실라제의 아디포일-절단 활성을 개선시키기 위한 방법을 기술하고 있다. α-서브유니트내의 특정 위치에서 상이한 아미노산을 치환함으로써, 아디포일 절단(아디포일-세린으로부터) 속도가 3 내지 5배 가속됨이 관측된다. 유럽 특허원 제0 453 048호는 아디포일 측쇄에 대한 증가된 활성을 갖는 아실라제를 입증하고 있으나, 아디포일-세팔로스포린이 처음부터 형성되는 방식(본 명세서중에 기술된 방식과 유사한 어떠한 화학적 또는 생물학적 공정에 의해서도)에 대해서는 기술하지 않고 있다.

(D)-α-아미노아디포일 측쇄가 존재하는 경우, 당해 분야에 있어서 먼저 아미노 그룹을 효소적으로 제거하고 (D)-아미노산 옥시다제로 측쇄를 단쇄화시켜 글루타릴(GL-7) 측쇄를 잔류시키고, 제2효소(글루타릴 아실라제)에 의해 글루타릴 측쇄를 제거한다는 사실이 공지되어 있다. 이러한 2단계 절단법은 문헌[참조 : Matsuda U.S. 3,960,662; EP-A-O 275 901; Jap. 61-218057(1988-Komatsu, Asahi Chemical Industry Co.); WO 90/ 12110(1990-Wong. Biopure Corp.); and EP-A-O 436 355, Isogai et al., also Bio/Technology(1991) 9, 188-191]에 기술되어 있다.

또한, 당해 분야에 있어 특히 재조합 기술을 사용한 (D)-α-아미노아디포일 측쇄의 1단계 절단 수행 기술이 하기와 같이 공지되어 있다 :

[1단계(D)-α-아미노아디포일 측쇄 절단]

-Jap. 53-94093(Meiji, 슈도모나스종 NB-188);

-Jap. 52-143289(=US 4,141,790, Meiji, 아스퍼질러스(Aspergillus)종);

-US 4,774,179(Asahi 1988, 슈도모나스종 SE-83 및 SE-495), =Jap. 61-21097 및 Jap. 61-152286;

-Fr. Pat. 2,241,557(Aries 1975, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) var. fluorescens);

-Jap. 52-082791(Toyo Jozo 1977, 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) NRRL B 5385);

-EP-A-0 321 849(Hoechst. 슈도모나스, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), γ-글루타밀 트랜스펩티다제);

-EP-A-0 322 032, EP-A-O 405 846, 및 U.S. 5,104,800(Merck, 바실러스 메가테리움);

-EP-A-0 283 218 및 U.S. 4,981,789(Merck, 아르트로박터 비스코서스(Arthrobacter viscosus);

[1단계 재조합 : Ceph C → 7-ACA :]

-Jap. 60-110292(Asahi 1985, 코마모나스(Comamonas), 코마모나스종 SY-77-1로부터의 유전자를 함유하는 재조합 이.콜라이, 1단계 전환)

-Jap. 61-152-286(Asahi 1986, 슈도모나스, 슈도모나스종 SE83으로부터의 유전자를 갖는 재조합 이.콜라이, 미합중국 특허 제4,774,179호에 청구된 1단계 공정, 기술된 유전자 서열);

-Jap. 63-74488(Asahi 1988, 트리고놉시스 배리아빌리스(Trigonopsis Variabilis), 코마모나스, D-아미노산 옥시다제 및 GL-7-ACA 아실라제 작제물의 재조합 이.콜라이 발현).

-EP-A-0 475 652(Fujisawa, 세팔로스포린 C 아실라제 및 재조합 기술에 의한 이의 생산).

7-ADAC 제조를 위한 다양한 양태의 방법이 당해 분야에 공지되어 있다[참조; U.S. 3,304,236 and 3,972,774(Eli Lilly & Co.); EP-A-0 454 478(Shionogi & Co., Ltd.); and published Japanese application 04 53, 499(Shionogi & Co., Ltd.)].

[공계류중인 특허원에 대한 참조]

1992년 8월 28일 출원된 공계류중인 특허원 제07/933, 469호(변리사 도켓 번호 제1832IA호)를 참조하면 7-ADCA 제조를 위한 생물학적 공정을 기술하고 있으며, 본원중 기술된 7-ADAC 및 7-ACA 제조를 위한 생물학적 공정과 동일한 방식으로 피.크리소게늄 형질전환체에서의 엑스팬다제 효소 활성의 발현을 근거로 한다. 하지만, 본 생물학적 공정에서는, 완전히 상이한 재조합체 대사 경로로 독특한 최종 생성물을 수득하기 위하여, 추가의 효소 활성의 발현에 추가의 형질 전환이 이용되는데, 이는 공계류중인 특허원에서는 제시된 바 없다.

본 발명의 방법 및 상기한 선행 분야의 참조문헌 교시를 보다 쉽게 이해하기 위하여, 하기 바로 설명할 기술 내용은 아디포일-6-APA, 아디포일-7-ADCA, 아디포일-7-ACA 및 7-ACA를 수득하는 대사 경로에 있어서 다양한 단계, 관련된 형질전환을 수행하는 효소 및 중간체 생성물을 나타낸다.

[발명의 요약]

본 발명은, 1) 이소페니실린 N을 생산하는 페니실리움 크리소게늄(Penicillium chrysogenum) 균주의 생장을 지속시킬 수 있는 배지 중에서 상기 균주를 유지시키고, 페니실리움 크리소게늄 균주에 의해 동화되고 이용될 수 있는 하나 이상의 아디프산 또는 이의 염 및 에스테르를 포함하는 아디페이트 영양 원액을 배지에 가해 아디포일-6-아미노페니실란산(아디포일-6-APA)을 생산하는 단계; 2) a) 기질로서 아디포일-6-APA를 허용할 수 있는 엑스 팬다제(expandase) 효소 활성을 암호화하는 DNA로 피.크리소게늄 균주를 형질전환시켜, 이를 발현한 결과 상기 균주에 의해 생산된 아디포일 6-APA를 이후 동일계 환 연장시켜 아디포일-7-ADCA를 형성시키는 방식으로, 엑스팬다제 효소에 의해 아디포일-6-APA를 동일계 환-연장시켜 아디포일-7-아미노데스아세톡시세팔로스포란산(아디포일-7-ADCA)를 형성시키고; b) 기질로서 상기 아디포일-7-ADCA를 허용할 수 있는 하이드록실라제 효소의 활성을 암호화하는 DNA에 의해 피.크리소 게늄 균주를 형질 전환시켜 이를 발현한 결과 상기 균주에 의해 생산된 아디포일-7-ADCA를 또한 이후 동일계 하이드록실화시켜 아디포일-7-ADAC를 형성시키는 방식으로, 하이드록실라제 효소에 의해 아디포일-7-ADCA의 3-메틸 측쇄를 동일계 하이드록실화시켜 아디포일-7-아미노데아세틸세팔로스포란산(아디포일-7-ADAC)을 형성시키는 바와 같이 효소적 전환을 상응하는 유전자의 동일계 발현에 의해 수행하는 단계; 3) 아디포일-7-ADAC를 아디포일 아미다제와 접촉시킴으로써 아디포일 측쇄를 제거하고 7-ADAC 생성물을 형성시킨 후 이 생성물을 분리하는 단계를 포함하는, 7-아미노데아세틸 세팔로스포란산(7-ADAC)을 제조하는 신규한 생물학적 공정에 관한 것이다.

본 발명은 추가로, 1) 이소페니실린 N을 생산하는 페니실리움 크리소게늄 균주의 생장을 지속시킬 수 있는 배지에서 상기 균주를 유지시키고, 페니실리움 크리소게늄 균주에 의해 동화되고 이용될 수 있는 하나 이상의 아디프산 또는 이의 염 및 에스테르를 포함하는 아디페이트 영양 원액을 배지에 가해 아디포일-6-아미노페니실란산(아디포일-6-APA)을 생산하는 단계; 2) a) 기질로서 아디포일-6-APA를 허용할 수 있는 엑스 팬다제 효소 활성을 암호화하는 DNA로 피.크리소게늄 균주를 형질전환시켜, 이를 발현한 결과 상기 균주에 의해 생산된 아디포일-6-APA를 이후 동일계 환 연장시켜 아디포일-7-ADCA를 형성시키는 방식으로, 엑스팬다제 효소에 의해 아디포일-6-APA를 동일계 환-연장시켜 아디포일-7-아미노데아세톡시 세팔로스포란산(아디포일-7-ADCA)를 형성시키고; b) 기질로서 상기 아디포일-7-ADCA를 허용할 수 있는 하이드록실라제 효소의 활성을 암호화하는 DNA에 의해 피.크리소 게늄 균주를 형질 전환시켜 이를 발현한 결과 상기 균주에 의해 생산된 아디포일-7-ADCA를 또한 이후 동일계 하이드록실화시켜 아디포일-7-ADAC를 형성시키는 방식으로, 하이드록실라제 효소에 의해 아디포일-7-ADCA의 3-메틸 측쇄를 동일계 하이드록실화시켜 아디포일-7-아미노데아세틸 세팔로스포란산(아디포일-7-ADAC)을 형성시키며; c) 기질로서 상기 아디포일-7-ADAC를 허용할 수 있는 아세틸트랜스퍼라제 효소의 활성을 암호화하는 DNA에 의해 피. 크리소게늄 균주를 형질전환시켜 이를 발현한 결과 상기 균주에 의해 생산된 아디포일-7-ADAC를 또한 이후 동일계 아세틸화하여 아디포일-7-ACA를 형성시키는 방식으로, 아세틸트랜스퍼라제 효소에 의해 아디포일-7-ADAC를 동일계 아세틸화시켜 아디포일-7-아미노 세팔로스포란산(아디포일-7-ACA)을 형성시키는 바와 같은 효소적 전환을 상응하는 유전자의 동일계 발현에 의해 수행하는 단계; 3) 아디포일-7-ACA를 아디포일 아미다제와 접촉시킴으로써 아디포일 측쇄를 제거하고 7-ACA 생성물을 형성시킨 후 이 생성물을 분리하는 단계를 포함하는, 7-아미노 세팔로스포란산(7-ACA)을 제조하는 신규한 생물학적 공정에 관한 것이다.

본원 중 사용된 용어는 하기 의미를 나타낸다 :

"7-ACA"는 3-[(아세토일옥시)-메틸]-7-아미노-8-옥소-5-티아-1-아자비사이클로[4.2.0]옥트-2-엔-2-카복실산을 의미하고; "아디포일-6-APA"는 [2S-(2α, 5α, 6β)]-3,3-디메틸-7-옥소-6-[(헥산-1,6-디오일)아미노]-4-티아-1-아자비사이클로[3.2.0]헵탄-2-카복실산을 의미하며; "아디포일-7-ADCA"는 3-메틸-7-[(헥산-1,6-디오일)아미노]-3-메틸-8-옥소-5-티아-1-아자비사이클로[4.2.0]-옥트-2-엔-2-카복실산을 의미하고; "아디 포일-7-ADAC"는 3-하이드록시메틸-7-[(헥산-1,6-디오일)아미노]-3-메틸-8-옥소-5-티아-1-아자비사이클로[4.2.0]옥트-2-엔-2-카복실산을 의미한다.

특히, 본 발명은, 아디페이트 영양원액이 이나트륨 아디페이트이고, 엑스팬다제 효소, 하이드록실라제 효소 및 아세틸 트랜스퍼라제 효소의 활성을 암호화하는 DNA를 모두 세팔로스포리움 아크레모니움(Cephalosporium acremonium)으로부터 수득하며, 아디포일 아실라제를 슈도모나스 종으로부터 수득하는, 상기 7-아미노데아세틸 세팔로스포란산(7-ADAC) 및 7-아미노 세팔로스포란산(7-ACA)을 제조하는 신규한 생물학적 공정에 관한 것이다.

본 발명은 추가로, 세팔로스포리움 아크레모니움으로부터 유도된 엑스팬다제, 하이드록실라제 및 아세틸트랜스퍼라제 효소의 활성을 암호화하는 DNA, 및 상기 효소를 암호화하는 유전자 발현을 추진시키는 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 발현 벡터에 관한 것으로서, 하기 기술할 플라스미드 pPEN/CEPH-1, pPENCACT 및 pTS-8을 특징으로 한다.

본 발명은 추가로, 세팔로스포리움 아크레모니움으로부터 수득된 엑스팬다제, 하이드록실라제 및 아세틸트랜스퍼라제 효소의 활성을 암호화하는 DNA 및 페니실리움 크리소게늄 IPNS 유전자의 프로모터를 특징으로 하는 상기 효소-암호화 DNA 발현을 추진하는 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 발현 벡터로 형질 전환된 페니실리움 크리소게늄 숙주 세포에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 하기 기술하게 될 플라스미드 pPEN/CEPH-1, pPEN CACT 및 pTS-8을 포함하는 재조합 DNA 발현 벡터로 형질전환된 페니실리움 크리소게늄 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명은 추가로, 유전자 발현에 적합한 조건하에 재조합 페니실리움 크리소게늄 숙주 세포를 배양하는 방법에 관한 것으로, 상기 재조합 숙주 세포는 세팔로스포리움 아크레모니움으로부터 유도된 엑스팬다제, 하이드록실라제 및 아세틸트랜스퍼라제 효소의 활성을 암호화하는 DNA 및 페니실리움 크리소게늄 IPNS 유전자의 프로모터를 특징으로 하는 상기 효소-암모화 DNA의 발현을 추진하는 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 발현 벡터를 포함한다. 특히, 본 발명은 유전자 발현에 적합한 조건하에 재조합 페니실리움 크리소게늄 숙주 세포를 배양하는 방법에 관한 것으로, 이때 상기 재조합 숙주 세포는, 하기 기술할 플라스미드 pPEN/CEPH-1, pPen CACT 및 pTS-8을 포함하는 재조합 DNA 발현 벡터를 포함한다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명의 주요 양상은 하기 구조식으로 표현될 수 있는, 합성 시판 세팔로스포린 제조에 있어서의 중요한 중간체인 7-아미노 세팔로스포란산(7-ACA) 및 7-아미노데아세틸 세팔로스포란산(7-ADAC)를 제조하는 신규한 생물학적 공정에 있다.

세팔로스포린 핵 이외에, 7-ACA의 구분되는 특성은 7-아미노 그룹 및 3-아세틸옥시메틸(또는 보다 빈번하게 언급되는 바로 3-아세톡시메틸) 그룹이다. 7-아미노 그룹은 다수의 유도화 측쇄로 전환될 수 있는 그룹으로서, 다양한 시판 세팔로스 포린 합성의 기초를 형성한다. 3-아세틸옥시메틸 그룹은 시판 세팔로스포린을 합성하기 위하여 몇몇 다른 측쇄로 종종 전환된다.

본 발명의 방법의 7-ACA 최종 생성물 및 아디포일-7-ACA 중간체 생성물은, 하기 구조식으로 표현될 수 있는 또 다른 중요한 세팔로스포린 중간체인 세팔로스포린 C와 비교될 수 있다.

이 중간체에 있어서, 7-(D)-α-아미노아디포일 측쇄는 추가의 합성 유도체화에 있어 허용되지 않고, 절단되어야 허용 가능한 7-아미노 그룹이 수득된다. 불행하게도, 7-(D)-α-아미노아디포일 측쇄는 화학적 또는 생화학적 방법에 의해서도 항상 제거하기 어려운 것으로 입증되었다.

[정의]

본 명세서 및 특히 바람직한 양태의 기술 제하의 섹션에서, 하기 용어는 지시된 의미를 나타낸다.

[페니실리움 크리소게늄 배양]

본 발명의 방법의 첫 번째 단계는, 이소페니실린 N을 생산하는 페니실리움 크리소게늄 균주의 생장을 지속시킬 수 있는 배지중에 이를 유지시키고, 상기 배지에 상기 균주에 의해 동화되고 이용될 수 있는 하나 이상의 아디프산 또는 이의 염 및 에스테르를 포함하는 아디페이트 영양원액을 가하여 아디포일-6-APA를 생산하는 단계를 특징으로 한다. 아디페이트 영양원액은 피.크리소게늄으로 접종한 후 배지에 가해질 수도 있으나, 접종이 일어나는 시기에 배지에 이미 존재하는 것이 바람직하다.

페니실리움 이외의 속, 예를 들면 아스퍼질러스 나이둘란스 및 크리소게늄종 이외의 페니실리움 속의 기타 종도 이소페니실린 N을 생산한다. 하지만, 종래 이소페니실린 N의 최고 생산 균주는 크리소게늄 종으로부터 널리 공지된 균주 향상 기술에 의해 개발되어 왔다. 그 후, 실제적인 문제로서, 비록 기타 종에 대한 그의 적용성이 명백함에도 불구하고, 본 발명은 페니실리움 크리소게늄 균주에 제한되어 왔다. 특정한 기탁된 페니실리움 크리소게늄 균주 또는 이러한 균주의 기타 공개적으로 입수 가능한 공급원이 본 발명의 방법을 수행하는데 있어서 적합한 출발점이 된다.

이소페니실린 N을 생산하는 페니실리움 크리소게늄 균주의 생장을 지속시킬 수 있는 배지는 당해 분야의 통상의 숙련가에게 용이하게 친숙한 유형의 배지이다. 예를 들면, 배양은 침수 호기성 발효 방법으로 수행될 수 있고, 사용 배지는 다수의 유용한 적합한 배지로부터 선택될 수 있다. 일반적인 배지는 슈크로스, 글루코스 및 전분 같은 탄소원; 콩 곡분 및 그릿(grit), 면실유, 땅콩 곡분 및 다양한 아미노산, 이의 혼합물 및 펩톤 같은 질소원을 사용한다. 생산 요구성은 수율 및 분리 용이성을 강조함으로써, 이러한 상황에 있어 바람직한 배지는 탄소원으로서 당밀 및 질소원으로서 콩 곡분 및 아미노산일 수 있다.

영양 무기염을 배지에 일반적으로 가하는데, 여기에는 하기 이온성 성분을 공급할 수 있는 염을 포함한다: 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 인산염, 황산염, 염화물, 브롬 화물, 질산염, 탄산염, 제이철염, 제일철염, 마그네슘, 망간등. 미량 원소는 또한 페니실리움 크리소게늄의 생장, 발달 및 대사에 통상 필수적이며, 이미 필수적으로 기타 배지 성분의 오염물로서 공급되지 않는 한 배지로 직접 가할 수 있다.

페니실리움 크리소게늄 균주는, 단지 소량의 아디포일-7-ACA 및 최종적으로 7-ACA를 생산하는데 바람직한 1ℓ 진탕 플라스크와 같은 소용량 장치내에서 배양할 수 있다. 하지만, 보다 대량의 아디포일-7-ACA가 바람직한 경우, 침수 호기성 발효 조건하의 대규모 발효 탱크가 사용된다.

아디포일-7-ACA의 대규모 제조를 수행하는데 있어, 페니실리움 크리소게늄 균주의 포자를 사면 한천 상에서 유지시킨다. 사면 한천으로부터의 포자를 사용하여 소용량 증식 배지를 접종시킨다. 증식 배지를 배양하여 미생물의 고밀도, 신선한, 활성 생장 배양물을 제조한다. 그런 다음 이러한 증식 생장물을 대규모 발효 배지에 대한 접종물로서 사용한다. 특정한 경우 발효 배지에 대한 접종물과 같은 또다른 증식 배지를 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 두 번째 단계의 증식 배지는, 발효 배지 용량이 첫 번째 증식 배지보다 상당히 대형인 경우 일반적으로 사용된다. 이러한 방식으로, 미생물 포자를 처음에는 소용량의 증식 배지에서 배양하여 보다 큰 용량의 증식 배지에 대한 접종물을 수득한다. 그런 다음 보다 큰 용량의 증식 배지는 대규모 발효 탱크에서 발효를 신속하게 개시하기에 충분한 농도의 미생물을 공급한다. 증식 배지는 발효 배지와 동일한 조성을 갖거나 소규모로 미생물 생장 및 발달을 촉진시킬 추가 성분을 함유할 수도 있다.

본 발명의 방법 중 사용되는 페니실리움 크리소게늄 균주는 약 20 내지 30℃의 온도에서 가장 효율적으로 배양할 수 있으나, 최적 수율은 약 22 내지 28℃, 바람직하게는 약 25℃에서 수득된다.

아디포일-7-ACA의 최대 생산은 페니실리움 크리소게늄 균주를 대규모 탱크 내에서 약 10 내지 약 30일, 바람직하게는 15 내지 25일간 배양하는 경우 이루어진다. 하지만, 250ml 진탕 플라스크와 같은 소규모 기구내에서 배양하는 경우, 미생물 생장은 보다 가속되어 보다 단시간내에, 예를 들면 4 내지 15일, 종종 5 내지 7일 이내에 아디포일-7-ACA를 생산하게 된다.

대규모 발효 탱크내의 최종 pH가 8.0 이상에 도달하는 경우, 아디포일-7-ACA의 수율은 역으로 영향받을 수 있다. 이러한 상황에 있어, 발효내내 배양 배지의 pH를 모니터하는 것이 바람직하다. 아디포일-7-ACA의 최대 생산이 이루어지기에 앞서 pH가 상기 수준에 도달하는 경우, 발효 배지에 적합한 산 또는 완충제를 가함으로써 pH를 하향 조절할 수 있다.

아디포일-7-ACA 생산 이후 발효 브로쓰(broth)의 샘플을 크로마토그래피에 의해 시험할 수 있다.

대부분의 침수 호기성 발효에서와 같이, 멸균 공기를 배양 배지에 통과시켜 페니실리움 크리소게늄 균주의 보다 효율적 생장이 이루어지도록 하고 아디포일-7-ACA 생산을 증가시킨다. 배지를 통한 강제 통풍 용량은 배지 용량당 매분 공기 약 0.2 용적 이상이다. 하지만, 증가된 공기 통과 속도는 아디포일-7-ACA 생산에 이로운 효과를 나타낼 수 있다.

페니실리움 크리소게늄 균주는 일반적으로 아디포일-7-ACA 이외에 다수의 부생성물 및 대사물을 생산한다. 이중 일부는 산 불안정하기 때문에, 발효 배지로부터 아디포일-7-ACA를 회수하는데 있어서 전체 발효 브로쓰를 산성 pH에서 단시간 처리하여 일부 공동 생산된 불순물을 파괴하는 것이 바람직하다. 아디포일-7-ACA 발효 생성물을 이와 같이 처리한 여과된 발효 브로쓰로부터 회수하고 임의로 이온 교환 수지상에서 크로마토그래피에 의해 발효 배지의 다른 성분으로부터 분리할 수 있으며, 필요한 경우 연속적인 아디포일 측쇄의 효소적 절단 단계 이전에 크로마토그래피에 의해 추가로 정제시킬 수 있다. 측쇄 절단을 수행한 후 이러한 이온 교환 크로마토그래피 분리를 수행할 수도 있다. 분리 문제를 나타내는 주요 부 생성물중 하나는 아디포일-6-APA로서, 좀더 수월하게 분리시키기 위하여 이러한 부생성물을 화학적으로 또는 효소적으로 분해할 수 있다. 먼저, 여과된 발효 브로쓰를 예비 정제 공정을 거쳐, 먼저 물 불혼화성 유기 용매(예 : n-부탄올 또는 아밀 아세테이트)로 추출하여 불순물을 제거한다. 그런 다음 추출한 브로쓸 활성 탄소 상에서 크로마토그래피하여 예비적 방식으로 추가로 정제할 수 있다.

[아디페이트 영양원액의 부가]

바람직하게는, 페니실리움 크리소게늄에 대한 발효 배양을 상기와 같이 수행하는 시점에서, 즉 접종 이전에, 아디페이트 영양원액을 발효 배양 배지의 기타 성분에 가한다. 임의로, 아디페이트 영양원액은 접종 후 특정 시기에 가할 수 있다(예 : 접종 후 1,2 및/또는 3일). 아디페이트 영양원액은 하나 이상의 아디프산, 또는 아디프산의 염 또는 에스테르로서, 이들은 배양된 페니실리움 크리소게늄 균주에 의해 동화되고 이용되어 아디포일-6-APA가 생산된다. 아디프산, 염 및 에스테르는 단독으로 또는 어떠한 배합물로서 사용될 수 있다. 칼륨염 및 나트륨과의 혼합염 또는 적합하지만 이나트륨 염이 바람직하다. 메틸 에스테르를 사용할 수 있으나, 에틸 에스테르는 불수용성이다. 아디프산염 또는 에스테르는 아디포일-6-APA를 생산하기 위하여 페니실리움 크리소게늄 균주에 의해 동화 및 이용될 수 있어야 한다. 예를 들면, 아디프산 자체가 적합할 수 있으며 그것이 불수용성일지라도, 적합한 pH 조건인 경우 동화성 염이 형성된다.

[적합한 엑스팬다제 및/또는 하이드록실라제 효소]

아디포일-6-APA를 생산하도록 상기한 바와 같이 아디페이트 영양원액과 함께 제공되어 배양되는 페니실리움 크리소게늄 균주는 또한 엑스팬다제 및 하이드록실라제 효소의 활성을 암호화하는 DNA에 의해 형질전환된 균주로서, 이의 발현 결과, 상기 아디포일-6-APA를 동일계 환 연장시켜 아디포일-7-ADCA를 형성시키고, 3-메틸 측쇄를 또한 3-하이드록시메틸로 전환시킨다.

아디포일-6-APA는 아디페이트 영양원액 배양된 페니실리움 크리소게늄에 의해 세포내에서 생산된다. 그러한 세포내 셋팅(setting)에 있어서, 즉 동일계 기초로, 형질전환된 페니실리움 크리소게늄은 엑스팬다제 및 하이드록실라제 효소 활성을 암호화하는 DNA를 발현하는데, 상기 효소는 기질인 아디포일-6-APA 상에 작용하여, 이를 환-연장시켜 아디포일-7-ADCA를 형성시킨 다음, 아디포일-7-ADAC(아디포일-7-아미노데아세틸 세팔로스포란산)으로 하이드록실화시킨다.

본 발명의 신규한 생물학적 공정은 본원의 영역내에 상기 타입의 페니실리움 크리소게늄 균주의 엑스팬다제 및 하이드록실라제 효소 활성 암호화 DNA로의 형질 전환체를 포함하는데, 이들의 발현 결과로서, 아디포일-6-APA를 동일계 환 연장시켜 아디포일-7-ADCA를 형성시킨 다음, 하이드록실화시켜 아디포일-7-ADAC을 형성시킨다. 따라서, 페니실리움 크리소게늄을 형질 전환시킨 DNA는 당해 분야에서 인지되는 바와 같은 엑스팬다제 효소 활성, 예를 들면 이소페니실린 N을 DAOC로 환 연장시키는 능력뿐만 아니라, 아디포일-6-APA를 아디포일-7-ADCA로 환 연장시키는 능력을 갖는 효소를 발현시켜야 한다. 추가로, 하이드록실라제 효소는 아디포일-7-ADCA를 아디포일-7-ADAC로 하이드록실화시킬 수 있어야 한다.

두 가지 대안적 접근은 엑스팬다제 및 하이드록실라제 효소 활성이 제공되는 방식에 대해 본 발명의 영역 내에서 적합한 양태인 것으로 간주된다. 바람직한 하나의 양태에 있어, 엑스팬다제 및 하이드록실라제 기능은 피.크리소게늄을 형질전환시키는, 단일(필수적으로는 이작용성이지만) 세팔로스포리움 아크레모니움의 유전자에 의해 발현되는 활성에 의해 성취된다. 엑스팬다제 및 하이드록실라제 활성 모두를 함께 발현시키는 이러한 유전자는 엑스팬다제/하이드록실라제 유전자로서 언급되며, 그의 유전자 생성물은 엑스팬다제/하이드록실라제 효소(들)로서 언급된다. 일반적으로, 피.크리소게늄을 엑스팬다제/하이드록실라제 활성을 암호화하는 씨.아크레모니움으로부터의 DNA로 형질전환시키는 경우, 이러한 활성의 발현은 단일 프로모터 서열에 의해 조절되어지고, 이는 단일 유전자의 존재를 나타내는 것이다.

동일하게 적합한 본 발명의 또 다른 대안적 양태는, 단일 엑스팬다제/하이드록실라제 유전자와는 상반되게, 각각의 유전자로서 엑스팬다제 및 하이드록실라제 활성을 암호화하는 DNA로 피.크리소게늄 숙주를 형질전환시키는 것을 포함한다. 각각의 엑스팬다제 및 하이드록실라제 유전자 및 이들이 암호화하는 상응하는 효소적 활성은, 상기 관찰된 바와 같은 단일 엑스팬다제/하이드록실라제 유전자 및 효소를 암호화하는 씨.아크레모니움 같은 진핵성 미생물에서 보다는 에스. 클라불리게 루스 같은 원핵성 미생물에서 발견됨을 주시해야 한다.

원핵성 하이드록실라제 효소 및 이를 암호화하는 뉴클레오타이드의 서열은 이 효소를 분리하는 수단과 함께 문헌[참조 : Kovacevic, et al., J. Bacteriol., 173(1), 398-400(1991) and EP-A-0 465 189]에 기술되어 있다. 당해 분야의 숙련가는 하이드록실라제의 서열로부터 널리 공지된 수동 방법 또는 자동화 DNA 합성기에 의해 하이드록실라제 효소를 암호화하는 DNA를 합성할 수 있음을 인지하게 될 것이다. 하이드록실라제의 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 화합물 또는 또 다른 서열, 또는 동등한 하이드록실라제 활성을 갖는 이의 단면 또는 유도체를 계속하여, 프로모터 및 기타 조절 서열과 혼합하는 경우 다양한 클로닝 및 발현 벡터를 제조하는 기초로서 사용할 수 있고, 이로써 피. 크리소게늄 숙주를 형질전환시켜 하이드록실라제 효소를 발현시킴으로써 본 발명의 방법을 수행할 수 있다. 또한, 내재적으로 유용한 하이드록실라제 효소를 함유하는 후보 균주의 게놈 라이브러리를 스크리닝하기 위한 프로브로서 DNA 화합물을 사용하여 하이브리드화에 의한 상동성 서열을 동정할 수도 있다. 이와 같이 동정된 특정한 추정적 하이드록실라제의 활성을 본 발명의 방법 중의 실질적인 아디포일-7-ADCA 기질을 사용하여 HPLC에 의해 그의 하이드록실화 생성물을 분리함으로써 확인할 수 있다.

이러한 본 발명의 양태 즉, 하이드록실라제 활성만을 발현하는 단일 유전자를 사용하는 경우, 엑스팬다제 기능의 동일계 발현을 허용하여 본 발명의 방법중의 환 연장 단계를 제공하는 적합한 발현 벡터에 의해 피.크리소게늄을 형질 전환시킬 수 있도록, 엑스팬다제 효소의 활성을 암호화하는 DNA를 별도로 제공할 필요가 있다. 다수의 엑스팬다제 효소가 공지되어 있으며, 측쇄 유사성을 기초로 하여, 다수의 엑스팬다제 효소가 본 발명의 신규한 생물학적 공정에서 기능을 발화할 수 있다는 것을 인지할 수 있다.

본 발명의 기타 유용한 양태는 하나 이상의 엑스팬다제 및/또는 하나 이상의 하이드록실라제 활성을 암호화하는 DNA를 사용하여 비-재조합 피.크리소게늄 균주를 형질 전환시킬 수 있다는 사실을 근거로 한다. 이와 같은 양태로, 발현되는 효소 단백질의 증가된 양으로 인해 향상된 엑스팬다제 및/또는 하이드록실라제 활성을 수득할 수 있다.

선행 분야를 기술하는 섹션하에서는, 스트렙토마이세스 클라불리게루스 ATCC 27064로부터 수득된 엑스팬다제 효소가 완전히 서열 분석되어 엔도뉴클레아제 제한지도화에 의해 특성이 결정되었다. 하지만, 에스.클라불리게루스 NRRL 3585로부터 수득된 동일 효소인 것으로 보이는 효소는 상이한 분자량을 갖는 것으로 보고된 바 있으나 서열분석 되지는 않았다. 또한, 선행 분야를 다루는 섹션에 기술된 바와 같이, 세팔로스포리움 아크레모니움 ATCC 11550으로부터의 DAOCS/DACS 효소가 서열 분석되었다[참조 : Samson et al., Bio/Technology (1987) 5 : 1207-1214 및 EP-A-0 281 391].

이미 선행 분야에서 동정된 이들 엑스팬다제 효소는 본 발명의 신규한 생물학적 공정에 있어 유용하다. 에스. 클라불리게루스 또는 씨. 아크레모니움 같은 상이한 균주 또는 상이한 속의 미생물로부터 유도된 아직 동정되지 않은 기타 엑스팬다제 효소 또한 본 발명의 신규한 생물학적 공정을 수행하기에 적합한 것으로 밝혀졌다. 이와 같은 신규한 균주 및 유용한 미생물 속의 동정 방법 및 추정적 엑스팬다제 효소 분리 방법 및 이들이 본 발명의 방법에 사용하기에 적합하다는 설정은 정확한 것이고 당해업자의 기술 영역 내에 있다. 후보 신규 균주 및 유용한 미생물 속의 세포-유리된 추출물의 스크리닝은, 제일철(Fe²⁺) 이온, 아스코르베이트, α-케토글루타레이트 및 아데노신 트리포스페이트(ATP)를 포함한 공지의 DAOCS 보조인자 존재하에 상기 추출물을 아디포일-6-APA 기질에 가함으로써 신뢰적이고 재현 가능한 방식으로 수행될 수 있다. 아디포일-6-APA는 하기 좀더 세부적으로 기술하는 바와 유사한 방식으로 아디페이트 영양원액을 비형질전환된 페니실리움 크리소게늄에 공급함으로써 충분한 양으로 생산할 수 있다. 아디포일-7-ADCA 및/또는 아디포일-7-ADAC가 형성되는 경우 목적하는 엑스팬다제(또는 엑스팬다제/하이드록실라제) 효소가 존재하는데, 그의 존재는 크로마토그래피에 의해 검출할 수 있다.

또한, 널리 공지된 재조합 기술을 사용하여, 에스. 클라불리게루스 및 씨.아크레모니움으로부터의 엑스팬다제 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 기초로 하여, DNA 프로브를 생성시킬 수 있고, 예를 들면, 본 발명의 방법중 사용하기에 적합한 엑스팬다제를 생산하는 것 같은 후보 미생물의 DNA 내용물을 스크리닝할 수 있다.

[엑스팬다제, 하이드록실라제 및 엑스팬다제/하이드록실라제 효소의 잠재적 공급원]

이미 주시된 바와 같이, 엑스팬다제 효소는 펜암 환 구조(페니실린 타입 분자에서 발견)의 세프-3-엠 환(세팔로스포린에서 발견)으로의 연장을 촉매하는 효소이다. 따라서, 세펨 환을 함유하는 대사물을 생산하는 어떠한 유기체도 엑스팬다제-암호화 DNA에 대한 잠재적 공급원이 된다. 마찬가지로, 3-하이드록시메틸 그룹을 함유하는 세팔로스포린을 생산하는 어떠한 유기체도 하이드록실라제-(또는 엑스팬다제/하이드록실라제-) 암호화 DNA의 잠재적 공급원이다. 이들 유기체의 실시예가 하기에 열거되어 있으나 이들은 예시에 불과하며 이로써 제한되지는 않는다 :

진균류

세팔로스포리움 아크레모니움(Cephalosporium acremonium)

세팔로스포리움종

에메리셀롭시스(Emericellopsis)

패실로마이세스(Paecilomyces)

스코풀라리옵시스(Scopulariopsis)

디헤테로스포라(Diheterospora)

스피로이디움(Spiroidium)

아녹시옵시스(Anoxiopsis)

방선균류

스트렙토마이세스 클라불리게루스(Streptomyces clavuligerus)

에스. 리프마니(S. lipmanii)

에스. 와다야멘시스(S. wadayamensis)

에스. 토도로미넨시스(S. todorominensis)

에스. 필리피넨시스 세파미시니(S. filipinensis cephamycini)

에스. 헤테로모르푸스(S. heteromorphus)

에스. 파나엔시스(S. panayensis)

에스. 그리세우스(S. griseus)

에스. 카틀레야(S. cattleya)

노카르디아 락탐듀란스(Nocardia lactamdurans)

기타세균

플라보박테리움종(Flavobacterium sp.)

알칼리게네스 데니트리피칸스(Alcaligenes denitrificans)

마이코플라나 불라타(Mycoplana bullata)

프로비덴시아 레트게리(Providencia rettgeri)

라이소박터 락탐게누스(Lysobacter lactamgenus)

상기 열거한 미생물의 엑스팬다제 및 하이드록실라제는 단순히 추가 연구를 위한 후보로서, 이들 모두 본 발명의 신규한 공정에 있어 적합한 것은 아니다.

[엑스팬다제 활성을 암호화하는 DNA 단편의 분리]

목적하는 엑스팬다제 효소의 존재를 상술한 방식으로 검출하는 경우, 엑스팬다제 효소 활성을 암호화하는 DNA 분리 방법 또한 직접적이고 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 엑스팬다제 효소를 암호화하는 유전자의 공지 서열 및 부분 서열을 기본으로 하는 DNA 프로브를 제작하면 이는 분리코자 하는 목적하는 효소-암호화 DNA에 하이브리드화 한다. 이러한 프로브의 작제는 엑스팬다제 효소를 암호화하는 아미노산 및 뉴클레오타이드 염기 서열의 정보 및 관련된 특정 미생물의 코돈 선호도를 기본으로 한다. 스트렙토마이세스 클라불리게루스 ATCC 27064의 게놈 DNA에 적용되는 이러한 타입의 일반적 방법에 대한 세부적인 기술이 하기에 좀더 설명되고 있다.

엑스팬다제 효소 활성을 암호화하는 DNA의 분리는 재조합 DNA 기술에 있어 널리 공지된 제한 및 연결 방법을 사용하여 성취된다. 적절한 제한 단편이 제조되고 분리될 수 있도록 관련된 미생물 게놈의 엔도뉴클레아제 제한 지도를 갖는 것이 필요하다. 에스. 클라불리게루스 및 씨. 아크레모니움에 대한 제한 지도는 이미 입수 가능하다; 따라서, 전자에 있어서, 제한 효소 BanHI 및 Sall을 사용하여 전기 영동함으로써 목적하는 1.8 내지 2.2kb 크기의 단편을 제공한다.

[아세틸트랜스퍼라제 효소의 공급원 및 이러한 활성을 암호화하는 DNA 단편 분리]

씨. 아크레모니움 DAC 아세틸트랜스퍼라제 유전자의 클로닝은, 하기에 바로 기술될 당해 분야에 널리 공지된 재조합 기술에 따라 수행할 수 있다.

아세틸트랜스퍼라제 유전자를 클로닝하기 위하여, 데아세틸세팔로스포란산(DAC)을 세팔로스포린 C로 전환시키는 능력이 결여된 씨. 아크레모니움의 돌연변이체를 먼저 생성시켜야 한다. 이러한 방법은 씨.아크레모니움 세포를 N-니트로소구아니딘(NTG), 아질산 또는 자외선 광선과 같은 돌연변이원에 노출시키고 적합한 생장 배지 상에서 회수한 후 크로마토그래피 또는 생물학적 수단에 의해 DAC 축적에 대해 검정한다.

적합한 돌연변이체의 동정에 있어 아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자를 동정하는 다음 단계는 세팔로스포린 C 생산 균주로부터 씨.아크레모니움 DNA의 분리이다. 제한 엔도뉴클레아제 또는 기계적 전단에 의해 적합한 크기의 단편으로 절단된 후, 이를 하이그로마이신 또는 플레오마이신 내성같은 적합한 우성 마커 유전자를 또한 함유하는 플라스미드 또는 코스미드, 형질전환 벡터로 혼입시킨다. 벡터는 또한 삽입된 DNA의 연속적 회수를 용이하게 하는 DNA 서열, 예를 들면, 시험관내 패키징(packaging) 이후, 이.콜라이 감염시켜 클로닝된 DNA를 획득할 수 있도록 해주는 λ(파지) cos 부위를 함유해야 하는데, 이는 우수하게 확립된 방법으로 수행할 수 있다.

그런 다음, 아세틸트랜스퍼라제-결여 돌연변이체 균주의 원형질체를 항생제 내성을 기본으로 하여 선택된 형질전환체 및 게놈 DNA의 무작위 단편을 함유하는 벡터를 사용하여 형질전환시킨다. 그런 다음 형질전환체를 세팔로스포린 C 생산 복구에 대해 검정할 수 있는데, 이는 벡터-함유 아세틸트랜스퍼라제 유전자에 의한 성공적 보상을 나타내는 것이다. 그후 클로닝된 유전자 복사체를 함유하는 것으로 추정되는 돌연변이체를 생장시키고, 이들의 DNA를 분리한 후 상기 방법에 의해 벡터 DNA를 회수한다. 벡터가 실제로 아세틸트랜스퍼라제 유전자를 함유한다는 검증은, 표준 방법 및 용이하게 입수 가능한 벡터를 사용하여 이.콜라 이내로 서브클로닝한 후 아세틸트랜스퍼라제 결여된 돌연변이체를 재형질 전환시켜 이루어진다. 그런 다음, 분자 유전학 분야의 통상의 숙련가에 의해 일상적으로 사용되는 기술을 이용하여 본원 실시예중 기술된 바와 같이 유전자를 분리하고, 서열을 분석한 후 조작한다.

또한 당해 분야에 널리 공지된 대안적 방법에 따라, 마쓰다(Matsuda) 등은 씨.아크레모니움의 아세틸트랜스퍼라제 활성을 암호화하는 유전자, 및 효소 자체의 추론된 아미노산 서열을 분리 및 서열분석 하였다[참조 : 유럽 특허원 제0 450 758호]. 이들 대안적 방법은, 아세틸트랜스퍼라제 효소의 분리, N-말단 아미노산의 서열분석 및 이들 정보로부터 이러한 효소 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드서열의 추론으로 이루어진다. 이러한 정보로부터 다시, 완전한 암호화 서열에 하이브리드화하는 프로브를 형성시켜, 이의 분리를 가능케 한다.

[페니실리움 크리소게늄 균주의 형질전환]

엑스팬다제/하이드록실라제, 엑스팬다제 및 하이드록실라제, 및 아세틸트랜스퍼라제 활성을 암호화하는 DNA 단편을 수득하게 되면, 프로모터, 해독 활성화 서열, 내성 마커, 조절 서열, 코스미드 형성체 및 유전자 생성물의 형질전환을 허용하거나 촉진시키며, 이의 발현을 추진시키고, 형질전환체 분리를 용이하게 하는 기타 다른 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편과 함께, 플라스미드 또는 기타 발현 벡터내로 삽입(연결)시킬 수 있다. 그런 다음, 이와 같이 작제된 발현 벡터를 사용하여 페니실리움 크리소게늄 균주의 형질전환 및 엑스팬다제/하이드록실라제, 엑스팬다제 및 하이드록실라제, 및 아세틸트랜스퍼라제 효소의 활성을 세포내 발현시킨다. 형질전환 및 발현을 이루기 위해 사용한 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 이러한 일반적인 방법의 세부적인 기술이 하기에 좀더 설명되어 있다.

이미 상기에서 좀더 세부적으로 기술한 바와 같이, 형질전환된 페니실리움 크리소게늄 균주는 엑스팬다제/하이드록실라제, 엑스팬다제 및 하이드록실라제, 및 아세틸트랜스퍼라제 효소의 활성을 세포내에서 발현시켜 아디포일-6-APA 기질상에서 각각 동일계 작용하도록 하여 이를 아디포일-7-ADCA로 환-연장시키고 나서 다시 l아디포일-7-ADCA로 하이드록실화시킨 다음, 아디포일-7-ACA로 아세틸화시킨다.

[신규한 형질전환체]

본 발명의 바람직한 양태인 엑스팬다제/하이드록실라제, 엑스팬다제 하이드록실라제와 아세틸트랜스퍼라제 유전자에 의해 암호화되는 활성을 발현하는 특이 페니실리움 크리소게늄 형질전환체는 선행 분야[예 : Cantwell et al. (1990) Current Genetics, 17, 213-221, EP-A-0 281 391, and EP-A-0 437 378]에서의 유사한 작제물과 관련하여 신규하다. 칸트웰(Cantwell) 작제물은 피.크리소게늄 이소페니실린 N 합성효소(IPNS) 프로모터의 조절하에 위치한 스트렙토마이세스 클라불리게루스 엑스팬다제 유전자를 가지므로, 하이드록실라제 또는 아세틸트랜스퍼라제 활성을 암호화하는 특정한 DNA가 결여되었다는 점에서 본 발명의 작제물과 상이하다.

인골리아(Ingolia) 등은 유럽 특허원 제 0 281 391호에서 그의 발현이 페니실리움 IPNS 프로모터에 의해 추진되는 씨. 아크레모니움 엑스팬다제/하이드록실라제 이작용성 효소를 암호화하는 DNA를 함유하는 피. 크리소게늄 형질전환 벡터를 기술하고 있다. 이들 작제물중 하나(pPS62)에서, 엑스팬다제/하이드록실라제 유전자를 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자의 하부에 프레임이 일치되게 융합시킨다. 이러한 유전자 생성물인 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 엑스팬다제/하이드록실라제 융합 단백질은 씨. 아크레모니움에서 생산된 것과 본질적으로 동일한 엑스팬다제/하이드록실라제 효소인 본 발명의 생성물과 상이하다. 유럽 특허원 제0 281 391호에 기술된 기타 벡터는, 합성 DNA 링커를 사용함을 포함하여, 광범위한 일련의 분자 조작을 통해 작게된다. 최종 작제물(pPS61)은 엑스팬다제/하이드록실라제 유전자를 발현시키기 위한 페니실리움 IPNS 프로모터의 1.2kb NcoI 단편 및 페니실리움의 형질전환체에 대한 선별 마커로서 아스퍼질러스 나이듈란스 아세트아미다제 유전자를 이용한다. 각각 아르기닌 및 류신을 암호화하는, 엑스팬다제/하이드록실라제 유전자중의 9 및 10번 코돈 서열은 CGTCTC에서 CGCCTA로 변하지만, 이는 암호화된 아미노산 서열을 변화시키진 않는다.

본 발명의 작제물에서, 1.2kb NcoI IPNS 프로모터 단편을 천연 엑스팬다제/하이드록실라제 유전자 서열을 변화시키지 않고 엑스팬다제/하이드록실라제 유전자로 융합시킨다. 본 발명의 작제물에 사용하는 IPNS 프로모터는 천연 프로모터에 대해 별개의 4염기 중복체를 2개 갖는데, 하나는 ATG 출발 코돈의 760bp 상부 SalI 부위에, 다른 하나는 출발 코돈의 5bp 상부로서 5´ 비해독 리더 서열 내부의 XbaI 부위에 존재한다. 이들 변화는 엑스팬다제/하이드록실라제 유전자의 고수준 발현에 영향을 주지 않는다.

벡터에서의 추가의 상이점은 사용된 선별 마커에 있다. 유럽 특허원 제0 281 391호에 기술된 이들 작제물은 선별 마커로서 아세트아미다제 및 하이그로마이신을 사용한다. 이는 플레오마이신 내성 마커를 함유하는 본 발명에서 사용되는 엑스팬다제/하이드록실라제 페니실리움 형질전환 벡터(pPEN/CEPH-1)와 상반된다. 벡터 pPEN/CEPH-1으로 형질전환되어 엑스팬다제/하이드록실라제 활성을 발현할 수 있는 페니실리움 크리소게늄 균주를 PC 200으로 동정한다. 이의 분류학상 특성은 일반적으로, 청록 내지 녹색, 매끄럽고 평탄한 황색 소적(drop)의, 광범위하게 분포된 콜로니 생산; 한천내로 확산; 모든 부분으로 브랜치(branch)화 된 원추형 헤드(head); 구저(globase) 길이 3-4㎛인 타원형 원추 형태를 포함한다. 피. 크리소게늄에 대한 허용 가능한 배양 조건은 1.5%(w/v) 일수화 락토오스; 0.5%(v/v) 옥수수 침지액; 0.5%(w/v) 펩톤; 0.4%(w/v) NaCl; 0.05%(w/v) MgSO₄-7H₂O; 0.06%(w/v) KH₂PO₄; 0.0005%(w/v) FeCl₃-6H₂O; 0.0002%(w/v) CuSO₄-5H₂O; 3.0%(w/v) 한천을 증류수 1ℓ(pH 4.8)에 포함하는 고형 배지를 사용한다. 상기한 PC 200으로 지정된 피. 크리소게늄은 미합중국 메릴랜드 20852 록크빌 파크로운 드라이브 12301의 의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)에 기탁번호 ATCC 74186으로 기탁되었다(기탁일 : 1992. 9. 22).

아디포일-7-ACA를 생산할 수 있는 본 발명의 두 번째 신규한 페니실리움 크리소게늄 형질전환체는 엑스팬다제/하이드록실라제 및 아세틸트랜스퍼라제 활성 모두를 암호화하는 DNA를 포함하는 단일 벡터(pTS-8)에 의해 형질전환되어 상기 효소 활성을 발현한다. 따라서, 이 벡터는 씨. 아크레모니움 아세틸 트랜스퍼라제만을 암호화하거나 또는 돌연변이체 엑스팬다제/하이드록실라제 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 함께 암호화하는 DNA를 포함하는, 유럽 특허원 제0 437 378호에 기술된 페니실리움 형질 전환 벡터와 상이하다. pTS-8 작제물의 경우, 엑스팬다제/하이드록실라제 및 아세틸트랜스퍼라제 유전자 발현은 각각 피.크리소게늄 IPNS 프로모터의 개별적 복사물에 의해 유도된다; IPNS 프로모터의 세 번째 복사물을 사용하여 선별 마커로서 사용된 플레오마이신 내성 유전자의 전사를 유도시킨다.

본 발명의 대안적 양태에 있어, 엑스팬다제/하이드록실라제 및 아세틸트랜스퍼라제 유전자는 각각의 벡터내로 혼입되어 연차적 방식으로 숙주 페니실리움 균주내로 도입될 수 있다. 엑스팬다제/하이드록실라제 및 아세틸트랜스퍼라제 효소 활성을 암호화하는 DNA 단편이 페니실리움 균주내로 도입되는 순서는 실제적인 관점에서만 중요하다. 바람직하게는, 엑스팬다제/하이드록실라제 유전자(들)를 사용한 페니실리움의 형질전환은 아세틸트랜스퍼라제 유전자의 삽입에 선행되어야 하는데, 왜냐하면 이것이 효소가 생체내에서 작용하는 순서이기 때문이다. 따라서, 엑스팬다제/하이드록실라제의 발현은 아디포일-7-ADAC 생산을 검정함으로써 모니터할 수 있다. 아디포일-7-ADAC는 아세틸트랜스퍼라제 효소의 기질로서, 연속적으로 도입된 아세틸트랜스퍼라제-암호화 유전자의 발현은 아디포일-7-ACA의 생산에 의해 지시된다. 아세틸트랜스퍼라제에 대한 적합한 시험관내 검정을 사용하여, 페니실리움을 먼저 아세틸트랜스퍼라제 유전자로 형질전환시켜 시험관내 검정으로 이의 발현을 확인한 다음, 계속하여 엑스팬다제/하이드록실라제 유전자를 도입할 수 있다. 따라서, 7-ACA 제조를 위한 어떠한 경로도 본 발명의 방법에 있어 적합한 양태가 될 수 있다.

하지만, 바람직한 양태는 씨. 아크레모니움의 엑스팬다제/하이드록실라제 및 아세틸트랜스퍼라제 활성을 암호화하는 DNA를 포함하는 단일 플라스미드 벡터의 작제를 통해 3가지 효소 활성이 모두 동시에 도입된 것이다. 이러한 단일 플라스미드 벡터(pTS-8)로 형질전환되어, 엑스팬다제/하이드록실라제 및 아세틸트랜스퍼라제 활성을 발현할 수 있는 페니실리움 크리소게늄 균주를 PC300으로 동정한다. 이의 분류학상 특성은 PC200에서 상기한 바와 동일하다. PC300에 대한 허용가능한 배양 조건은 상기 PC200에 대해 기술한 바와 동일하다. PC300으로 지정된 피.크리소게늄 균주는 메릴랜드 20852 록크빌 파크로운 드라이브 12301 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)에 기탁번호 ATCC 74187로 기탁되었다(기탁일 : 1991. 9. 22).

본 발명의 바람직한 양태인 에스. 클라불리게루스 엑스팬다제 유전자의 활성을 발현하는 벡터 pPenFTSO로 형질전환된 특이적 페니실리움 크리소게늄은 문헌[Cantwell et al. (1990) Current Genetic, 17, 213-221]에서의 작제물과 관련하여 신규한다. 양 작제물에서, 시험관내 돌연변이 유발에 의해 프로모터를 엑스팬다제 유전자에 연결시킨다. 칸트웰의 작제에서는, XbaI/NdeI 링커에 의해 IPNS 프로모터의 3´ 말단에서 XbaI 부위에 연결된 엑스팬다제 유전자의 ATG에 NdeI 부위를 유전자 조작으로 도입시킨다. 본 발명의 작제에서는 NcoI 부위를 엑스팬다제 유전자의 ATG에 생성시키고 IPNS 링커의 3´ 말단에 NcoI 부위를 연결시킨다. 이로써 이들 작제물에서 프로모터-유전자 결합부 부근에 하기 서열을 생성시킨다.

칸트웰 작제물에서는 C가 T로 대체된 반면, 본 발명의 작제물에서는 C가 유지된다; 따라서 ATG 출발 코돈과 바로 인접한 IPNS 프로모터의 서열은 천연발생 IPNS 유전자에서 발견되는 것과 정확히 일치한다. 비록 하나의 단일 뉴클레오타이드 염기만이 상이할지라도, 선행 분야의 프로모터는 해독 효율성이 저하되기 때문에 결국 저수준으로 엑스팬다제 유전자가 발현된다.

기타 상이성은 작제물중 포함되는 프로모터 또는 유전자의 영역내에 존재한다. 칸트웰 작물은 IPNS 프로모터의 5´ BamHI 내지 XbaI 3´ 영역을 함유하는 반면, 본 발명의 벡터는 프로모터의 5´ NcoI 내지 NcoI 3´ 영역을 함유한다[참조 : Diez, et al., (1990), J. Biol. Chem. 265, 16358-16365]. 이것은 칸트웰 작제물에서 IPNS 프로모터의 5´ 말단 상에 추가로 약 250개 bp를 생성시킨다. 하지만, 이 영역은 IPNS 유전자 상무의 ACV 합성효소 유전자의 개방 판독 프레임 내에 존재한다.

칸트웰 작제물은 또한 유전자의 ATG로부터 3´ BamHI 부위에 이르는 스트렙토 마이세스 유전자를 함유하는 반면, 본 발명의 벡터는 유전자의 ATG 내지 3´ SalI 부위를 함유한다[참조 : Kovacevic et al. (1989), J. Bacteriol., 171, 754-760]. 이것은 칸트웰 작제물상의 3´ 말단 서열에 약 1000개 bp를 추가로 생성시킨다. 본 발명의 작제물은 ATG의 5´ BamHI 부위까지 엑스팬다제 유전자의 상부 영역을 함유하지만, 이는 IPNS 프로모터에 의해 엑스팬다제 유전자의 판독 프레임으로부터 분리된다.

선행 분야에 기술된 작제물과 비교하여 본 발명의 pPenFTSO 작제물의 또다른 상이성은 사용된 선별 마커에 관한 것이다. 본 발명의 작제물에서 페니실리움 IPNS 프로모터 : 플레오마이신 유전자 융합물의 사용은 다중 복사체의 통합 또는 고수준의 발현을 허용하는 부위에서의 통합을 선별하는 경향이 있고, 따라서 고수준으로 엑스팬다제 유전자를 발현하는 형질전환체를 고도의 %로 수득할 수 있다.

[아디포일 측쇄의 절단]

본 발명의 신규한 생물학적 공정에서의 최종 단계는 아디포일-7-ADAC 또는 아디포일-7-ACA로부터 아디포일 측쇄를 절단하는 것으로서, 이는 전단계의 생성물을 아디포일 아미다제 효소로 처리해야 한다. 상기에서 이미 주시한 바와 같이, 본 발명의 중요한 성취중 하나는 단일 발효 배양으로 아디포일-7-ADAC 및 아디포일-7-ACA의 형성에까지 이르는 단계를 모두 수행할 수 있는 수행력에 있다. 이러한 업적은 공정의 매단계마다 중간체 생성물을 분리하고 부분적으로 정제할 필요가 없으므로 예외적으로 향상된 효율성을 제공한다. 하지만, 이러한 최종 단계에서, 아디포일 아미다제 효소 시스템은 존재하지 않고, 즉 피.크리소게늄의 유전자의 천연 또는 재조합 발현에 의해 본래의 발효 배양물내에서 동일계로 형성되지 않았다.

본 발명의 신규한 생물학적 공정을 뱃치 방식으로 수행하는 경우, 제1단계의 생성물을 분리하고 부분 정제해야만 하는데, 이를 수행하기 위한 예비 공정이 이미 상기에서 기술된 바 있다.

그럼에도 불구하고, 본 발명의 방법은, 아디포일 아미다제를 아디포일-7-ADAC 또는 아디포일-7-ACA와 효율적으로 접촉시켜 이들 화합물의 7-ADAC 또는 7-ACA로의 효소적 전환이 발생할 수 있도록 하는 어떠한 방식으로도 수행될 수 있다. 이것이 본원 전반에 걸친 용어 "접촉"의 정의이다. 조 아디포일-7-ADAC 또는 아디포일-7-ACA의 세포-유리된 브로쓰를 공급 스트림으로 사용하여 이를 조 아디포일 아미다제 브로쓰로 뱃치 방식으로 이를 처리할 수 있다. 이러한 접근 양식은 그것이 초기에는 반응물의 어떠한 실질적인 정제도 필요로 하지 않기 때문에 효율적이다. 물론, 변형도 가능하다. 예를 들면, 서로 접촉시키기에 앞서 목적하는 정도로 반응물을 정제시킬 수 있다. 또한, 공정을 뱃치식이 아닌 연속적 방식으로 수행할 수도 있다. 반응물 자체의 접촉은 공정 기술 향상에 따른 다양한 방식으로 변형될 수 있다. 따라서, 고정화된 효소를, 예를 들면 컬럼을 통과하는 아디포일-7-ADAC 또는 아디포일-7-ACA와 함께 아디포일 아실라제를 함유하는 컬럼의 형태로 사용할 수 있다. 고정화 효소는 또한 아디포일-7-ADAC 또는 아디포일-7-ACA 용액에 현탁액으로서 가해질 수 있다. 이러한 고정화 효소 시스템은 용이한 효소 회수 및 다중적 사용의 이점을 제공한다. 이러한 공정 기술의 또다른 실시예는 막 반응기와 관련된 것이다. 바람직한 반응물 접촉 방법은 고정화 효소 컬럼을 통해서이다.

[절단 단계에서 유용한 아디포일 아미다제 효소]

아디포일 측쇄에 대해 공지의 특이성을 나타내는 다수의 효소가 존재한다. RAEV 코포레이션으로부터 시판되어 입수가능한 아디포일 아미다제로 수득되는 결과가 하기 실시예에 좀더 자세히 기술되어 있다. 문헌중에는 세팔로스포린-타입 분자로부터 아디포일 측쇄를 제거하는 7개의 다른 효소들이 기록되어 있다. 7가지 효소 중 6개는 슈도모나스종으로부터 수득되고 7번째 효소는 바실러스종으로부터 수득된다. 특정 슈도모나스 효소간에는 일부 유사성이 존재하지만, 7가지 전부 그들의 물리적/생물학적 특성에 있어 어느 정도는 상이하다. 이들 특성중 일부가 하기에 요약되어 있다 :

상기 아디포일 아미다제 효소 모두 본 발명의 신규한 생물학적 공정에 있어 유용하다. 본 발명의 방법중 유용한 기타 아디포일 아미다제는, 후보 효소들이 작용해야 하는 실질적 기질인 아디포일-7-ACA 및 아디포일-7-ADAC에 대해 이들 효소를 시험함으로써 용이하게 발견될 수 있다. 포지티브 결과는 후보 효소가 실질적으로 본 발명의 방법중 유용하다는 신뢰적이고 재현가능한 측정 방법을 제공한다. 기질은 문헌[참조 : Szewczuk and Wellman-Bednawska in Clin. Chim. Acta (1978) 84, 19-26]에 기록된 방법을 변형시켜 7-ACA와 아디프산 무수물의 반응으로부터 제조될 수 있다. 글루타릴-7-ACA 제조 방법중 하나인, 문헌[참조 : Agric, Biol. Chem. (1981) 45(7), 1561-1567]에 기술된 방법을 택할 수도 있다. 아디프산 무수물은 문헌[참조 : Albertson and Lundmark, J. Macromol. Sci. Chem. (1990) A27 397-412]에 기술된 방법에 따라 제조할 수 있다. 7-ACA는 시그마 케미칼 캄파니를 포함한, 몇몇 시판 공급처로부터 입수 가능하다.

신속한 비색계 방법을 사용하여 후보 효소의 대략적 스크리닝을 수행하는 것이 바람직한 경우, 아디포일-7-ACA 기질을 아디포일-PABA(파라-아미노벤조산) 또는 아디포일-pNA(파라-니트로아닐린) 같은 비색용 기질로 치환할 수 있다. 이러한 방법을 문헌[참조 : Szewczuk et al., Clinica Chimica Acta, 84 (1978) 19-26] 중 γ-글루타밀 PABA에 대해 기술된 방법으로부터 택할 수 있다. 측쇄 절단으로 그의 존재 및 농도를 비색계를 사용하여 용이하게 측정할 수 있는 발색 종이 수득된다. 이들 및 기타 적합한 비색 방법에 관한 보다 세부적인 기술사항은 문헌[참조 : Marelli, L.P.(1968) J. Pharm. Sci. 57 : 2172-2173; Szasz, G. (1969) Clin. Chem. 15 : 124-136; Szewczuk, A. et al. (1980) Anal. Biochem. 103 : 166-169; and Reyes, F. et al. (1989) J. Pharma. Pharmacol. 41 : 136-137]을 참고로 한다.

RAEV 효소의 N-말단 아미노산 서열을 상기 표에서 설명한 acyII 및 GK16 효소의 대형 서브유니트와 비교한다. 비교결과가 하기에 나타나 있다(괄호는 덜확정된 지정을 나타낸다) :

도시된 서열로부터, 이들 펩타이드중 3가지 모두 관련됨은 명백하다. 하지만, 상기 도시한 것과 유사한 N-말단 서열을 갖는 단백질은 아트로박터(Arthrobacter) 균주에 의해 생산되는 페니실린 G 아실라제를 사용하는 경우에서처럼 반드시 아디포일 아미다제 활성을 소지하지는 않는다. 반면, 상기 N-말단 서열과 상당한 상동성을 나타내지 않는, 본 발명의 방법중 유용한 아디포일 아미다제가 존재한다. 예를 들면, 상기에서 설명한 아사히(Asahi) acyI 및 후지사와 비. 락테로스포러스(Fujisawa B. laterosporus) J1 아실라제는 일부 아디포일-7-ACA 아실라제 활성을 갖는 것으로 보이고, 상기한 기타 효소와는 어떠한 서열 상동성도 공유하지 않는다. 결과적으로, 신규한 생물학적 공정의 최종 단계에서 유용한 아디포일 아미다제에 대하여 본 발명의 영역은 후보 효소가 아디포일-7-ACA로부터 아디포일 측쇄를 절단할 수 있는지의 여부를 결정하는 것으로써, 이는 상기 자세히 설명한 바와 같이 용이하고 신뢰적으로 측정될 수 있다.

[바람직한 양태의 기술]

하기는 본 발명의 특정 바람직한 양태의 상세한 기술이지만, 이들은 예시적으로 제시될 뿐 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한할 의도는 없다.

[실시예 1]

[페니실리움 크리소게늄 배양 조건]

이들 방법에서 사용된 페니실리움 크리소게늄 균주를 증류수 1ℓ, pH 4.8중 1.5%(w/v) 일수화된 락토오스; 0.5%(v/v) 옥수수 침지액; 0.5%(w/v) 펩톤; 0.4%(w/v) NaCl; 0.05%(w/v) MgSO₄-7H₂O; 0.06%(w/v) KH₂PO₄; 0.0005%(w/v), FeCl₃-6H₂O; 0.0002%(w/v) CuSO₄-5H₂O; 3.0%(w/v) 한천으로 이루어진 LCSB 배지를 함유하는 평판상에 유지시킨다. 25℃, 상대 습도 65%에서 12일 후, 단일 콜로니를 제거하고 유리 비이드를 함유하는 스크류-톱(screw-top) 튜브중의 멸균수 2ml에 가한다. 와동에 의해 배양 생장물을 침연시킨 후, 현탁액을 사용하여 라이스(rice) 플라스크를 접종시킨다. 라이스 플라스크는 천연 장일 곡물을 증류수 3 내지 4배량으로 7분간 세척하고 매 30초마다 혼합한 다음 라이스내로의 물 흡수가 약 25%에 달할 때까지 배수시킨 25g/250ml 플라스크 분량의 엉클 벤(Uncle Ben's) 개량미를 함유한다. 25℃, 65% 습도에서 12일 후, 라이스로부터의 포자(spore)를 멸균수 50ml로 세척한다. 포자 현탁액을 사용하여 액체 배양물을 접종시키고 또한 4℃에서 저장하기 위한 배양 동결건조물을 제공한다. 포자를 동일 용량의 5% 탈지 우유에 가하고 멸균 앰플에서 동결건조시킨다.

진탕-플라스크 중에서 균주를 2-단계 발효시켜, RNA 또는 DNA의 공급원으로서 페니실린을 생산하거나 균사를 생산한다. 종자(sedd) 단계는, 증류수 1ℓ 중 3.0%(w/v) 글루코스; 1.0%(w/v) 파마메디아; 3.0%(v/v) 옥수수 침지액; 0.2%(w/v) 황산암모늄; 0.5%(w/v) CaCO₃; 0.05%(w/v) 무수 일인산칼륨; 1.0%(w/v) 락토오스; 1.0%(w/v) 1차 무수 효모를 포함하는 배지로 이루어진 플라스크(50ml/500ml)에 1×10⁸개 포자를 가함으로써 개시된다. 직경 70mm의 회전 진탕기(220rpm) 상에서 25℃, 상대 습도 65%로 배양을 수행한다. 배양 48시간 후, 생산 단계는 영양(vegetative) 종자 2ml를 하기 조성의 배지 플라스크(35ml/500ml)로 옮겨 개시한다 : pH 6.6의 증류수 1ℓ 중 0.05%(w/v) KH₂PO₄; 0.5%(w/v) K₂SO₄; 1.0%(w/v) (NH4)₂SO₄; 12.0%(w/v) 락토오스; 2.75%(w/v) 파마메디아; 1.0%(w/v) CaCO₃(침전); 1.0%(v/v) 라아드유. 오토클래이브시킨 후 접종 이전에, 멸균 25% 아디프산나트륨(pH 6.6)을 가해 2.5%의 최종 아디프산나트륨 농도를 수득한다. 접종 후 배양을 종자 단계와 동일한 조건하에 5 내지 7일간 지속한다.

형질전환 또는 DNA 공급원으로서 원형질체를 생성시키기 위하여 균사가 필요한 경우, 하기로 이루어진 완전 배지 플라스크 50ml/250ml에서 균주를 생장시킨다; 증류수 1ℓ 중 20X 클루터브크 염(Clutterbuck's salts) 50ml(120g Na₂NO₃, 10.4g KCl, 10.4g MgSO₄-7H₂O, 30.4g KH₂PO₄), 2.0mL 보겔(Vogel) 미량원소 0.3M 시트르산, 0.2M ZnSO₄, 25mM Fe(NH₄)₂(SO₄)₂-6H₂O, 10mM CuSO₄, 3mM MnSO₄, 8mM 붕산, 2mM Na₂MoO₄-2H₂O, 5g 트립톤, 5g 효모 추출물, 10g 글루코스. 배양은 회전 진탕기 상에서 220rpm으로 25℃에서 이루어진다.

[실시예 2]

[세팔로스포리움 아크레모니움 배양 조건]

씨. 아크레모니움 균주를 증류수 1ℓ, pH 6.6중 슈크로스 20g, 한천 20g, 펩톤 4g; 효모 추출물 4g, NaNO₃3g, KH₂PO₄0.5g, KCl 0.5g, MgSO₄/7H₂O 0.5g, FeSO₄/7H₂O 0.01g으로 이루어진 완전 배지를 함유하는 사면상에 유지시킨다. 28℃, 상대 습도 66%에서 10일 후, 멸균수 6ml를 사면에 가하고, 배양 생장물을 한천 표면으로부터 스크랩핑(scrap)한다. 수득된 현탁액을 유리 비이드를 함유하는 멸균 스크류-톱 튜브내로 옮긴다. 와동에 의해 수분간 배양 생장을 침연시킨 후, 수득된 현탁액 3.5ml를 사용하여 액체 배양물을 접종시킨다. 이 현탁액을 사용하여 4℃에서 저장하기 위한 배양물의 동결건조물을 제공한다. 침연 배양 생장물의 현탁액을 원심분리하고, 펠렛을 5% 탈지 우유에 재현탁시키고 멸균 앰풀중에서 분취량을 동결건조시킨다.

진탕-플라스크중에서 균주를 2-단계 발효시켜, RNA 및 DNA의 공급원으로서 균사를 생산하거나 세팔로스포린을 생산한다. 종자 단계는, 증류수 1ℓ, pH 6.2중 글루코스 5g; 슈크로스 40g; 옥수수 전분 30g; 사탕무우 당밀 50g; 콩곡분 65g; CaSO₄/2H₂O 15.8g; 아세트산암모늄 8g; CaCO₃(pptd) 5g; (NH₄)₂SO₄7.5g; MaSO₄/7H₂O 3.5g; KH₂PO₄1g; 대두유 0.15ml를 플라스크당 0.15ml를 함유하는 15ml 배지를 함유하는 250ml 플라스크에 접종물을 가함으로써 개시된다. 직경 70mm의 회전 진탕기(220rpm) 상에서 25℃, 상대 습도 65%로 배양을 수행한다. 배양 96시간 후, 생산 단계는 영양 종자 2ml를 상기 조성의 신선한 배지를 함유하는 플라스크 250ml로 옮김으로써 개시된다. 동일 조건하에 추가로 96시간 동안 배양을 지속한다.

형질전환을 위한 DNA 공급원으로서 균사체가 요구되는 경우, 하기로 이루어진 완전 배지 플라스크 100ml/500ml 중에서 균주를 생성시킨다; 증류수 1ℓ 중 글리세롤 20g; 펩톤 4g : 효모 추출물, 4g, KH₂PO₄, 0.5g; K₂HPO₄, 0.5g; KCl, 0.5g; MgSO₄/7HO₂O, 1g; NaNO₃, 3g, FeSO₄/7H₂O, 0.01g, 배양은 회전 진탕기 상에서 30℃에서 200rpm으로 수행한다.

[실시예 3]

[페니실리움 및 세팔로스포리움 게놈 DNA 및 전체 RNA의 분리]

상기한 바와 같이 제조한 48시간 배양물로부터의 영양 균사 생장물을 무명을 통해 여과하여 회수하고, 액체 질소중에서 동결후 밤새 동결건조한다. 무수 균사를 약자사발내에서 모래와 함께 분쇄한 후, 100mM LiCl, 50mM EDTA, 10mM 트리스 pH 8.0, 4% SDS 25ml 중에서 재현탁시킨다. 현탁액을 60℃ 수욕중 50 내지 55℃로 가열한 후 혼합물을 먼저 1M 트리스(pH 8) 포화 페놀, 이후 트리스-포화 페놀 : 클로로포름(1 : 1, v : v)으로, 이후 클로로포름으로 추출한다. RNA는 동일 용량의 냉 6M LiCl을 부가하여 수성상으로부터 침전시킨 후 혼합물을 -20℃에서 2 내지 3시간 유지시킨다. 12,000×g에서 4℃로 20분간 원심분리한 후, 상등액을 66%(v/v) 에탄올로 만들고 -20℃로 15분간 냉각시켜 DNA를 침전시킨다. 상기한 바와 같이 원심분리한 후, DNA 펠렛을 70% 에탄올로 세척하고, 건조한 후 TE 완충액(10mM 트리스-HCl, pH 7.5, 1mM EDTA)에 재현탁시킨다. DNA 농도는, 아가로스 겔 전기영동시 에티디움 브로마이드로 염색한 경우 공지의 DNA 표준과 비교함으로써 측정된다.

RNA 추출을 위하여, 상기 실시예 1 및 2에 기술한 바와 같은 페니실리움 크리소게늄 및 세팔로스포리움 아크레모니움 배양물을 220rpm의 회전 진탕기 상에서 25℃에서 발효 배지(발효 조건은 상기한 바와 같다) 35ml중 96시간 동안 생장시킨다. 균사체를 진공하에 와트맨 #1 필터를 통해 여과하여 회수하여 물 약 50ml로 세척한다. 균사체를 즉시 필터로부터 스크랩핑하고, "분해 완충액"(50mM 트리스-HCl pH 7.4, 150mM NaCl, 5mM EDTA pH 8.0, 5% SDS) 5ml에 재현탁시키며, 액체 질소에서 냉동시킨 후 동결건조시킨다. 밤새 동결건조시킨 후, 0.1% DEPC 함유 물 5ml 및 1M 트리스(pH 8) 포화된 페놀 : 클로로포름 : 이소아밀 알콜(50 : 50 : 1)5ml를 가하고 혼합물을 방치시켜 진탕시키며 37℃에서 20분간 해동시킨다. 혼합물을 12,000×g로 10분간 4℃에서 원심분리한 후 수성층을 제거하고, 처음에는 1M 트리스(ph 8) 포화된 페놀:클로로포름:이소아밀 알콜(50:50:1)로, 두 번째는 1M 트리스(pH 8) 포화된 페놀로, 세 번째는 클로로포름으로 재추출한다. 동일 용량의 6M LiCl을 최종 수성층과 합하고, 용액을 -20℃에서 최소한 4시간 동안 정치시킨다. 전체 RNA를 12,000×g로 20분간 4℃에서 펠렛화한 다음, 펠렛을 TE 완충액 0.3ml 및 3M 아세트산나트륨 0.03ml 중에 용해시키고, 2.5배 용량의 에탄올을 가해 RNA를 재침전시킨다. 최종 펠렛을 TE 완충액 0.1ml에 용해시키고 RNA 농도를 260nm에서의 흡광도를 사용하여 분광학적으로 측정한다.

[실시예 4]

[세팔로스포리움 아크레모니움 유전자 라이브러리의 작제 및 씨. 아크레모니움 엑스팬다제/하이드록실라제 및 아세틸트랜스퍼라제 유전자의 분리]

씨. 아크레모니움 게놈 DNA를 Sau 3AI로 부분 분해하여 평균 단편 크기 10 내지 20kb를 수득하고 이 크기 범위를 5 내지 20% NaCl 밀도 구배상에서 분해물을 원심분리하여 증량시킨다. 크기 분별화된 DNA를 사용하여, 2001 벡터의 BamHI 부위내로 연결시켜 씨. 아크레모니움 게놈 DNA 라이브러리를 제조하고, Gigapak(Stratagene)을 사용하여 파지 입자 내로 패키징한 후 이. 콜라이를 감염시킨다. 수득된 플라크를 니트로셀룰로스로 이전시켜, 엑스팬다제/하이드록실라제 유전자(Samson et al., 1987)의 공개된 서열의 3´ 말단에 상보성인 올리고뉴클레오타이드 프로브에 하이브리드화시켜 스크리닝한다. 프로브는 T4 폴리 뉴클레오타이드 키나제를 사용하여[τ-³²P] ATP로 말단 표지화한다. 포지티브 클론을 분리하고, 제산 엔도뉴클레아제 부위에 대해 지도화한 후, 유전자 방향을, 상기 올리고뉴클레오타이드로의 써던 블롯 하이브리드화에 의해, 다른 것은 유전자 5´ 말단에 상보적인 서열을 사용하여 확립한다.

[씨. 아크레모니움 아세틸트랜스퍼라제 유전자의 분리]

하기 실시예 11 및 12에 기술된 연속적 벡터 작제를 위한 아세틸트랜스퍼라제 유전자의 분리에 사용된 방법은 아닐지라도, 하기 방법은 현재 입수가능한 공개된 DNA 서열 정보를 사용하여 통상의 숙련가에 의해 사용될 수 있다. 상기한 바와 같이 작제된 씨. 아크레모니움 게놈 라이브러리로부터, 아세틸트랜스퍼라제 서열에 상보성인 합성 올리고뉴클레오타이드 프로브로의 하이브리드화를 기본으로 하여 아세틸트랜스퍼라제 유전자를 암호화하는 클론을 선별한다[참조 : Matsuda et al. (1992) Biochem. Biophys. Res. Commun, 182 : 995-1001].

[실시예 5]

[스트렙토마이세스 클라불리게루스 배양 조건]

본 방법에 사용된 스트렙토마이세스 클라불리게루스 균주는 ATCC 27064이다. 상기 균주를 증류수 1ℓ, pH 7.2중 효모 추출물 4g; 맥아 추출물 10g; 글루코스 4g; 한천 20g으로 이루어진 평판상에서 유지시킨다. 30℃에서 5일간 생장시킨 후, 멸균수 2ml를 평판에 가하고 배양 생장물을 한천 표면으로부터 스크랩핑한다. 수득된 현탁액을 유리 비이드를 함유하는 멸균 스크류-톱 튜브로 옮긴다. 와동시켜 배양 생장물을 침연시킨 후, 현탁액을 사용하여 액체 배양물을 접종한다. 현탁액은 또한, 글리세롤을 최종 용적 15%까지 가함으로써 -70℃에서 영구 배양 보존을 위해 사용된다.

균사체가 형질전환 또는 DNA 공급원을 위한 원형질체를 생성시키기 위하여 필요한 경우, 균주를 하기로 이루어진 YEME 배지 200ml/1 플라스크에서 생장시킨다 : 증류수 1ℓ 중 효모 추출물 3g; 펩톤 5g; 맥아 추출물 3g; 글루코스 10g; 슈크로스 340g; MgCl₂-6H₂O 1.02g; 글리신 5g; 한천 18g. 220rpm의 회전 진탕기 상에서 28℃에서 배양을 수행한다.

[실시예 6]

[스트렙토마이세스 게놈성 DNA의 분리]

상기와 같이 제조한 48시간 배양물로부터의 영양성 생장물을 22100×g에서 10분간 원심분리하여 회수한다. 세포를 TE 완충액 10ml에 재현탁시키고, 라이소자임 10mg을 가한 후 혼합물을 30℃에서 15분간 배양한다. 그런 다음 20% SDS 1ml를 가한 직후, TE(pH 8) 포화된 페놀 10ml 및 5M NaCl 1.5ml를 가하고, 혼합물을 20분간 가볍게 회전시킨다. 상을 12,000×g에서 10분간 분리시킨 후, 수성층을 제거하고 새로운 튜브에 옮긴다. 동량의 클로로포름을 가하고 혼합물을 10분간 가볍게 회전시킨다. 12,000×g로 10분간 원심분리하여 상을 재분리하고 수성층을 제거한 후 새로운 튜브로 다시 옮긴다. 2배 용량의 이소프로판올을 조심스럽게 가하고 침전된 DNA를 스풀링(spool)한 후 최소량의 TE 완충액에 재용해시킨다. RNAse A를 20㎍/ml의 최종 농도로 가하고 용액을 50℃에서 1시간 배양한다. 그런 다음 프로테아제 K를, 100mM NaCl 및 0.4% SDS와 함께 100㎍/ml의 최종 농도로 가하고, 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 배양한다. 용액을 동일 용적의 TE(pH 8) 포화된 페놀로 재추출한 다음, 다시 클로로포름으로 추출한다. 최종 추출로부터의 DNA를 2배 용량의 이소프로판올 부가후 스풀링하고, 260nm에서 판독한 흡광도를 사용하여 농도를 분광학적으로 측정한다.

[실시예 7]

[유전자 라이브러리의 작제 및 스트렙토마이세스 클라불리게루스 엑스팬다제 및 하이드록실라제 유전자를 함유하는 DNA 단편의 분리]

[에스. 클라불리게루스 엑스팬다제 유전자의 분리]

상기한 방법으로부터 수득한 스트렙토마이세스 클라불리게루스 게놈 DNA를 제한 효소 BamHI 및 SalI으로 분해한다. 분해된 DNA를 0.8% 아가로스 겔상으로 전기영동한 후 1.8 내지 2.2kb 크기 단편을 용출시키고 미리 BamHI 및 SalI으로 분해한 pUC18 DNA에 연결시킨다. 연결 혼합물의 희석물을 사용하여 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 컴피턴트 JM109 세포를 형질전환시킨다[참조 : Gene Pulser, Bio-Rad, Richmond, CA]. 컴피턴트 세포의 제조 및 전기영동 조건을 둘다 제조업자의 권고에 따른다. 형질전환 혼합물을, 100㎍/ml 앰피실린 및 2% X-Gal 75㎕를 함유하는 LB 평판상에 도말한다. 밤새 37℃에서 배양한 후, 재조합 콜로니를, 플라스미드 벡터 β-갈락토시다제 유전자 활성의 불활성화로 인한 무색 외관에 의해 동정한다. 밤새 37℃에서 생장시킨 후 콜로니를 니트로셀룰로스로 옮기고 염기 52-918로부터의 공개된 스트렙토마이세스 클라불리게루스 엑스팬다제 유전자 서열에 상응하는, 폴리머라제 쇄 반응에 의해 제조된 프로브와 하이브리드화시킨다[참조 : Kovacevic et al, (1989) J. Bacteriol. 171 : 754-760; and Ingolia et al. U. S. 5,070,020]. 폴리머라제 쇄 반응 생성물의 표지화는 제조업자의 지시(Pharmacia, Piscataway, New Jersey)에 따라 (³²P) dCTP 및 올리고라벨링 키트를 사용한 랜덤-프라이머 연장 반응에 의해 이루어진다. 하이브리드화 반응은 10₆CPM 방사표지된 프로브, 30% 포름아미드, 5× SSC (0.15M NaCl, 0.015M 시트르산 나트륨 pH 7), 0.1% SDS, 5 × 덴하르트 용액(피콜 5g, 폴리비닐 피롤리돈 5g 및 BSA 5g, 50배 스톡의 500ml에 대해) 및 100㎍/ml 송아지 흉선 DNA의 존재하에 밤새 37℃에서 수행한다. 일부 형질전환체는 프로브에 강력히 하이브리드화한다. 효소 분석으로 하나의 콜로니가 제한 엑스팬다제 유전자를 지닌 벡터를 함유하는 것을 확인하고 이 플라스미드를 pFTSO-1로 지정한다.

[에스. 클라불리게루스 하이드록실라제 유전자의 분리]

스트렙토마이세스 클라불리게루스 게놈 DNA를 BamHI으로 부분 분해하여 업체(Stratagene)로부터의 Dash II 벡터 내로 연결시킨다. 수득한 게놈 라이브러리는, 하이드록실라제 유전자에 대해 공개된 서열의 처음 30개 염기[참조 : Kovacevic and Miller, 1991, J. Bact. 173 : 398]와 동일한 서열의 30개 염기 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드화시킴으로써 스크리닝된다. 2개의 포지티브 파지 클론으로부터의 BamHI 분해된 DNA와 써던 하이브리드화시키면 예기된 6kb 단편이 나타나고, 이를 서브클로닝한다. 이 서브클론을 kpnI으로 분해하면 하이드록실라제 유전자 주변에 대해 공개된 제한 지도[참조 : Kovacevic and Miller 1991]와 일치하는 단편 세트가 수득한다.

[실시예 8]

[플라스미드 DNA의 분리]

관심 대상인 플라스미드 함유 이.콜라이 배양물을 220rpm의 회전 진탕기 상에서 15㎍/ml 테트라사이클린이 가해진 LB 브로쓰(20g/ℓ LB 브로쓰 기재, Gibco, Paisley, Scotland) 500ml 중에서 37℃에서 12 내지 16시간 동안 생장시킨다. 4,000×g로 4℃에서 10분간 원심분리하여 세포를 펠렛화한다. 세포 펠렛을 글루코스 완충액(50mM 글루코스, 25mM 트리스 pH 8.0, 10mM EDTA) 18ml에 재현탁시키고 글루코스 완충액중 40mg/ml 라이소자임(Sigma, St. Louis. MO) 2ml를 가해, 혼합하고, 혼합물을 실온에서 15분간 배양한다. 새로이 제조된 0.2N NaOH, 1% SDS 용액 40ml를 가하고, 혼합물을 가볍게 젓고 얼음상에 10분간 정치시킨다. 그런 다음 5M 아세트산칼륨(pH 4.8) 30ml를 가하고, 잘 혼합한 후 생성된 혼합물을 얼음상에 추가로 10분간 놓아둔다. 세포 잔사를 4,000×g로 4℃에서 10분간 원심분리하여 펠렛화하고, 수득된 상등액을 무명 필터를 통해 여과한다. 이소프로판올(0.6배 용적)을 정화된 상등액에 가하여 플라스미드 DNA를 침전시키면, 실온에서 20분간 배양하는 동안 침전물이 형성된다. 플라스미드 DNA를 4,000×g에서 4℃에서 20분간 펠렛화한 후 70% 에탄올로 세척하고 잠시 건조시킨다. 펠렛을 TE 완충액 9ml에 재현탁시킨 후, CsCl 10g 및 10mg/ml 에티디움 브로마이드 용액 0.387ml를 가한다. 이 용액을 313,100×g에서 24시간 동안 원심분리시킨다. 염화세슘 구배로 수득한 플라스미드 밴드를 자외선으로 가시화시켜 분리한 다음, 에티디움 브로마이드를 추출을 위해 물 포화된 부탄올로 제거한다. 그런 다음 플라스미드 제조물중 CsCl을 TE 완충액에 대해 투석하여 제거하고, 최종적으로 PEG(MW 8000)를 사용, DNA를 농축시킨다. DNA 농도를 260nm에서 판독한 흡광도를 사용하여 분광학적으로 측정한다.

[실시예 9]

[페니실리움 형질전환 벡터 pPenFTSO의 작제]

[플레오마이신 내성 유전자의 혼입]

페니실리움 형질전환 벡터를 우성 선별 마커로서 플레오마이신 내성 유전자를 사용하여 작제한다. 이것은 먼저, 플레오마이신 내성 유전자(스트렙토알로테이쿠스 히두스타누스(Streptoalloteichus hindustanus)로부터의 플레오마이신 결합 단백질 유전자)를 함유하고 또한 효모 씨토크롬 C1 터미네이터에 커플링된 660bp 단편을 아가로스겔상에서 전기영동하여 상기 겔로부터 용출시켜 플라스미드 pUT713(CAYLA, Toulouse Cedex, France)의 Bam HI/Bg1 II분해물로부터 분리한다. 분리된 단편을 벡터 pSELECT1(Promega Corporation)의 BamHI 부위로 연결시키고, 유전자의 방향을 제한 효소 분석으로 결정한다. 수득된 플라스미드내의 단일 Hind III 부위는 Hind III로 제한 절단시키고, 클레나우 폴리머라제로 충진시킨 후 재연결시킴으로써 제거된다. 다음, λcos 부위를 함유하는 550bp Pst I 단편을 삽입하여, 벡터가, 적절한 크기의 삽입체가 포함되는 경우 코스미드 형성에 사용될 수 있도록 한다. 이 벡터를 pSCP4로 지정한다.

피. 크리소게늄 게놈 DNA를 Sau 3A로 부분 분해하고 파지 벡터 λEMBL 3중에서 라이브러리 제조에 사용한다. 이소페니실린 N 합성효소(IPNS) 유전자 함유 클론을 이 라이브러리로부터 분리하여 일련의 서브클론을 제조하는데 사용하는데, 이 중 하나는 IPNS 유전자 상부의 첫 번째 BamII 부위로부터 유전자 하부의 첫 번째 Hind III 부위에 이르는 3.6kb 단편을 함유한다. 이러한 서브클론중의 단일 SalI 부위를, SalI으로 제한 절단하고, 함요된(recessed) 말단을 클레나우 폴리머라제로 충진 후 재연결하여 제거한다. 그런 다음, 단일 XbaI 부위를 XbaI으로 제한 절단하고, 충진 후 재연결하여 유사하게 제거한다. 수득한 플라스미드를 pSXF-1으로 지정한다. 조작된 IPNS 프로모터를 pSXF-1로부터 1.2kb NcoI 단편으로서 분리하여 상기한 바와 같이 pSCP4의 NcoI 부위내로 연결한다. 제한 분해에 의해 결정된 방향은 프로모터가 ATG 출발 코돈에서 플레오마이신 내성 유전자에 융합되도록 선택한다. 이 플라스미드를 pUTZ-2로 지정한다.

[에스. 클라불리게루스 엑스팬다제 유전자의 혼입]

스트렙토마이세스 클라불리게루스 엑스팬다제 유전자를 함유하는 1.645kb 단편을 0.8% 아가로스 겔상에서 전기영동하여 상기 겔로부터 용출시켜 pFTSO-1(상기한 벡터)의 BamHI 및 SalI 분해물로부터 정제한다. 분리한 단편을 또한 BamHI 및 SalI으로 분해한 벡터 pSELECT(Promega Corporation) 내로 연결시킨다. 이 벡터를 pFTSO-8로 지정한다. 신규한 NcoI 부위를 시스템[Altered Sitesin vitro Mutagensis System(Promega Corporation)]을 사용하여 pFTSO-8의 부위-지시된 돌연변이 유발에 의해 엑스팬다제 유전자의 ATG 출발 코돈에서 생성시킨다. 제조업자의 지시에 따라 돌연변이 유발을 수행한다. 올리고뉴클레오타이드를 작제하여 스트렙토마이세스 엑스팬다제 유전자의 공개된 서열[참조 : Kovacevic et al. (1990) Journal of Bacteriology, 171, p. 3952-3958]로부터 ATG 출발 코돈에서 DNA 영역의 암호화 서열을 보충한다. 올리고뉴클레오타이드는 시아노에틸 포스포르아미디트 화학[Pharmacia Gene Assmbler instrumentation]에 의해 합성하면, 올리고 서열은 하기와 같다 :

돌연변이 유발을 제한 효소 분석에 의해 확인한다. 그런 다음, 조작된 피.크리소게늄 IPNS 프로모터 영역을 함유하는, pUTZ-2로부터의 1.2kb NcoI 단편을 NcoI으로 제한 절단하여 분리한 후, 아가로스 겔 전기영동시킨다. IPNS-프로모터 영역을 엑스팬다제 유전자의 ATG 출발 코돈에서 돌연변이 유발에 의해 생성된 신규한 NcoI 부위에서 pFTSO-8 벡터내로 연결시킨다. 엑스팬다제 유전자에 대한 프로모터의 방향은 제한 효소 분석에 의해 확인된다. 그런 다음 이러한 IPNS-프로모터 엑스팬다제 유전자 카세트를 BamHI/SalI 단편으로서 제거하여 BamHI/SalI 절단 페니실리움 형질전환 벡터 pUTZ-2을 수득한다. 최종 작제물을 pPenFTSO로 지정한다.

[실시예 10]

[페니실리움 형질전환 벡터 pPEN/CEPH-1의 작제]

[IPNS 프로모터 영역의 혼입]

IPNS 프로모터 영역을 XhoI/SmaI으로 분해시켜 실시예 9에서 좀 더 기술된 pUTZ-2로부터 분리한다. pUTZ-2 벡터는 BamHI으로 절단하고 돌출 말단을 dNTP 및 클레나우 단편으로 충진시켜 평활 말단을 생성시킨 후 XhoI으로 분해하여, 분리된 XhoI/SmaI IPNS 프로모터 단편을 이러한 절단 벡터내로 연결하여 2개의 IPNS 프로모터 영역을 함유하는 작제물을 수득한다. 이 벡터를 pUTZ-7로 지정한다.

[씨. 아크레모니움 엑스팬다제/하이드록실라제 유전자 혼입]

그럼 다음, IPNS 프로모터 영역중 하나를 pUTZ-7로부터 XhoI/XbaI 단편으로서 분리(아가로스 겔상에서 전기영동하여 용출시킴)시키고, XhoI/XbaI 절단 벡터 pBluescript II SK(Stratagene, La Jolla, CA)내로 연결한다. 이 벡터를 pIPNSp/blue로 지정한다.

세팔로스포리움 엑스팬다제/하이드록실라제 유전자를, 상기 동정된 게놈 클론으로부터 1.6kb HindIII/XbaI 단편으로서 분리(아가로스 겔상에서 전기 영동하여 용출시킴)한 후 HindIII/XbaI 분해된 벡터 pSELECT내로 연결시킨다. 신규한 BspHI 부위를 시스템[Altered Sites^TMin vitro Mutagenesis System(Promega Corporation)]을 사용하여 부위-지시된 돌연변이 유발에 의해 엑스팬다제/하이드록실라제 유전자의 ATG 출발 코돈에서 생성시킨다. 제조업자의 지시에 따라 돌연변이 유발을 수행한다. 올리고뉴클레오타이드를 작제하여 세팔로스포리움 아크레모니움 엑스팬다제/하이드록실라제 유전자의 공개된 서열[참조; Samson et al., Bio/Technology, Vol. 5, November, 1987]로부터 ATG 출발 코돈에서 DNA 영역의 암호화 서열을 보충한다. 올리고뉴클레오타이드는 시아노에틸 포스포르아미디트 화학[Pharmacia Gene Assmbler instrumentation]에 의해 합성하면, 올리고 서열은 하기와 같다 :

돌연변이 유발을 제한 효소 분석에 의해 확인한다. 그런 다음, 세팔로스포리움 아크레모니움 엑스팬다제/하이드록실라제 유전자를 BspHI/XbaI 단편으로서 분리(아가로스 겔상에서 전기영동하여 용출시킴)한 후, 상기 실시예에 기술된 NcoI/XbaI 분해된 벡터 pIPNSp/blue내로 연결시킨다. 이 벡터는 이제 세팔로스포리움 아크레모니움 엑스팬다제/하이드록실라제 유전자의 ATG에서 페니실리움 IPNS 프로모터를 함유한다. 이 벡터를 pIPNSp/EXP/blue로 지정한다. 이러한 IPNS 프로모터 엑스팬다제/하이드록실라제 카세트를 XhoI으로 부분 분해하고 XhaI으로 완전분해한 후 단편을 분리(아가로스겔로부터 전기영동하여 용출시킴)하고, 상기 실시예에 기술된 XhoI/XbaI 분해된 벡터 pUTZ-2내로 연결시켜 최종 형질전환 벡터 pPEN/CEPH-1을 수득한다.

[실시예 11]

[에스. 클라불리게루스의 엑스팬다제 및 하이드록실라제 유전자 모두를 발현하기 위한 페니실리움 형질전환 벡터의 작제]

피. 크리소게늄 β-튜불린 유전자를 하이브리드화 프로브로서 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) β-튜불린 유전자를 사용하여 λ 게놈 라이브러리로부터 클로닝한다. 페니실리움 β-튜불린 프로모터를 함유하는 2.0kb X baI/HindIII 단편을 sPELECT(Promega)의 XbaI/HindIII 부위내로 연결시킨다. NcoI 부위를 서열 AAAATGCGT를 ACCATGGGT로 부위-지시된 돌연변이 유발로서 ATG 출발 코돈에 도입시킨다. 수득된 벡터로부터, 1.4kb BamHI/NcoI 단편을 겔 분리하여(상기한) pUTZ-2의 BamHI과 NcoI 부위 사이에 연결시켜 벡터 pCI-6을 생성시킨다. 피.크리소게늄 게놈 클론으로부터, IPNS 및 아실 트랜스퍼라제 유전자 모두를 함유하는 5.1kb SalI 단편을 겔 분리하고 pUTZ-2의 SalI 부위내로 연결하여 pUTZ-5를 생성시킨다. IPNS 유전자의 3´ 터미네이터 서열을 BamHI 및 HindIII로 제한 절단시킨 후 1.3kb 단편을 겔 분리하여 pUTZ-5로부터 분리하고, 이를 (상기) pCI-6의 BamHI과 HindIII 부위 사이에 연결시켜 pCI-13을 수득한다. pCI-13중의 BamHI 부위 근처의 단일 SalI 부위를 제한 절단하고, 클레나우 폴리머라제로 충진후 재연결시켜 제거한다. 새로운 SalI 부위를, 서열 GGAAGACG를 GGTCGACG로 부위-지시된 돌연변이를 유발시켜 BamHI 부위의 다른쪽상에 도입시킨다. 그런 다음, 앰피실린 내성 유전자를 PvuI으로 제한 절단하여 제거하고, 보다 큰 단편을 겔 분리한 후 재연결시켜 pCI-15를 수득한다. 최종적으로, IPNS 프로모터 : 엑스팬다제 유전자 카셋트를 pPENFTSO로부터 2.4kb BamHI/SalI 단편으로서 겔 분리하여 pCI-15내로 연결시켜 pEXP-1을 수득한다.

에스. 클라불리게루스의 하이드록실라제 및 엑스팬다제 유전자 모두를 발현하는 벡터의 작제는 하기 단계와 관련되어 있다. 하이드록실라제 유전자를 함유하는 2.9kb KpnI 단편을 pSELECT내로 서브클로닝하여 폴리링커내의 EcoRI 부위가 유전자의 5´ 말단 다음에 위치하도록 한다. 플라스미드내의 단일 NcoI 부위를, 서열 TCCATGGGC를 서열 TCGATGGGC로 부위-지시된 돌연변이를 유발시켜 제거하고, 동시에, 서열 AACATGGC를 ACCATGGC로 변화시켜 출발 코돈에 신규한 NcoI 부위를 도입시킨다. 양 변화는 암호화된 아미노산 서열을 보존시킨다. 조작된 IPNS 프로모터를 함유하는 1.0kb EcoRI/NcoI 단편을 pUTZ-2로부터 겔 분리하여 변경된 하이드록실라제 유전자를 함유하는 상기 벡터의 EcoRI과 NcoI 부위 사이에 연결시킨다. 그런 다음, 수득된 벡터내 단일 EcoRI 부위를 부위-지시된 돌연변이 유발에 의해 HindIII 부위로 변화시킨다. 5´ IPNS : 하이드록실라제 융합 작제물을 HindIII 단편으로서 수득된 벡터로부터 분리하고, 이를 상기 벡터 pEXP-1의 단일 HindIII 부위내로 연결시킨다. 최종 벡터는 각각 IPNS 프로모터에 의해 유도되는 엑스팬다제 및 하이드록실라제 유전자를, β-튜불린 프로모터에 의해 유도되는 플레오마이신 내성 마커를 함유한다.

[실시예 12]

[페니실리움 형질전환 벡터 pPenCACT의 작제]

[하이그로마이신 내성 유전자의 혼입]

페니실리움 형질전환 벡터는 우성 선별 마커로서 하이그로마이신 내성 유전자를 사용하여 작제한다. 이. 콜라이 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 유전자를 벡터 pHph-1(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)로부터 1.15kb Bam HI 단편으로서 분리(아가로스겔 상에서 전기영동하여 용출시킴)하고 BamHI 분해된 벡터 mp 19에 연결시킨다. mp 19 내의 하이그로마이신 내성 유전자의 방향을 RF DNA의 제한 효소 분석으로부터 결정한다. 5´ BamHI 부위는 하이그로마이신 내성 유전자의 ATG 출발 코돈 부근이다. 이러한 5´ BamHI 부위에서 또다른 프로모터의 위치화를 용이하게 하기 위하여, 3´ BamHI 부위를 키트[Mutator^TMSite Directed Mutagenesis Kit(Stratagene, La Jolle, CA)]을 사용하여 부위-지시된 돌연변이 유발에 의해 제거한다. 제조업자의 지시에 따라 돌연변이 유발을 수행한다. 올리고뉴클레오타이드를 작제하여 이.콜라이 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 유전자의 공개된 서열[참조 : Gritz, L. and Davies, J., 1983, Gene 25, 179]로부터 3´ BamHI 부위에서 DNA 영역을 보충한다. 올리고뉴클레오타이드를 시아노에틸 포스포르아미디트 화학[Pharmacia Gene Assembler instrumentation]에 의해 합성하면, 올리고 서열은 하기와 같다 :

돌연변이 유발을 제한 효소 분석에 의해 확인한다. 돌연변이된 하이그로마이신 내성 유전자를 SmaI/XbaI 단편으로서 분리(아가로스겔 상에서 전기영동하고 용출시킴)하고 SmaI/XbaI 분해된 벡터 pUC 18내로 연결시킨다.

페니실리움 IPNS 프로모터를 NcoI 절단 벡터 pUTZ-2(상기 벡터)로부터 1.2kb NcoI 단편으로서 분리(아가로스겔 상에서 전기영동하여 용출한다. 합성 올리고뉴클레오타이드 링커를 합성하여, IPNS 프로모터 단편의 말단상에서 NcoI 부위로부터 BamHI 부위를 생성시켜, 하이그로마이신 내성 유전자의 ATG 근처 5´ BamHI 부위내에 IPNS 프로모터를 위치시킨다. 올리고를 시아노에틸 포스포르아미디트 화학(Pharmacia Gene Assembler instrumentation)으로 합성하면, 올리고 서열은 하기와 같다 :

이 서열은 IPNS 프로모터의 천연 서열을 유지하지만 하이그로마이신 내성 유전자내에 2개의 아미노산을 삽입한다. 올리고를 어닐링하고, 인산화시킨 후 NcoI 절단 IPNS 프로모터 단편에 연결하여 IPNS 프로모터 단편의 5´ 및 3´ 양 말단 모두에 BamHI 부위를 생성시킨다. 이와 같이 링커화된 프로모터를 pUC18내의 BamHI 절단 하이드로마이신 내성 유전자에 연결시키고, 제한 효소 분석에 의해 방향을 확인한다. 그런 다음 IPNS 프로모터 : 하이드로마이신 내성 유전자 카셋트를 2.1kb XhoI/SalI(XhoI 부위는 IPNS 프로모터의 5´ 말단에 위치하고, SalI 부위는 pUC 폴리링커로부터 유래하여 SalI 분해된 벡터 pSELECT 내로 연결된다)로서 분리(아가로스겔 상에서 전기영동하여 용출시킴)한다. 상기 카셋트 방향을 제한 효소 분석에 의해 측정한다. 이 벡터를 pIPNS/HYG로 지정한다.

[세팔로스포리움 아크레모니움 아세틸트랜스퍼라제 유전자의 혼입]

세팔로스포리움 아세틸 트랜스퍼라제 유전자를 게놈 클론(상기)으로부터 1.8kb Bgl II/SalI 단편으로서 아가로스 겔상에서 전기영동하여 용출시켜 분리한다. 아세틸트랜스퍼라제 유전자를 BamHI/SalI 분해된 벡터 pSELECT 내로 연결시킨다. 세팔로스포리움 아세틸트랜스퍼라제 유전자의 ATG에 페니실리움 IPNS 프로모터의 위치화를 용이하게 하기 위하여, 신규한 NcoI 부위를 아세틸트랜스퍼라제 유전자의 ATG에서 생성시키고; 구조 유전자중의 내부 NcoI 부위를 시스템[Altered Sites^TMin vitro Mutagensis System(Promega Corporation)]을 사용하여, 부위-지시된 돌연변이 유발에 의해 제거한다. 제조업자의 지시에 따라 돌연변이 유발을 수행한다. 올리고뉴클레오타이드를 작제하여 상기 SEQ ID NO : 1 및 2의 세팔로스포리움 아세틸트랜스퍼라제 유전자의 서열로부터 관심 대상 DNA 영역의 암호화 서열을 보충한다. 구조 유전자내 내부 NcoI 부위 제거에 사용된 올리고뉴클레오타이드 서열은 하기와 같다 :

ATG 출발 코돈에서 신규한 NcoI 부위를 생성시키는데 사용된 올리고뉴클레오타이드 서열은 하기와 같다 :

이들 올리고뉴클레오타이드를 시아노에틸 포스포르 아미디트 화학(Pharmacia Gene Assembler instrumentation)에 의해 합성한다. 돌연변이 유발을 제한 효소 분석으로 확인한다. 이 벡터를 pMUTACT로 지정한다.

페니실리움 IPNS 프로모터는 상기 실시예에서 기술된 벡터 pUTZ-2로부터 1.2kb NcoI 단편으로서 분리(아가로스겔 상에서 전기영동하여 용출시킴)한다. 이러한 프로모터 단편을 NcoI 절단 벡터 pMUTACT에 연결시키면 이제 IPNS 프로모터는 세팔로스포리움 아크레모니움 아세틸트랜스퍼라제 유전자의 ATG에 바로 위치하게 된다. 프로모터의 방향을 제한 효소 분석에 의해 확인한다. 이러한 IPNS 프로모터 : 아세틸트랜스퍼라제 유전자 카셋트를 XhoI/SalI(XhoI 부위는 IPNS 프로모터의 5´ 말단에, SalI 부위는 아세틸트랜스퍼라제 유전자의 3´ 말단에 위치한다)으로 분해하여 SalI 분해된 벡터 pSELECT내로 연결한다. 단편의 방향을 제한 효소 분석으로 결정한다. 이 벡터를 pMUTACT/IPNS로 지정한다.

아세틸트랜스퍼라제 유전자의 ATG에서 신규한 NcoI 부위를 생성시키는데 사용되는 돌연변이 유발로 두 번째 아미노산이 세린에서 알라닌으로 변하게 된다. 천연 유전자와 동일한 암호화 서열을 유지시키기 위하여, 시스템[Altered Sites^TMin vitro Mutagenesis System]을 사용하여 부위- 지시된 돌연변이 유발을 수행한다. 올리고뉴클레오타이드를 작제하여, 상기 SEQ ID NO : 1 및 2에서 설명한 아세틸트랜스퍼라제 유전자의 서열로부터 관심 대상인 DNA 영역의 암호화 서열을 보충한다. 두 번째 아미노산을 알라닌에서 세린으로 변화시키는데 사용된 올리고뉴클레오타이드는 하기와 같다 :

올리고뉴클레오타이드를 시아노에틸 포스포르아미디트 화학(Pharmacia Gene Assembler instrumentation)을 사용하여 합성한다. USB Sequense Version 2.0 DNA Sequcncirg Kit (USB, Cleveland, Ohio)를 사용하여 DNA 서열을 분석하여 돌연변이 유발을 확인한다. 서열 분석용 프라이머를 시아노에틸 포스포르아미디트 화학(Pharmacia Gene Assembler instrumentation)을 사용하여 합성한다. 이 벡터를 pMUTACT/IPNS-2로 지정한다.

IPNS 프로모터 : 하이드로마이신 내성 유전자 카셋트를 XbaI 단편으로서 벡터 pIPNS/HYG로부터 제거하여 XbaI 분해된 벡터 pMUTAG/IPNS-2내로 연결시켜 최종 형질전환 벡터 pPenCACT를 수득한다. 하이그로마이신 카셋트의 방향을 제한 효소 분석으로 결정한다.

[실시예 13]

[세팔로스포리움 아크레모니움의 엑스팬다제/하이드록실라제 및 아세틸트랜스퍼라제 유전자 모두를 발현시키기 위한 페니실리움 형질전환 벡터 pTS-8의 작제]

세팔로스포리움 아세틸트랜스퍼라제 유전자를 게놈 클론으로부터 1.8kb BglII/SalI 단편으로서 분리(아가로스겔 상에서 전기영동하여 용출시킴)하고 BamHI/SalI 분해된 벡터 pSELECT(Promega Corporation)내에 연결한다. 세팔로스포리움 아세틸트랜스퍼라제 유전자의 ATG에 페니실리움 IPNS 프로모터를 용이하게 위치시키기 위하여, 신규한 NcoI 부위를 염기-42번에 위치한 ATG 코돈에서 생성시키고[참조 : Mathison et al., Current Genetics submitted], 구조 유전자 내의 내부 NcoI 부위를 시스템[Altered Sites in vitro Mutagenesis System(Promega Corporation)]을 사용하여 부위-지시된 돌연변이 유발로 제거한다. 돌연변이 유발은 제조업자의 지시에 따라 수행한다. 작제된 올리고뉴클레오타이드는 관심 대상인 DNA 영역의 암호화 서열에 상보적이기는 하나 NcoI 부위를 생성시키거나 제거하기 위해 일부가 변화되어 있다. 구조 유전자내에서 내부 NcoI 부위를 제거하는 데 사용되는 올리고뉴클레오타이드 서열은 하기와 같다.

염기-42에서 ATG에 신규한 NcoI 부위를 생성시키는데 사용되는 올리고뉴클레오타이드 서열은 하기와 같다.

올리고뉴클레오타이드를 시아노에틸 포스포르아미디트 화학(Pharmacia Gene Assembler instrumentation)에 의해 합성한다. 두 돌연변이 유발 사례를 제한 효소 분석에 의해 확인한다. 이 벡터를 pMUTACT로 지정한다. 페니실리움 IPNS 프로모터를 상기 벡터 pUTZ-2로부터 1.2kb NcoI 단편으로서 분리(아가로스겔 상에서 전기영동하여 용출시킴)한다. 이 프로모터 단편을 NcoI 절단 벡터 pMUTACT에 연결시켜 IPNS 프로모터가 세팔로스포리움 아세틸트랜스퍼라제 유전자의 -42 ATG에 바로 위치하게 한다. 프로모터의 방향을 제한 효소 분석에 의해 확인한다. 이 벡터를 pMUTACT/IPNS로 지정한다. 2.5kb XhoI/SalI 단편을, IPNS 프로모터 : 아세틸트랜스퍼라제 카셋트를 함유하는 벡터 pMUTACT/IPNS로부터 분리(아가로스겔 상에서 전기 영동하여 용출시킴)한 후 SalI 분해된 벡터 pUTZ-2(상기)에 연결시킨다. 그런 다음 이 중간체 벡터를 XbaI로 분해하고, IPNS 프로모터 : 엑스팬다제/하이드록실라제 카셋트를 함유하는 벡터 pPEN/CEPH-1(상기)로부터의 2.1kb XbaI 단편과 연결하여 최종 형질전환 벡터 pTS-8을 수득한다.

[실시예14]

[페니실리움 크리소게늄의 형질전환]

상기 페니실리움 크리소게늄 균주로부터의 원형질체를, 1×10⁷개 포자와 함께 CM 브로쓰 50ml를 220rpm의 회전 진탕기 상에서 25℃로 67시간 배양하여 생성시킨다. 무명 필터로 여과시켜 균사체를 회수하고, 이를 500ml 플라스크에 옮겨 노보자임 234(Novo BioLabs, Bagsvaerd, Denmark)100mg을 함유하는 KMP(0.7M KCl, 0.8M 만니톨, 0.02M KPO₄pH 6.3) 25ml에 재현탁시키고 30℃에서 100rpm으로 배양시킨다. 스페로플라스트(spheroplast)를 무명/유리섬유 필터를 통해 여과하여 분리하고 350xg로 10분간 원심분리하여 펠렛화한다. 그런 다음 스페로플라스트를 KMP 완충액 10ml로 3회 세척한 후 KMPC(50mM CaCl₂가 있는 KMP)에 5×10⁷세포/ml의 농도로 재현탁시켜 실온에서 20분간 정치시킨다. 페니실리움의 형질전환을 위해, 스페로플라스트 현탁액 200㎕를 PPC(40% PEG MW 3500, 20mM KPO₄, pH 6.3, 5% CaCl₂를 사용 직전에 가한다) 50㎕와 함께 DNA(5mg/ml 헤파린과 함께 KMPC 6.2㎕ 중의 벡터 DNA 5㎍)에 가하고 형질전환 혼합물을 얼음상에서 30분간 배양한다. 새로이 제조된 PPC 1ml를 가하고 혼합을 용융된(50℃) 회수 한천(CM + 1.3M 만니톨 및 3% 한천) 50ml에 옮긴다. 그런 다음 형질전환 혼합물을 5개 페트리 디쉬 사이에 분배한다. 25℃에서 24시간 동안 회수한 후 플레오마이신 100㎍/50ml OL을 함유하는 OL(1% 한천중 1% 펩톤)로 평판을 오버레이(overlay) 한다. 오버레이 양은 회수 한천의 양과 동일하다. 평판을 25℃에서 7 내지 14일간 배양하고 형질전환 콜로니의 형성에 대해 관축한다.

[실시예 15]

[생물할성 검정]

한천 확산 생물검정을 사용하여 HPLC 분리된 아디포일-6-APA 및 아디포일-7-ADCA 발효 생성물의 항생제 활성을 측정한다. 분리된 생성물 20㎕를, 바실러스 서브틸리스 ATCC 33677 또는 이.콜라이 슈퍼 센시티브 균주(Prof. Arnold L. Demain, MIT에서 공급)로 씨딩(seeding)된 LB 한천 평판[3% 한천이 가해진 20g/ℓ LB 브로쓰 기재)(Gibco, Paisley, Scotland)] 상에 도말하여 5mm 디스크를 형성시킨다. 바실러스 서브틸루스를 지시제 균주로서 사용하여 아디포일-6-APA 생성물을 검정하고, 이.콜라이 슈퍼 센서티브 균주를 아디포일-7-ADCA 생성물을 검정하기 위한 지시제 균주로서 사용한다. 37℃에서 배양한 지 15시간 후 디스크 주변에 지시제 세균의 억제된 생장의 륜(halo)은 생성물이 생물활성을 나타냄을 지시한다. 이러한 실험에서의 대조군은 데아세톡시 세팔로스포린 C, 세팔로스포린 C, 페니실린 V, 및 페니실린아제 함유 한천 또는 페니실린아제 비함유 한천(β-락탐 구조의 확인을 위한 대조군의 경우)을 포함한다.

[실시예 16]

[아디포일- : 6-APA, 7-ADCA, 7-ADAC 및 7-ACA의 동시 분석을 위한 HPLC 방법]

형질전환된 페니실리움 균주(아디포일-6-APA, 아디포일-7-ADCA, 아디포일-7-ADAC 및 아디포일-7-ACA)로부터의 발효 생성물을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 동시에 분석한다. HPLC 시스템은 하기 워터스 성분으로 이루어진다. 625 용매 전달 시스템, 409E 변이 파장 검출기(220nm 및 260nm에서 고정), 825 맥시마(Maxima) 데이터 시스템. 정체상은 삽입체(Nova-Pak C₁₈Guard-Pak insert)가 있는 Nova-Pak C₁₈5×100mm 방사 압착 카트리지이다. 이동상(1ml/분유동)은 5% 메탄올 및 95% 10mM KPO₄, pH 5의 초기 조건에서 40% 메탄올 및 60% KPO₄, pH 5의 10분 선형 구배로 이루어진다. 아디포일-6-APA를 220nm에서 페니실린 N의 표준 곡선과 비교하여 정량화한다. 증량된 생성물을 합성 아디포일-7-ADCA 및 아디포일-7-ACA의 260nm에서의 표준 곡선과 비교하여 정량화한다.

[실시예 17]

[RAEV 효소 검정]

화학적으로 합성된 아디포일-7-ADCA 및 아디포일-7-ACA를 기질로 사용하여 RAEV 효소(RAEV Corp.에서 시판되어 입수가능)의 특이 활성을 측정한다. 반응 혼합물은 총 50㎖ 용량의 0.16M KH₂PO₄중에 10mM 기질, RAEV 효소 1㎍, 5% 글리세롤을 함유하고, 이를 37℃에서 배양한다(보다 적정 반응 조건은 20 내지 50mM 인산칼륨 완충액중 20mM 이상의 기질 사용을 포함한다). 분취량 5㎕를 0,1,3,5,10,20 및 30분에 취하고, 0.010M KH₂PO₄pH 3.5 35㎕로 희석후, 상기 조건하에 HPLC로 분석하기에 앞서 -70℃에서 동결시킨다.

비색계 아디포일-P-아미노벤조산 기질에 대한 RAEV 효소의 활성을 0.065M KH₂PO₄pH 7.0(총 용량 50㎕) 중의 5mM기질, RAEV 효소 8.25㎍, 10% 굴리세롤을 사용하여 37℃에서 30분간 검정한다. 반응을 96웰 미세역가 디쉬에서 수행한다. 0.25M아세트산중 1M NaNO₂1/100 희석물 50㎕를 가해 반응을 종결시키고, 반응물을 실온에서 30분간 방치한다. 0.5M NaCO₃내로 H₂O중 4-아미노-5-하이드록시-2,7-나프탈렌-디설폰산 일나트륨염 수화물 10mg/mL의 1/100 희석물 100㎕를 가하고, 판독기(EL 312 Bio-Kinetics Plate Reader, Biotek Instruments)를 사용하여 515nm에서 발색을 즉시 모니터한다.

[실시예 18]

[또 다른 아디포일 아실라제의 평가]

RAEV 효소를 사용하는 연구 이외에, 아디포일-7-ADCA( 및 기타 아디포일 화합물)로부터의 아디포일 측쇄 제거를 다양한 미생물 공급원으로부터 생산된 효소로 입증한다. 초기 연구에서 아사히 슈도모나스 종(Asahi Pseudomonas sp.) 균주 SE-83 및 SE-495(Fermentation Reseauch Institute에 기탁번호 제FERM BP-817 및 FERM BP-818로 각각 기탁) 및 토요 조조 슈도모나스(Toyo Jozo Pseudomonas) 균주 SY-77-1(Northern Regional Research Laboratory에 NRRL B-8070으로 기탁)을, 2.0%(w/v) HyCase SF; 0.5%(w/v) 글루탐산일나트륨; 0.5%(w/v) 효모 추출물; 0.2%(w/v) 옥수수 침지 분말; 0.5%(w/v) 면실유 및 0.1%(w/v) 글루타르산을 함유하는 배지에서 72시간 동안 생장시킨다. 세포를 원심분리에 의해 수거하고 50mM 인산염 완충액(pH 8.0)으로 세척한다; 그런 다음 완충액중에 재현탁시키고 소량의 클로로포름을 가하여 외막을 투과성으로 만든다. 그런 다음 세포 현탁액의 분취량을 아디포일-파라-니트로아닐라이드(ad-pNA)와 혼합하고 30℃에서 2 내지 18시간 동안 배양한다. 배양 후, 10%(w/v) 아세트산을 가해 혼합물을 산성화시킨다. 그런 다음 방출된 p-니트로아닐린을, -글루타민-트랜스퍼라제(Sigma Product number 545-A)의 검정을 위해 시그마 케미칼 캄파니에서 키트형으로 제공되는 시약을 사용하여 디아조 화합물로의 전환을 비색계 수단으로 검출한다. SE-495, SE-83 및 SY-77-1 3가지 균주의 각각의 상대 활성은 100%, 85.5% 및 48%이다. 상기 RAEV 효소에 대해 기술된 바와 유사한 방법을 사용하여, 아디포일-7-ADCA에 대한 SE-83 및 SE-495 효소 활성 또한 입증한다. SY-77-1에 의한 β-락타마제 생산으로 인해 아디포일-7-ADCA에 대한 상기 균주에 의한 탈아실화 활성이 입증되지 못했다. 유사한 방법에 의해 아디포일-아실라제 생산을 또한 2개의 진균 균주[알터나리아종(Alternaria sp.) MA-133, ATCC No. 20492 및 아스퍼질러스종 MA-13, ATCC No. 20491; U.S. 4,141,790, Meij seita Kaisha Ltd.] 및 3개의 추가 세균 균주[브레비박테 리움(Bre vibacterium), ATCC No. 14,649, 아크로모박테리움(Achromobacterium), ATCC No. 14,648, 및 플라보박테리움(Flavobacterium), ATCC No. 14,650, 머크 앤드 캄파니, 인코포레이티드의 미합중국 특허 제3,239,394호에서 세팔로스포린 C 아실라제 생산체로 기술됨)에 대해 입증하였다.

Claims (13)

1) 이소페니실린 N을 생산하는 페니실리움 크리소게늄(Penicillium chrysogenum) 균주의 생장을 지속시킬 수 있는 배지 중에서 상기 균주를 유지시키고, 페니실리움 크리소게늄 균주에 의해 동화되고 이용될 수 있는 하나 이상의 아디프산 또는 이의 염 및 에스테르를 포함하는 아디페이트 영양 원액을 배지에 가해 아디포일-6-아미노페니실란산(아디포일-6-APA)을 생산하는 단계; 2) a) 기질로서 아디포일-6-APA를 허용할 수 있는 엑스 팬다제(expandase) 효소 활성을 암호화하는 DNA로 피.크리소게늄 균주를 형질전환시켜 이를 발현한 결과 상기 균주에 의해 생산된 아디포일 6-APA를 동일계 환 연장시켜 아디포일-7-아미노데스아세톡시세팔로스포린산(아디포일-7-ADCA)를 형성시키는 방식으로, 엑스팬다제 효소에 의해 아디포일-6-APA를 동일계로 환-연장시켜 아디포일-7-ADCA를 형성시키고; b) 기질로서 상기 아디포일-7-ADCA를 허용할 수 있는 하이드록실라제 효소의 활성을 암호화하는 DNA에 의해 피.크리소 게늄 균주를 형질 전환시켜 이를 발현한 결과 상기 균주에 의해 생산된 아디포일-7-ADCA를 동일계 하이드록실화시켜 아디포일-7-아미노데아세틸세팔로스포란산(아디포일-7-ADAC)를 형성시키는 방식으로, 하이드록실라제 효소에 의해 아디포일-7-ADCA의 3-메틸 측쇄를 동일계 하이드록실화시켜 아디포일-7-ADAC를 형성시키는 바와 같이 효소적 전환을 상응하는 유전자의 동일계 발현에 의해 수행하는 단계; 및 3) 아디포일-7-ADAC를 아디포일 아미다제와 접촉시킴으로써 아디포일 측쇄를 제거하고 7-ADAC 생성물을 형성시킨 후 이 생성물을 분리하는 단계를 포함하는, 7-아미노데아세틸 세팔로스포란산(7-ADAC)을 제조하기 위한 생물학적 공정.

제1항에 있어서, 아디페이트 영양 원액이 이나트륨 아디페이트인 생물학적 공정.

제1항에 있어서, 엑스팬다제 및 하이드록실라제 효소의 활성을 암호화하는 DNA가 세팔로스포리움 아크레모니움(Cephalosporium acremonium)으로부터 유도되는 생물학적 공정.

제3항에 있어서, 단일 이작용성 엑스팬다제/하이드록실라제 효소를 사용하는 생물학적 공정.

제1항에 있어서, 아디포일 아미다제가 슈도모나스(Pseudomonas)종으로부터 유도되는 생물학적 공정.

1) 이소페니실린 N을 생산하는 페니실리움 크리소게늄 균주의 생장을 지속시킬 수 있는 배지에서 상기 균주를 유지시키고, 페니실리움 크리소게늄 균주에 의해 동화되고 이용될 수 있는 하나 이상의 아디프산 또는 이의 염 및 에스테르를 포함하는 아디페이트 영양 원액을 배지에 가해 아디포일-6-아미노페니실란산(아디포일-6-APA)을 생산하는 단계; 2) a) 기질로서 아디포일-6-APA를 허용할 수 있는 엑스 팬다제 효소 활성을 암호화하는 DNA로 피.크리소게늄 균주를 형질전환시켜, 이를 발현한 결과 상기 균주에 의해 생산된 아디포일-6-APA를 동일계 환 연장시켜 아디포일-7-ADCA를 형성시키는 방식으로, 엑스팬다제 효소에 의해 아디포일-6-APA를 동일계 환-연장시켜 아디포일-7-아미노데아세톡시 세팔로스포란산(아디포일-7-ADCA)를 형성시키고; b) 기질로서 상기 아디포일-7-ADCA를 허용할 수 있는 하이드록실라제 효소의 활성을 암호화하는 DNA에 의해 피.크리소 게늄 균주를 형질 전환시켜 이를 발현한 결과 상기 균주에 의해 생산된 아디포일-7-ADCA를 동일계 하이드록실화시켜 아디포일-7-ADAC를 형성시키는 방식으로, 하이드록실라제 효소에 의해 아디포일-7-ADCA의 3-메틸 측쇄를 동일계 하이드록실화시켜 아디포일-7-아미노데아세틸 세팔로스포란산(아디포일-7-아미노데아세틸세팔로스포란산(아디포일-7-ADAC)을 형성시키며; c) 기질로서 상기 아디포일-7-ADAC를 허용할 수 있는 아세틸트랜스퍼라제 효소의 활성을 암호화하는 DNA에 의해 피. 크리소게늄 균주를 형질전환시켜 이를 발현한 결과 상기 균주에 의해 생산된 아디포일-7-ADAC를 동일계 아세틸화하여 아디포일-7-ACA를 형성시키는 방식으로, 아세틸트랜스퍼라제 효소에 의해 아디포일-7-ADAC를 동일계 아세틸화시켜 아디포일-7-아미노 세팔로스포란산(아디포일-7-ACA)을 형성시키는 바와 같은 효소적 전환을 상응하는 유전자의 동일계 발현에 의해 수행하는 단계; 3) 아디포일-7-ACA를 아디포일 아미다제와 접촉시킴으로써 아디포일 측쇄를 제거하고 7-ACA 생성물을 형성시킨 후 이 생성물을 분리하는 단계를 포함하는, 7-아미노 세팔로스포란산(7-ACA)을 제조하는 신규한 생물학적 공정.

제6항에 있어서, 아디페이트 영양 원액이 이나트륨 아디페이트인 생물학적 공정.

제6항에 있어서, 엑스팬다제, 하이드록실라제 및 아세틸트랜스퍼라제 효소의 활성을 암호화하는 DNA가 세팔로스포리움 아크레모니움으로부터 유도되는 생물학적 공정.

제8항에 있어서, 단일 이작용성 엑스팬다제/하이드록실라제 효소를 사용하는 생물학적 공정.

제6항에 있어서, 아디포일 아미다제가 슈도모나스 종으로부터 유도되는 생물학적 공정.

세팔로스포리움 아크레모니움으로부터 수득된 엑스팬다제/하이드록실라제 및/또는 아세틸트랜스퍼라제 활성을 암호화하는 DNA, 및 페니실리움 크리소게늄 IPNS 유전자의 프로모터로 실질적으로 이루어진, 상기 엑스팬다제/하이드록실라제 및/또는 아세틸트랜스퍼라제 활성-암호화 DNA의 발현을 유도하는 프로모터로 실질적으로 이루어짐을 특징으로 하는, 재조합 페니실리움 크리소게늄 균주의 염색체 DNA내로 혼입될 수 있는 재조합 DNA 발현 벡터인 플라스미드 PEN/CEPH-1, pPenCACT 및 pTS-8.

각각 세팔로스포리움 아크레모니움으로부터 유도된 엑스팬다제/하이드록실라제 및 아세틸트랜스퍼라제 활성을 암호화하는 DNA, 및 페니실리움 크리소게늄 IPNS 유전자의 프로모터로 실질적으로 이루어진, 상기 엑스팬다제/하이드록실라제 및 아세틸트랜스퍼라제 활성-암호화 DNA의 발현을 유도하는 프로모터로 실질적으로 이루어지고, 페니실리움 크리소게늄 숙주세포의 염색체 DNA내로 혼입되는, 재조합 DNA 발현 벡터인 플라스미드 pPEN/CEPH-1 또는 플라스미드 pTS-8로 각각 형질전환된, 페니실리움 크리소게늄 숙주 세포인 PC200(ATCC 74186) 또는 PC300(ATCC 74187).

각각 세팔로스포리움 아크레모니움으로부터 수득된 엑스팬다제/하이드록실라제 및 아세틸트랜스퍼라제 활성을 암호화하는 DNA, 및 페니실리움 크리소게늄 IPNS 유전자의 프로모터로 실질적으로 포함하는 상기 엑스팬다제/하이드록실라제 및 아세틸트랜스퍼라제 활성-암호화 DNA 발현을 유도하는 프로모터로 실질적으로 이루어지고 페니실리움 크리소게늄 숙주 세포의 염색체 DNA내로 혼입되는, 재조합 DNA 발현 벡터인 플라스미드 pPEN/CEPH-1 또는 플라스미드 pTS-8을 포함하는 재조합 페니실리움 크리소게늄 숙주 세포를 유전자 발현에 적합한 조건하에 배양하는 단계를 포함하는 생물학적 공정.