JPH06113884A - ７−ａｃａ及び７−ａｄａｃを製造するための新規なバイオプロセス - Google Patents
７−ａｃａ及び７−ａｄａｃを製造するための新規なバイオプロセスInfo
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- JPH06113884A JPH06113884A JP4319194A JP31919492A JPH06113884A JP H06113884 A JPH06113884 A JP H06113884A JP 4319194 A JP4319194 A JP 4319194A JP 31919492 A JP31919492 A JP 31919492A JP H06113884 A JPH06113884 A JP H06113884A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ７−アミノ−セファロスポラン酸（７−ＡＣ
Ａ）及び７−アミノデアセチルセファロスポラン酸（７
−ＡＤＡＣ）を製造するための新規なバイオプロセス
は、アジペート原液の存在下に形質転換Ｐｅｎｉｃｉｌ
ｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ菌株を培養してアジポ
イル−６−ＡＰＡ（６−アミノペニシラン酸）を産生さ
せ、次いで、Ｐ．ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍの形質転換に用
いた遺伝子、即ち、（１）Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕ
ｍ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍに由来のエキスパンダーゼ遺
伝子、（２）ヒドロキシラーゼ遺伝子、（３）アセチル
トランスフフェラーゼ遺伝子をｉｎ ｓｉｔｕ発現させ
る。アジポイルアシラーゼを用いたアジポイル側鎖の開
裂によって最終生成物７−ＡＣＡを得る。 【効果】 バイオプロセスによって完全合成が行なわ
れ、合成の効率及び経済性がよい。
Ａ）及び７−アミノデアセチルセファロスポラン酸（７
−ＡＤＡＣ）を製造するための新規なバイオプロセス
は、アジペート原液の存在下に形質転換Ｐｅｎｉｃｉｌ
ｌｉｕｍ ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ菌株を培養してアジポ
イル−６−ＡＰＡ（６−アミノペニシラン酸）を産生さ
せ、次いで、Ｐ．ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍの形質転換に用
いた遺伝子、即ち、（１）Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕ
ｍ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍに由来のエキスパンダーゼ遺
伝子、（２）ヒドロキシラーゼ遺伝子、（３）アセチル
トランスフフェラーゼ遺伝子をｉｎ ｓｉｔｕ発現させ
る。アジポイルアシラーゼを用いたアジポイル側鎖の開
裂によって最終生成物７−ＡＣＡを得る。 【効果】 バイオプロセスによって完全合成が行なわ
れ、合成の効率及び経済性がよい。
Description
【産業上の利用分野】本発明は市販用セファロスポリン
抗生物質を製造する合成方法の分野に関する。かなりの
数の市販セファロスポリンが現に存在しており、治療薬
としては既にその第四世代に入っている。市販セファロ
スポリン類に多様な側鎖が検出される、セファロスポリ
ンが多額の経済的負担を与える、などの理由から、種々
のセファロスポリン類の容易な合成に適した基幹中間体
を調整し得る経済的で有効な方法を開発することが益々
重要になっている。これらの基幹中間体の１例は７−ア
ミノーセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）であり、これ
は式：
抗生物質を製造する合成方法の分野に関する。かなりの
数の市販セファロスポリンが現に存在しており、治療薬
としては既にその第四世代に入っている。市販セファロ
スポリン類に多様な側鎖が検出される、セファロスポリ
ンが多額の経済的負担を与える、などの理由から、種々
のセファロスポリン類の容易な合成に適した基幹中間体
を調整し得る経済的で有効な方法を開発することが益々
重要になっている。これらの基幹中間体の１例は７−ア
ミノーセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）であり、これ
は式：
【化１】 によって示される。現在、７−ＡＣＡはセファロスポリ
ンＣから製造されている。セファロスポリンＣ自体は、
現在市販されているほぼ全てのセファロスポリン類の出
発点となる発酵生成物である。しかしながら、これらの
種々の市販セファロスポリン類を製造するための合成的
操作は多くの場合、基本的には７−アミノセファロスポ
ラン酸を出発物質としており、この出発物質は、７−ア
ミノアジポイル側鎖を開裂することによってセファロス
ポリンＣから誘導される必要がある。７−ＡＣＡから合
成的に誘導され、従って３−アセチルオキシメチレン側
鎖を有する代表的な市販セファロスポリン類としては、
例えば、セフォタキシム、セファログリシン、セファロ
チン、及びセファピリンがある。基幹中間体の別の例は
７−アミノデアセチルセファロスポラン酸（７−ＡＤＡ
Ｃ）であり、これは式：
ンＣから製造されている。セファロスポリンＣ自体は、
現在市販されているほぼ全てのセファロスポリン類の出
発点となる発酵生成物である。しかしながら、これらの
種々の市販セファロスポリン類を製造するための合成的
操作は多くの場合、基本的には７−アミノセファロスポ
ラン酸を出発物質としており、この出発物質は、７−ア
ミノアジポイル側鎖を開裂することによってセファロス
ポリンＣから誘導される必要がある。７−ＡＣＡから合
成的に誘導され、従って３−アセチルオキシメチレン側
鎖を有する代表的な市販セファロスポリン類としては、
例えば、セフォタキシム、セファログリシン、セファロ
チン、及びセファピリンがある。基幹中間体の別の例は
７−アミノデアセチルセファロスポラン酸（７−ＡＤＡ
Ｃ）であり、これは式：
【化２】 によって示される。現状では、７−ＡＤＡＣもまた、セ
ファロスポリンＣの７−Ｄ−α−アミノアジポイル側鎖
を除去し、同時に３−アセチルオキシメチレン側鎖を３
−ヒドロキシメチルに変換することによって製造されて
いる。７−ＡＤＡＣは、Ｃ−３位に修飾置換基を含んで
おりセファロスポリン類の合成に有用な中間化合物であ
る。７−アミノアジポイル側鎖を開裂するために当業界
では現在、化学的方法が選択されている。塩基性イミノ
−ハロゲン化物プロセスでは、７−アミノアジポイル側
鎖のアミノ基とカルボキシル基とを封鎖する必要があ
り、このためにいくつかの方法が現在使用されている。
しかしながら、現在使用されている化学的開裂プロセス
は重大な欠点を有している。特に指摘すべき欠点として
は、複雑な多段階プロセスが必要なこと、処理温度が極
めて低いこと、高価な試薬を使用すること、相当量のプ
ロセス副生物が生成するので廃液処理の問題が生じるこ
と、極めて不純な出発物質を化学的処理開始の前に精製
する必要があること、などがある。従って、現行の化学
的プロセスよりも経済的に７−アミノセファロスポラン
酸を製造するために、セファロスポリンＣを酵素的に脱
アシル化する微生物プロセスまたは発酵プロセスの研究
が進められている。しかしながら、このような好ましい
微生物学的プロセスの研究は概して失敗に終わってい
る。ペニシリンは多様な微生物によって産生されるペニ
シリンアシラーゼを用いた酵素的開裂による脱アシル化
に成功しているので、上記の失敗の理由は、文献にも明
らかなように、セファロスポリンＣのアミノアジポイル
側鎖の構造、特にその立体化学にある。また、セファロ
スポリンＣの１段階酵素的脱アシル化の成功は文献に報
告されてはいるが、これらの報告はしばしば再現性に欠
けるかまたは辛うじて採算の合う程度の収率しか得られ
ない。従って本発明は特に、基幹セファロスポリン７−
ＡＣＡの製造の分野、特に７−ＡＣＡを製造するバイオ
プロセスの分野に関する。今日まで、７−ＡＣＡを製造
するための好ましいバイオプロセスの研究は概して、特
に工業生産規模では確実に失敗に終わっている。例え
ば、ペニシリンＧの直接発酵及び／または酵素処理によ
って６−アミノペニシラン酸（６−ＡＰＡ）を製造し、
環拡張させるだけで７−ＡＤＣＡを得ることは可能であ
ったが、不運にも、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍまた
はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓなどの微生物の正常代謝経
路で環拡張を生起させるＣｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ
またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの酵素は６−ＡＰＡを
基質として受容しないことが知見された。当業界でＤＡ
ＯＣＳまたはエキスパンダーゼ酵素と総称されているこ
れらの酵素は、ペニシリン型分子に検出されるペナム環
構造が拡張してセファロスポリン類に検出されるセフ−
３−エム（ｃｅｐｈ−３−ｅｍ）環を与える作用を触媒
する酵素であると定義されている。以後の記載では、こ
れらの酵素を「エキスパンダーゼ酵素」と総称する。エ
キスパンダーゼ酵素の作用を受けない基質はペニシリン
Ｎであり、これは環拡張及びヒドロキシル化によってデ
アセチルセファロスポラン酸（ＤＡＣ）を与える。ここ
では、７−ＡＤＡＣを与えるために（Ｄ）−α−アミノ
アジポイル側鎖の開裂が必要なだけであるが、この側鎖
は酵素的開裂に対して極めて耐性であり、許容できない
低収率しか与えないことが判明した。本発明によれば、
（アジポイル側鎖を有する）ペニシリン化合物を新規な
発酵プロセスによって高力価で産生する有力なバイオプ
ロセスが提供される。上記ペニシリン化合物は、エキス
パンダーゼ酵素を発現するように形質転換されたペニシ
リン化合物産生微生物によってｉｎ ｓｉｔｕ（その場
で）産生されるエキスパンダーゼ酵素の許容される基質
となる。従ってエキスパンダーゼ酵素はペニシリン化合
物を環拡張させてセファロスポリン化合物を高収率で与
えるべく作用する。エキスパンダーゼ酵素のｉｎ ｓｉ
ｔｕ作用によって産生されるアジポイル−７−ＡＤＣＡ
は、３−メチル（−ＣＨ３）側鎖を有しているが、最終
産生物７−ＡＣＡは３−アセチルオキシメチル〔−ＣＨ
２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３〕側鎖を有している。本発明によれ
ば、３−メチルを３−アセチルオキシメチル側鎖に変換
するために、本発明によれば、エキスパンダーゼ活性に
加えて別の２つの酵素活性がｉｎ ｓｉｔｕ発現され
る。これらは順次にヒドロキシラーゼ及びアセチルトラ
ンスフェラーゼであり、双方が、ペニシリン化合物を産
生する微生物を形質転換させた遺伝子の発現産物であ
る。ヒドロキシラーゼ酵素はアジポイル−７−ＡＤＣＡ
の３−メチル側鎖を３−ヒドロキシメチルに変換し、ア
セチルトランスフェラーゼ酵素はこの３−ヒドロキシメ
チル側鎖を７−ＡＣＡの３−アセチルオキシメチル側鎖
に変換する。更に本発明方法の極めて重要な最終段階で
は、ペニシリン化合物、ここではセファロスポリン化合
物の側鎖を、別の酵素系によって驚異的な収率で除去し
得る。本発明のこの独特の全バイオプロセスは、７−Ａ
ＣＡを驚異的な高収率で産生し、現在使用されている化
学的及び生化学的な処理方法の好ましい代替方法となり
得る十分な経済性を有するという予想外の結果を与え
た。
ファロスポリンＣの７−Ｄ−α−アミノアジポイル側鎖
を除去し、同時に３−アセチルオキシメチレン側鎖を３
−ヒドロキシメチルに変換することによって製造されて
いる。７−ＡＤＡＣは、Ｃ−３位に修飾置換基を含んで
おりセファロスポリン類の合成に有用な中間化合物であ
る。７−アミノアジポイル側鎖を開裂するために当業界
では現在、化学的方法が選択されている。塩基性イミノ
−ハロゲン化物プロセスでは、７−アミノアジポイル側
鎖のアミノ基とカルボキシル基とを封鎖する必要があ
り、このためにいくつかの方法が現在使用されている。
しかしながら、現在使用されている化学的開裂プロセス
は重大な欠点を有している。特に指摘すべき欠点として
は、複雑な多段階プロセスが必要なこと、処理温度が極
めて低いこと、高価な試薬を使用すること、相当量のプ
ロセス副生物が生成するので廃液処理の問題が生じるこ
と、極めて不純な出発物質を化学的処理開始の前に精製
する必要があること、などがある。従って、現行の化学
的プロセスよりも経済的に７−アミノセファロスポラン
酸を製造するために、セファロスポリンＣを酵素的に脱
アシル化する微生物プロセスまたは発酵プロセスの研究
が進められている。しかしながら、このような好ましい
微生物学的プロセスの研究は概して失敗に終わってい
る。ペニシリンは多様な微生物によって産生されるペニ
シリンアシラーゼを用いた酵素的開裂による脱アシル化
に成功しているので、上記の失敗の理由は、文献にも明
らかなように、セファロスポリンＣのアミノアジポイル
側鎖の構造、特にその立体化学にある。また、セファロ
スポリンＣの１段階酵素的脱アシル化の成功は文献に報
告されてはいるが、これらの報告はしばしば再現性に欠
けるかまたは辛うじて採算の合う程度の収率しか得られ
ない。従って本発明は特に、基幹セファロスポリン７−
ＡＣＡの製造の分野、特に７−ＡＣＡを製造するバイオ
プロセスの分野に関する。今日まで、７−ＡＣＡを製造
するための好ましいバイオプロセスの研究は概して、特
に工業生産規模では確実に失敗に終わっている。例え
ば、ペニシリンＧの直接発酵及び／または酵素処理によ
って６−アミノペニシラン酸（６−ＡＰＡ）を製造し、
環拡張させるだけで７−ＡＤＣＡを得ることは可能であ
ったが、不運にも、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍまた
はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓなどの微生物の正常代謝経
路で環拡張を生起させるＣｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ
またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの酵素は６−ＡＰＡを
基質として受容しないことが知見された。当業界でＤＡ
ＯＣＳまたはエキスパンダーゼ酵素と総称されているこ
れらの酵素は、ペニシリン型分子に検出されるペナム環
構造が拡張してセファロスポリン類に検出されるセフ−
３−エム（ｃｅｐｈ−３−ｅｍ）環を与える作用を触媒
する酵素であると定義されている。以後の記載では、こ
れらの酵素を「エキスパンダーゼ酵素」と総称する。エ
キスパンダーゼ酵素の作用を受けない基質はペニシリン
Ｎであり、これは環拡張及びヒドロキシル化によってデ
アセチルセファロスポラン酸（ＤＡＣ）を与える。ここ
では、７−ＡＤＡＣを与えるために（Ｄ）−α−アミノ
アジポイル側鎖の開裂が必要なだけであるが、この側鎖
は酵素的開裂に対して極めて耐性であり、許容できない
低収率しか与えないことが判明した。本発明によれば、
（アジポイル側鎖を有する）ペニシリン化合物を新規な
発酵プロセスによって高力価で産生する有力なバイオプ
ロセスが提供される。上記ペニシリン化合物は、エキス
パンダーゼ酵素を発現するように形質転換されたペニシ
リン化合物産生微生物によってｉｎ ｓｉｔｕ（その場
で）産生されるエキスパンダーゼ酵素の許容される基質
となる。従ってエキスパンダーゼ酵素はペニシリン化合
物を環拡張させてセファロスポリン化合物を高収率で与
えるべく作用する。エキスパンダーゼ酵素のｉｎ ｓｉ
ｔｕ作用によって産生されるアジポイル−７−ＡＤＣＡ
は、３−メチル（−ＣＨ３）側鎖を有しているが、最終
産生物７−ＡＣＡは３−アセチルオキシメチル〔−ＣＨ
２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３〕側鎖を有している。本発明によれ
ば、３−メチルを３−アセチルオキシメチル側鎖に変換
するために、本発明によれば、エキスパンダーゼ活性に
加えて別の２つの酵素活性がｉｎ ｓｉｔｕ発現され
る。これらは順次にヒドロキシラーゼ及びアセチルトラ
ンスフェラーゼであり、双方が、ペニシリン化合物を産
生する微生物を形質転換させた遺伝子の発現産物であ
る。ヒドロキシラーゼ酵素はアジポイル−７−ＡＤＣＡ
の３−メチル側鎖を３−ヒドロキシメチルに変換し、ア
セチルトランスフェラーゼ酵素はこの３−ヒドロキシメ
チル側鎖を７−ＡＣＡの３−アセチルオキシメチル側鎖
に変換する。更に本発明方法の極めて重要な最終段階で
は、ペニシリン化合物、ここではセファロスポリン化合
物の側鎖を、別の酵素系によって驚異的な収率で除去し
得る。本発明のこの独特の全バイオプロセスは、７−Ａ
ＣＡを驚異的な高収率で産生し、現在使用されている化
学的及び生化学的な処理方法の好ましい代替方法となり
得る十分な経済性を有するという予想外の結果を与え
た。
【従来の技術】本発明の新規なバイオプロセスは、極め
て有効な独特の７−ＡＣＡの製造方法を提供する。この
方法は、経済的に実用化可能な現行の化学的合成の代替
方法を構成し得る。このようなバイオプロセスを開発す
るために当業界で続けられてきた研究は何度も失敗し
た。例えば、欧州特許公開第０，４２２，７９０号は、
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓのイソペニ
シリンＮ：アシル−ＣｏＡアシルトトラスフェラーゼ活
性をコードするＤＮＡを記載し、該ＤＮＡを使用してペ
ニシリン産生真菌類中で有用なセファロスポリンを産生
させるためのこれまでに成功例のない方法を開示してい
る。しかしながら、該特許では、セファロスポリン産生
微生物に由来のエピメラーゼ酵素及びエキスパンダーゼ
酵素をコードする遺伝子の添加に伴ってアシルトランス
フェラーゼ遺伝子を破壊または転位させると記載されて
いる。更に、有用な形質転換及び発現結果が全く実現し
なかったことは明らかである。また、形質転換に成功し
たとしても、Ｄ−α−アミノアジポイル側鎖をどのよう
にして除去するかに関する問題が残っているので本発明
の目的に役立つことはできない。ペニシリン産生真菌類
の培養物から市販用セファロスポリン中間体を産生する
という好ましい結果を得るための当業者の試みが失敗に
帰していることは、本発明方法で達成された結果と全く
対照的である。本発明方法における第１の酵素的バイオ
プロセスは、非組換えペニシリウム・クリソゲナムＰｅ
ｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ宿主の形
質転換に用いたエキスパンダーゼ遺伝子の発現産物であ
るエキスパンダーゼ酵素によって行なわれるアジポイル
−６−ＡＰＡの環拡張である。かかるエキスパンダーゼ
酵素の使用は従来技術でも模索されている。例えば、Ｃ
ａｎｔｗｅｌｌ他は、Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ（１９９
０）１７：２１３〜２２１において、７−ＡＤＣＡを製
造するために、ペニシリンＶを環拡張させ、得られたデ
アセトキシセファロスポリンＶを次いで酵素的加水分解
して７−ＡＤＣＡを形成させるバイオプロセスを提案し
た。この提案は、Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓに由来
のクローン化ペニシリンＮエキスパンダーゼ遺伝子（ｃ
ｅｆＥ）が入手可能であることに基づいている：Ｋｏｖ
ａｃｅｖｉｃ他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ（１９８９）
１７１：７５４〜７６０；及びＩｎｇｏｌｉａ他、米国
特許第５，０７０，０２０号。しかしながら、エキスパ
ンダーゼはその天然基質であるペニシリンＮに作用する
がペニシリンＶに作用しないので、この提案では、ペニ
シリンＶを環拡張させ得る修飾エキスパンダーゼ遺伝子
を産生するための遺伝子操作が必要である。しかしなが
らＣａｎｔｗｅｌｌ他は、必要な修飾を達成することは
できなかったので、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａ
ｖｕｌｉｇｅｒｕｓに由来のｃｅｆＥ遺伝子によってＰ
ｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍを形質
転換させ、ＤＡＯＣＳ（エキスパンダーゼ）酵素を低レ
ベルで発現させることに成功しただけである。エキスパ
ンダーゼ酵素はその活性及びその遺伝子配列の双方に関
して当業界で研究の進んだ酵素である。例えば、Ｗｏｌ
ｆｅの米国特許第４，５１０，２４６号及び第４，５３
６，４７６号は、シクラーゼ、エピメラーゼ及び環拡張
酵素を、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇ
ｅｒｕｓのようなβ−ラクタムを産生する原核生物の無
細胞抽出物から個別に単離し、安定な酵素試薬を提供し
た。Ｄｏｔｚｌａｆの米国特許第５，０８２，７７２号
（欧州特許公開０，３６６，３５４号）はＳ．ｃｌａｖ
ｕｌｉｇｅｒｕｓから単離し精製したエキスパンダーゼ
酵素を記載しており、この酵素は末端残基及びアミノ酸
組成によって特性決定されており、分子量約３４，６０
０ダルトンを有すると言われている。しかしながらこの
分子量は、米国特許第４，５３６，４７６号で同じ酵素
であると考えられる酵素の分子量２９，０００とはかな
り違っている。欧州特許公開第０，２３３，７１５号
は、Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓから得られたエキス
パンダーゼ遺伝子の単離、エンドヌクレアーゼ制限地図
キャラクタリゼーション、及び、セファロスポリン産生
能力が欠如したＳ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ菌株中に
おける（活性エキスパンダーゼ酵素を産生する）エキス
パンダーゼをコードする組換えＤＮＡの発現を開示して
いる。Ｉｎｇｏｌｉａ他の米国特許第５，０７０，０２
０号（欧州特許公開第０，３４１，８９２号）は、Ｓ．
ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓから得られたエキスパンダー
ゼ酵素をコードするＤＮＡ配列を開示し、該ＤＮＡ配列
を含む発現ベクターによるＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ
菌株を形質転換し、これによってエキスパンダーゼ酵素
の発現を得ることを記載している。この酵素がペニシリ
ンＮ以外の基質の拡張に有用であることは示唆されてい
るが、拡張の実例は示されていない。上記の研究ではい
ずれも、原核生物Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓに由来
のエキスパンダーゼ酵素が注目されていた。明らかに同
じ環拡張活性を有する酵素はまた、真核生物セファロス
ポリウム・アクレモニウムＣｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕ
ｍ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃ
ｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍとも呼ばれる）菌株によって発現
される。しかしながら、この菌株中ではエキスパンダー
ゼ活性が２機能遺伝子（ｃｅｆＥＦ）によって発現さ
れ、該遺伝子は、エキスパンダーゼ酵素の産生物である
デスアセトキシセファロスポラン酸（ＤＡＯＣ）をデア
セチルセファロスポリン Ｃ（ＤＡＣ）に変換する自然
機能を有するＤＡＣＳ（ヒドロキシラーゼ）活性を発現
する。このような発現の結果は、エキスパンダーゼ／ヒ
ドロキシラーゼの２つの機能を有する単一酵素によって
与えられる。これらの２つの遺伝子産物の活性を分離す
る試みもあったが、まだ成功はみていない。例えば、欧
州特許公開第０，２８１，３９１号は、Ｃ．ａｃｒｅｍ
ｏｎｉｕｍ ＡＴＣＣ １１５５０から得られたＤＡＯ
ＣＳ／ＤＡＣＳ遺伝子の単離及びＤＮＡ配列同定並びに
酵素の対応するアミノ酸配列を開示している。Ｐｅｎｉ
ｃｉｌｌｉｕｍは形質転換されて酵素を発現させるが、
ペニシリンＧ及びＶを対応するセファロスポリンに変換
させる実験は証明されていない。更に、遺伝子操作技術
がＤＡＯＣＳをコードする遺伝情報をＤＡＣＳから分離
しそれらを別々に発現させる容易な手段を提供すること
は示唆されているが、このような分離の実験は証明され
ていない。Ｃ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍのＤＡＯＣＳ／Ｄ
ＡＣＳ（エキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ）酵素も
また、その活性及び特性と遺伝子配列に関して当業界で
十分に研究されている。例えば、Ｄｅｍａｉｎの米国特
許第４，１７８，２１０号、第４，２４８，９６６号及
び第４，３０７，１９２号は、種々のペニシリン型の出
発物質を、エピマー化及び環拡張の作用を有するＣ．ａ
ｃｒｅｍｏｎｉｕｍの無細胞抽出物で処理してセファロ
スポリン抗生物質を産生する。Ｗｕ−Ｋｕａｎｇ Ｙｅ
ｈの米国特許第４，７５３，８８１号は、Ｃ．ａｃｒｅ
ｍｏｎｉｕｍ酵素の等電点、分子量、アミノ酸残基、ヒ
ドロキシラーゼ活性とエキスパンダーゼ活性との比及び
ペプチドフラグメントを記載している。Ｃ．ａｃｒｅｍ
ｏｎｉｕｍのアセチルトランスフェラーゼ酵素に関して
もその活性、特性、制限マッピング、ヌクレオチド及び
核酸配列は当業界の文献に記載されている。例えば欧州
特許公開第０，４３７，３７８号及び第０，４５０，７
５８号がある。上記で検討した従来技術では、本発明の
１つの面、即ち、エキスパンダーゼ及びエキスパンダー
ゼ／ヒドロキシラーゼ酵素を発現する遺伝子によって
Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ菌株を形質転換させ、これ
らの酵素の発現を得るという面だけを取り扱っている。
しかしながら、発現された酵素をペニシリンＮの環拡張
のためにだけ使用し、ペニシリンＧ及びＶには使用しな
かった。また、ペニシリンＮ環拡張のために使用する場
合でも、ペニシリンＮは７−位側鎖を有しており、この
側鎖は遊離アミノ基を離脱させるために酵素的に開裂す
ることができない。本発明は、アジポイル側鎖にＰ．ｃ
ｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ菌株が有効に付加し得ること、ｉ
ｎ ｓｉｔｕ発現されたエキスパンダーゼ酵素が得られ
た化合物を環拡張のための基質として有効に使用してア
ジポイル７−ＡＤＣＡを産生し得ること、ｉｎ ｓｉｔ
ｕ発現されたヒドロキシラーゼ及びアセチルトランスフ
ェラーゼ酵素もまたアジポイル−７−ＡＤＣＡを基質と
して使用して７−ＡＣＡの３−アセトキシメチル側鎖を
産生し得ること、次にアジポイル側鎖が別の酵素によっ
て有効に除去されて７−ＡＣＡを与えること、などの意
外な知見に基づく。本発明の種々の単離フラグメントは
従来技術で知見されているかもしれないが、本発明方法
によって得られた予想外の結果を与えるためにそれらを
組み合わせることが示唆されたことはない。例えば、６
−アジポイルペニシラン酸の産生は当業界で公知であ
る；Ｂａｌｌｉｏ、Ａ．他、Ｎａｔｕｒｅ（１９６０）
１８５、９７〜９９参照。６−アジポイルペニシラン酸
の酵素的拡張もｉｎ ｖｉｔｒｏに限って当業界で公知
である；Ｂａｌｄｗｉｎ他、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
（１９８７）４３、３００９〜０１４；及び欧州特許公
開第０，２６８，３４３号参照。また、アジポイル側鎖
の酵素的開裂も当業界で公知である；例えばＭａｔｓｕ
ｄａ他、Ｊ．Ｂａｃｔ．（１９８７）１６９、５８１５
〜５８２０参照。アジポイル側鎖は式：ＣＯＯＨ−（Ｃ
Ｈ２）４−ＣＯ−で示される構造を有している。極めて
近縁の構造の２つの側鎖は、式：ＣＯＯＨ−（ＣＨ２）
３−ＣＯ−をの構造を有するグルタリル側鎖、及び、
式：ＣＯＯＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−（ＣＨ２）３−ＣＯ−
の構造を有する（Ｄ）−α−アミノアジポイル側鎖であ
る。グルタリル側鎖の酵素的開裂は当業界で公知であ
る。例えばＳｈｉｂｕｙａ他、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．
ｃｈｅｍ．（１９８１）４５、１５６１〜１５６７及び
米国特許第３，９６０，６６２号；Ｍａｔｓｕｄａ ＆
Ｋｏｍａｔｓｕ、Ｊ．Ｂａｃｔ．（１９８５）１６
３、１２２２〜１２２８；Ｍａｔｓｕｄａ他、Ｊ．Ｂａ
ｃｔ．（１９８７）１６９、５８１５〜５８２０；Ｊａ
Ｐ．５３−０８６０８４（１９７８−Ｂａｎｙｕ Ｐｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）；Ｊａ
ｐ．５２−１２８２９３（１９７７−Ｂａｎｙｕ Ｐｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）また欧州
特許公開第０，４５，０４８号は、プソイドモナスＰｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ＳＹ−７７−１によって産生され
るグルタリルアシラーゼのアジポイル開裂活性を改善す
る方法を記載している。α−サブユニット内部のいくつ
かの位置の種々のアミノ酸を置換することによって、３
〜５倍のアジポイル開裂率（アジポイル−セリンから）
が観察された。明らかに欧州特許公開第０，４５３，０
４８号はアジポイル側鎖に対する活性が改善されたアシ
ラーゼを開示しているが、アジポイル−セファロスポリ
ンをまず産生させる方法（化学的方法または本明細書に
記載の方法と同様のバイオプロセスのいずれでもよい）
は全く記載していないことに注目されたい。（Ｄ）−α
−アミノアジポイル側鎖が存在する場合、まず（Ｄ）−
アミノ酸オキシダーゼによってアミノ基を酵素的に除去
して側鎖を短縮し、グルタリル（ＧＬ−７）側鎖を残
し、第２酵素（グルタリルアシラーゼ）によってグルタ
リル側鎖を除去することは当業界で公知である。このよ
うな２段階開裂はＭａｔｓｕｄａの米国特許第３，９６
０，６６２号；欧州特許公開第０，２７５，９０１号；
Ｊａｐ．６１−２１８０５７（１９８８−Ｋａｍａｔｓ
ｕ、Ａｓａｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ
Ｃｏ．）；国際特許出願ＷＯ９０／１２１１０（１９
９０−Ｗｏｎｇ、Ｂｉｏｐｕｒｅ Ｃｏｒｐ．）；欧州
特許公開第０，４３６３５５号、及び、Ｉｓｏｇａｉ
他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９１）９、１
８８〜１９１に記載されている。また、特に組換え技術
を用いた（Ｄ）−α−アミノアジポイル側鎖の１段階開
裂も当業界で公知である。例えば以下の文献を参照する
とよい：（Ｄ）−α−アミノアジポイル側鎖の１段階開裂 ： −Ｊａｐ．５３−９４０９３（Ｍｅｉｊｉ、Ｐｓｅｕｄ
ｏｎｏｍａｓ ｓｐ．ＢＮ−１８８）； −Ｊａｐ．５２−１４３２８９（＝米国特許第４，１４
１，７９０号、Ｍｅｉｊｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｓｐ．）； −米国特許第４，７７４，１７９号（Ａｓａｈｉ １９
８８、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｍａｓ ｓｐ．ＳＥ−８３ ＆
ＳＥ−４９５）、＝Ｊａｐ．６１−２１０９７＆ Ｊ
ａｐ．６１−１５２２８６； −仏国特許公開第２，２４１，５５７号（Ａｒｉｅｓ
１９７５、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ｖａｒ．
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）； −Ｊａｐ．５２−０８２７９１（Ｔｏｙｏ Ｊｏｚｏ
１９７７、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ
ＮＲＲＬ Ｂ ５３８５）； −欧州特許公開第０，３２１，８４９号（Ｈｏｅｃｈｓ
ｔ、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｍａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ、γ−グルタミルトランスペプチダー
ゼ）； −欧州特許公開第０，３２２，０３２号、欧州特許公開
第０，４０５，８４６号、米国特許第５，１０４，８０
０号（Ｍｅｒｃｋ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒ
ｉｕｍ）； −欧州特許公開第０，２８３，２１８号、及び米国特許
第４，９８１，７８９号（Ｍｅｒｃｋ、Ａｒｔｈｒｏｂ
ａｃｔｅｒ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）；１段階組換え：Ｃｅｐｈ Ｃ→７−ＡＣＡ ： −Ｊａｐ．６０−１１０２９２（Ａｓａｈｉ １９８
５、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｓｐ．
ＳＹ−７７−１に由来の遺伝子を有する組換えＥ．ｃｏ
ｌｉ、１段階変換）； −Ｊａｐ．６１−１５２−２８６（Ａｓａｈｉ １９８
６、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、特許請求の範囲に記載さ
れた遺伝子配列のＰｓｅｕｒｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｓ
Ｅ８３に由来の遺伝子を有する組換えＥ．ｃｏｌｉ、米
国特許第４，７７４，１７９号の特許請求の範囲に既に
記載された１段階プロセス）； −Ｊａｐ．６３−７４４８８（Ａｓａｈｉ １９８８、
Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｃｏｍ
ａｍｏｎａｓ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ及びＧＬ−７
−ＡＣＡアシラーゼ構築物の組換えＥ．ｃｏｌｉ発
現）； −欧州特許公開第０，４７５，６５２号（Ｆｕｊｉｓａ
ｗａ、セファロスポリンＣアシラーゼ及び組換え技術に
よるその産生）。 ７−ＡＤＡＣの産生方法の種々の局面は当業界で公知で
ある。例えば、米国特許第３，３０４，２３６号及び第
３，９７２，７７４号（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ＆Ｃ
ｏ．）；欧州特許公開第０，４５４，４７８号（Ｓｈｉ
ｏｎｏｇｉ ＆ Ｃｏ．，Ｌｔｄ，）；Ｐｕｂｌｉｓｈ
ｅｄ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ０
４ ５３，４９９（Ｓｈｉｏｎｏｇｉ ＆ Ｃｏ．，Ｌ
ｔｄ．）。同時係属出願の参照 １９９２年８月２８日出願の米国特許出願第０７／９３
３，４６９号は、７−ＡＤＡＣ及び７−ＡＣＡを製造す
るための本発明のバイオプロセスと同様に、Ｐ．ｃｈｒ
ｙｓｏｇｅｎｕｍ形質転換体中のエキスパンダーゼ酵素
の活性の発現に基づいて７−ＡＤＣＡを製造するバイオ
プロセスを開示している。しかしながら、本発明のバイ
オプロセスでは、該出願で示唆されていない最終生成物
を分離するために全く異なる組換え代謝経路を与える追
加の形質転換を使用して追加の酵素活性を発現させる。
本発明方法及び上記に参照した従来技術の教示をより十
分に理解するために、アジポイル−６−ＡＰＡ、アジポ
イル−７−ＡＤＣＡ、アジポイル−７−ＡＣＡ、及び７
−ＡＣＡ、などの中間生成物に導く代謝経路の種々の段
階の代表例、及び関連する形質転換を生起させる酵素に
関して以下に説明する。
て有効な独特の７−ＡＣＡの製造方法を提供する。この
方法は、経済的に実用化可能な現行の化学的合成の代替
方法を構成し得る。このようなバイオプロセスを開発す
るために当業界で続けられてきた研究は何度も失敗し
た。例えば、欧州特許公開第０，４２２，７９０号は、
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓのイソペニ
シリンＮ：アシル−ＣｏＡアシルトトラスフェラーゼ活
性をコードするＤＮＡを記載し、該ＤＮＡを使用してペ
ニシリン産生真菌類中で有用なセファロスポリンを産生
させるためのこれまでに成功例のない方法を開示してい
る。しかしながら、該特許では、セファロスポリン産生
微生物に由来のエピメラーゼ酵素及びエキスパンダーゼ
酵素をコードする遺伝子の添加に伴ってアシルトランス
フェラーゼ遺伝子を破壊または転位させると記載されて
いる。更に、有用な形質転換及び発現結果が全く実現し
なかったことは明らかである。また、形質転換に成功し
たとしても、Ｄ−α−アミノアジポイル側鎖をどのよう
にして除去するかに関する問題が残っているので本発明
の目的に役立つことはできない。ペニシリン産生真菌類
の培養物から市販用セファロスポリン中間体を産生する
という好ましい結果を得るための当業者の試みが失敗に
帰していることは、本発明方法で達成された結果と全く
対照的である。本発明方法における第１の酵素的バイオ
プロセスは、非組換えペニシリウム・クリソゲナムＰｅ
ｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ宿主の形
質転換に用いたエキスパンダーゼ遺伝子の発現産物であ
るエキスパンダーゼ酵素によって行なわれるアジポイル
−６−ＡＰＡの環拡張である。かかるエキスパンダーゼ
酵素の使用は従来技術でも模索されている。例えば、Ｃ
ａｎｔｗｅｌｌ他は、Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ（１９９
０）１７：２１３〜２２１において、７−ＡＤＣＡを製
造するために、ペニシリンＶを環拡張させ、得られたデ
アセトキシセファロスポリンＶを次いで酵素的加水分解
して７−ＡＤＣＡを形成させるバイオプロセスを提案し
た。この提案は、Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓに由来
のクローン化ペニシリンＮエキスパンダーゼ遺伝子（ｃ
ｅｆＥ）が入手可能であることに基づいている：Ｋｏｖ
ａｃｅｖｉｃ他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ（１９８９）
１７１：７５４〜７６０；及びＩｎｇｏｌｉａ他、米国
特許第５，０７０，０２０号。しかしながら、エキスパ
ンダーゼはその天然基質であるペニシリンＮに作用する
がペニシリンＶに作用しないので、この提案では、ペニ
シリンＶを環拡張させ得る修飾エキスパンダーゼ遺伝子
を産生するための遺伝子操作が必要である。しかしなが
らＣａｎｔｗｅｌｌ他は、必要な修飾を達成することは
できなかったので、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａ
ｖｕｌｉｇｅｒｕｓに由来のｃｅｆＥ遺伝子によってＰ
ｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍを形質
転換させ、ＤＡＯＣＳ（エキスパンダーゼ）酵素を低レ
ベルで発現させることに成功しただけである。エキスパ
ンダーゼ酵素はその活性及びその遺伝子配列の双方に関
して当業界で研究の進んだ酵素である。例えば、Ｗｏｌ
ｆｅの米国特許第４，５１０，２４６号及び第４，５３
６，４７６号は、シクラーゼ、エピメラーゼ及び環拡張
酵素を、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇ
ｅｒｕｓのようなβ−ラクタムを産生する原核生物の無
細胞抽出物から個別に単離し、安定な酵素試薬を提供し
た。Ｄｏｔｚｌａｆの米国特許第５，０８２，７７２号
（欧州特許公開０，３６６，３５４号）はＳ．ｃｌａｖ
ｕｌｉｇｅｒｕｓから単離し精製したエキスパンダーゼ
酵素を記載しており、この酵素は末端残基及びアミノ酸
組成によって特性決定されており、分子量約３４，６０
０ダルトンを有すると言われている。しかしながらこの
分子量は、米国特許第４，５３６，４７６号で同じ酵素
であると考えられる酵素の分子量２９，０００とはかな
り違っている。欧州特許公開第０，２３３，７１５号
は、Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓから得られたエキス
パンダーゼ遺伝子の単離、エンドヌクレアーゼ制限地図
キャラクタリゼーション、及び、セファロスポリン産生
能力が欠如したＳ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ菌株中に
おける（活性エキスパンダーゼ酵素を産生する）エキス
パンダーゼをコードする組換えＤＮＡの発現を開示して
いる。Ｉｎｇｏｌｉａ他の米国特許第５，０７０，０２
０号（欧州特許公開第０，３４１，８９２号）は、Ｓ．
ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓから得られたエキスパンダー
ゼ酵素をコードするＤＮＡ配列を開示し、該ＤＮＡ配列
を含む発現ベクターによるＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ
菌株を形質転換し、これによってエキスパンダーゼ酵素
の発現を得ることを記載している。この酵素がペニシリ
ンＮ以外の基質の拡張に有用であることは示唆されてい
るが、拡張の実例は示されていない。上記の研究ではい
ずれも、原核生物Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓに由来
のエキスパンダーゼ酵素が注目されていた。明らかに同
じ環拡張活性を有する酵素はまた、真核生物セファロス
ポリウム・アクレモニウムＣｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕ
ｍ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃ
ｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍとも呼ばれる）菌株によって発現
される。しかしながら、この菌株中ではエキスパンダー
ゼ活性が２機能遺伝子（ｃｅｆＥＦ）によって発現さ
れ、該遺伝子は、エキスパンダーゼ酵素の産生物である
デスアセトキシセファロスポラン酸（ＤＡＯＣ）をデア
セチルセファロスポリン Ｃ（ＤＡＣ）に変換する自然
機能を有するＤＡＣＳ（ヒドロキシラーゼ）活性を発現
する。このような発現の結果は、エキスパンダーゼ／ヒ
ドロキシラーゼの２つの機能を有する単一酵素によって
与えられる。これらの２つの遺伝子産物の活性を分離す
る試みもあったが、まだ成功はみていない。例えば、欧
州特許公開第０，２８１，３９１号は、Ｃ．ａｃｒｅｍ
ｏｎｉｕｍ ＡＴＣＣ １１５５０から得られたＤＡＯ
ＣＳ／ＤＡＣＳ遺伝子の単離及びＤＮＡ配列同定並びに
酵素の対応するアミノ酸配列を開示している。Ｐｅｎｉ
ｃｉｌｌｉｕｍは形質転換されて酵素を発現させるが、
ペニシリンＧ及びＶを対応するセファロスポリンに変換
させる実験は証明されていない。更に、遺伝子操作技術
がＤＡＯＣＳをコードする遺伝情報をＤＡＣＳから分離
しそれらを別々に発現させる容易な手段を提供すること
は示唆されているが、このような分離の実験は証明され
ていない。Ｃ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍのＤＡＯＣＳ／Ｄ
ＡＣＳ（エキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ）酵素も
また、その活性及び特性と遺伝子配列に関して当業界で
十分に研究されている。例えば、Ｄｅｍａｉｎの米国特
許第４，１７８，２１０号、第４，２４８，９６６号及
び第４，３０７，１９２号は、種々のペニシリン型の出
発物質を、エピマー化及び環拡張の作用を有するＣ．ａ
ｃｒｅｍｏｎｉｕｍの無細胞抽出物で処理してセファロ
スポリン抗生物質を産生する。Ｗｕ−Ｋｕａｎｇ Ｙｅ
ｈの米国特許第４，７５３，８８１号は、Ｃ．ａｃｒｅ
ｍｏｎｉｕｍ酵素の等電点、分子量、アミノ酸残基、ヒ
ドロキシラーゼ活性とエキスパンダーゼ活性との比及び
ペプチドフラグメントを記載している。Ｃ．ａｃｒｅｍ
ｏｎｉｕｍのアセチルトランスフェラーゼ酵素に関して
もその活性、特性、制限マッピング、ヌクレオチド及び
核酸配列は当業界の文献に記載されている。例えば欧州
特許公開第０，４３７，３７８号及び第０，４５０，７
５８号がある。上記で検討した従来技術では、本発明の
１つの面、即ち、エキスパンダーゼ及びエキスパンダー
ゼ／ヒドロキシラーゼ酵素を発現する遺伝子によって
Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ菌株を形質転換させ、これ
らの酵素の発現を得るという面だけを取り扱っている。
しかしながら、発現された酵素をペニシリンＮの環拡張
のためにだけ使用し、ペニシリンＧ及びＶには使用しな
かった。また、ペニシリンＮ環拡張のために使用する場
合でも、ペニシリンＮは７−位側鎖を有しており、この
側鎖は遊離アミノ基を離脱させるために酵素的に開裂す
ることができない。本発明は、アジポイル側鎖にＰ．ｃ
ｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ菌株が有効に付加し得ること、ｉ
ｎ ｓｉｔｕ発現されたエキスパンダーゼ酵素が得られ
た化合物を環拡張のための基質として有効に使用してア
ジポイル７−ＡＤＣＡを産生し得ること、ｉｎ ｓｉｔ
ｕ発現されたヒドロキシラーゼ及びアセチルトランスフ
ェラーゼ酵素もまたアジポイル−７−ＡＤＣＡを基質と
して使用して７−ＡＣＡの３−アセトキシメチル側鎖を
産生し得ること、次にアジポイル側鎖が別の酵素によっ
て有効に除去されて７−ＡＣＡを与えること、などの意
外な知見に基づく。本発明の種々の単離フラグメントは
従来技術で知見されているかもしれないが、本発明方法
によって得られた予想外の結果を与えるためにそれらを
組み合わせることが示唆されたことはない。例えば、６
−アジポイルペニシラン酸の産生は当業界で公知であ
る；Ｂａｌｌｉｏ、Ａ．他、Ｎａｔｕｒｅ（１９６０）
１８５、９７〜９９参照。６−アジポイルペニシラン酸
の酵素的拡張もｉｎ ｖｉｔｒｏに限って当業界で公知
である；Ｂａｌｄｗｉｎ他、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
（１９８７）４３、３００９〜０１４；及び欧州特許公
開第０，２６８，３４３号参照。また、アジポイル側鎖
の酵素的開裂も当業界で公知である；例えばＭａｔｓｕ
ｄａ他、Ｊ．Ｂａｃｔ．（１９８７）１６９、５８１５
〜５８２０参照。アジポイル側鎖は式：ＣＯＯＨ−（Ｃ
Ｈ２）４−ＣＯ−で示される構造を有している。極めて
近縁の構造の２つの側鎖は、式：ＣＯＯＨ−（ＣＨ２）
３−ＣＯ−をの構造を有するグルタリル側鎖、及び、
式：ＣＯＯＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−（ＣＨ２）３−ＣＯ−
の構造を有する（Ｄ）−α−アミノアジポイル側鎖であ
る。グルタリル側鎖の酵素的開裂は当業界で公知であ
る。例えばＳｈｉｂｕｙａ他、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．
ｃｈｅｍ．（１９８１）４５、１５６１〜１５６７及び
米国特許第３，９６０，６６２号；Ｍａｔｓｕｄａ ＆
Ｋｏｍａｔｓｕ、Ｊ．Ｂａｃｔ．（１９８５）１６
３、１２２２〜１２２８；Ｍａｔｓｕｄａ他、Ｊ．Ｂａ
ｃｔ．（１９８７）１６９、５８１５〜５８２０；Ｊａ
Ｐ．５３−０８６０８４（１９７８−Ｂａｎｙｕ Ｐｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）；Ｊａ
ｐ．５２−１２８２９３（１９７７−Ｂａｎｙｕ Ｐｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）また欧州
特許公開第０，４５，０４８号は、プソイドモナスＰｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ＳＹ−７７−１によって産生され
るグルタリルアシラーゼのアジポイル開裂活性を改善す
る方法を記載している。α−サブユニット内部のいくつ
かの位置の種々のアミノ酸を置換することによって、３
〜５倍のアジポイル開裂率（アジポイル−セリンから）
が観察された。明らかに欧州特許公開第０，４５３，０
４８号はアジポイル側鎖に対する活性が改善されたアシ
ラーゼを開示しているが、アジポイル−セファロスポリ
ンをまず産生させる方法（化学的方法または本明細書に
記載の方法と同様のバイオプロセスのいずれでもよい）
は全く記載していないことに注目されたい。（Ｄ）−α
−アミノアジポイル側鎖が存在する場合、まず（Ｄ）−
アミノ酸オキシダーゼによってアミノ基を酵素的に除去
して側鎖を短縮し、グルタリル（ＧＬ−７）側鎖を残
し、第２酵素（グルタリルアシラーゼ）によってグルタ
リル側鎖を除去することは当業界で公知である。このよ
うな２段階開裂はＭａｔｓｕｄａの米国特許第３，９６
０，６６２号；欧州特許公開第０，２７５，９０１号；
Ｊａｐ．６１−２１８０５７（１９８８−Ｋａｍａｔｓ
ｕ、Ａｓａｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ
Ｃｏ．）；国際特許出願ＷＯ９０／１２１１０（１９
９０−Ｗｏｎｇ、Ｂｉｏｐｕｒｅ Ｃｏｒｐ．）；欧州
特許公開第０，４３６３５５号、及び、Ｉｓｏｇａｉ
他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９１）９、１
８８〜１９１に記載されている。また、特に組換え技術
を用いた（Ｄ）−α−アミノアジポイル側鎖の１段階開
裂も当業界で公知である。例えば以下の文献を参照する
とよい：（Ｄ）−α−アミノアジポイル側鎖の１段階開裂 ： −Ｊａｐ．５３−９４０９３（Ｍｅｉｊｉ、Ｐｓｅｕｄ
ｏｎｏｍａｓ ｓｐ．ＢＮ−１８８）； −Ｊａｐ．５２−１４３２８９（＝米国特許第４，１４
１，７９０号、Ｍｅｉｊｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｓｐ．）； −米国特許第４，７７４，１７９号（Ａｓａｈｉ １９
８８、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｍａｓ ｓｐ．ＳＥ−８３ ＆
ＳＥ−４９５）、＝Ｊａｐ．６１−２１０９７＆ Ｊ
ａｐ．６１−１５２２８６； −仏国特許公開第２，２４１，５５７号（Ａｒｉｅｓ
１９７５、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ｖａｒ．
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）； −Ｊａｐ．５２−０８２７９１（Ｔｏｙｏ Ｊｏｚｏ
１９７７、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ
ＮＲＲＬ Ｂ ５３８５）； −欧州特許公開第０，３２１，８４９号（Ｈｏｅｃｈｓ
ｔ、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｍａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ、γ−グルタミルトランスペプチダー
ゼ）； −欧州特許公開第０，３２２，０３２号、欧州特許公開
第０，４０５，８４６号、米国特許第５，１０４，８０
０号（Ｍｅｒｃｋ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒ
ｉｕｍ）； −欧州特許公開第０，２８３，２１８号、及び米国特許
第４，９８１，７８９号（Ｍｅｒｃｋ、Ａｒｔｈｒｏｂ
ａｃｔｅｒ ｖｉｓｃｏｓｕｓ）；１段階組換え：Ｃｅｐｈ Ｃ→７−ＡＣＡ ： −Ｊａｐ．６０−１１０２９２（Ａｓａｈｉ １９８
５、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｓｐ．
ＳＹ−７７−１に由来の遺伝子を有する組換えＥ．ｃｏ
ｌｉ、１段階変換）； −Ｊａｐ．６１−１５２−２８６（Ａｓａｈｉ １９８
６、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、特許請求の範囲に記載さ
れた遺伝子配列のＰｓｅｕｒｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｓ
Ｅ８３に由来の遺伝子を有する組換えＥ．ｃｏｌｉ、米
国特許第４，７７４，１７９号の特許請求の範囲に既に
記載された１段階プロセス）； −Ｊａｐ．６３−７４４８８（Ａｓａｈｉ １９８８、
Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｃｏｍ
ａｍｏｎａｓ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ及びＧＬ−７
−ＡＣＡアシラーゼ構築物の組換えＥ．ｃｏｌｉ発
現）； −欧州特許公開第０，４７５，６５２号（Ｆｕｊｉｓａ
ｗａ、セファロスポリンＣアシラーゼ及び組換え技術に
よるその産生）。 ７−ＡＤＡＣの産生方法の種々の局面は当業界で公知で
ある。例えば、米国特許第３，３０４，２３６号及び第
３，９７２，７７４号（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ＆Ｃ
ｏ．）；欧州特許公開第０，４５４，４７８号（Ｓｈｉ
ｏｎｏｇｉ ＆ Ｃｏ．，Ｌｔｄ，）；Ｐｕｂｌｉｓｈ
ｅｄ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ０
４ ５３，４９９（Ｓｈｉｏｎｏｇｉ ＆ Ｃｏ．，Ｌ
ｔｄ．）。同時係属出願の参照 １９９２年８月２８日出願の米国特許出願第０７／９３
３，４６９号は、７−ＡＤＡＣ及び７−ＡＣＡを製造す
るための本発明のバイオプロセスと同様に、Ｐ．ｃｈｒ
ｙｓｏｇｅｎｕｍ形質転換体中のエキスパンダーゼ酵素
の活性の発現に基づいて７−ＡＤＣＡを製造するバイオ
プロセスを開示している。しかしながら、本発明のバイ
オプロセスでは、該出願で示唆されていない最終生成物
を分離するために全く異なる組換え代謝経路を与える追
加の形質転換を使用して追加の酵素活性を発現させる。
本発明方法及び上記に参照した従来技術の教示をより十
分に理解するために、アジポイル−６−ＡＰＡ、アジポ
イル−７−ＡＤＣＡ、アジポイル−７−ＡＣＡ、及び７
−ＡＣＡ、などの中間生成物に導く代謝経路の種々の段
階の代表例、及び関連する形質転換を生起させる酵素に
関して以下に説明する。
【化３】
【発明の概要】本発明は、７−アミノデアセチルセファ
ロスポラン酸（７−ＡＤＡＣ）を製造するための新規な
バイオプロセスに関する。本発明のバイオプロセスは、 （１）イソペニシリンＮを産生するＰｅｎｉｃｉｌｌｉ
ｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ菌株をその増殖を支持し
得る培地中に維持し、アジポイル−６−アミノペニシラ
ン酸（アジポイル−６−ＡＰＡ）を産生すべく前記Ｐｅ
ｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ菌株によ
って同化され利用され得るアジピン酸またはその塩及び
エステルのいずれか１種以上から成るアジペート原液を
前記培地に添加して前記アジポイル−６−ＡＰＡを産生
させる段階と、 （２）対応する遺伝子のｉｎ ｓｉｔｕ発現によって以
下の酵素的変換を生起させる段階、即ち、（ａ）エキス
パンダーゼ酵素によってアジポイル−６−ＡＰＡをｉｎ
ｓｉｔｕ環拡張させてアジポイル−７−アミノデスア
セトキシセファロスポラン酸（アジポイル−７−ＡＤＣ
Ａ）を形成させるために、前記アジポイル−６−ＡＰＡ
を基質として受容し得るエキスパンダーゼ酵素の活性を
コードするＤＮＡによって前記Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ
ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ菌株を形質転換させ、その発
現の結果として次に、前記菌株によって産生された前記
アジポイル−６−ＡＰＡをｉｎ ｓｉｔｕ環拡張させて
アジポイル−７−ＡＤＣＡを形成する段階、及び、
（ｂ）ヒドロキシラーゼ酵素によってアジポイル−７−
ＡＤＣＡの３−メチル側鎖をｉｎ ｓｉｔｕヒドロキシ
ル化してアジポイル−７−アミノデアセチルセファロス
ポラン酸（アジポイル−７−ＡＤＡＣ）を産生させるた
めに、前記アジポイル−７−ＡＤＣＡを基質として受容
し得るヒドロキシラーゼ酵素の活性をコードするＤＮＡ
によって前記Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇ
ｅｎｕｍ菌株を形質転換させ、その発現の結果として次
に、前記菌株によって産生された前記アジポイル−７−
ＡＤＣＡをｉｎ ｓｉｔｕヒドロキシル化してアジポイ
ル−７−ＡＤＡＣを形成する段階と、 （３）前記アジポイル−７…ＡＤＡＣをアジポイルアミ
ダーゼと接触させることによって、アジポイル側鎖を除
去し、７−ＡＤＡＣ産生物を形成させ、前記産生物を単
離する段階とから成る。 本発明は更に、７−アミノセファロスポラン酸（７−Ａ
ＣＡ）を製造するための新規なバイオプロセスに関す
る。本発明のバイオプロセスは、 （１）イソペニシリンＮを産生するＰｅｎｉｃｉｌｌｉ
ｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ菌株をその増殖を支持し
得る培地中に維持し、アジポイル−６−アミノペニシラ
ン酸（アジポイル−６−ＡＰＡ）を産生すべく前記Ｐｅ
ｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ菌株によ
って同化され利用され得るアジピン酸またはその塩及び
エステルのいずれか１種以上から成るアジペート原液を
前記培地に添加して前記アジポイル−６−ＡＰＡを産生
させる段階と、 （２）対応する遺伝子のｉｎ ｓｉｔｕ発現によって以
下の酵素的変換を生起させる段階、即ち、（ａ）エキス
パンダーゼ酵素によってアジポイル−６−ＡＰＡをｉｎ
ｓｉｔｕ環拡張させてアジポイル−７−アミノデスア
セトキシセファロスポラン酸（アジポイル−７−ＡＤＣ
Ａ）を形成させるために、前記アジポイル−６−ＡＰＡ
を基質として受容し得るエキスパンダーゼ酵素の活性を
コードするＤＮＡによって前記Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎ
ｕｍ菌株を形質転換させ、その発現の結果として次に、
前記菌株によって産生された前記アジポイル−６−ＡＰ
Ａをｉｎ ｓｉｔｕ環拡張させてアジポイル−７−ＡＤ
ＣＡを形成する段階、及び、（ｂ）ヒドロキシラーゼ酵
素によってアジポイル−７−ＡＤＣＡの３−メチル側鎖
をｉｎ ｓｉｔｕヒドロキシル化してアジポイル−７−
アミノデアセチルセファロスポラン酸（アジポイル−７
−ＡＤＡＣ）を産生させるために、前記アジポイル−７
−ＡＤＣＡを基質として受容し得るヒドロキシラーゼ酵
素の活性をコードするＤＮＡによって前記Ｐ．ｃｈｒｙ
ｓｏｇｅｎｕｍ菌株を形質転換させ、その発現の結果と
して次に、前記菌株によって産生された前記アジポイル
−７−ＡＤＣＡをｉｎ ｓｉｔｕヒドロキシル化してア
ジポイル−７−ＡＤＡＣを形成する段階、及び、（ｃ）
アセチルトランスフェラーゼ酵素によってアジポイル−
７−ＡＤＡＣをｉｎ ｓｉｔｕアセチル化してアジポイ
ル−７−アミノセファロスポラン酸（アジポイル−７−
ＡＣＡ）を産生させるために、前記アジポイル−７−Ａ
ＤＡＣを基質として受容し得るアセチルトランスフェラ
ーゼ酵素の活性をコードするＤＮＡによって前記Ｐ．ｃ
ｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ菌株を形質転換させ、その発現の
結果として次に、前記菌株によって産生された前記アジ
ポイル−７−ＡＤＡＣをｉｎｓｉｔｕアセチル化してア
ジポイル−７−ＡＣＡを形成する段階と、 （３）前記アジポイル−７−ＡＣＡをアジポイルアミダ
ーゼと接触させることによって、アジポイル側鎖を除去
し、７−ＡＣＡ産生物を形成させ、前記産生物を単離す
る段階とから成る。 本文中で使用した用語を以下のごとく定義する；「７−
ＡＣＡ」は、３−〔（アセチルオキシ）−メチル〕−７
−アミノ−８−オキソ−５−チア−１−アザビシクロ
〔４．２．０〕オクトー２−エン−２−カルボン酸；
「アジポイル−６−ＡＰＡ」は、〔２Ｓ−（２α，５
α，６β）〕−３，３−ジメチル−７−オキソ−６−
〔ヘキサン−１，６−ジオイル）アミノ〕−４−チア−
１−アザビシクロ〔３．２．０〕ヘプタン−２−カルボ
ン酸；「アジポイル−７−ＡＤＣＡ」は、３−メチル−
７−〔（ヘキサン−１，６−ジオイル）アミノ〕−３−
メチル−８−オキソ−５−チア−１−アザビシクロ
〔４．２．０〕オクト−２−エン−２−カルボン酸；
「アジポイル−７−ＡＤＡＣ」は、３−ヒドロキシメチ
ル−７−〔（ヘキサン−１，６−ジオイル）アミノ〕−
３−メチル−８−オキソ−５−チア−１−アザビシクロ
〔４．２．０〕オクト−２−エン−２−カルボン酸；を
夫々意味する。特に、本発明は、上記のごとき７−アミ
ノデアセチルセファロスポラン酸（７−ＡＤＡＣ）及び
７−アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）を製造す
るための新規なバイオプロセスにおいて、アジペート原
液がアジピン酸二ナトリウムであり、エキスパンダーゼ
酵素、ヒドロキシラーゼ酵素及びアセチルトランスフェ
ラーゼ酵素の活性をコードするＤＮＡがすべてＣｅｐｈ
ａｌｏｓｐｏｒｉｕｍａｃｒｅｍｏｎｉｕｍに由来し、
アジポイルアシラーゼがＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種に由
来することを特徴とする方法に関する。本発明は更に、
Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ
に由来のエキスパンダーゼ、ヒドロキシラーゼ及びアセ
チルトランスフェラーゼの酵素活性をコードするＤＮＡ
と、前記酵素をコードするＤＮＡの発現を促進するプロ
モーターとを含み、プラスミドｐＰＥＮ／ＣＥＰＨ−
１、ｐＰｅｎＣＡＣＴ及びｐＴＳ−８を含むことを特徴
とする組換えＤＮＡ発現ベクターに関する。本発明は更
に、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍｏｎｉ
ｕｍに由来のエキスパンダーゼ、ヒドロキシラーゼ及び
アセチルトランスフェラーゼの活性をコードするＤＮＡ
と、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ
のＩＰＮＳ遺伝子のプロモーターから成る前記酵素をコ
ードするＤＮＡの発現を促進するプロモーターとを含む
組換えＤＮＡ発現ベクターによって形質転換されたＰｅ
ｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ宿主細胞
に関する。特に本発明は、後述するごとく、プラスミド
ｐＰＥＮ／ＣＥＰＨ−１、ｐＰｅｎＣＡＣＴ及びｐＴＳ
−８から成る組換えＤＮＡ発現ベクターによって形質転
換されたＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎ
ｕｍ宿主細胞に関する。本発明は更に、遺伝子発現に適
した条件下の組換えＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓ
ｏｇｅｎｕｍ宿主細胞の培養方法に関する。この組換え
宿主細胞は、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅ
ｍｏｎｉｕｍに由来のエキスパンダーゼ、ヒドロキシラ
ーゼ及びアセチルトランスフェラーゼの酵素活性をコー
ドするＤＮＡと、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓ
ｏｇｅｎｕｍのＩＰＮＳ遺伝子のプロモーターから成り
前記酵素をコードするＤＮＡの発現を促進するプロモー
ターとを含む組換えＤＮＡ発現ベクターを含む。本発明
は特に、遺伝子発現に適した条件下に組換えＰｅｎｉｃ
ｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ宿主細胞を培養
する方法において、前記組換え宿主細胞が、後述するご
とくプラスミドｐＰＥＮ／ＣＥＰＨ−１、ｐＰｅｎＣＡ
ＣＴ及びｐＴＳ−８から成る組換えＤＮＡ発現ベクター
を含むことを特徴とする方法に関する。
ロスポラン酸（７−ＡＤＡＣ）を製造するための新規な
バイオプロセスに関する。本発明のバイオプロセスは、 （１）イソペニシリンＮを産生するＰｅｎｉｃｉｌｌｉ
ｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ菌株をその増殖を支持し
得る培地中に維持し、アジポイル−６−アミノペニシラ
ン酸（アジポイル−６−ＡＰＡ）を産生すべく前記Ｐｅ
ｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ菌株によ
って同化され利用され得るアジピン酸またはその塩及び
エステルのいずれか１種以上から成るアジペート原液を
前記培地に添加して前記アジポイル−６−ＡＰＡを産生
させる段階と、 （２）対応する遺伝子のｉｎ ｓｉｔｕ発現によって以
下の酵素的変換を生起させる段階、即ち、（ａ）エキス
パンダーゼ酵素によってアジポイル−６−ＡＰＡをｉｎ
ｓｉｔｕ環拡張させてアジポイル−７−アミノデスア
セトキシセファロスポラン酸（アジポイル−７−ＡＤＣ
Ａ）を形成させるために、前記アジポイル−６−ＡＰＡ
を基質として受容し得るエキスパンダーゼ酵素の活性を
コードするＤＮＡによって前記Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ
ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ菌株を形質転換させ、その発
現の結果として次に、前記菌株によって産生された前記
アジポイル−６−ＡＰＡをｉｎ ｓｉｔｕ環拡張させて
アジポイル−７−ＡＤＣＡを形成する段階、及び、
（ｂ）ヒドロキシラーゼ酵素によってアジポイル−７−
ＡＤＣＡの３−メチル側鎖をｉｎ ｓｉｔｕヒドロキシ
ル化してアジポイル−７−アミノデアセチルセファロス
ポラン酸（アジポイル−７−ＡＤＡＣ）を産生させるた
めに、前記アジポイル−７−ＡＤＣＡを基質として受容
し得るヒドロキシラーゼ酵素の活性をコードするＤＮＡ
によって前記Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇ
ｅｎｕｍ菌株を形質転換させ、その発現の結果として次
に、前記菌株によって産生された前記アジポイル−７−
ＡＤＣＡをｉｎ ｓｉｔｕヒドロキシル化してアジポイ
ル−７−ＡＤＡＣを形成する段階と、 （３）前記アジポイル−７…ＡＤＡＣをアジポイルアミ
ダーゼと接触させることによって、アジポイル側鎖を除
去し、７−ＡＤＡＣ産生物を形成させ、前記産生物を単
離する段階とから成る。 本発明は更に、７−アミノセファロスポラン酸（７−Ａ
ＣＡ）を製造するための新規なバイオプロセスに関す
る。本発明のバイオプロセスは、 （１）イソペニシリンＮを産生するＰｅｎｉｃｉｌｌｉ
ｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ菌株をその増殖を支持し
得る培地中に維持し、アジポイル−６−アミノペニシラ
ン酸（アジポイル−６−ＡＰＡ）を産生すべく前記Ｐｅ
ｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ菌株によ
って同化され利用され得るアジピン酸またはその塩及び
エステルのいずれか１種以上から成るアジペート原液を
前記培地に添加して前記アジポイル−６−ＡＰＡを産生
させる段階と、 （２）対応する遺伝子のｉｎ ｓｉｔｕ発現によって以
下の酵素的変換を生起させる段階、即ち、（ａ）エキス
パンダーゼ酵素によってアジポイル−６−ＡＰＡをｉｎ
ｓｉｔｕ環拡張させてアジポイル−７−アミノデスア
セトキシセファロスポラン酸（アジポイル−７−ＡＤＣ
Ａ）を形成させるために、前記アジポイル−６−ＡＰＡ
を基質として受容し得るエキスパンダーゼ酵素の活性を
コードするＤＮＡによって前記Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎ
ｕｍ菌株を形質転換させ、その発現の結果として次に、
前記菌株によって産生された前記アジポイル−６−ＡＰ
Ａをｉｎ ｓｉｔｕ環拡張させてアジポイル−７−ＡＤ
ＣＡを形成する段階、及び、（ｂ）ヒドロキシラーゼ酵
素によってアジポイル−７−ＡＤＣＡの３−メチル側鎖
をｉｎ ｓｉｔｕヒドロキシル化してアジポイル−７−
アミノデアセチルセファロスポラン酸（アジポイル−７
−ＡＤＡＣ）を産生させるために、前記アジポイル−７
−ＡＤＣＡを基質として受容し得るヒドロキシラーゼ酵
素の活性をコードするＤＮＡによって前記Ｐ．ｃｈｒｙ
ｓｏｇｅｎｕｍ菌株を形質転換させ、その発現の結果と
して次に、前記菌株によって産生された前記アジポイル
−７−ＡＤＣＡをｉｎ ｓｉｔｕヒドロキシル化してア
ジポイル−７−ＡＤＡＣを形成する段階、及び、（ｃ）
アセチルトランスフェラーゼ酵素によってアジポイル−
７−ＡＤＡＣをｉｎ ｓｉｔｕアセチル化してアジポイ
ル−７−アミノセファロスポラン酸（アジポイル−７−
ＡＣＡ）を産生させるために、前記アジポイル−７−Ａ
ＤＡＣを基質として受容し得るアセチルトランスフェラ
ーゼ酵素の活性をコードするＤＮＡによって前記Ｐ．ｃ
ｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ菌株を形質転換させ、その発現の
結果として次に、前記菌株によって産生された前記アジ
ポイル−７−ＡＤＡＣをｉｎｓｉｔｕアセチル化してア
ジポイル−７−ＡＣＡを形成する段階と、 （３）前記アジポイル−７−ＡＣＡをアジポイルアミダ
ーゼと接触させることによって、アジポイル側鎖を除去
し、７−ＡＣＡ産生物を形成させ、前記産生物を単離す
る段階とから成る。 本文中で使用した用語を以下のごとく定義する；「７−
ＡＣＡ」は、３−〔（アセチルオキシ）−メチル〕−７
−アミノ−８−オキソ−５−チア−１−アザビシクロ
〔４．２．０〕オクトー２−エン−２−カルボン酸；
「アジポイル−６−ＡＰＡ」は、〔２Ｓ−（２α，５
α，６β）〕−３，３−ジメチル−７−オキソ−６−
〔ヘキサン−１，６−ジオイル）アミノ〕−４−チア−
１−アザビシクロ〔３．２．０〕ヘプタン−２−カルボ
ン酸；「アジポイル−７−ＡＤＣＡ」は、３−メチル−
７−〔（ヘキサン−１，６−ジオイル）アミノ〕−３−
メチル−８−オキソ−５−チア−１−アザビシクロ
〔４．２．０〕オクト−２−エン−２−カルボン酸；
「アジポイル−７−ＡＤＡＣ」は、３−ヒドロキシメチ
ル−７−〔（ヘキサン−１，６−ジオイル）アミノ〕−
３−メチル−８−オキソ−５−チア−１−アザビシクロ
〔４．２．０〕オクト−２−エン−２−カルボン酸；を
夫々意味する。特に、本発明は、上記のごとき７−アミ
ノデアセチルセファロスポラン酸（７−ＡＤＡＣ）及び
７−アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）を製造す
るための新規なバイオプロセスにおいて、アジペート原
液がアジピン酸二ナトリウムであり、エキスパンダーゼ
酵素、ヒドロキシラーゼ酵素及びアセチルトランスフェ
ラーゼ酵素の活性をコードするＤＮＡがすべてＣｅｐｈ
ａｌｏｓｐｏｒｉｕｍａｃｒｅｍｏｎｉｕｍに由来し、
アジポイルアシラーゼがＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種に由
来することを特徴とする方法に関する。本発明は更に、
Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ
に由来のエキスパンダーゼ、ヒドロキシラーゼ及びアセ
チルトランスフェラーゼの酵素活性をコードするＤＮＡ
と、前記酵素をコードするＤＮＡの発現を促進するプロ
モーターとを含み、プラスミドｐＰＥＮ／ＣＥＰＨ−
１、ｐＰｅｎＣＡＣＴ及びｐＴＳ−８を含むことを特徴
とする組換えＤＮＡ発現ベクターに関する。本発明は更
に、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍｏｎｉ
ｕｍに由来のエキスパンダーゼ、ヒドロキシラーゼ及び
アセチルトランスフェラーゼの活性をコードするＤＮＡ
と、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ
のＩＰＮＳ遺伝子のプロモーターから成る前記酵素をコ
ードするＤＮＡの発現を促進するプロモーターとを含む
組換えＤＮＡ発現ベクターによって形質転換されたＰｅ
ｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ宿主細胞
に関する。特に本発明は、後述するごとく、プラスミド
ｐＰＥＮ／ＣＥＰＨ−１、ｐＰｅｎＣＡＣＴ及びｐＴＳ
−８から成る組換えＤＮＡ発現ベクターによって形質転
換されたＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎ
ｕｍ宿主細胞に関する。本発明は更に、遺伝子発現に適
した条件下の組換えＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓ
ｏｇｅｎｕｍ宿主細胞の培養方法に関する。この組換え
宿主細胞は、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅ
ｍｏｎｉｕｍに由来のエキスパンダーゼ、ヒドロキシラ
ーゼ及びアセチルトランスフェラーゼの酵素活性をコー
ドするＤＮＡと、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓ
ｏｇｅｎｕｍのＩＰＮＳ遺伝子のプロモーターから成り
前記酵素をコードするＤＮＡの発現を促進するプロモー
ターとを含む組換えＤＮＡ発現ベクターを含む。本発明
は特に、遺伝子発現に適した条件下に組換えＰｅｎｉｃ
ｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ宿主細胞を培養
する方法において、前記組換え宿主細胞が、後述するご
とくプラスミドｐＰＥＮ／ＣＥＰＨ−１、ｐＰｅｎＣＡ
ＣＴ及びｐＴＳ−８から成る組換えＤＮＡ発現ベクター
を含むことを特徴とする方法に関する。
【詳細な説明】本発明の第１の目的は、以下の構造式：
【化４】 によって示される市販の合成セファロスポリン類の製造
における基幹中間体である７−アミノセファロスポラン
酸（７−ＡＣＡ）及び７−アミノデアセチルセファロス
ポラン酸（７−ＡＤＡＣ）を製造するための新規なバイ
オプロセスを提供することである。７−ＡＣＡの顕著な
特徴は、セファロスポリン核に加えて、７−アミノ基及
び３−アセチルオキシメチル（またはより普及した呼び
方では３−アセトキシメチル）基を含むことである。７
−アミノ基は、任意の数の誘導体側鎖に変換される基で
あり、従って種々の市販セファロスポリン類の合成のベ
ースを形成し得る。３−アセチルオキシメチル基は、市
販のセファロスポリンを合成するために別の側鎖にしば
しば変換される。本発明方法の最終生成物である７−Ａ
ＣＡ及び中間生成物であるアジポイル−７−ＡＣＡは、
以下の構造式：
における基幹中間体である７−アミノセファロスポラン
酸（７−ＡＣＡ）及び７−アミノデアセチルセファロス
ポラン酸（７−ＡＤＡＣ）を製造するための新規なバイ
オプロセスを提供することである。７−ＡＣＡの顕著な
特徴は、セファロスポリン核に加えて、７−アミノ基及
び３−アセチルオキシメチル（またはより普及した呼び
方では３−アセトキシメチル）基を含むことである。７
−アミノ基は、任意の数の誘導体側鎖に変換される基で
あり、従って種々の市販セファロスポリン類の合成のベ
ースを形成し得る。３−アセチルオキシメチル基は、市
販のセファロスポリンを合成するために別の側鎖にしば
しば変換される。本発明方法の最終生成物である７−Ａ
ＣＡ及び中間生成物であるアジポイル−７−ＡＣＡは、
以下の構造式：
【化５】 によって示される別の基幹セファロスポリン中間体であ
るセファロスポリンＣとは極めて異なっている。この中
間体の場合は、７−（Ｄ）−α−アミノアジポイル側鎖
が以後の合成的誘導を許容しないので、許容的な７−ア
ミノ基を与えるために開裂する必要がある。残念なこと
に、７−（Ｄ）−α−アミノアジポイル側鎖は化学的手
段によっても生化学的手段によってもその除去が常に難
しいことが立証されている。用語の定義 本明細書中、特に好ましい実施態様の項で使用する以下
の用語の意味は下記の通りである： ７−ＡＣＡ ７−アミノセファロスポラン酸 ７−ＡＤＡＣ ７−アミノデアセチルセファロスポラ
ン酸 ７−ＡＤＣＡ ７−アミノデアセトキシセファロスポ
ラン酸 ６−ＡＰＡ ６−アミノペニシラン酸 ＤＡＯＣ デアセトキシセファロスポラン酸 ＤＡＯＣＳ ＤＡＯＣシンテターゼ ＤＡＣ デアセチルセファロスポリンＣ ＤＡＣＳ ＤＡＣシンターゼ ＩＰＮＳ イソペニシリンＮジンテターゼ Ｔｒｉｓ トリス［ヒドロキシメチル］アミノメ
タン ＥＤＴＡ エチレンジアミンテトラ酢酸 ＤＥＰＣ ジエチルピロカーボネート ＴＥ トリス／ＥＤＴＡ緩衝液 ＳＳＣ 塩（塩化ナトリウム）、クエン酸ナト
リウム緩衝液 ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム ＰＥＧ ポリエチレングリコールＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ の培
養 本発明の方法の第１のステップは、イソペニシリンＮを
産生するＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎ
ｕｍ株をその増殖を維持することができる培養培地中に
保持し、この培養培地に、アジピン酸か、又はアジポイ
ル−６−ＡＰＡを産生するために前記Ｐｅｎｉｃｉｌｌ
ｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株により同化され使用
され得るアジピン酸の塩及びエステルのうちいずれか１
つ以上を含むアジペート原液（ａｄｉｐａｔｅ ｆｅｅ
ｄｓｔｏｃｋ）を加えることからなる。このアジペート
原液は、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍを接種した後で培
養培地に加えてもよいが、好ましくは接種実施時点で既
に培養培地中に存在しているようにする。Ｐｅｎｉｃｉ
ｌｌｉｕｎｍ以外の属、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｄｕｌａｎｓ、並びにｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ種
以外のＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属の種ｍイソペニシリン
Ｎを産生する。しかしながら歴史的には、イソペニシリ
ンＮを最も多く産生する株は総て、ｃｈｒｙｓｏｇｅｎ
ｕｍ種からの株の改良という公知の技術によって開発さ
れてきた。そこで、実際問題として、本発明はＰｅｎｉ
ｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍに限定されて
いるが、他の種にも勿論適用し得る。任意の寄託済みＰ
ｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株、又
は他の一般的に入手できるこの種の株の由来源は、本発
明の方法を実施するための適当な出発点である。イソペ
ニシリンＮを産生するＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒ
ｙｓｏｇｅｎｕｍ株の増殖を維持できる培養培地は、普
通の知識を備えた当業者が容易に思い付くようなもので
ある。例えば、培養は水中好気性発酵方法を用いて行
い、使用する培地は多くの適当な入手可能な培地から選
択する。典型的な培地は、スクロース、グルコース及び
澱粉のような炭素源；大豆のあら粉（ｍｅａｌ）及び顆
粒（ｇｒｉｔ）、綿実油、ピーナッツのあら粉、種々の
アミノ酸及びその混合物、並びにペプトンのような窒素
源を使用する。産生要件としては収率と単離の容易さと
が重要であり、従ってこのような状況では、炭素源とし
ての糖蜜（ｍｏｌａｓｓｅｓ）、並びに窒素源としての
大豆粉及びアミノ酸を好ましい培地として使用し得る。
培養培地には通常、栄養素無機塩を加える。この種の塩
としては、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カル
シウム、ホスフェート、スルフェート、塩化物、臭化
物、ニトレート、カーボネート、第二鉄、第一鉄、マグ
ネシウム、マンガン等のようなイオン性成分を供給でき
るものが挙げられる。Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒ
ｙｓｏｇｅｎｕｍの増殖、発育及び代謝には通常微量元
素も不可欠であり、この種の元素は、主に他の培養培地
成分の混入物として既に存在していない限り、培養培地
に直接添加し得る。Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙ
ｓｏｇｅｎｕｍ株は、アジポイル−７−ＡＣＡ、そして
任意に７−ＡＣＡを少量だけ製造したい場合には、１リ
ットルのシェークフラスコのような小容積装置で培養し
得る。しかしながら、より大量のアジポイル−７−ＡＣ
Ａを製造したい場合には、大型発酵タンクを水中好気性
発酵条件で使用する。アジポイル−７−ＡＣＡの大規模
調製を行う場合には、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒ
ｙｓｏｇｅｎｕｍ株の胞子を寒天斜面培養基上に保持す
る。この斜面培養基からの胞子を用いて、少量の栄養培
地（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｍｅｄｉｕｍ）に接種す
る。この栄養培地をインキュベートして、前記微生物の
新鮮な活発に増殖する生産率の高い（ｈｅａｖｙ）培養
物を得る。次いで、この栄養増殖物を大規模発酵培地の
接種物（ｉｎｏｃｕｌｕｍ）として使用する。場合によ
っては、更に別の栄養培地を発酵培地の接種物として加
えるのが望ましいこともある。このような第２の段階の
栄養培地は通常、発酵培地の量が第１の栄養培地を大き
く上回る場合に使用する。このようにして、微生物の胞
子を最初は少量の栄養培地で培養し、より大量の栄養培
地のための接種物を得る。次いで、この大量の栄養培地
で、大型発酵タンクでの発酵を迅速に開始させるのに十
分な濃度の微生物を得る。栄養培地は発酵培地と同じ組
成を有するか、又は小規模操作で微生物の増殖及び発育
を促進するために他の成分を含み得る。本発明の方法で
使用するＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎ
ｕｍ株は約２０℃〜３０℃の温度で最も効果的に培養さ
れるが、最適収率は温度が約２２℃〜２８℃、好ましく
は約２５℃の時に得られる。アジポイル−７−ＡＣＡの
最大産生は、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇ
ｅｎｕｍ株を大型タンクで約１０〜３０日、好ましくは
１５〜２５日培養したときに生起する。しかしながらこ
の微生物は、例えば２５０ｍｌシェークフラスコのよう
な小型装置で培養するとより速く増殖し、より短い期
間、例えば４〜１５日、通常は５〜７日でアジポイル−
７−ＡＣＡを産生する。大型発酵タンクの末期ｐＨ（ｔ
ｅｒｍｉｎａｌ ｐＨ）が８．０以上になると、アジポ
イル−７−ＡＣＡの収率に悪影響が及ぼされ得る。この
ような状況では、発酵の間中、培養培地のｐＨをモニタ
ーするのが望ましい。アジポイル−７−ＡＣＡの最大産
生時点の前にｐＨが前記レベルに到達しそうな場合に
は、発酵培地に適当な酸又は緩衝剤を加えてｐＨを下げ
るように調整するとよい。アジポイル−７−ＡＣＡが産
生されたら、発酵ブイヨンの試料をクロマトグラフィー
によって検査し得る。水中好気性発酵で通常実施される
ように、培養培地には無菌空気を通してＰｅｎｉｃｉｌ
ｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株をより効果的に増
殖させ、アジポイル−７−ＡＣＡの産生率を高める。培
養培地に通す空気の量は通常、培養培地１倍容当たり約
０．２倍容／分以上である。しかしながら、空気の流量
を増やすと、アジポイル−７−ＡＣＡの産生に有用な効
果がもたらされることもしばしばある。Ｐｅｎｉｃｉｌ
ｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株は通常、アジポイ
ル−７−ＡＣＡの他に、多くの副産物及び代謝産物を産
生する。これらの産物の一部は酸に弱いため、発酵培地
からアジポイル−７−ＡＣＡを回収する時には、同時に
産生された不純物の一部を破壊するために、発酵ブイヨ
ン全体を酸性ｐＨで短時間処理するのが望ましい。この
ように処理した濾過後の発酵ブイヨンからアジポイル−
７−ＡＣＡ発酵生成物を回収する。この生成物は任意に
イオン交換樹脂でのクロマトグラフィーによって発酵培
地の他の成分から分離し得、必要であればアジポイル側
鎖の酵素開裂ステップの前にクロマトグラフィーで更に
精製し得る。このようなイオン交換クロマトグラフィー
による分離は側鎖開裂の後で行うこともできる。分離問
題を伴う主要副産物の１つはアジポイル−６−ＡＰＡで
ある。この副産物は、分離をより容易にするために、化
学的又は酵素的に分解できる。まず、濾過した発酵ブイ
ヨンを予精製処理にかける。この処理は、例えばｎ−ブ
タノール又はアミルアセテートのような非水混和性有機
溶媒で初期抽出を行って不純物を除去する操作を含み得
る。抽出したブイヨンは活性炭でのクロマトグラフィー
により更に予精製し得る。アジペート原液の添加 好ましくは、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇ
ｅｎｕｍの発酵培養が前述のように確立された時点で、
即ち接種に先立って、アジペート原液を発酵培養培地の
他の成分に加える。場合によっては、アジペート原液を
接種の後、例えば接種の１日後、２日後及び／又は３日
後に加えてもよい。アジペート原液とは、アジピン酸
か、又はアジポイル−６−ＡＰＡを産生するために培養
中のＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ
株によって同化され使用され得るアジピン酸の塩もしく
はエステルのうちいずれか１つ以上をさすと定義され
る。アジピン酸、その塩及びエステルは、単独で、又は
任意に組合わせて使用し得る。好ましいのはジナトリウ
ム塩であるが、カリウム及びナトリウムとの混合塩も適
当である。メチルエステルも使用し得るが、エチルエス
テルは水不溶性である。アジピン酸の塩又はエステル
は、アジポイル−６−ＡＰＡを産生するためにＰｅｎｉ
ｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株によって同
化され使用され得るようなものでなければならない。例
えば、アジピン酸は水不溶性ではあるが、適当なｐＨ条
件下で同化可能塩を生成するのであれば、適当な原料と
して使用し得る。適当なエキスパンターゼ酵素及び／又はヒドロキシラー
ゼ酵素 培養し且つアジポイル−６−ＡＰＡを産生するために前
述のようにアジペート原液を加えたＰｅｎｉｃｉｌｌｉ
ｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株は、エキスパンターゼ
酵素及びヒドロキシラーゼ酵素の活性をコードするＤＮ
Ａによって形質転換した株でもあり、その発現の結果と
して前記アジポイル−６−ＡＰＡがその場で環拡張され
て（ｒｉｎｇ−ｅｘｐａｎｄｅｄ）アジポイル，７−Ａ
ＤＣＡを形成し、３−メチル側鎖も３−ヒドロキシメチ
ルに変換される。アジポイル−６−ＡＰＡはアジペート
原液培養したＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅ
ｎｕｍにより細胞内で産生される。この細胞内セッティ
ングでは、即ちｉｎ ｓｉｔｕベースでは、形質転換し
たＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍが
エキスパンターゼ酵素及びヒドロキシラーゼ酵素の活性
をコードするＤＮＡを発現し、その結果前記酵素が基質
としてのアジポイル−６−ＡＰＡに作用し、これを環拡
張させてアジポイル−７−ＡＤＣＡを形成せしめる。こ
のアジポイル−７−ＡＤＣＡは次いでヒドロキシル化に
よりアジポイル−７−ＡＤＡＣ（アジポイル−７ーアミ
ノデアセチルセファロスポラン酸）に変換される。本発
明の新規のバイオプロセスは、その範囲内に、前記タイ
プのＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ
株をエキスパンターゼ酵素及びヒドロキシラーゼ酵素の
活性をコードするＤＮＡで形質転換し、これら酵素の発
現の結果として、アジポイル−６−ＡＰＡをその場で環
拡張してアジポイル−７−ＡＤＣＡを形成し、更にヒド
ロキシル化してアジポイル−７−ＡＤＡＣを形成する操
作を含む。従って、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙ
ｓｏｇｅｎｕｍの形質転換に使用するＤＮＡは、当業者
に公知のエキスパンダーゼ酵素の活性、即ちイソペニシ
リンＮを環拡張してＤＡＯＣに変換する能力だけでな
く、アジポイル−６−ＡＰＡを還拡張してアジポイル−
７−ＡＤＣＡに変換する能力をも有する酵素を発現する
ようなものでなければならない。また、ヒドロキシラー
ゼ酵素はアジポイル−７−ＡＤＣＡをヒドロキシル化し
てアジポイル−７−ＡＤＡＣに変換できるようなもので
なければならない。本発明では、エキスパンターゼ酵素
及びヒドロキシラーゼ酵素の活性を与える方法に関し
て、２つの実施態様が適当とみなされる。一方の好まし
い実施態様では、エキスパンターゼ及びヒドロキシラー
ゼの機能を、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅ
ｎｕｍを形質転換させる本質的には二官能性の単一のＣ
ｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ遺
伝子によって発現される活性により達成する。前記遺伝
子はエキスパンターゼ及びヒドロキシラーゼの活性を両
方一緒に発現する。この遺伝子はエキスパンターゼ／ヒ
ドロキシラーゼ遺伝子と称し、その遺伝子産物はエキス
パンターゼ／ヒドロキシラーゼ酵素と称する。通常は、
エキスパンターゼ／ヒドロキシラーゼ活性をコードする
Ｃ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ由来のＤＮＡでＰ．ｃｈｒｙ
ｓｏｇｅｎｕｍを形質転換すると、前記活性の発現が単
一プロモーター配列によって制御される。これは、単一
遺伝子の存在を示すものである。本発明の別の適当な実
施態様では、単一のエキスパンターゼ／ヒドロキシラー
ゼ遺伝子ではなく、エキスパンターゼ及びヒドロキシラ
ーゼ活性を別個の遺伝子としてコードするＤＮＡでＰ．
ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ宿主を形質転換する。尚、別個
のエキスパンターゼ及びヒドロキシラーゼ遺伝子、並び
にこれらの遺伝子がコードする対応する酵素活性は、前
述のように単一のエキスパンターゼ／ヒドロキシラーゼ
遺伝子及び酵素をコードするＣ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ
のような真核微生物ではなく、Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅ
ｒｕｓのような原核微生物に見られる。原核ヒドロキシ
ラーゼ酵素の配列及びこれをコードするヌクレオチド
は、前記酵素の単離手段と共に、Ｋｏｖａｃｅｖｉｃ
ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７３（１），３９８
−４００（１９９１）及びＥＰ−Ａ−０ ４６５ １８
９号に記述されている。当業者には明らかなように、ヒ
ドロキシラーゼの配列からは、良く知られた手動的方法
又は自動化されたＤＮＡシンセサイザーによって、ヒド
ロキシラーゼ酵素をコードするＤＮＡを合成することが
できる。このＤＮＡ化合物、又はヒドロキシラーゼと同
一のアミノ酸配列あるいは同等のヒドロキシラーゼ活性
を有する前記酵素のフラグメントもしくは誘導体をコー
ドする別の配列は、プロモーター及び他の調節配列と組
合わせて種々のクローニングベクター及び発現ベクター
の調製のベースとして使用し得る。次いで、これを用い
てＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの形質転換を行えば、ヒ
ドロキシラーゼ酵素を発現しそれによって本発明の方法
を実施することができる。また、ハイブリダイゼーショ
ンによって相同の配列を同定するために、有用なヒドロ
キシラーゼ酵素を含んでいる可能性のある株のゲノムラ
イブラリーをスクリーニングするためのプローブとして
前記ＤＮＡ化合物を使用することも可能である。このよ
うにして同定される任意の推定上のヒドロキシラーゼの
活性は、本発明の方法の実際のアジポイル−７−ＡＤＣ
Ａ基質を使用し且つＨＰＬＣによってそのヒドロキシル
化産物を単離することにより確認し得る。本発明のこの
実施態様を使用する時は、即ちヒドロキシラーゼ活性の
みを発現する単一遺伝子を使用する場合には、エキスパ
ンダーゼ酵素の活性をコードするＤＮＡを別個に供給す
る必要もある。これは、エキスパンダーゼ機能をその場
で発現させて本発明の方法で環拡張ステップが行われる
ようにする適当な発現ベクターによりＰ．ｃｈｒｙｓｏ
ｇｅｎｕｍを形質転換できるようにするためである。エ
キスパンダーゼ酵素は多数知られている。側鎖の類似性
に基づいて、多くのエキスパンダーゼ酵素が本発明の新
規のバイオプロセスで操作可能であると考えられる。本
発明の他の有用な実施態様は、１つ以上のエキスパンダ
ーゼ及び／又は１つ以上のヒドロキシラーゼの活性をコ
ードするＤＮＡを非組換えＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ
の形質転換に使用し得るという事実をベースとする。こ
のような実施態様では、発現される酵素タンパク質の量
が増加するため、より大きいエキスパンダーゼ及び／又
はヒドロキシラーゼ活性を得ることができる。先行技術
の項で述べたように、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌ
ａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ ＡＴＣＣ ２７０６４由来のエ
キスパンダーゼ酵素は完全に配列決定されており、且つ
エンドヌクレアーゼ制限地図によって特徴が解明されて
いる。しかしながら、Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ
ＮＲＲＬ ３５８５由来の同一酵素と思われる物質は、
異なる分子量を有すると報告されている。この分子量は
配列決定はされていない。また、やはり先行技術の項で
述べたように、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒ
ｅｍｏｎｉｕｍ ＡＴＣＣ １１５５０由来のＤＡＯＣ
Ｓ／ＤＡＣＳ酵素は配列決定されている［Ｓａｍｓｏｎ
ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８７）５；１
２０７−１２１４及びＥＰ−Ａ−０ ２８１ ３９１
号］。先行技術で既に同定されているこれらのエキスパ
ンダーゼ酵素は本発明の新規のバイオプロセスで有用で
ある。種々のＳ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ株又はＣ．
ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ株、あるいは異なる属の微生物に
由来するまだ同定されていない他のエキスパンダーゼ酵
素も、本発明の新規のバイオプロセスを実施するのに適
したものであり得る。有用な微生物のこのような新しい
株及び属を同定するための方法、並びに推定上のエキス
パンダーゼ酵素を単離し且つこれらの酵素が本発明の方
法で使用するのに適しているということを立証する方法
は簡単であり、当業者により容易に実施される。有用な
微生物の期待される新しい株及び属の無細胞抽出物のス
クリーニングは、第一鉄（Ｆｅ２＋）イオン、アスコル
ベート、α−ケトグルタレート及びアデノシントリホス
フェート（ＡＴＰ）を含む公知のＤＡＯＣＳ補助因子の
存在下でアジポイル−６−ＡＰＡ基質に前記抽出物を加
えることにより、信頼性と再現可能性とをもって実施し
得る。アジポイル−６−ＡＰＡは、後で詳述する方法と
類似の方法で非形質転換Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈ
ｒｙｓｏｇｅｎｕｍにアジペート原液を供給することに
より十分な量で製造し得る。アジポイル−７−ＡＤＣＡ
及び／又はアジポイル−７−ＡＤＡＣが生成されれば、
所望のエキスパンダーゼ（又はエキスパンダーゼ／ヒド
ロキシラーゼ）酵素が存在する。この酵素の存在はクロ
マトグラフィーによって検出し得る。また、公知の組換
え技術を使用し、例えばＳ．Ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ
及びＣ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ由来のエキスパンダーゼ
遺伝子のヌクレオチド配列に基づいてＤＮＡプローブを
形成し、本発明の方法で使用するのに適したエキスパン
ダーゼを産生する可能性のある微生物のＤＮＡの内容を
スクリーニングすることもできる。エキスパンダーゼ酵素、ヒドロキシラーゼ酵素及びエキ
スパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ酵素の潜在的由来源 エキスパンダーゼ酵素は前述のように、ｐｅｎａｍ還構
造（ペニシリンタイプの分子に見られる）の拡張を触媒
してＣｅｐｈ−３−ｅｍ環（セファロスポリンに見られ
る）にする酵素である。従って、ｃｅｐｈｅｍ環を有す
る代謝産物を産生する微生物はいずれもエキスパンダー
ゼをコードするＤＮＡの潜在的由来源である。同様にし
て、３−ヒドロキシメチル基を有するセファロスポリン
を産生する微生物はいずれも、ヒドロキシラーゼ（又は
エキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ）をコードするＤ
ＮＡの潜在的由来源である。この種の微生物の具体例を
下に挙げる。但し、このリストは非限定的なものにすぎ
ない。 菌類Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐ．Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌｏｐｓｉｓ Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ Ｓｃｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ Ｄｉｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒａ Ｓｐｉｒｏｉｄｉｕｍ Ａｎｏｘｉｏｐｓｉｓ 放線菌類Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ Ｓ．ｌｉｐｍａｎｉｉ Ｓ．ｗａｄａｙａｍｅｎｓｉｓ Ｓ．ｔｏｄｏｒｏｍｉｎｅｎｓｉｓ Ｓ．ｆｉｌｉｐｉｎｅｎｓｉｓ ｃｅｐｈａｍｙｃｉｎ
ｉ Ｓ．ｈｅｔｅｒｏｍｏｒｐｈｕｓ Ｓ．Ｐａｎａｙｅｎｓｉｓ Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ Ｓ．ｃａｔｔ１ｅｙａ Ｎｏｃａｒｄｉａ ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ 他の細菌類Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ Ｍｙｃｏｐｌａｎａ ｂｕｌｌａｔａ Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｒｅｔｔｇｅｒｉ Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ ｌａｃｔａｍｇｅｎｕｓ 前記リストの微生物のエキスパンダーゼ及びヒドロキシ
ラーゼは更に検査する必要のある潜在的な酵素にすぎ
ず、これらの総てが本発明の新規の方法に適していると
は限らない。エキスパンダーゼ活性をコードするＤＮＡフラグメント
の単離 前述の方法で所望のエキスパンダーゼ酵素の存在が検出
されれば、エキスパンダーゼ活性をコードするＤＮＡを
単離する方法も簡単であり当業者には良く知られてい
る。エキスパンダーゼ酵素をコードする遺伝子の既知の
配列及び部分配列に基づいて、単離すべき所望の酵素コ
ードＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡプローブを構成
する。この種のプローブの構成は、エキスパンダーゼ酵
素をコードするアミノ酸及びヌクレオチド塩基配列に関
する知識と、特定の関連微生物の優先コドン（ｃｏｄｏ
ｎ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）とに基づく。Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ ＡＴＣＣ
２７０６４のゲノムＤＮＡに適用されるこの種の典型
的方法は後で詳述する。エキスパンダーゼ酵素活性をコ
ードするＤＮＡの単離は、組換えＤＮＡ技術で良く知ら
れている制限及び連結方法を用いて達成される。適当な
制限フラグメントを形成し且つ単離できるように、当該
微生物のゲノムのエンドヌクレアーゼ制限地図を有する
ことが必要である。Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ及び
Ｃ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍの制限地図は既に入手可能で
ある。例えば、前者の場合には、制限酵素Ｂａｍ ＨＩ
及びＳａｌ Ｉを使用し電気泳動を行えば、所望の１．
８〜２．２ｋｂの大きさのフラグメントが得られる。アセチルトランスフェラーゼ酵素の由来源及び前記活性
をコードするＤＮＡフラグメントの単離 Ｃ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ＤＡＣアセチルトランスフ
ェラーゼ遺伝子のクローニングは、当業者に公知の組換
え技術を用いて実施し得る。ここで、前記組換え技術の
一般論を説明する。アセチルトランスフェラーゼ遺伝子
をクローニングするためには、アセチルセファロスポラ
ン酸（ＤＡＣ）をセファロポスポリンＣに変換する能力
がないＣ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍの突然変異体を最初に
形成しなければならない。このようなプロセスでは、
Ｃ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ細胞をＮ−ニトロソグアニジ
ン（ＮＴＧ）、亜硝酸又は紫外線のような突然変異誘発
物質の作用にかけ、適当な増殖培地で回収し、次いで例
えばクロマトグラフィーもしくは生物学的手段によって
ＤＡＣの蓄積をアッセイする必要がある。適当な突然変
異誘発物質が同定されたら、アセチルトランスフェラー
ゼをコードする遺伝子の同定における次のステップとし
て、セファロスポリンＣ産生株からＣ．ａｃｒｅｍｏｎ
ｉｕｍ ＤＮＡを単離する。制限エンドヌクレアーゼで
の消化又は機械的せん断により適当な大きさのフラグメ
ントに開裂した後、プラスミド又はコスミドに組み込
む。形質転換ベクターは、ハイグロマイシン又はフレオ
マイシン耐性に対するような適当な優性マーカー遺伝子
をも含む。このベクターは、次の挿入ＤＮＡの回収を容
易にするために、ＤＮＡ配列も含んでいなければならな
い。例えば、クローニングしたＤＮＡを、十分に確立さ
れた方法によって実施できるｉｎ ｖｉｔｒｏパッケー
ジング及びそれに次ぐ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染によ
って回収せしめるラムダ（ファージ）ｃｏｓ部位であ
る。次いで、ゲノムＤＮＡのランダムフラグメントを含
むベクターと抗生物質耐性に基づいて選択した形質転換
体とを用いてアセチルトランスフェラーゼマイナス突然
変異株のプロトプラストを形質転換する。次いで、得ら
れた形質転換体をセファロスポリンＣ産生の回復につい
て分析し得る。この回復は、ベクターに含まれているア
セチルトランスフェラーゼ遺伝子による相補が功を奏し
たことを示すものである。次いで、前記遺伝子のクロー
ニングしたコピーを有している疑いのある突然変異体を
増殖し、そのＤＮＡを単離し、ベクターＤＮＡを前述の
方法で回収し得る。ベクターが実際にアセチルトランス
フェラーゼ遺伝子を含んでいるかどうかの確認は、標準
的な方法と容易に入手できるベクターとを用いて大腸菌
にサブクローニングし、次いでアセチルトランスフェラ
ーゼマイナス突然変異体を再度形質転換することにより
得られる。その後遺伝子を単離し、配列決定し、分子遺
伝学で一般的に使用されている方法を用いて実施例に記
載のように操作し得る。やはり当業者に公知の別の方法
で、Ｍａｔｓｕｄａらは、Ｃ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍの
アセチルトランスフェラーゼ活性をコードする遺伝子を
単離し、その配列決定を行うと共に、ＥＰ−Ｓ−０ ４
５０ ７５８号に記載のように前記酵素自体の推定され
るアミノ酸配列も決定した。これらの別の方法は、アセ
チルトランスフェラーゼ酵素の単離と、Ｎ末端アミノ酸
配列の決定と、この情報に基づいて前記酵素のこの部分
をコードするヌクレオチド配列を推定する操作とを含
む。この情報からは、完全なコード配列とハイブリダイ
ズしてその単離を可能にするプローブが形成される。Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株の
形質転換 エキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ、エキスパンダー
ゼ及びヒドロキシラーゼ、並びにアセチルトランスフェ
ラーゼの活性をコードするＤＮＡフラグメントが得られ
たら、これらのフラグメントを、プロモーターと、翻訳
活性化配列と、耐性マーカーと、調節配列と、コスミド
形成物質（ｃｏｓｍｉｄ ｆｏｒｍｅｒ）と、形質転換
を生起もしくは促進し、遺伝子産物の発現を誘起し、且
つ形質転換体の単離を容易にする他の任意のＤＮＡ配列
とを含むＤＮＡフラグメントと共に、プラスミド又は他
の発現ベクターに挿入（連結）する。次いで、このよう
にして構成した発現ベクターを用いてＰｅｎｉｃｉｌｌ
ｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株の形質転換と、エキ
スパンダーゼ／ヒドロキジラーゼ、エキスパンダーゼ及
びヒドロキシラーゼ、並びにアセチルトランスフェラー
ゼ酵素の活性の細胞内発現とを行う。形質転換及び発現
の実施に使用される技術は当業者には公知であり、その
典型を後で説明する。既述のように、形質転換したＰｅ
ｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株は、エ
キスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ、エキスパンダーゼ
及びヒドロキシラーゼ、並びにアセチルトランスフェラ
ーゼ酵素の活性を細胞内で発現し、その結果これらの酵
素がそれぞれその場でアジポイル−６−ＡＰＡ基質に作
用して環拡張によりアジポイル−７−ＡＤＣＡに変換
し、これをヒドロキシル化してアジポイル−７−ＡＤＡ
Ｃに変換する。これは更にアセチル化されてアジポイル
−７−ＡＣＡとなる。新規形質転換体 本発明の好ましい実施態様であるエキスパンダーゼ／ヒ
ドロキシラーゼ及びエキスパンダーゼ／ヒドロキシラー
ゼプラスアセチル基転移酵素遺伝子によりコード化され
る活性を発現する特異Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙ
ｓｏｇｅｎｕｍ形質転換体は、Ｃａｎｔｗｅｌｌら、
（１９９０）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１
７，２１３〜２２１，ＥＰ−Ａ−０ ２８１ ３９１号
及びＥＰ−Ａ−０ ４３７ ３７８号のような、先行技
術の同様な構築に関して新規である。Ｃａｎｔｗｅｌｌ
構築はＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍイソペニシリンＮ合
成酵素（ＩＰＮＳ）プロモーターの制御下に置かれるＳ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｎｌｉｇｅｒｕｓエ
キスパンダーゼ遺伝子を有し、それによりヒドロキシラ
ーゼ又はアセチル基転移酵素活性をコード化するＤＮＡ
を欠く本発明の場合の構築物とは異なる。ＥＰ−Ａ−０
２８１ ３９１号でＩｎｇｏｌｌａらは、Ｐｅｎｉｃ
ｉｌｌｉｎｍ ＩＰＮＳプロモーターにより推進される
発現を有するＣ．ａｃｒｏｍｏｎｉｕｍエキスパンダー
ゼ／ヒドロキシラーゼ二価性酵素をコード化するＤＮＡ
を含有するＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ形質転換ベクタ
ーついて記載している。これらの構築の１つ（ｐＰＳ６
２）では、エキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ遺伝子
はハイグロマイシン燐酸基転移酵素遺伝子の下流でその
枠の中で融合される。遺伝子産生物であるハイグロマイ
シン燐酸基転移酵素：：エキスパンダーゼ／ヒドロキラ
ーゼ融合蛋白質は、本発明の産生物、即ち、基本的に
Ｃ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍに産生されるのと同じエキス
パンダーゼ／ヒドロキシラーゼ酵素とは異なる。ＥＰ−
Ａ−０ ２８１ ３９１号に記載されたその他のベクタ
ーは合成ＤＮＡリンカーの使用を含めて、広範な系統の
モレキュラーマニピュレーションを介して構築された。
最終構築（ｐＰＳ６１）は、エキスパンダーゼ／ヒドロ
キシラーゼ遺伝子を発現するＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ
ＩＰＮＳプロモーター及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎ
ｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼの１．２ｋｂ Ｎｃｏ
ＩフラグメントをＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍの形質転移の
ための選択マーカーとして利用する。アルギニンとロイ
シンをそれぞれコード化するエキスパンダーゼ／ヒドロ
キシラーゼ中のコドン９及び１０の配列をＣＧＴＣＴＣ
からＣＧＣＣＴＡに変え、それはコード化したアミノ酸
配列を変えない。本発明の構築では、１．２ｋｂ Ｎｃ
ｏＩ ＩＰＮＳプロモーターフラグメントをエキスパン
ダーゼ／ヒドロキラーゼ遺伝子配列を、生エキスパンダ
ーゼ／ヒドロキシラーゼ遺伝子配列を変更することなく
エキスパンダーゼ／ヒドロキシラゼ遺伝子に融合した。
本発明構築に使用したＩＰＮＳプロモーターは、生プロ
モーターに関して２個の四塩基複製を有し、１つはＡＴ
Ｇスタートコドンの７６０ｂｐ上流のＳａｌＩ部位にあ
り、他の１つはスタートコドンの５個の塩基対上流のＸ
ｂａｌＩ部位において、５′未翻訳配列以内ある。これ
らの変化はエキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ遺伝子
の高水準発現に影響しない。ベクターのもう１つの相違
は使用される選択マーカーにある。ＥＰ−Ａ−Ｏ２８１
３９１号に記載の構築物は選択マーカーとしてアセト
アミダーゼとハイグロマイシンを使用する。これは、フ
レオマイシン耐性マーカーを含有する、本発明に利用さ
れるエキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼＰｅｎｉｃｉ
ｌｌｉｕｍ形質転換ベクター（ｐＰＥＮ／ ＣＰＨ−
１）とは著しく違っている。ベクターｐＰＥＮ／ＣＥＰ
Ｈ−１を用いて形質転換され、エキスパンダーゼ／ヒド
ロキラーゼ活性を発現できるＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ
ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株はＰＣ２００として確認され
ている。その分類学的特徴としては広く拡がる集落の産
生が揚げられるのが典型的で、色が青緑色〜緑色、黄色
の滴を有する滑かなビロード状、寒天中に拡散する黄色
裏面、すべての部分が滑かな枝を有する分生子頭、長さ
３〜４μｍの長円形〜ほぼ球形の分生子である。Ｐ．ｃ
ｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍに受け入れられる培養条件は、乳
糖、一水和物１．５％（ｗ／ｖ）、コーンスティープリ
カー０．５％（ｖ／ｖ）、ヘプトン０．５％（ｗ／ｖ）
ＮａＣｌ０．４％（ｗ／ｖ）、ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ
０．０５％（ｗ／ｖ）、ＫＨ２ＰＯ４ ０．０６％（ｗ
／ｖ）、ＦｅＣｌ３−６Ｈ２Ｏ ０．０００５％（ｗ／
ｖ）、ＣｕＳＯ４−５Ｈ２Ｏ ０．０００２％（ｗ／
ｖ）、寒天３．０（ｗ／ｖ）を１ｌの蒸留水中に含む固
体培地ｐＨ４．８を利用する。前記したＰＣ２００と称
するＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍは受託番号ＡＴＣＣ
７４１８６号（寄託日付：１９２２年９月２３日）とし
てＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１２３０１ Ｐａｒｋ
ｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙ
ｌａｎｄ ２０８５２に寄託されている。アジポイル−
７−ＡＣＡを産生できる、本発明の第２の新規なＰｅｎ
ｉｃｉｌｌｉｕｍ Ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ形質転換体
は、エキスパンダーゼ／ヒドロキラーゼとアセチル基転
移酵素の両酵素をコード化するＤＮＡを含む単一ベクタ
ー（ｐＴＳ−８）を用いて形質転換されたために、エキ
スパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ及びアセチル基転移酵
素活性を両方共発現する。従って、このベクターは、
Ｃ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍアセチル基転移酵素単独か、
又は突然変異体エキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼポ
リペプチドをコード化するＤＮＡ配列と一緒のいずれか
をコード化するＤＮＡを含む、ＥＰ−Ａ−Ｏ ４３７
３７８号に記載されたＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ形質転換
ベクターとは異なる。ｐＴＳ−８構築では、エキスパン
ダーゼ／ヒドロキシラーゼ及びアセチル基転移酵素遺伝
子の発現は、それぞれＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ Ｉ
ＰＮＳプロモーターの別々の複写により推進される。Ｉ
ＰＮＳプロモーターの第３の複写は選択マーカーとして
使用されるフレオマイシン耐性遺伝子の転写を推進する
ために使用される。本発明の代りの実施態様では、エキ
スパンダーゼ／ヒドロキシラーゼとアセチル基転移酵素
は別々のベクターに組み入れられ連鎖様式で宿生Ｐｅｎ
ｉｃｉｌｌｉｕｍ株に導入される。エキスパンダーゼ／
ヒドロキシラーゼ及びアセチル基転移酵素活性をコード
化するＤＮＡフラグメントがＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ株
に導入される順序は実際的観点からでしか重要でない。
好ましくは、エキスパンダーゼ／ヒドロキラーゼ遺伝子
を用いるＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍの形質転換はアセチル
基転移酵素の挿入に先行しなければならない。なぜなら
ばこれは酵素が生体内で活動する順序であるからであ
る。従って、エキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼの発
現はアジポイル−７−ＡＤＡＣ産生を検定することによ
り監視することができる。アジポイル−７−ＡＤＡＣは
アセチル基転移酵素の基質であるから、逐次導入される
アセチル基転移酵素コード化遺伝子の発現はアジポイル
−７−ＡＣＡの産生により示される。アセチル基転移酵
素に対する適当なインビトロ検定を使用して、先ずアセ
チル基転移酵素を用いてＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍを形質
転換し、インビトロ検定を使用してその発現を確かめ、
次いでエキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ遺伝子の導
入に移ることが可能である。従っていずれの経路も７−
ＡＣＡを製造するための本発明方法の適当な実施態様で
ある得る。しかしながら、好ましい実施態様には、Ｃ．
ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍのエキスパンダーゼ／ヒドロキシ
ラーゼ及びアセチル基転移酵素活性をコード化するＤＮ
Ａを含む単独のプラスミドベクターの構築を介して同時
に導入される３つの酵素活性を全部有する。このような
単一プラスミドベクターであるベクターｐＴＳ−８を用
いて形質転換され、かつエキスパンダーゼ／ヒドロキシ
ラーゼ及びアセチル基転移酵素活性を発現できるＰｅｎ
ｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｏｇｅｎｕｍ株はＰＣ３０
０と同定されている。その類学的特徴はＰＣ２００につ
いて前記に詳しく記載したものと同じである。ＰＣ３０
０について受け入れ得る培養条件はＰＣ２００について
前記に詳しく記載したものと同じである。ＰＣ３００と
称されるＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株は受託番号ＡＴ
ＣＣ ７４１８７号（寄託日付：１９９２年９月２３
日）として、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１２３０１
Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌ
ｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２に寄託されている。
本発明の好ましい実施態様であるＳ．ｃｌａｖｎｌｉｇ
ｅｒｕｓエキスパンダーゼ遺伝子の活性を発現するベク
ターｐＰｅｎ ＦＴＳＯを用いて形質転換された特異Ｐ
ｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍは、Ｃ
ａｎｔｗｅｌｌら（１９９０）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃ，１７，２１３〜２２１のような先行技術の構
築に関しては新規である。両方の構築では共に、インビ
トロ突然変異生成を使用してプロモーターをエキスパン
ダーゼ遺伝子に接続する。Ｃａｎｔｗｅｌｌ構築では、
ＸｂａＩ／ＮｄｅＩリンカーによりＩＰＮＳプロモータ
ーの３′末端のＸｂａＩ部位に連結されるエキスパンダ
ーゼ遺伝子のＡＴＧのＮｄｅＩ部位を操作により導入す
る。本発明の構築では、ＮｃｏＩ部位をエキスパンダー
ゼ遺伝子のＡＴＧに作り出して、ＩＰＮＳリンカーの
３′末端のＮｃｏＩ部位に連結する。これによりこれら
の構築の中のプロモーター遺伝子連結部の周辺に次の配
列を作り出す。 ＸｂａＩ ＮｃｏＩ ＩＰＮＳプロモーター ５′ ＴＣＴＡＧＡＣＡＣＣＡＴＧＧ ３′ 配列番号１Ｓｔｒｅｐ エキスパンダーゼ ５′ ＧＴＧＡＧＡＧＴＴＧＡＴＧＧＡＣ ３ ′ 配列番号２ Ｃａｎｔｗｅｌｌ ５′ ＴＣＴＡＧＡＣＡＣＴＡＴＧＧＡＣ ３ ′ 配列番号３ 本発明 ５′ ＴＣＴＡＧＡＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣ ３ ′配列番号４ Ｃａｎｔｗｅｌｌ構築ではＣをＴで置き換えるが、本発
明の構築物ではＣは保留される。このようにＡＴＧスタ
ートコドンに直接隣接するＩＰＮＳプロモーターの配列
は、天然産１ＰＮＳ遺伝子について見出される配列と正
確に合致する。先行技術のプロモーターは単一ヌクレオ
チド塩基１つしか違わないけれども、翻訳効率の効率低
下をもたらし、従ってエキスパンダーゼ遺伝子発現を低
水準にすることがあり得る。他の相違は構築に包含され
るプロモーター又は遺伝子の領域にある。Ｃａｎｔｗｅ
ｌｌ構築はＩＰＮＳプロモーターの５′ＢａｍＨＩ〜Ｘ
ｂａＩ３′領域を含有するが、本発明のベクターはプロ
モーターの５′ＮｃｏＩ〜ＮｃｏＩ３′領域を含有する
［Ｄｉｅｚら、（１９９０），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６５，１６３５８〜１６３６５］。これによりＣ
ａｎｔｗｅｌｌ構築のＩＰＮＳプロモーターの５′末端
に約２５０ｂｐＳの追加をもたらす。しかしながら、こ
の領域はＩＰＮＳ遺伝子の上流のＡＣＶ合成酵素遺伝子
の開いた読み取枠（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａ
ｍｅ）にある。Ｃａｎｔｗｅｌｌ構築は遺伝子のＡＴＧ
からＢａｍＨＩまでの部位３′のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ遺伝子をも含有するが、本発明のベクターは遺伝子
のＡＴＧ／ＳＡｌＩ部位３′を含有する［Ｋｏｖａｃｅ
ｖｉｃ ら（１９８９），Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，
１７１，７５４〜７６０］。このためＣａｎｔｗｅｌｌ
構築上の追加３′末端配列の大体１０００ｂｐｓに生じ
る。本発明の構築にはＡＴＧのＢａｍＨＩ部位５′まで
エキスパンダーゼ遺伝子の上流領域をやはり含有する。
しかしながら、ＩＰＮＳプロモーターによりエキスパン
ダーゼ遺伝子の読み取枠から分離される。先行技術に記
載されているものとに関する本発明のｐＰｅｎ ＦＴＳ
Ｏ構築物のもう１つの相違は、使用される選択マーカー
に関する。ＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍＩＰＮＳプロモータ
ー：フレオマイシン遺伝子融合を本発明の構築物に使用
することにより、多数複写の組込み又は高水準の発現を
許容する遺伝子座における組込みを選ぶ傾向となり、こ
のようにしてエキスパンダーゼを高水準で発現する形質
転換体の百分率を潜在的に更に高くし得る。アジポイル側鎖の開裂 本発明の新規バイオプロセスの最後のステップはアジポ
イル−７−ＡＤＡＣ又はアジポイル−７−ＡＣＡからア
ジポイル側鎖を開裂することであって、それはアジポイ
ルアミダーゼ酵素を用いて先行ステップの産生物を処理
することを要する。前記に既に示したように、本発明の
重要な成果の１つはアジポイル−７−ＡＤＡＣ及びアジ
ポイル−７−ＡＣＡの形成をもたらすステップのすべて
を単独の発酵培養で行うことができることである。この
成果によりプロセスのステップごとに中間生成物を単離
して部分的に精製する必要がなくなって抜群の効率の向
上をもたらす。しかしながら、この最終のステップでは
アジポイルアミダーゼ酵素系は存在しない。即ち、Ｐ．
ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの遺伝子の天然又は組換え発現
のいずれによっても元来の発酵培養ではその場では形成
されていない。本発明の新規バイオプロセスをバッチ式
に行う場合には、第１ステップの産生物を単離して部分
的に精製することが必要となり、これを行うため予備的
操作は既に前記した。それにもかかわらず、本発明の方
法は、アジポイルアミダーゼをアジポイル−７−ＡＤＡ
Ｃ又はアジポイル−７−ＡＣＡと効果的に接触させ、そ
の結果その化合物の７−ＡＤＡＣ又は７−ＡＣＡへの酵
素的変換を起すことができる方法により行い得る。これ
はもっとも広い意味の用語「接触」の定義である。粗製
のアジポイル−７−ＡＤＡＣ又はアジポイル−７−ＡＣ
Ａの無細胞ブイヨンを原料流として使用し、それを粗製
アジポイルアミダーゼブイヨンを用いてバッチ方式で処
理することが可能である。この処理方法は初めに反応物
の実質的な精製を必要としないため、それにより若干の
効率が得られる。変更が可能であるのは当然である。た
とえば、反応物を相互に接触する前に所望のどんな程度
にでも精製し得る。同様に、バッチ式よりも連続式に方
法を行うことも可能である。反応物自体の接触はプロセ
ス工学の進歩に合わせて種々の方法で変更し得る。それ
で、たとえばアジポイルアシラーゼを含有するカラムの
形で固定化酵素を使用し、アジポイル−７−ＡＤＡＣ又
はアジポイル−７−ＡＣＡをカラムを通過させ得る。固
定化酵素は懸濁液としてアジポイル−７−ＡＤＡＣ又は
アジポイル−７−ＡＣＡ溶液に添加もし得る。このよう
な固定化酵素系は容易な酵素回収と多重使用の利点を提
供する。このようなプロセス工学のもう１つの例は膜反
応器に関するものである。反応物を接触させる好ましい
方法は固定化酵素カラムを用いる。開裂ステップに有用なアジポイルアミダーゼ酵素 アジポイル側鎖に対する特異性の知られている酵素が多
数存在する。ＲＡＥＶＣｏｒｐ．から市販品を入手し得
るアジポイルアミダーゼを用いて得た結果を実施例とし
て更に下記に詳細に示す。セファロスポリン型分子から
アジポイル側鎖を除去する７個の他の酵素が文献に報告
されている。これらの７個の酵素の中６個はＰｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ種に由来し、７番目はＢａｃｉｌｌｕｓ種
に由来する。若干の類似性が緑膿菌類似菌酵素のあるも
のの間存在するが、７個全部がそれらの物理的／生物学
的性質においてある程度異なる。それらの特性のいくつ
かを下記にまとめて示す。 前記アジポイルアミダーゼ酵素の全部が本発明の新規バ
イオプロセスに有用である。本発明の方法に有用な他の
アジポイルアミダーゼは、作動しなければならない実際
の基質であるアジポイル−７−ＡＣＡ及びアジポイル−
７−ＡＤＡＣに対して候補酵素を試験することにより容
易に発見し得る。肯定的な結果は候補酵素が本発明方法
に本当に有用であることを決定する信頼性と再現性のあ
る方法をもたらす。基質は、Ｓｚｅｗｃｚｕｋ及びＷｅ
ｌｌｍａｎ−ＢｅｄｎａｗｓｋａによりＣｌｉｎ．Ｃｈ
ｉｍ．Ａｃｔａ（１９７８）８４，１９〜２６に報告さ
れた操作の変更を使用して無水アジピン酸と７−ＡＣＡ
の反応により製造することができる。Ａｇｒｉｃ，Ｂｉ
ｏｌ，Ｃｈｅｍ．（１９８１）４５（７），１５６１〜
１５６７に記載された方法を修正させることも可能であ
り、これはグルタリル−７−ＡＣＡお製造するための方
法である。無水アジピン酸はＪ．Ｍａｃｒｃｍｏｌ．Ｓ
ｃｉ．Ｃｈｅｍ（１９９０）Ａ２７，３９７〜４１２に
記載されたＡｌｂｅｒｔｓｏｎ及びＬｕｎｄｍａｒｋの
方法により製造し得る。７−ＡＣＡはＳｉｇｍａ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．を含めて数個所の販売元から入手
しる。迅速な比色方法を使用して候補酵素の大まかな選
別を行うことが望ましい場合は、アジポイル−ＰＡＢＡ
（ｐ−アミノ安息香酸）又はアジポイル−ｐＮＡ（ｐ−
ニトロアニリン）のような比色基質をアジポイル−７−
ＡＣＡの代りに置き換え得る。このような方法はＳｚｅ
ｗｃｚｕｋら、Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃ
ｔａ，８４（１９７８）１９〜２６のγ−グルタミンＰ
ＡＢＡに対する記載から修正させ得る。側鎖の開裂によ
り発色種が得られ、その存在と濃度が比色計を使用して
容易に決定される。これら及び他の適当な比色方法に開
する更に詳細な知見は、Ｍｅｒｅｌｌｉ，Ｌ．Ｐ．（１
９６８）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．５７：２１７２〜２
１７３；Ｓｚａｓｚ，Ｇ．（１９６９）Ｃｌｉｎ．Ｃｈ
ｏｍ．１５：１２４〜１３６；Ｓｚｅｗｃｚｕｋ，Ａ．
ら（１９８０）Ａｎａｌ．Ｂｉｃｈｅｍ．１０３：１６
６〜１６９；及びＲｅｙｅｓ，Ｆ．ら（１９８９）Ｊ．
Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４１；１３６〜１３７を参照され
たい。前記表に示したａｃｙＩＩの大きいサブユニット
を有するＲＡＥＶ酵素とＧＫ１６酵素のＮ−末端アミノ
酸配列を比較した。比較の結果を下記に示す（括弧は決
定的指定に至らないことを示す。 ＲＡＥＶ一配列番号：５ （Ｓ）Ｎ（Ｓ）（Ｇ）ＡＶＡＰＧＫＴＡＮＧＮＡＬ（Ｌ）ＬＱＮ（Ｐ） ＧＫ１６ −配列番号：６ Ｓ Ｎ Ｓ Ｗ ＡＶＡＰＧＫＴＡＮＧＮＡＬ Ｌ ＬＱＮ Ｐ ａｃｙＩＩ−配列番号：７ ｓ Ｎ Ｎ Ｗ ＡＶＡＰＧＲＴＡＴＧＲＰＩ Ｌ ＡＧＤ Ｐ 表示の配列から、これらのペプチドの３個すべてが関連
していることは明らかである。しかしながら、前記に示
したのと同様なＮ−末端配列を有する蛋白質は、Ａｒｔ
ｈｒｏｂａｃｔｅｒの菌株により産生されるペニシリン
Ｇアシラーゼについて事実であるように、アジポイルア
ミダーゼ活性を必ずしも有しない。他方で、前記Ｎ−末
端配列に重要な相同を示さない、本発明方法で有用なア
ジポイルアミダーゼが存在する。たとえば前記表に示さ
れた旭ａｃｙＩ及び藤沢Ｂ．ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｏｕ
ｓ Ｊ１シラーゼは若干のアジポイル−７−ＡＣＡアシ
ラ−ゼ活性を有することが示されているが、前記に示し
たその他の酵素と配列相同を共有しない。従って、新規
パイオプロセスの最後のステップで有用なアジポイルア
ミダーゼに関する本発明の範囲は、候補酵素がアジポイ
ル−７−ＡＣＡからアジポイル側鎖を開裂できるか又は
できないかにより決定され、前記説明のように容易で確
実に決定し得る事柄である。
るセファロスポリンＣとは極めて異なっている。この中
間体の場合は、７−（Ｄ）−α−アミノアジポイル側鎖
が以後の合成的誘導を許容しないので、許容的な７−ア
ミノ基を与えるために開裂する必要がある。残念なこと
に、７−（Ｄ）−α−アミノアジポイル側鎖は化学的手
段によっても生化学的手段によってもその除去が常に難
しいことが立証されている。用語の定義 本明細書中、特に好ましい実施態様の項で使用する以下
の用語の意味は下記の通りである： ７−ＡＣＡ ７−アミノセファロスポラン酸 ７−ＡＤＡＣ ７−アミノデアセチルセファロスポラ
ン酸 ７−ＡＤＣＡ ７−アミノデアセトキシセファロスポ
ラン酸 ６−ＡＰＡ ６−アミノペニシラン酸 ＤＡＯＣ デアセトキシセファロスポラン酸 ＤＡＯＣＳ ＤＡＯＣシンテターゼ ＤＡＣ デアセチルセファロスポリンＣ ＤＡＣＳ ＤＡＣシンターゼ ＩＰＮＳ イソペニシリンＮジンテターゼ Ｔｒｉｓ トリス［ヒドロキシメチル］アミノメ
タン ＥＤＴＡ エチレンジアミンテトラ酢酸 ＤＥＰＣ ジエチルピロカーボネート ＴＥ トリス／ＥＤＴＡ緩衝液 ＳＳＣ 塩（塩化ナトリウム）、クエン酸ナト
リウム緩衝液 ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム ＰＥＧ ポリエチレングリコールＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ の培
養 本発明の方法の第１のステップは、イソペニシリンＮを
産生するＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎ
ｕｍ株をその増殖を維持することができる培養培地中に
保持し、この培養培地に、アジピン酸か、又はアジポイ
ル−６−ＡＰＡを産生するために前記Ｐｅｎｉｃｉｌｌ
ｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株により同化され使用
され得るアジピン酸の塩及びエステルのうちいずれか１
つ以上を含むアジペート原液（ａｄｉｐａｔｅ ｆｅｅ
ｄｓｔｏｃｋ）を加えることからなる。このアジペート
原液は、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍを接種した後で培
養培地に加えてもよいが、好ましくは接種実施時点で既
に培養培地中に存在しているようにする。Ｐｅｎｉｃｉ
ｌｌｉｕｎｍ以外の属、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｄｕｌａｎｓ、並びにｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ種
以外のＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属の種ｍイソペニシリン
Ｎを産生する。しかしながら歴史的には、イソペニシリ
ンＮを最も多く産生する株は総て、ｃｈｒｙｓｏｇｅｎ
ｕｍ種からの株の改良という公知の技術によって開発さ
れてきた。そこで、実際問題として、本発明はＰｅｎｉ
ｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍに限定されて
いるが、他の種にも勿論適用し得る。任意の寄託済みＰ
ｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株、又
は他の一般的に入手できるこの種の株の由来源は、本発
明の方法を実施するための適当な出発点である。イソペ
ニシリンＮを産生するＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒ
ｙｓｏｇｅｎｕｍ株の増殖を維持できる培養培地は、普
通の知識を備えた当業者が容易に思い付くようなもので
ある。例えば、培養は水中好気性発酵方法を用いて行
い、使用する培地は多くの適当な入手可能な培地から選
択する。典型的な培地は、スクロース、グルコース及び
澱粉のような炭素源；大豆のあら粉（ｍｅａｌ）及び顆
粒（ｇｒｉｔ）、綿実油、ピーナッツのあら粉、種々の
アミノ酸及びその混合物、並びにペプトンのような窒素
源を使用する。産生要件としては収率と単離の容易さと
が重要であり、従ってこのような状況では、炭素源とし
ての糖蜜（ｍｏｌａｓｓｅｓ）、並びに窒素源としての
大豆粉及びアミノ酸を好ましい培地として使用し得る。
培養培地には通常、栄養素無機塩を加える。この種の塩
としては、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カル
シウム、ホスフェート、スルフェート、塩化物、臭化
物、ニトレート、カーボネート、第二鉄、第一鉄、マグ
ネシウム、マンガン等のようなイオン性成分を供給でき
るものが挙げられる。Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒ
ｙｓｏｇｅｎｕｍの増殖、発育及び代謝には通常微量元
素も不可欠であり、この種の元素は、主に他の培養培地
成分の混入物として既に存在していない限り、培養培地
に直接添加し得る。Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙ
ｓｏｇｅｎｕｍ株は、アジポイル−７−ＡＣＡ、そして
任意に７−ＡＣＡを少量だけ製造したい場合には、１リ
ットルのシェークフラスコのような小容積装置で培養し
得る。しかしながら、より大量のアジポイル−７−ＡＣ
Ａを製造したい場合には、大型発酵タンクを水中好気性
発酵条件で使用する。アジポイル−７−ＡＣＡの大規模
調製を行う場合には、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒ
ｙｓｏｇｅｎｕｍ株の胞子を寒天斜面培養基上に保持す
る。この斜面培養基からの胞子を用いて、少量の栄養培
地（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｍｅｄｉｕｍ）に接種す
る。この栄養培地をインキュベートして、前記微生物の
新鮮な活発に増殖する生産率の高い（ｈｅａｖｙ）培養
物を得る。次いで、この栄養増殖物を大規模発酵培地の
接種物（ｉｎｏｃｕｌｕｍ）として使用する。場合によ
っては、更に別の栄養培地を発酵培地の接種物として加
えるのが望ましいこともある。このような第２の段階の
栄養培地は通常、発酵培地の量が第１の栄養培地を大き
く上回る場合に使用する。このようにして、微生物の胞
子を最初は少量の栄養培地で培養し、より大量の栄養培
地のための接種物を得る。次いで、この大量の栄養培地
で、大型発酵タンクでの発酵を迅速に開始させるのに十
分な濃度の微生物を得る。栄養培地は発酵培地と同じ組
成を有するか、又は小規模操作で微生物の増殖及び発育
を促進するために他の成分を含み得る。本発明の方法で
使用するＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎ
ｕｍ株は約２０℃〜３０℃の温度で最も効果的に培養さ
れるが、最適収率は温度が約２２℃〜２８℃、好ましく
は約２５℃の時に得られる。アジポイル−７−ＡＣＡの
最大産生は、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇ
ｅｎｕｍ株を大型タンクで約１０〜３０日、好ましくは
１５〜２５日培養したときに生起する。しかしながらこ
の微生物は、例えば２５０ｍｌシェークフラスコのよう
な小型装置で培養するとより速く増殖し、より短い期
間、例えば４〜１５日、通常は５〜７日でアジポイル−
７−ＡＣＡを産生する。大型発酵タンクの末期ｐＨ（ｔ
ｅｒｍｉｎａｌ ｐＨ）が８．０以上になると、アジポ
イル−７−ＡＣＡの収率に悪影響が及ぼされ得る。この
ような状況では、発酵の間中、培養培地のｐＨをモニタ
ーするのが望ましい。アジポイル−７−ＡＣＡの最大産
生時点の前にｐＨが前記レベルに到達しそうな場合に
は、発酵培地に適当な酸又は緩衝剤を加えてｐＨを下げ
るように調整するとよい。アジポイル−７−ＡＣＡが産
生されたら、発酵ブイヨンの試料をクロマトグラフィー
によって検査し得る。水中好気性発酵で通常実施される
ように、培養培地には無菌空気を通してＰｅｎｉｃｉｌ
ｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株をより効果的に増
殖させ、アジポイル−７−ＡＣＡの産生率を高める。培
養培地に通す空気の量は通常、培養培地１倍容当たり約
０．２倍容／分以上である。しかしながら、空気の流量
を増やすと、アジポイル−７−ＡＣＡの産生に有用な効
果がもたらされることもしばしばある。Ｐｅｎｉｃｉｌ
ｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株は通常、アジポイ
ル−７−ＡＣＡの他に、多くの副産物及び代謝産物を産
生する。これらの産物の一部は酸に弱いため、発酵培地
からアジポイル−７−ＡＣＡを回収する時には、同時に
産生された不純物の一部を破壊するために、発酵ブイヨ
ン全体を酸性ｐＨで短時間処理するのが望ましい。この
ように処理した濾過後の発酵ブイヨンからアジポイル−
７−ＡＣＡ発酵生成物を回収する。この生成物は任意に
イオン交換樹脂でのクロマトグラフィーによって発酵培
地の他の成分から分離し得、必要であればアジポイル側
鎖の酵素開裂ステップの前にクロマトグラフィーで更に
精製し得る。このようなイオン交換クロマトグラフィー
による分離は側鎖開裂の後で行うこともできる。分離問
題を伴う主要副産物の１つはアジポイル−６−ＡＰＡで
ある。この副産物は、分離をより容易にするために、化
学的又は酵素的に分解できる。まず、濾過した発酵ブイ
ヨンを予精製処理にかける。この処理は、例えばｎ−ブ
タノール又はアミルアセテートのような非水混和性有機
溶媒で初期抽出を行って不純物を除去する操作を含み得
る。抽出したブイヨンは活性炭でのクロマトグラフィー
により更に予精製し得る。アジペート原液の添加 好ましくは、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇ
ｅｎｕｍの発酵培養が前述のように確立された時点で、
即ち接種に先立って、アジペート原液を発酵培養培地の
他の成分に加える。場合によっては、アジペート原液を
接種の後、例えば接種の１日後、２日後及び／又は３日
後に加えてもよい。アジペート原液とは、アジピン酸
か、又はアジポイル−６−ＡＰＡを産生するために培養
中のＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ
株によって同化され使用され得るアジピン酸の塩もしく
はエステルのうちいずれか１つ以上をさすと定義され
る。アジピン酸、その塩及びエステルは、単独で、又は
任意に組合わせて使用し得る。好ましいのはジナトリウ
ム塩であるが、カリウム及びナトリウムとの混合塩も適
当である。メチルエステルも使用し得るが、エチルエス
テルは水不溶性である。アジピン酸の塩又はエステル
は、アジポイル−６−ＡＰＡを産生するためにＰｅｎｉ
ｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株によって同
化され使用され得るようなものでなければならない。例
えば、アジピン酸は水不溶性ではあるが、適当なｐＨ条
件下で同化可能塩を生成するのであれば、適当な原料と
して使用し得る。適当なエキスパンターゼ酵素及び／又はヒドロキシラー
ゼ酵素 培養し且つアジポイル−６−ＡＰＡを産生するために前
述のようにアジペート原液を加えたＰｅｎｉｃｉｌｌｉ
ｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株は、エキスパンターゼ
酵素及びヒドロキシラーゼ酵素の活性をコードするＤＮ
Ａによって形質転換した株でもあり、その発現の結果と
して前記アジポイル−６−ＡＰＡがその場で環拡張され
て（ｒｉｎｇ−ｅｘｐａｎｄｅｄ）アジポイル，７−Ａ
ＤＣＡを形成し、３−メチル側鎖も３−ヒドロキシメチ
ルに変換される。アジポイル−６−ＡＰＡはアジペート
原液培養したＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅ
ｎｕｍにより細胞内で産生される。この細胞内セッティ
ングでは、即ちｉｎ ｓｉｔｕベースでは、形質転換し
たＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍが
エキスパンターゼ酵素及びヒドロキシラーゼ酵素の活性
をコードするＤＮＡを発現し、その結果前記酵素が基質
としてのアジポイル−６−ＡＰＡに作用し、これを環拡
張させてアジポイル−７−ＡＤＣＡを形成せしめる。こ
のアジポイル−７−ＡＤＣＡは次いでヒドロキシル化に
よりアジポイル−７−ＡＤＡＣ（アジポイル−７ーアミ
ノデアセチルセファロスポラン酸）に変換される。本発
明の新規のバイオプロセスは、その範囲内に、前記タイ
プのＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ
株をエキスパンターゼ酵素及びヒドロキシラーゼ酵素の
活性をコードするＤＮＡで形質転換し、これら酵素の発
現の結果として、アジポイル−６−ＡＰＡをその場で環
拡張してアジポイル−７−ＡＤＣＡを形成し、更にヒド
ロキシル化してアジポイル−７−ＡＤＡＣを形成する操
作を含む。従って、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙ
ｓｏｇｅｎｕｍの形質転換に使用するＤＮＡは、当業者
に公知のエキスパンダーゼ酵素の活性、即ちイソペニシ
リンＮを環拡張してＤＡＯＣに変換する能力だけでな
く、アジポイル−６−ＡＰＡを還拡張してアジポイル−
７−ＡＤＣＡに変換する能力をも有する酵素を発現する
ようなものでなければならない。また、ヒドロキシラー
ゼ酵素はアジポイル−７−ＡＤＣＡをヒドロキシル化し
てアジポイル−７−ＡＤＡＣに変換できるようなもので
なければならない。本発明では、エキスパンターゼ酵素
及びヒドロキシラーゼ酵素の活性を与える方法に関し
て、２つの実施態様が適当とみなされる。一方の好まし
い実施態様では、エキスパンターゼ及びヒドロキシラー
ゼの機能を、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅ
ｎｕｍを形質転換させる本質的には二官能性の単一のＣ
ｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ遺
伝子によって発現される活性により達成する。前記遺伝
子はエキスパンターゼ及びヒドロキシラーゼの活性を両
方一緒に発現する。この遺伝子はエキスパンターゼ／ヒ
ドロキシラーゼ遺伝子と称し、その遺伝子産物はエキス
パンターゼ／ヒドロキシラーゼ酵素と称する。通常は、
エキスパンターゼ／ヒドロキシラーゼ活性をコードする
Ｃ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ由来のＤＮＡでＰ．ｃｈｒｙ
ｓｏｇｅｎｕｍを形質転換すると、前記活性の発現が単
一プロモーター配列によって制御される。これは、単一
遺伝子の存在を示すものである。本発明の別の適当な実
施態様では、単一のエキスパンターゼ／ヒドロキシラー
ゼ遺伝子ではなく、エキスパンターゼ及びヒドロキシラ
ーゼ活性を別個の遺伝子としてコードするＤＮＡでＰ．
ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ宿主を形質転換する。尚、別個
のエキスパンターゼ及びヒドロキシラーゼ遺伝子、並び
にこれらの遺伝子がコードする対応する酵素活性は、前
述のように単一のエキスパンターゼ／ヒドロキシラーゼ
遺伝子及び酵素をコードするＣ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ
のような真核微生物ではなく、Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅ
ｒｕｓのような原核微生物に見られる。原核ヒドロキシ
ラーゼ酵素の配列及びこれをコードするヌクレオチド
は、前記酵素の単離手段と共に、Ｋｏｖａｃｅｖｉｃ
ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７３（１），３９８
−４００（１９９１）及びＥＰ−Ａ−０ ４６５ １８
９号に記述されている。当業者には明らかなように、ヒ
ドロキシラーゼの配列からは、良く知られた手動的方法
又は自動化されたＤＮＡシンセサイザーによって、ヒド
ロキシラーゼ酵素をコードするＤＮＡを合成することが
できる。このＤＮＡ化合物、又はヒドロキシラーゼと同
一のアミノ酸配列あるいは同等のヒドロキシラーゼ活性
を有する前記酵素のフラグメントもしくは誘導体をコー
ドする別の配列は、プロモーター及び他の調節配列と組
合わせて種々のクローニングベクター及び発現ベクター
の調製のベースとして使用し得る。次いで、これを用い
てＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの形質転換を行えば、ヒ
ドロキシラーゼ酵素を発現しそれによって本発明の方法
を実施することができる。また、ハイブリダイゼーショ
ンによって相同の配列を同定するために、有用なヒドロ
キシラーゼ酵素を含んでいる可能性のある株のゲノムラ
イブラリーをスクリーニングするためのプローブとして
前記ＤＮＡ化合物を使用することも可能である。このよ
うにして同定される任意の推定上のヒドロキシラーゼの
活性は、本発明の方法の実際のアジポイル−７−ＡＤＣ
Ａ基質を使用し且つＨＰＬＣによってそのヒドロキシル
化産物を単離することにより確認し得る。本発明のこの
実施態様を使用する時は、即ちヒドロキシラーゼ活性の
みを発現する単一遺伝子を使用する場合には、エキスパ
ンダーゼ酵素の活性をコードするＤＮＡを別個に供給す
る必要もある。これは、エキスパンダーゼ機能をその場
で発現させて本発明の方法で環拡張ステップが行われる
ようにする適当な発現ベクターによりＰ．ｃｈｒｙｓｏ
ｇｅｎｕｍを形質転換できるようにするためである。エ
キスパンダーゼ酵素は多数知られている。側鎖の類似性
に基づいて、多くのエキスパンダーゼ酵素が本発明の新
規のバイオプロセスで操作可能であると考えられる。本
発明の他の有用な実施態様は、１つ以上のエキスパンダ
ーゼ及び／又は１つ以上のヒドロキシラーゼの活性をコ
ードするＤＮＡを非組換えＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ
の形質転換に使用し得るという事実をベースとする。こ
のような実施態様では、発現される酵素タンパク質の量
が増加するため、より大きいエキスパンダーゼ及び／又
はヒドロキシラーゼ活性を得ることができる。先行技術
の項で述べたように、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌ
ａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ ＡＴＣＣ ２７０６４由来のエ
キスパンダーゼ酵素は完全に配列決定されており、且つ
エンドヌクレアーゼ制限地図によって特徴が解明されて
いる。しかしながら、Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ
ＮＲＲＬ ３５８５由来の同一酵素と思われる物質は、
異なる分子量を有すると報告されている。この分子量は
配列決定はされていない。また、やはり先行技術の項で
述べたように、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒ
ｅｍｏｎｉｕｍ ＡＴＣＣ １１５５０由来のＤＡＯＣ
Ｓ／ＤＡＣＳ酵素は配列決定されている［Ｓａｍｓｏｎ
ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８７）５；１
２０７−１２１４及びＥＰ−Ａ−０ ２８１ ３９１
号］。先行技術で既に同定されているこれらのエキスパ
ンダーゼ酵素は本発明の新規のバイオプロセスで有用で
ある。種々のＳ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ株又はＣ．
ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ株、あるいは異なる属の微生物に
由来するまだ同定されていない他のエキスパンダーゼ酵
素も、本発明の新規のバイオプロセスを実施するのに適
したものであり得る。有用な微生物のこのような新しい
株及び属を同定するための方法、並びに推定上のエキス
パンダーゼ酵素を単離し且つこれらの酵素が本発明の方
法で使用するのに適しているということを立証する方法
は簡単であり、当業者により容易に実施される。有用な
微生物の期待される新しい株及び属の無細胞抽出物のス
クリーニングは、第一鉄（Ｆｅ２＋）イオン、アスコル
ベート、α−ケトグルタレート及びアデノシントリホス
フェート（ＡＴＰ）を含む公知のＤＡＯＣＳ補助因子の
存在下でアジポイル−６−ＡＰＡ基質に前記抽出物を加
えることにより、信頼性と再現可能性とをもって実施し
得る。アジポイル−６−ＡＰＡは、後で詳述する方法と
類似の方法で非形質転換Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈ
ｒｙｓｏｇｅｎｕｍにアジペート原液を供給することに
より十分な量で製造し得る。アジポイル−７−ＡＤＣＡ
及び／又はアジポイル−７−ＡＤＡＣが生成されれば、
所望のエキスパンダーゼ（又はエキスパンダーゼ／ヒド
ロキシラーゼ）酵素が存在する。この酵素の存在はクロ
マトグラフィーによって検出し得る。また、公知の組換
え技術を使用し、例えばＳ．Ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ
及びＣ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ由来のエキスパンダーゼ
遺伝子のヌクレオチド配列に基づいてＤＮＡプローブを
形成し、本発明の方法で使用するのに適したエキスパン
ダーゼを産生する可能性のある微生物のＤＮＡの内容を
スクリーニングすることもできる。エキスパンダーゼ酵素、ヒドロキシラーゼ酵素及びエキ
スパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ酵素の潜在的由来源 エキスパンダーゼ酵素は前述のように、ｐｅｎａｍ還構
造（ペニシリンタイプの分子に見られる）の拡張を触媒
してＣｅｐｈ−３−ｅｍ環（セファロスポリンに見られ
る）にする酵素である。従って、ｃｅｐｈｅｍ環を有す
る代謝産物を産生する微生物はいずれもエキスパンダー
ゼをコードするＤＮＡの潜在的由来源である。同様にし
て、３−ヒドロキシメチル基を有するセファロスポリン
を産生する微生物はいずれも、ヒドロキシラーゼ（又は
エキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ）をコードするＤ
ＮＡの潜在的由来源である。この種の微生物の具体例を
下に挙げる。但し、このリストは非限定的なものにすぎ
ない。 菌類Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐ．Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌｏｐｓｉｓ Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ Ｓｃｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ Ｄｉｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒａ Ｓｐｉｒｏｉｄｉｕｍ Ａｎｏｘｉｏｐｓｉｓ 放線菌類Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ Ｓ．ｌｉｐｍａｎｉｉ Ｓ．ｗａｄａｙａｍｅｎｓｉｓ Ｓ．ｔｏｄｏｒｏｍｉｎｅｎｓｉｓ Ｓ．ｆｉｌｉｐｉｎｅｎｓｉｓ ｃｅｐｈａｍｙｃｉｎ
ｉ Ｓ．ｈｅｔｅｒｏｍｏｒｐｈｕｓ Ｓ．Ｐａｎａｙｅｎｓｉｓ Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ Ｓ．ｃａｔｔ１ｅｙａ Ｎｏｃａｒｄｉａ ｌａｃｔａｍｄｕｒａｎｓ 他の細菌類Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ Ｍｙｃｏｐｌａｎａ ｂｕｌｌａｔａ Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｒｅｔｔｇｅｒｉ Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ ｌａｃｔａｍｇｅｎｕｓ 前記リストの微生物のエキスパンダーゼ及びヒドロキシ
ラーゼは更に検査する必要のある潜在的な酵素にすぎ
ず、これらの総てが本発明の新規の方法に適していると
は限らない。エキスパンダーゼ活性をコードするＤＮＡフラグメント
の単離 前述の方法で所望のエキスパンダーゼ酵素の存在が検出
されれば、エキスパンダーゼ活性をコードするＤＮＡを
単離する方法も簡単であり当業者には良く知られてい
る。エキスパンダーゼ酵素をコードする遺伝子の既知の
配列及び部分配列に基づいて、単離すべき所望の酵素コ
ードＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡプローブを構成
する。この種のプローブの構成は、エキスパンダーゼ酵
素をコードするアミノ酸及びヌクレオチド塩基配列に関
する知識と、特定の関連微生物の優先コドン（ｃｏｄｏ
ｎ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）とに基づく。Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ ＡＴＣＣ
２７０６４のゲノムＤＮＡに適用されるこの種の典型
的方法は後で詳述する。エキスパンダーゼ酵素活性をコ
ードするＤＮＡの単離は、組換えＤＮＡ技術で良く知ら
れている制限及び連結方法を用いて達成される。適当な
制限フラグメントを形成し且つ単離できるように、当該
微生物のゲノムのエンドヌクレアーゼ制限地図を有する
ことが必要である。Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ及び
Ｃ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍの制限地図は既に入手可能で
ある。例えば、前者の場合には、制限酵素Ｂａｍ ＨＩ
及びＳａｌ Ｉを使用し電気泳動を行えば、所望の１．
８〜２．２ｋｂの大きさのフラグメントが得られる。アセチルトランスフェラーゼ酵素の由来源及び前記活性
をコードするＤＮＡフラグメントの単離 Ｃ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ＤＡＣアセチルトランスフ
ェラーゼ遺伝子のクローニングは、当業者に公知の組換
え技術を用いて実施し得る。ここで、前記組換え技術の
一般論を説明する。アセチルトランスフェラーゼ遺伝子
をクローニングするためには、アセチルセファロスポラ
ン酸（ＤＡＣ）をセファロポスポリンＣに変換する能力
がないＣ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍの突然変異体を最初に
形成しなければならない。このようなプロセスでは、
Ｃ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ細胞をＮ−ニトロソグアニジ
ン（ＮＴＧ）、亜硝酸又は紫外線のような突然変異誘発
物質の作用にかけ、適当な増殖培地で回収し、次いで例
えばクロマトグラフィーもしくは生物学的手段によって
ＤＡＣの蓄積をアッセイする必要がある。適当な突然変
異誘発物質が同定されたら、アセチルトランスフェラー
ゼをコードする遺伝子の同定における次のステップとし
て、セファロスポリンＣ産生株からＣ．ａｃｒｅｍｏｎ
ｉｕｍ ＤＮＡを単離する。制限エンドヌクレアーゼで
の消化又は機械的せん断により適当な大きさのフラグメ
ントに開裂した後、プラスミド又はコスミドに組み込
む。形質転換ベクターは、ハイグロマイシン又はフレオ
マイシン耐性に対するような適当な優性マーカー遺伝子
をも含む。このベクターは、次の挿入ＤＮＡの回収を容
易にするために、ＤＮＡ配列も含んでいなければならな
い。例えば、クローニングしたＤＮＡを、十分に確立さ
れた方法によって実施できるｉｎ ｖｉｔｒｏパッケー
ジング及びそれに次ぐ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染によ
って回収せしめるラムダ（ファージ）ｃｏｓ部位であ
る。次いで、ゲノムＤＮＡのランダムフラグメントを含
むベクターと抗生物質耐性に基づいて選択した形質転換
体とを用いてアセチルトランスフェラーゼマイナス突然
変異株のプロトプラストを形質転換する。次いで、得ら
れた形質転換体をセファロスポリンＣ産生の回復につい
て分析し得る。この回復は、ベクターに含まれているア
セチルトランスフェラーゼ遺伝子による相補が功を奏し
たことを示すものである。次いで、前記遺伝子のクロー
ニングしたコピーを有している疑いのある突然変異体を
増殖し、そのＤＮＡを単離し、ベクターＤＮＡを前述の
方法で回収し得る。ベクターが実際にアセチルトランス
フェラーゼ遺伝子を含んでいるかどうかの確認は、標準
的な方法と容易に入手できるベクターとを用いて大腸菌
にサブクローニングし、次いでアセチルトランスフェラ
ーゼマイナス突然変異体を再度形質転換することにより
得られる。その後遺伝子を単離し、配列決定し、分子遺
伝学で一般的に使用されている方法を用いて実施例に記
載のように操作し得る。やはり当業者に公知の別の方法
で、Ｍａｔｓｕｄａらは、Ｃ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍの
アセチルトランスフェラーゼ活性をコードする遺伝子を
単離し、その配列決定を行うと共に、ＥＰ−Ｓ−０ ４
５０ ７５８号に記載のように前記酵素自体の推定され
るアミノ酸配列も決定した。これらの別の方法は、アセ
チルトランスフェラーゼ酵素の単離と、Ｎ末端アミノ酸
配列の決定と、この情報に基づいて前記酵素のこの部分
をコードするヌクレオチド配列を推定する操作とを含
む。この情報からは、完全なコード配列とハイブリダイ
ズしてその単離を可能にするプローブが形成される。Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株の
形質転換 エキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ、エキスパンダー
ゼ及びヒドロキシラーゼ、並びにアセチルトランスフェ
ラーゼの活性をコードするＤＮＡフラグメントが得られ
たら、これらのフラグメントを、プロモーターと、翻訳
活性化配列と、耐性マーカーと、調節配列と、コスミド
形成物質（ｃｏｓｍｉｄ ｆｏｒｍｅｒ）と、形質転換
を生起もしくは促進し、遺伝子産物の発現を誘起し、且
つ形質転換体の単離を容易にする他の任意のＤＮＡ配列
とを含むＤＮＡフラグメントと共に、プラスミド又は他
の発現ベクターに挿入（連結）する。次いで、このよう
にして構成した発現ベクターを用いてＰｅｎｉｃｉｌｌ
ｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株の形質転換と、エキ
スパンダーゼ／ヒドロキジラーゼ、エキスパンダーゼ及
びヒドロキシラーゼ、並びにアセチルトランスフェラー
ゼ酵素の活性の細胞内発現とを行う。形質転換及び発現
の実施に使用される技術は当業者には公知であり、その
典型を後で説明する。既述のように、形質転換したＰｅ
ｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株は、エ
キスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ、エキスパンダーゼ
及びヒドロキシラーゼ、並びにアセチルトランスフェラ
ーゼ酵素の活性を細胞内で発現し、その結果これらの酵
素がそれぞれその場でアジポイル−６−ＡＰＡ基質に作
用して環拡張によりアジポイル−７−ＡＤＣＡに変換
し、これをヒドロキシル化してアジポイル−７−ＡＤＡ
Ｃに変換する。これは更にアセチル化されてアジポイル
−７−ＡＣＡとなる。新規形質転換体 本発明の好ましい実施態様であるエキスパンダーゼ／ヒ
ドロキシラーゼ及びエキスパンダーゼ／ヒドロキシラー
ゼプラスアセチル基転移酵素遺伝子によりコード化され
る活性を発現する特異Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙ
ｓｏｇｅｎｕｍ形質転換体は、Ｃａｎｔｗｅｌｌら、
（１９９０）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１
７，２１３〜２２１，ＥＰ−Ａ−０ ２８１ ３９１号
及びＥＰ−Ａ−０ ４３７ ３７８号のような、先行技
術の同様な構築に関して新規である。Ｃａｎｔｗｅｌｌ
構築はＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍイソペニシリンＮ合
成酵素（ＩＰＮＳ）プロモーターの制御下に置かれるＳ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｎｌｉｇｅｒｕｓエ
キスパンダーゼ遺伝子を有し、それによりヒドロキシラ
ーゼ又はアセチル基転移酵素活性をコード化するＤＮＡ
を欠く本発明の場合の構築物とは異なる。ＥＰ−Ａ−０
２８１ ３９１号でＩｎｇｏｌｌａらは、Ｐｅｎｉｃ
ｉｌｌｉｎｍ ＩＰＮＳプロモーターにより推進される
発現を有するＣ．ａｃｒｏｍｏｎｉｕｍエキスパンダー
ゼ／ヒドロキシラーゼ二価性酵素をコード化するＤＮＡ
を含有するＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ形質転換ベクタ
ーついて記載している。これらの構築の１つ（ｐＰＳ６
２）では、エキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ遺伝子
はハイグロマイシン燐酸基転移酵素遺伝子の下流でその
枠の中で融合される。遺伝子産生物であるハイグロマイ
シン燐酸基転移酵素：：エキスパンダーゼ／ヒドロキラ
ーゼ融合蛋白質は、本発明の産生物、即ち、基本的に
Ｃ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍに産生されるのと同じエキス
パンダーゼ／ヒドロキシラーゼ酵素とは異なる。ＥＰ−
Ａ−０ ２８１ ３９１号に記載されたその他のベクタ
ーは合成ＤＮＡリンカーの使用を含めて、広範な系統の
モレキュラーマニピュレーションを介して構築された。
最終構築（ｐＰＳ６１）は、エキスパンダーゼ／ヒドロ
キシラーゼ遺伝子を発現するＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ
ＩＰＮＳプロモーター及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎ
ｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼの１．２ｋｂ Ｎｃｏ
ＩフラグメントをＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍの形質転移の
ための選択マーカーとして利用する。アルギニンとロイ
シンをそれぞれコード化するエキスパンダーゼ／ヒドロ
キシラーゼ中のコドン９及び１０の配列をＣＧＴＣＴＣ
からＣＧＣＣＴＡに変え、それはコード化したアミノ酸
配列を変えない。本発明の構築では、１．２ｋｂ Ｎｃ
ｏＩ ＩＰＮＳプロモーターフラグメントをエキスパン
ダーゼ／ヒドロキラーゼ遺伝子配列を、生エキスパンダ
ーゼ／ヒドロキシラーゼ遺伝子配列を変更することなく
エキスパンダーゼ／ヒドロキシラゼ遺伝子に融合した。
本発明構築に使用したＩＰＮＳプロモーターは、生プロ
モーターに関して２個の四塩基複製を有し、１つはＡＴ
Ｇスタートコドンの７６０ｂｐ上流のＳａｌＩ部位にあ
り、他の１つはスタートコドンの５個の塩基対上流のＸ
ｂａｌＩ部位において、５′未翻訳配列以内ある。これ
らの変化はエキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ遺伝子
の高水準発現に影響しない。ベクターのもう１つの相違
は使用される選択マーカーにある。ＥＰ−Ａ−Ｏ２８１
３９１号に記載の構築物は選択マーカーとしてアセト
アミダーゼとハイグロマイシンを使用する。これは、フ
レオマイシン耐性マーカーを含有する、本発明に利用さ
れるエキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼＰｅｎｉｃｉ
ｌｌｉｕｍ形質転換ベクター（ｐＰＥＮ／ ＣＰＨ−
１）とは著しく違っている。ベクターｐＰＥＮ／ＣＥＰ
Ｈ−１を用いて形質転換され、エキスパンダーゼ／ヒド
ロキラーゼ活性を発現できるＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ
ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株はＰＣ２００として確認され
ている。その分類学的特徴としては広く拡がる集落の産
生が揚げられるのが典型的で、色が青緑色〜緑色、黄色
の滴を有する滑かなビロード状、寒天中に拡散する黄色
裏面、すべての部分が滑かな枝を有する分生子頭、長さ
３〜４μｍの長円形〜ほぼ球形の分生子である。Ｐ．ｃ
ｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍに受け入れられる培養条件は、乳
糖、一水和物１．５％（ｗ／ｖ）、コーンスティープリ
カー０．５％（ｖ／ｖ）、ヘプトン０．５％（ｗ／ｖ）
ＮａＣｌ０．４％（ｗ／ｖ）、ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ
０．０５％（ｗ／ｖ）、ＫＨ２ＰＯ４ ０．０６％（ｗ
／ｖ）、ＦｅＣｌ３−６Ｈ２Ｏ ０．０００５％（ｗ／
ｖ）、ＣｕＳＯ４−５Ｈ２Ｏ ０．０００２％（ｗ／
ｖ）、寒天３．０（ｗ／ｖ）を１ｌの蒸留水中に含む固
体培地ｐＨ４．８を利用する。前記したＰＣ２００と称
するＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍは受託番号ＡＴＣＣ
７４１８６号（寄託日付：１９２２年９月２３日）とし
てＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１２３０１ Ｐａｒｋ
ｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙ
ｌａｎｄ ２０８５２に寄託されている。アジポイル−
７−ＡＣＡを産生できる、本発明の第２の新規なＰｅｎ
ｉｃｉｌｌｉｕｍ Ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ形質転換体
は、エキスパンダーゼ／ヒドロキラーゼとアセチル基転
移酵素の両酵素をコード化するＤＮＡを含む単一ベクタ
ー（ｐＴＳ−８）を用いて形質転換されたために、エキ
スパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ及びアセチル基転移酵
素活性を両方共発現する。従って、このベクターは、
Ｃ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍアセチル基転移酵素単独か、
又は突然変異体エキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼポ
リペプチドをコード化するＤＮＡ配列と一緒のいずれか
をコード化するＤＮＡを含む、ＥＰ−Ａ−Ｏ ４３７
３７８号に記載されたＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ形質転換
ベクターとは異なる。ｐＴＳ−８構築では、エキスパン
ダーゼ／ヒドロキシラーゼ及びアセチル基転移酵素遺伝
子の発現は、それぞれＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ Ｉ
ＰＮＳプロモーターの別々の複写により推進される。Ｉ
ＰＮＳプロモーターの第３の複写は選択マーカーとして
使用されるフレオマイシン耐性遺伝子の転写を推進する
ために使用される。本発明の代りの実施態様では、エキ
スパンダーゼ／ヒドロキシラーゼとアセチル基転移酵素
は別々のベクターに組み入れられ連鎖様式で宿生Ｐｅｎ
ｉｃｉｌｌｉｕｍ株に導入される。エキスパンダーゼ／
ヒドロキシラーゼ及びアセチル基転移酵素活性をコード
化するＤＮＡフラグメントがＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ株
に導入される順序は実際的観点からでしか重要でない。
好ましくは、エキスパンダーゼ／ヒドロキラーゼ遺伝子
を用いるＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍの形質転換はアセチル
基転移酵素の挿入に先行しなければならない。なぜなら
ばこれは酵素が生体内で活動する順序であるからであ
る。従って、エキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼの発
現はアジポイル−７−ＡＤＡＣ産生を検定することによ
り監視することができる。アジポイル−７−ＡＤＡＣは
アセチル基転移酵素の基質であるから、逐次導入される
アセチル基転移酵素コード化遺伝子の発現はアジポイル
−７−ＡＣＡの産生により示される。アセチル基転移酵
素に対する適当なインビトロ検定を使用して、先ずアセ
チル基転移酵素を用いてＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍを形質
転換し、インビトロ検定を使用してその発現を確かめ、
次いでエキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ遺伝子の導
入に移ることが可能である。従っていずれの経路も７−
ＡＣＡを製造するための本発明方法の適当な実施態様で
ある得る。しかしながら、好ましい実施態様には、Ｃ．
ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍのエキスパンダーゼ／ヒドロキシ
ラーゼ及びアセチル基転移酵素活性をコード化するＤＮ
Ａを含む単独のプラスミドベクターの構築を介して同時
に導入される３つの酵素活性を全部有する。このような
単一プラスミドベクターであるベクターｐＴＳ−８を用
いて形質転換され、かつエキスパンダーゼ／ヒドロキシ
ラーゼ及びアセチル基転移酵素活性を発現できるＰｅｎ
ｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｏｇｅｎｕｍ株はＰＣ３０
０と同定されている。その類学的特徴はＰＣ２００につ
いて前記に詳しく記載したものと同じである。ＰＣ３０
０について受け入れ得る培養条件はＰＣ２００について
前記に詳しく記載したものと同じである。ＰＣ３００と
称されるＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ株は受託番号ＡＴ
ＣＣ ７４１８７号（寄託日付：１９９２年９月２３
日）として、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１２３０１
Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌ
ｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２に寄託されている。
本発明の好ましい実施態様であるＳ．ｃｌａｖｎｌｉｇ
ｅｒｕｓエキスパンダーゼ遺伝子の活性を発現するベク
ターｐＰｅｎ ＦＴＳＯを用いて形質転換された特異Ｐ
ｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍは、Ｃ
ａｎｔｗｅｌｌら（１９９０）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃ，１７，２１３〜２２１のような先行技術の構
築に関しては新規である。両方の構築では共に、インビ
トロ突然変異生成を使用してプロモーターをエキスパン
ダーゼ遺伝子に接続する。Ｃａｎｔｗｅｌｌ構築では、
ＸｂａＩ／ＮｄｅＩリンカーによりＩＰＮＳプロモータ
ーの３′末端のＸｂａＩ部位に連結されるエキスパンダ
ーゼ遺伝子のＡＴＧのＮｄｅＩ部位を操作により導入す
る。本発明の構築では、ＮｃｏＩ部位をエキスパンダー
ゼ遺伝子のＡＴＧに作り出して、ＩＰＮＳリンカーの
３′末端のＮｃｏＩ部位に連結する。これによりこれら
の構築の中のプロモーター遺伝子連結部の周辺に次の配
列を作り出す。 ＸｂａＩ ＮｃｏＩ ＩＰＮＳプロモーター ５′ ＴＣＴＡＧＡＣＡＣＣＡＴＧＧ ３′ 配列番号１Ｓｔｒｅｐ エキスパンダーゼ ５′ ＧＴＧＡＧＡＧＴＴＧＡＴＧＧＡＣ ３ ′ 配列番号２ Ｃａｎｔｗｅｌｌ ５′ ＴＣＴＡＧＡＣＡＣＴＡＴＧＧＡＣ ３ ′ 配列番号３ 本発明 ５′ ＴＣＴＡＧＡＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣ ３ ′配列番号４ Ｃａｎｔｗｅｌｌ構築ではＣをＴで置き換えるが、本発
明の構築物ではＣは保留される。このようにＡＴＧスタ
ートコドンに直接隣接するＩＰＮＳプロモーターの配列
は、天然産１ＰＮＳ遺伝子について見出される配列と正
確に合致する。先行技術のプロモーターは単一ヌクレオ
チド塩基１つしか違わないけれども、翻訳効率の効率低
下をもたらし、従ってエキスパンダーゼ遺伝子発現を低
水準にすることがあり得る。他の相違は構築に包含され
るプロモーター又は遺伝子の領域にある。Ｃａｎｔｗｅ
ｌｌ構築はＩＰＮＳプロモーターの５′ＢａｍＨＩ〜Ｘ
ｂａＩ３′領域を含有するが、本発明のベクターはプロ
モーターの５′ＮｃｏＩ〜ＮｃｏＩ３′領域を含有する
［Ｄｉｅｚら、（１９９０），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６５，１６３５８〜１６３６５］。これによりＣ
ａｎｔｗｅｌｌ構築のＩＰＮＳプロモーターの５′末端
に約２５０ｂｐＳの追加をもたらす。しかしながら、こ
の領域はＩＰＮＳ遺伝子の上流のＡＣＶ合成酵素遺伝子
の開いた読み取枠（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａ
ｍｅ）にある。Ｃａｎｔｗｅｌｌ構築は遺伝子のＡＴＧ
からＢａｍＨＩまでの部位３′のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ遺伝子をも含有するが、本発明のベクターは遺伝子
のＡＴＧ／ＳＡｌＩ部位３′を含有する［Ｋｏｖａｃｅ
ｖｉｃ ら（１９８９），Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，
１７１，７５４〜７６０］。このためＣａｎｔｗｅｌｌ
構築上の追加３′末端配列の大体１０００ｂｐｓに生じ
る。本発明の構築にはＡＴＧのＢａｍＨＩ部位５′まで
エキスパンダーゼ遺伝子の上流領域をやはり含有する。
しかしながら、ＩＰＮＳプロモーターによりエキスパン
ダーゼ遺伝子の読み取枠から分離される。先行技術に記
載されているものとに関する本発明のｐＰｅｎ ＦＴＳ
Ｏ構築物のもう１つの相違は、使用される選択マーカー
に関する。ＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍＩＰＮＳプロモータ
ー：フレオマイシン遺伝子融合を本発明の構築物に使用
することにより、多数複写の組込み又は高水準の発現を
許容する遺伝子座における組込みを選ぶ傾向となり、こ
のようにしてエキスパンダーゼを高水準で発現する形質
転換体の百分率を潜在的に更に高くし得る。アジポイル側鎖の開裂 本発明の新規バイオプロセスの最後のステップはアジポ
イル−７−ＡＤＡＣ又はアジポイル−７−ＡＣＡからア
ジポイル側鎖を開裂することであって、それはアジポイ
ルアミダーゼ酵素を用いて先行ステップの産生物を処理
することを要する。前記に既に示したように、本発明の
重要な成果の１つはアジポイル−７−ＡＤＡＣ及びアジ
ポイル−７−ＡＣＡの形成をもたらすステップのすべて
を単独の発酵培養で行うことができることである。この
成果によりプロセスのステップごとに中間生成物を単離
して部分的に精製する必要がなくなって抜群の効率の向
上をもたらす。しかしながら、この最終のステップでは
アジポイルアミダーゼ酵素系は存在しない。即ち、Ｐ．
ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの遺伝子の天然又は組換え発現
のいずれによっても元来の発酵培養ではその場では形成
されていない。本発明の新規バイオプロセスをバッチ式
に行う場合には、第１ステップの産生物を単離して部分
的に精製することが必要となり、これを行うため予備的
操作は既に前記した。それにもかかわらず、本発明の方
法は、アジポイルアミダーゼをアジポイル−７−ＡＤＡ
Ｃ又はアジポイル−７−ＡＣＡと効果的に接触させ、そ
の結果その化合物の７−ＡＤＡＣ又は７−ＡＣＡへの酵
素的変換を起すことができる方法により行い得る。これ
はもっとも広い意味の用語「接触」の定義である。粗製
のアジポイル−７−ＡＤＡＣ又はアジポイル−７−ＡＣ
Ａの無細胞ブイヨンを原料流として使用し、それを粗製
アジポイルアミダーゼブイヨンを用いてバッチ方式で処
理することが可能である。この処理方法は初めに反応物
の実質的な精製を必要としないため、それにより若干の
効率が得られる。変更が可能であるのは当然である。た
とえば、反応物を相互に接触する前に所望のどんな程度
にでも精製し得る。同様に、バッチ式よりも連続式に方
法を行うことも可能である。反応物自体の接触はプロセ
ス工学の進歩に合わせて種々の方法で変更し得る。それ
で、たとえばアジポイルアシラーゼを含有するカラムの
形で固定化酵素を使用し、アジポイル−７−ＡＤＡＣ又
はアジポイル−７−ＡＣＡをカラムを通過させ得る。固
定化酵素は懸濁液としてアジポイル−７−ＡＤＡＣ又は
アジポイル−７−ＡＣＡ溶液に添加もし得る。このよう
な固定化酵素系は容易な酵素回収と多重使用の利点を提
供する。このようなプロセス工学のもう１つの例は膜反
応器に関するものである。反応物を接触させる好ましい
方法は固定化酵素カラムを用いる。開裂ステップに有用なアジポイルアミダーゼ酵素 アジポイル側鎖に対する特異性の知られている酵素が多
数存在する。ＲＡＥＶＣｏｒｐ．から市販品を入手し得
るアジポイルアミダーゼを用いて得た結果を実施例とし
て更に下記に詳細に示す。セファロスポリン型分子から
アジポイル側鎖を除去する７個の他の酵素が文献に報告
されている。これらの７個の酵素の中６個はＰｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ種に由来し、７番目はＢａｃｉｌｌｕｓ種
に由来する。若干の類似性が緑膿菌類似菌酵素のあるも
のの間存在するが、７個全部がそれらの物理的／生物学
的性質においてある程度異なる。それらの特性のいくつ
かを下記にまとめて示す。 前記アジポイルアミダーゼ酵素の全部が本発明の新規バ
イオプロセスに有用である。本発明の方法に有用な他の
アジポイルアミダーゼは、作動しなければならない実際
の基質であるアジポイル−７−ＡＣＡ及びアジポイル−
７−ＡＤＡＣに対して候補酵素を試験することにより容
易に発見し得る。肯定的な結果は候補酵素が本発明方法
に本当に有用であることを決定する信頼性と再現性のあ
る方法をもたらす。基質は、Ｓｚｅｗｃｚｕｋ及びＷｅ
ｌｌｍａｎ−ＢｅｄｎａｗｓｋａによりＣｌｉｎ．Ｃｈ
ｉｍ．Ａｃｔａ（１９７８）８４，１９〜２６に報告さ
れた操作の変更を使用して無水アジピン酸と７−ＡＣＡ
の反応により製造することができる。Ａｇｒｉｃ，Ｂｉ
ｏｌ，Ｃｈｅｍ．（１９８１）４５（７），１５６１〜
１５６７に記載された方法を修正させることも可能であ
り、これはグルタリル−７−ＡＣＡお製造するための方
法である。無水アジピン酸はＪ．Ｍａｃｒｃｍｏｌ．Ｓ
ｃｉ．Ｃｈｅｍ（１９９０）Ａ２７，３９７〜４１２に
記載されたＡｌｂｅｒｔｓｏｎ及びＬｕｎｄｍａｒｋの
方法により製造し得る。７−ＡＣＡはＳｉｇｍａ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．を含めて数個所の販売元から入手
しる。迅速な比色方法を使用して候補酵素の大まかな選
別を行うことが望ましい場合は、アジポイル−ＰＡＢＡ
（ｐ−アミノ安息香酸）又はアジポイル−ｐＮＡ（ｐ−
ニトロアニリン）のような比色基質をアジポイル−７−
ＡＣＡの代りに置き換え得る。このような方法はＳｚｅ
ｗｃｚｕｋら、Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃ
ｔａ，８４（１９７８）１９〜２６のγ−グルタミンＰ
ＡＢＡに対する記載から修正させ得る。側鎖の開裂によ
り発色種が得られ、その存在と濃度が比色計を使用して
容易に決定される。これら及び他の適当な比色方法に開
する更に詳細な知見は、Ｍｅｒｅｌｌｉ，Ｌ．Ｐ．（１
９６８）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．５７：２１７２〜２
１７３；Ｓｚａｓｚ，Ｇ．（１９６９）Ｃｌｉｎ．Ｃｈ
ｏｍ．１５：１２４〜１３６；Ｓｚｅｗｃｚｕｋ，Ａ．
ら（１９８０）Ａｎａｌ．Ｂｉｃｈｅｍ．１０３：１６
６〜１６９；及びＲｅｙｅｓ，Ｆ．ら（１９８９）Ｊ．
Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４１；１３６〜１３７を参照され
たい。前記表に示したａｃｙＩＩの大きいサブユニット
を有するＲＡＥＶ酵素とＧＫ１６酵素のＮ−末端アミノ
酸配列を比較した。比較の結果を下記に示す（括弧は決
定的指定に至らないことを示す。 ＲＡＥＶ一配列番号：５ （Ｓ）Ｎ（Ｓ）（Ｇ）ＡＶＡＰＧＫＴＡＮＧＮＡＬ（Ｌ）ＬＱＮ（Ｐ） ＧＫ１６ −配列番号：６ Ｓ Ｎ Ｓ Ｗ ＡＶＡＰＧＫＴＡＮＧＮＡＬ Ｌ ＬＱＮ Ｐ ａｃｙＩＩ−配列番号：７ ｓ Ｎ Ｎ Ｗ ＡＶＡＰＧＲＴＡＴＧＲＰＩ Ｌ ＡＧＤ Ｐ 表示の配列から、これらのペプチドの３個すべてが関連
していることは明らかである。しかしながら、前記に示
したのと同様なＮ−末端配列を有する蛋白質は、Ａｒｔ
ｈｒｏｂａｃｔｅｒの菌株により産生されるペニシリン
Ｇアシラーゼについて事実であるように、アジポイルア
ミダーゼ活性を必ずしも有しない。他方で、前記Ｎ−末
端配列に重要な相同を示さない、本発明方法で有用なア
ジポイルアミダーゼが存在する。たとえば前記表に示さ
れた旭ａｃｙＩ及び藤沢Ｂ．ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｏｕ
ｓ Ｊ１シラーゼは若干のアジポイル−７−ＡＣＡアシ
ラ−ゼ活性を有することが示されているが、前記に示し
たその他の酵素と配列相同を共有しない。従って、新規
パイオプロセスの最後のステップで有用なアジポイルア
ミダーゼに関する本発明の範囲は、候補酵素がアジポイ
ル−７−ＡＣＡからアジポイル側鎖を開裂できるか又は
できないかにより決定され、前記説明のように容易で確
実に決定し得る事柄である。
【実施例】本発明の好ましい実施態様を以下に詳述する
が、これらは例示しただけであり、本発明のいかなる限
定をも意図するものではない。実施例１ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの培
養条件 本方法で使うＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇ
ｅｎｕｍ株は、ラクトース（一水和物）１．５％（ｗ／
ｖ）、コーンスティープリカー０．５％（ｖ／ｖ）、ペ
プトン０．５％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ ０．４％（ｗ／
ｖ）、ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ ０．０５％（ｗ／ｖ）、
ＫＨ２ＰＯ４ ０．０６％（ｗ／ｖ）、ＦｅＣｌ３−６
Ｈ２Ｏ ０．０００５％（ｗ／ｖ）、ＣｕＳＯ４−５Ｈ
２Ｏ ０．０００２％（ｗ／ｖ）、寒天３．０％（ｗ／
ｖ）、１ｌの蒸留水ｐＨ４．８から成るＬＣＳＢ培地を
含むプレート上で維持した。２５℃、相対湿度６５％で
１２日後、単コロニーをガラスビーズの入ったねじ付管
に移し２ｍＬの蒸留水を加えた。うず巻撹拌により培養
増殖物を懸濁した後、懸濁液をライスフラスコ（ｒｉｃ
ｅ ｆｌａｓｋ）の接種に使った。ライスフラスコは２
５０ｍＬフラスコ中に２５ｇのアンクルベン変換ライス
（ＵｎｃｌｅＢｅｎ′ｓ ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ ｒｉｃ
ｅ）を含んでいた。かかるライスは天然の長い穀物で、
３〜４容量倍の蒸留水で７分間、３０分毎に混合して洗
浄し、次いでライス中への水の取り込みが約２５％にな
るように水を排出した。２５℃、相対湿度６５％で１２
日後に、ライスからの胞子は５０ｍＬの無菌水で洗浄し
た。胞子懸濁液は、液体培地に接種するのに使い、４℃
で保存するために凍結乾燥にも使われた。胞子を等容量
の５％脱脂乳に加え、殺菌アンプル中で凍結乾燥した。
振盪フラスコ中の株の二段階発酵によりペニシリンの生
産又はＲＮＡあるいはＤＮＡ源としての菌糸体の生産を
行なった。種段階は、５００ｍＬフラスコ中の次の組成
の培地５０ｍＬに１×１０８個の胞子を加えて開始し
た。培地の組成は、グルコース３．０％（ｗ／ｖ）、フ
ァーマメディア１．０％（ｗ／ｖ）、コーンスティープ
リカー３．０％（ｖ／ｖ）、硫酸アンモニウム０．２％
（ｗ／ｖ）、ＣａＣＯ３０．５％（ｗ／ｖ）、無水リン
酸モノカリウム０．０５％（ｗ／ｖ）、ラクトース１．
０％（ｗ／ｖ）、一次ドライイースト１．０％（ｗ／
ｖ）の１ｌ蒸留水溶液であった。インキュベーション
は、２５℃、相対湿度６５％で、７０ｍｍ直径の振幅、
２２０ｒｐｍの回転シェーカーにて行った。４８時間イ
ンキュベーションした後、生産段階は５００ｍＬフラス
コ中の次の組成の培地３５ｍＬに増殖期の種を２ｍＬ移
すことにより開始した。培地の組成は、ＫＨ２ＰＯ４
０．０５％（ｗ／ｖ）、Ｋ２ＳＯ４ ０．５％（ｗ／
ｖ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １．０％（ｗ／ｖ）、ラク
トース １２．０％（ｗ／ｖ）、ファーマメディア２．
７５％（ｗ／ｖ）、ＣａＣＯ３（沈殿性）１．０％（ｗ
／ｖ）、ラード油１．０％（ｖ／ｖ）の１ｌ蒸留水溶液
（ｐＨ６．６）であった。オートクレーブにかけた後、
しかし接種に先立って、無菌のアジピン酸ナトリウム２
５％溶液（ｐＨ６．６）を、最終のアジピン酸ナトリウ
ムの濃度が２．５％になるように加えた。接種にひきつ
づき、インキュベーションを、種段階と同じ条件下で５
〜７日間継続した。菌糸体が形質転換のためあるいはＤ
ＮＡ源としてプロトプラストを発生させる必要があると
きは、株を２５０ｍＬフラスコ中の次の組成の完全培地
（ＣＭ）５０ｍＬにて生育させた。培地の組成は２０Ｘ
クラッターバックの塩（Ｃｌｕｔｔｅｒｂｕｃｋ′ｓ
ｓａｌｔｓ）５０ｍＬ（１２０ｇ Ｎａ２ＮＯ３、１
０．４ｇ ＫＣｌ、１０．４ｇ ＭｇＳＯ４−７Ｈ
２Ｏ、３０．４ｇ ＫＨ２ＰＯ４）、２．０ｍＬフォー
ゲルの微量元素（Ｖｏｇｅｌ′ｓ Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅ
ｍｅｎｔｓ）（０．３Ｍクエン酸、０．２Ｍ ＺｎＳＯ
４、２５ｍＭ Ｆｅ（ＮＨ４）２（ＳＯ４）２−６Ｈ２
Ｏ、１０ｍＭ ＣｕＳＯ４、３ｍＭ ＭｎＳＯ４ ８ｍ
Ｍホウ酸、２ｍＭ Ｎａ２ＭｏＯ４−２Ｈ２Ｏ）、５ｇ
トリプトン、５ｇイースト抽出物、１０ｇグルコースの
１ｌ蒸留水溶液であった。インキュベーションは、２５
℃、２２０ｒｐｍの回転シェーカーで行なった。実施例２ Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ
の培養条件Ｃ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ 株は次の組成の完全培地を含
む斜面培地上で維持した。培地はシュークロース２０
ｇ、寒天２０ｇ、ペプトン４ｇ、イースト抽出物４ｇ、
ＮａＮＯ３ ３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．５ｇ、Ｋ２ＨＰ
Ｏ４ ０．５ｇ、ＫＣｌ ０．５ｇ、ＭｇＳＯ４／７Ｈ
２Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ４／７Ｈ２Ｏ０．０１ｇの１
ｌ蒸留水溶液（ｐＨ６．６）であった。２８℃、相対湿
度６６％で１０日間生育させた後、６ｍｌの殺菌水を斜
面培地に加え、培養増殖物を寒天表面からはがした。得
られた懸濁液をガラスビーズの入った無菌のねじ付管に
移した。数分間、培養増殖物をうず巻き撹拌により懸濁
した後、得られた懸濁液の３．５ｍｌを液体培地に接種
した。この懸濁液は４℃での保存のため凍結乾燥にも使
われた。培養増殖物の懸濁液は、遠心分離し、ペレット
は５％脱脂乳に再び懸濁し、そしてその一部を無菌のア
ンプル中で凍結乾燥した。振盪フラスコ中の株の二段階
発酵により、セファロスポリンの生産又はＤＮＡ及びＲ
ＮＡ源としての菌糸体の生産を行なった。種段階は、１
５ｍｌの次の組成の培地を有する２５０ｍｌフラスコに
接種することにより開始した。培地の組成は、グルコー
ス５ｇ、シュークロース４０ｇ、コーンスーチ３０ｇ、
ビート糖蜜５０ｇ、大豆ミール６５ｇ、ＣａＳＯ４／２
Ｈ２Ｏ １５．８ｇ、酢酸アンモニウム８ｇ、ＣａＣＯ
３（沈殿性）５ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ７．５ｇ、Ｍ
ｇＳＯ４／７Ｈ２Ｏ ３．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１ｇ、大
豆油フラスコ当り０．１５ｍｌの１ｌ蒸留水溶液（ｐＨ
６．２）であった。インキュベーションは２５℃、相対
湿度６５％で、７０ｍｍ直径の振幅、２２０ｒｐｍの回
転シェーカーにて行なった。９６時間インキュベーショ
ンの後、生産段階を、上記培地の新しい１５ｍｌを含む
２５０ｍｌフラスコに増殖期の種２ｍｌを移すことによ
り開始した。インキュベーションは、同条件で更に９６
時間継続した。菌糸体が形質転換のためのＤＮＡ源とし
て必要な時は、株は５００ｍｌフラスコ中の次の組成の
完全培地１００ｍｌで生育させた。培地の組成はグリセ
リン２０ｇ、ペプトン４ｇ、イースト抽出物４ｇ、ＫＨ
２ＰＯ４ ０．５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．５ｇ、ＫＣｌ
０．５ｇ、ＭｇＳＯ４／７Ｈ２Ｏ １ｇ、ＮａＮＯ３
３ｇ、ＦｅＳＯ４／７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇの１ｌ蒸留水
溶液であった。インキュベーションは、３０℃で回転シ
ェーカー（２００ｒｐｍ）にて行なった。実施例３ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ 及びＣｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉ
ｕｍのゲノムＤＮＡ及び全ＲＮＡの分離 上記で調製した４８時間培養物からの増殖期菌糸体増殖
物をチーズクロスを通し濾過することにより集め、液体
窒素中で凍結し、一夜凍結乾燥した。乾燥菌糸体を、乳
鉢と乳棒により砂と共にすりつぶし、１００ｍＭ Ｌｉ
ｃｌ、５０ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭトリス ｐＨ８．
０、４％ＳＤＳ溶液２５ｍＬ中に再懸濁した。懸濁液を
６０℃水浴中で５０−５５℃に加熱後、混合物を最初に
１Ｍトリス（ｐＨ８）飽和フェノールで、次いでトリス
飽和フェノール：クロロホルム（１：１、ｖ／ｖ）で、
そしてクロロホルムで抽出した。等容量の冷６Ｍ Ｌｉ
Ｃｌを加え、次いで混合物を−２０℃に２〜３時間保
ち、ＲＮＡを水相から沈殿させた。１２０００×ｇ、４
℃で２０分間遠心分離した後、上澄を６６％（ｖ／ｖ）
エタノール溶液にし、−２０℃で１５分間冷却しＤＮＡ
を沈殿させた。上記のように遠心分離後、ＤＮＡペレッ
トを７０％エタノールで洗浄し乾燥後、ＴＥバッファー
（１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）中に再度懸濁した。ＤＮＡ濃度はアガロースゲル電
気泳動においてエチジウムブロミドで染色することによ
り、濃度既知のＤＮＡ標準液と比較して決定した。ＲＮ
Ａの抽出のため、上記実施例１及び２に記載のようにＰ
ｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ及びＣ
ｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍの
培養を醗酵培地３５ｍＬ（醗酵条件は既に記述した）、
２５℃にて２２０ｒｐｍの回転シェーカーにおいて９６
時間行なった。菌糸体は減圧下でワットマン＃１フィル
ターにより濾過して集め、約５０ｍＬの水で洗った。菌
糸体は、すぐにフィルターからはがしとり、ブレーキン
グバッファー（ｂｒｅａｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（５
０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、５％ ＳＤＳ）５
ｍＬ中に再懸濁し、液体窒素で凍結し、凍結乾燥した。
一夜の凍結乾燥後、０．１％ＤＥＰＣを含有する水５ｍ
Ｌ及び１Ｍトリス（ｐＨ８）飽和フェノール：クロロホ
ルム：イソアミルアルコール（５０：５０：１）の５ｍ
Ｌを加え、混合物を３７℃で２０分間振りながらとかし
た。混合物を、４℃で１２０００×ｇ １０分間遠心分
離し、水層を取り、最初に１Ｍトリス（ｐＨ８）飽和フ
ェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（５
０：５０：１）で、二番目に１Ｍトリス（ｐＨ８）飽和
フェノールで、三番目にクロロホルムで再抽出した。等
容量の６Ｍ ＬｉＣｌを最後の水層に加え、溶液を−２
０℃で４時間以上静置する。全ＲＮＡは４℃、１２，０
００×ｇ、２０分間でペレット化し、ペレットはＴＥバ
ッファー０．３ｍＬ＋３Ｍ酢酸ナトリウム０．０３ｍＬ
中に再溶解し、２．５倍容のエタノールを加えＲＮＡを
再沈殿させた。最後のペレットをＴＥバッファー０．１
ｍＬに溶解し、ＲＮＡ濃度を２６０ｎｍの吸光度から分
光光学的に決定した。実施例４ Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ
遺伝子ライブラリーの構築及びＣ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕ
ｍエキスパンダーゼ（Ｅｘｐａｎｄａｓｅ）／ヒドロキ
シラーゼそしてアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の分
離Ｃ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ エキスパンダーゼ／ヒドロキ
シラーゼ遺伝子の分離Ｃ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ゲノムＤＮＡをＳａｕ３ＡＩ
で部分消化し、１０−２０ｋｂの平均フラグメントサイ
ズにして、このサイズ範囲のものを消化物の５−２０％
ＮａＣｌ密度勾配遠心分離により濃縮した。λ２００１
ベクターのＢａｍＨＩ部位とライゲーションすること、
ギガパック（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使いファージ粒
子中にパッケージングすること及びＥ．ｃｏｌｉを感染
することによりＣ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍゲノムＤＮＡ
ライブラリーを作るためにサイズ分取ＤＮＡを使った。
得られたプラークは、ニトロセルロースに移し、エキス
パンダーゼ／ヒドロキシラーゼ遺伝子の公知の配列（Ｓ
ａｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７）の３′末端に対
して相補的なオリゴヌクレオシドプローブに対するハイ
ブリッド形成によりスクリーニングした。プローブは、
Ｔ４ポリヌクレオシドキナーゼを使い、［τ−３２Ｐ］
ＡＴＰで末端ラベルした。陽性のクローンを分離し、制
限エンドヌクレアーゼ部位をマップし、遺伝子の配向
を、遺伝子の５′末端に相補的な配列をもつ上記オリゴ
ヌクレオシド及び他のヌクレオシドに対するサザンブロ
ットハイブリッド形成法により確定した。Ｃ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍアセチルトランスフェラーゼ
遺伝子の分離 下記実施例１１および１２で記載のベクター構築のため
にアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を分離するのに使
った方法ではないが、次の方法は最近公知になったＤＮ
Ａ配列を使用し、通常の熟練者であれば使用しえた。上
記で構築されたＣ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍゲノムライブ
ラリーから、アセチルトランスフェラーゼ配列に相補的
な合成オリゴヌクレオシドプローブに対してハイブリッ
ド形成をするアセチルトランスフェラーゼ遺伝子をコー
ド化するクローンを選ぶ。このことはＭａｔｓｕｄａ
ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１８２巻、９９５−１０
０１頁（１９９２）に記載されている。実施例５ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ
の培養条件 これらの方法で使ったＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌ
ａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ株はＡＴＣＣ ２７０６４であっ
た。この株は、イースト抽出物４ｇ、モルト抽出物１０
ｇ、グルコース４ｇ、寒天２０ｇ、１ｌの蒸留水より成
るｐＨ７．２の平板培地上で維持した。３０℃で５日間
増殖させた後、平板培地に２ｍＬの無菌水を加え、そし
て培養増殖物を寒天表面からはがしとった。得られた懸
濁液をガラスビーズを入れた無菌のねじ付管に移した。
うず巻き撹拌により培養増殖物を懸濁後、懸濁液は液体
培地に接種するのに使用した。懸濁液は、グリセリンを
最終容量の１５％になるように加え−７０℃での長期の
保存にも使用した。菌糸体が、形質転換のためあるいは
ＤＮＡ源のためクロロプラストを発生する必要がある場
合には、その株は１ｌフラスコ中の次の組成から成るＹ
ＥＭＥ培地２００ｍＬにて生育させた。培地の組成は、
イースト抽出物３ｇ、ペプトン５ｇ、モルト抽出物３
ｇ、グルコース１０ｇ、シュークロース３４０ｇ、Ｍｇ
Ｃｌ２−６Ｈ２Ｏ １．０２ｇ、グリシン５ｇ、寒天１
８ｇ、１ｌの蒸留水であった。インキュベーションは２
８℃、２２０ｒｐｍの回転シェーカーでおこなった。実施例６ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ゲノムＤＮＡの分離 上記のように調製した４８時間培養の増殖増殖物を２２
１００×ｇ、１０分間の遠心分離により集めた。その細
胞はＴＥバッファー１０ｍＬ中に再懸濁し、リゾチーム
１０ｍｇを加え、その混合物を３０℃で１５分間インキ
ュベートした。そして２０％ｓＤｓ １ｍＬを加え、す
ぐにＴＥ（ｐＨ８）飽和フェノール１０ｍＬ及び５Ｍ
ＮａＣｌ １．５ｍＬを加えた後、混合物を２０分間ゆ
るやかに転倒撹拌した。１２０００×ｇで１０分間の遠
心分離により相分離し、その後水層を取り新しい管に移
した。等容量のクロロホルムを加え、混合物を１０分間
ゆるやかに転倒撹拌した。再び１２０００×ｇで１０分
間の遠心分離により相分離し、水層を取り、新しい管に
再度移した。２倍容のイソプロパノールを注意深く加
え、沈殿したＤＮＡを巻き取り、最少量のＴＥバッファ
ーに再溶解した。ＲＮＡｓｅＡを最終濃度２０μｇ／ｍ
Ｌになるように加え、溶液を５０℃で１時間インキュベ
ートした。次いで、１００ｍＭ ＮａＣｌ及び０．４％
ＳＤＳと共にプロテアーゼＫを最終濃度１００μｇ／ｍ
Ｌになるように加え、そして混合物を３７℃で１時間イ
ンキュベートした。溶液を、再び等容量のＴＥ（ｐＨ
８）飽和フェノールで抽出し、次いでクロロホルムで抽
出した。２倍容のイソプロパノールを加えた後、最終抽
出物からのＤＮＡを巻き取り、濃度を２６０ｎｍの吸光
度を使い分光光学的に決定した。実施例７ 遺伝子ライブラリーの構築とＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓエキスパンダーゼ及びヒド
ロキシラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡフラグメントの分
離Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓエキスパンダーゼ遺伝子
の分離 前述の方法により得られたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓゲノムＤＮＡを、制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ及びｓａｌＩにより消化した。消化ＤＮＡを
０．８％アガロースゲル上で電気泳動し、１．８−２．
２ｋｂサイズのフラグメントを溶出し、以前にＢａｍＨ
Ｉ及びｓａｌＩで消化されたＰＵＣ１８ＤＮＡとライゲ
ーションを行なった。ライゲーション混合物の希釈液
は、エレクトロポーレーション（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅ
ｒ， Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， ＣＡ）
により、コンピテントなＪＭ１０９細胞を形質転換する
のに使った。コンピテントな細胞の調製及びエレクトロ
ポーレーションの条件は、製造業者の忠告に従った。形
質転換混合物はアンピシリン１００μｇ／ｍＬ及び２％
Ｘ−Ｇａｌ ７５μｌを含有するＬＢ培地で平面培養し
た。３７℃で一夜インキュベーションした後、組換えコ
ロニーを、プラスミドベクタ−β−ガラクトシダーゼ遺
伝子活性が不活性化されて外観が無色となることにより
同定した。無色コロニーをアンピシリン１００μｇ／ｍ
Ｌを含有する新しいＬＢ平板培地に植えた。３７℃で一
夜増殖させた後、コロニーをニトロセルロースに移し、
塩基５２−９１８が公知のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓエキスパンダーゼ遺伝子配列
［Ｋｏｖａｃｅｖｉｃｅｔ ａｌ，（１９８９）Ｊ．Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１；７５４−７６０；及びＩｎ
ｇｏｌｉａ ｅｔ ａｌ．Ｕ．Ｓ．５，０，７０，０２
０］に対応した、ポリメラーゼ連鎖反応により生産され
るプローブでハイブリッド形成を行なった。ポリメラー
ゼ連鎖反応生産物のラベリングは、（３２Ｐ）ｄＣＴＰ
及びオリゴラベリングキットを使い、製造業者の指示書
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅ
ｗ Ｊｅｒｓｅｙ）に基づきランダムプライマー伸長反
応（ｒａｎｄｏｍ−ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎ）により行なった。ハイブリッド形
成反応は、１０６ＣＰＭの放射線ラベル化したプロー
ブ、３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ７）、
０．１％ＳＤＳ、５×デンハート溶液（５ｇフィコー
ル、５ｇポリビニルピロリドン、５ｇＢｓＡで、これは
５０×回分の５００ｍＬのため）、そして１００μｇ／
ｍＬのウシ胸腺ＤＮＡの存在下で３７℃一夜行なった。
いくつかの形質転換物はプローブと強くハイブリッドを
形成した。１つのコロニーが、制限酵素分析により、エ
キスパンダーゼ遺伝子をはこぶベクターを含有している
ことを確認し、このプラスミドをｐＦＴＳＯ−１とし
た。Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓヒドロキシラーゼ遺伝子
の分離 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ
ゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、層状遺伝子（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ）からのラムダＤａｓｈＩＩベクター
とライゲーションをした。得られたゲノムライブラリー
を、ヒドロキシラーゼ遺伝子のために、公知の配列の最
初の３０塩基と同じ配列をもつ３０塩基のオリゴヌクレ
オシドとのハイブリッド形成によりスクリーニングした
（Ｋｏｖａｃｅｖｉｃ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，１９９
１， Ｊ． Ｂａｃｔ．，１７３：３９８）。２つの陽
性のファージクローンからのＢａｍＨＩ消化ＤＮＡとの
サザン法によるハイブリッド形成は予想通り６ｋｂフラ
グメントを示し、それをサブクローン化した。このサブ
クローンは、ヒドロキシラーゼ遺伝子周辺領域に対する
公知の制限酵素地図と一致するＫｐｎＩによる消化後に
フラグメント−式を与えた。実施例８ プラスミドＤＮＡの分離 問題のプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉ培養菌を、１
５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含むＬＢブイヨン５
００ｍＬ（２０ｇ／ＩのＬＢブイヨンベース（Ｇｉｂｃ
ｏ，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ））中で、２２
０ｒｐｍの回転シェーカーにて、３７℃で１２〜１６時
間増殖させた。細胞を、４℃で４０００×ｇ、１０分間
の遠心分離によりペレット化した。細胞ペレットを１８
ｍＬグルコースバッファー（５０ｍＭグルコース、２５
ｍＭトリスｐＨ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸
濁し、そして２ｍＬのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ，ｓｔ．
Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）グルコースバッファー溶液（４０ｍ
ｇ／ｍＬ）を加え、混合し、そして混合物を室温で１５
分間インキュベートした。新しく調製した０．２％Ｎａ
ＯＨ、１％ＳＤＳの溶液４０ｍＬを加え、混合物をかる
くうず巻き撹拌し、氷上に１０分間置いた。次いで３０
ｍＬの５Ｍ酢酸カリウムｐＨ４．８を加えよく混合し、
得られた混合物は更に氷上に１０分間置いた。細胞の破
片を４℃、４０００×ｇ １０分間の遠心分離によりペ
レット化し、得られた上澄をチーズクロスフィルターを
通して濾過した。透明な上澄にイソプロパノール（０．
６倍容）を加え、プラスミドＤＮＡを沈殿させ、室温で
２０分間インキュベーションし、その沈殿を形成させ
た。プラスミドＤＮＡは、４℃で４０００×ｇ ２０分
間の遠心分離によりペレット化し、次いで７０％エタノ
ールで洗浄し、手短に乾燥した。ペレットは９ｍＬＴＥ
バッファーに再懸濁し、ＣｓＣｌ １０ｇ及び１０ｍｇ
／Ｌエチジウムプロミド溶液０．３８７ｍＬを加えた。
この溶液を３１３，１００×ｇで２４時間遠心分離し
た。得られた塩化セシウムグラジエント中のプラスミド
帯を紫外線ランプにより可視化し、分離し、次いで水飽
和ブタノールで抽出しエチジウムブロミドを除去した。
次にプラスミドプレパレーション中のＣｓＣｌを、ＴＥ
バッファーに対する透析により除去し、最後にＤＮＡを
ＰＥＧ（ＭＷ ８０００）を使い濃縮した。ＤＮＡ濃度
は、２６０ｎｍの吸光度により分光光学的に決定した。実施例９ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ 形質転換ベクターｐＰｅｎＦＴ
ＳＯの構築フレオマイシン耐性遺伝子の取り込み Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ 形質転換ベクターを、優性選択
マーカーとしてのフレオマイシン耐性遺伝子により構成
した。これを、最初にフレオマイシン耐性遺伝子（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａ
ｎｕｓからのフレオマイシン結合タンパク質）を含有
し、またイーストのチトクロームＣｌのターミネーター
と結合している６６０ｂｐフラグメントをアガロースゲ
ル上の電気泳動及びアガロースゲルから溶離によりプラ
スミドｐＵＴ７１３（ＣＡＹＬＡ，Ｔｏｕｌｏｕｓｅ
Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ）のＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ
消化物から分離することにより達成した。分離したフラ
グメントを、ベクターｐＳＥＬＥＣＴ（商標）１（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のＢａｍＨＩ部
位とライゲーションし、遺伝子の配向を制限酵素分析に
より決定した。得られたプラスミドの特異なＨｉｎｄ
ＩＩＩ部位を、ＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素切断し、クレ
ノウポリメラーゼで充填し、再ライゲーションすること
により除去した。次いで、適切なサイズの挿入体が含ま
れているときベクターがコスミド形成に使用できるよう
にするラムダｃｏｓ部位を含む５５０ｂｐ ＰｓｔＩフ
ラグメントを挿入した。このベクターをｐＳＣＰ４とす
る。Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍゲノムＤＮＡを、Ｓａ
ｕ３Ａで部分的に消化し、ファージベクターラムダＥＭ
ＢＬ３におけるライブラリーの調製に使用した。イソペ
ニシリンＮシンセターゼ（ＩＰＮＳ）遺伝子を含むクロ
ーンをこのライブラリーから分離し、一連のサブクロー
ンの調製に使用した。その１つは、ＩＰＮＳ遺伝子の最
初のＢａｍＨＩ部位上流から、遺伝子の最初のＨｉｎｄ
ＩＩＩ部位下流までの３．６ｋｂフラグメントを含んで
いた。このサブクローンの唯一のｓａｌＩ部位は、ｓａ
ｌＩによる制限酵素切断し、クレノウポリメラーゼで奥
まった末端を満たし、ライゲーションして除いた。次
に、唯一のＸｂａＩ部位を、同じように、ＸｂａＩで制
限酵素切断し、充填し、ライゲションして除いた。得ら
れたプラスミドはｐＳＸＦ−１とする。工学的に作り出
したＩＰＮＳプロモーターは、上記のように、１．２ｋ
ｂ ＮｃｏＩフラグメントとしてｐＳＸＦ−１から分離
し、ｐＳＣＰ４のＮｃｏＩ部位とライゲーションしたゲ
ルであった。制限酵素消化により決定した配向を選択
し、それによりプロモーターをフレオマイシン耐性遺伝
子のＡＴＧ開始コドンのに対して融合した。このプラス
ミドをｐＵＴＺ−２とする。Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓエキスパンダーゼ遺伝子
の取り込み ＳｔｒｅＰｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ
エキスパンダーゼ遺伝子を含む１．６４５ｋｂフラグメ
ントを、ｐＦＴＳＯ−１（前述したベクター）のＢａｍ
ＨＩ及びＳａｌＩ消化物から、０．８％アガロースゲル
上の電気泳動及びアガロースゲルからの溶離により精製
した。分離したフラグメントを、同じくＢａｍＨＩ及び
ｓａｌＩで消化したベクターｐＳＥＬＥＣＴ（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）とライゲーションし
た。このベクターはｐＦＴＳＯ−８とした。新しいＮｃ
ｏＩ部位を、エキスパンダーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コド
ンに、Ａｌｔｅｒｅｄ Ｓｉｔｅｓ（登録商標）ｉｎ
ｖｉｔｒｏ突然変異導入システム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃ
ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使うｐＦＴＳＯ−８の部位特
異的突然変異導入法により創り出した。突然変異導入は
製造業者の指示書に基づいて行なった。Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓエキスパンダーゼ遺伝子の公知の配列（Ｋｏ
ｖａｃｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，（１９９０），Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７１，
ｐ．３９５２−３９５８）からＡＴＧスタートコドンに
おけるＤＮＡ領域のコード化配列と相補体を作るように
オリゴヌクオレシドを構成した。オリゴヌクレオシドを
シアノエチルホフフォラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａ
ｍｉｄｉｔｅ）化学（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｇｅｎｅ
Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏ
ｎ）により合成し、オリゴ配列は以下の通りであった。 配列番号：８ ３′ ＣＧＡＧＡＧＧＡＴＣＡＧＴＧＡＧＡＧＴＣＣＡ
ＴＧＧＡＣＡＣＧＡＣＧＧ ５′ 突然変異を制限酵素分析により確定した。次に、工学的
に作り出したＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ＩＰＮＳプ
ロモーター領域を含むｐＵＴＺ−２からの１．２ｋｂ
ＮｃｏＩフラグメントを、ＮｃｏＩによる制限酵素切
断、次いでアガロースゲルの電気泳動により分離した。
ＩＰＮＳ−プロモーター領域を、エキスパンダーゼ遺伝
子のＡＴＧスタートコドンに突然変異により作られた新
しいＮｃｏＩ部位でｐＦＴＳＯ−８ベクターとライゲー
ションした。エキスパンダーゼ遺伝子に対するプロモー
ターの配向は、制限酵素分析により決定した。このＩＰ
ＮＳ−プロモーター：エキスパンダーゼ遺伝子カセット
を、前述のように、ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩフラグメント
として、ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ切断Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉ
ｕｍ形質転換ベクター中に移した。最終構成物はｐＰｅ
ｎＦＴＳＯとした。実施例１０ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ 形質転換ベクターｐＰＥＮ／Ｃ
ＥＰＨ−１の構築ＩＰＮＳプロモータ領域の挿入 ＩＰＮＳ領域を、実施例９で上記したｐＵＴＺ−２から
Ｘｈｏ Ｉ／ＳｍａＩを用いる消化により単離した。ｐ
ＵＴＺ−２ベクターをＢａｍ ＨＩを用いて切断し、付
着末端をｄＮＴＰ’ｓおよびＫｌｅｎｏｗ断片を用いて
充填し、平滑末端を作成し、次いでＸｈｏ Ｉで消化し
た。単離したＸｈｏ Ｉ／Ｓｍａ ＩＩＰＮＳプロモー
タ断片をこの切断したベクターに連結して２つのＩＰＮ
Ｓプロモータ領域を含む構築物を得た。このベクターを
ｐＵＴＺ−７と称した。Ｃ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ Ｅｘｐａｎｄａｓｅ／Ｈｙ
ｄｒｏｘｙｌａｓｅ 遺伝子の挿入 次に、ＩＰＮＳプロモータ領域の一つをｐＵＴＺ−７か
ら（電気泳動およびアガロースゲルからの溶離により）
Ｘｈｏ Ｉ／Ｘｂａ Ｉ断片として単離し、Ｘｈｏ Ｉ
／Ｘｂａ Ｉ切断ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｉ
Ｉ ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、
ＣＡ）に連結した。このベクターをＰＩＰＮＳｐ／ｂｌ
ｕｅと称した。Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍエキスパ
ンダーゼ／ヒドロキシラーゼ遺伝子を、上で同定した一
つのゲノムクローンから（電気泳動およびアガロースゲ
ルからの溶離により）１．６ｋｂ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／
Ｘｂａ Ｉ断片として単離し、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／Ｘｂ
ａ Ｉ消化ベクターｐＳＥＬＥＣＴに連結した。新規な
Ｂｓｐ ＨＩサイトを、Ａｌｔｅｒｅｄ Ｓｉｔｅｓ
（商標）インビトロ突然変異誘発システム（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、部位特異的
突然変異誘発によりエキスパンダーゼ／ヒドロキシラー
ゼ遺伝子のＡＴＧ出発コドンに作成した。突然変異誘発
は製造業者の指示にしたがって実施した。オリゴヌクレ
オチドを、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍ
ｏｎｉｕｍエキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ遺伝子
の公表された配列からＡＴＧ出発コドンにおけるＤＮＡ
領域のコーディング配列に相補すべく構築した（Ｓａｍ
ｓｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．
５、Ｎｏｖｅｍｂｅｒ、１９８７）。オリゴヌクレオチ
ドをシアノエチルホスホルアミデート化学により合成し
た（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｇｅｎｅ Ａｓｓｅｍｂｌｅ
ｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）。オリゴ配列は
次の通りであった： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９ ３’ ＧＴＴＴＴＧＧＴＧＴＣＧＴＡＧＴＡＧＴＡＣＴ
ＡＡＧＧＴＴＣＣＡＧ ５’． 突然変異誘発を制限酵素分析により確認した。次いで、
Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ
エキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ遺伝子を、（電気
泳動およびアガロースゲルからの溶離により）Ｂｓｐ
ＨＩ／Ｘｂａ Ｉ断片として単離し、先の実施例に記載
したＮｃｏ Ｉ／Ｘｂａ Ｉ消化ベクターｐＩＰＮＳｐ
／ｂｌｕｅに連結した。このベクターは、Ｃｅｐｈａｌ
ｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍエキスパンダ
ーゼ／ヒドロキシラーゼ遺伝子のＡＴＧにＰｅｎｉｃｉ
ｌｌｉｕｍ ＩＰＮＳプロモータを含んでいた。このベ
クターをｐＩＰＮＳｐ／ｂｌｕｅと称した。このＩＰＮ
Ｓプロモータ：エキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼカ
セットをＸｈｏ Ｉで部分的に消化し、Ｘｂａ Ｉで完
全に消化し、（電気泳動およびアガロースゲルからの溶
離により）断片を単離し、先の実施例に記載したＸｈｏ
Ｉ／Ｘｂａ Ｉ消化ベクターに連結して、最終形質転
換ベクターｐＰＥＮ／ＣＥＰＨ−１を得た。実施例１１ Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ のエキスパンダーゼ／ヒ
ドロキシラーゼ遺伝子を発現させるためのＰｅｎｉｃｉ
ｌｌｉｕｍ形質転換ベクターの構築Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ βーチュープリン遺伝子
を、ラムダゲノムライブラリーからＡｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓ ｎｉｇｅｒ β−チューブリン遺伝子を用いてハ
イブリッド形成プローブとしてクローン化した。Ｐｅｎ
ｉｃｉｌｌｉｕｍ β−チューブリンプロモータを含有
する２．０ｋｂのＸｂａ ｌ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、
ｐＳＥＬＥＣＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＸｂａ Ｉ／Ｈｉ
ｎｄＩＩＩサイトに連結させた。ＮｃｏＩサイトを、配
列ＡＡＡＡＴＧＣＧＴからＡＣＣＡＴＧＧＧＴへの部位
特異的突然変異誘発によりＡＴＧ開始コドンに導入し
た。得られたベクターから、１．４ｋｂのＢａｍＨＩ／
ＮｃｏＩ断片をゲル単離し、（前記した）ｐＵＴＺ−２
のＢａｍＨＩサイトとＮｃｏＩサイトとの間に結合し、
ベクターｐＣＩ−６を形成した。Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅ
ｎｕｍゲノムクローンから、ＩＰＮＳおよびアシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子を含む５．１ｋｂのｓａｌＩ断片
をゲル単離し、ｐＵＴＺ−２のｓａｌＩサイトに連結さ
せてｐＵＴＺ−５を作成した。ＩＰＮＳ遺伝子の３’タ
ーミネータ配列を、ｐＵＴＺ−５からＢａｍＨＩおよび
ＨｉｎｄＩＩＩを用いて制限後１．３ｋｂ断片をゲル単
離することにより単離し、これを（上記した）ｐＣＩ−
６のＢａｍＨＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイトとの間に
連結し、ｐＣＩ−１３を形成した。ｐＣＩ−１３におけ
るＢａｍＨＩサイト近くの非反復ＳａｌＩサイトを制
限、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼを用いる充填および再連
結により除去した。あたらしいＳａｌＩサイトを、配列
ＧＧＡＡＧＡＣＧからＧＧＴＣＧＡＣＧへの部位特異的
突然変異誘発によりＢａｍＨＩサイトの反対側に導入し
た。次に、アンピシリン耐性遺伝子を、プラスミドから
ｐｖｕＩによる制限、大きな断片のゲル単離および再連
結により除去して、ｐＣＩ−１５を得た。最後に、ＩＰ
ＳＮＳプロモータ：エキスパンダーゼ遺伝子カセットを
ｐＰＥＮＦＴＳＯから２．４ｋｂのＢａｍＨＩ／Ｓａｌ
Ｉ断片としてゲル単離し、ｐＣＩ−１５に連結してｐＥ
ＸＰ−１を得た。Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓのヒド
ロキシラーゼ遺伝子およびエキスパンダーゼ遺伝子を発
現させるためのベクターの構築は次のステップを含む。
ヒドロキシラーゼ遺伝子を含む２．９ｋｂのＫｐｎＩ断
片をｐＳＥＬＥＣＴにサブクローニングして、ポリリン
カー中のＥｃｏＲＩサイトを遺伝子の５’末端に接近さ
せる。プラスミド内の非反復ＮｃｏＩサイトを配列ＴＣ
ＣＡＴＧＧＧＣから配列ＴＣＧＡＴＧＧＧＣへの部位特
異的突然変異誘発により除去すると同時に、あたらしい
ＮｃｏＩサイトを配列ＡＡＣＡＴＧＧＣからＡＣＣＡＴ
ＧＧＣへ変化させることにより開始コドンに導入する。
両変化ともコード化したアミノ酸配列を保存する。作成
したＩＰＮＳプロモータを含む１．０ｋｂのＥｃｏＲＩ
／ＮｃｏＩ断片をｐＵＴＺ−２からゲル単離し、改変し
たヒドロキシラーゼ遺伝子を含む上記ベクターのＥｃｏ
ＲＩサイトとＮｃｏＩサイトとの間に連結させる。次い
で、得られたベクター中の非反復ＥｃｏＲＩサイトを部
位特異的突然変異誘発によりＨｉｎｄＩＩＩに変化させ
る。５’ＩＰＮＳ：ヒドロキシラーゼ融合構築物を得ら
れたベクターからＨｉｎｄＩＩＩ断片として単離する。
これを、上記したベクターｐＥＸＰ−１の非反復Ｈｉｎ
ｄＩＩＩサイトに連結させる。最終ベクターは、それぞ
れＩＰＮｓプロモータにより動作するエキスパンダーゼ
遺伝子およびヒドロキシラーゼ遺伝子と、β−チューブ
リン遺伝子により動作するブレオマイシン耐性マーカー
を含む。実施例１２ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ 形質転換ベクターｐＰｅｎＣＡ
ＣＴの構築 ヒグロマイシン耐性遺伝子の組み込み 優性（ｄｏｍｉｎａｔｅ）選択性マーカーとしてヒグロ
マイシン耐性遺伝子によってＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ形
質転換ベクターを構築した。そのＥ．ｃｏｌｉヒグロマ
イシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子を、ベクター
ｐＨｐＨ−１（Ｂｏｃｈｒｉｎｇｅｎ Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から、１．１５
ｋｂ Ｂａｍ ＨＩフラグメントとして、（アガロース
ゲル上での電気泳動とそのゲルからの溶出によって）単
離し、次に、Ｂａｍ ＨＩ消化ベクターｍｐ１９に連結
した。ｍｐ１９内のヒグロマイシン耐性遺伝子の配置
を、ＲＦ ＤＮＡの制限酵素分析から、決定した。５′
Ｂａｍ ＨＩ位は、ヒグロマイシン耐性遺伝子のＡＴＧ
開始コドンの近くにあった。３′Ｂａｍ ＨＩ位を、Ｍ
ｕｔａｔｏｒ（登録商標）部位特異的突然変異導入用キ
ット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌｅ，Ｃ
Ａ）を用いた、部位特異的突然変異法によって除去し
た。その方法は、キットの製造者の指示に応じて実施し
た。Ｅ．ｃｏｌｉヒグロマイシンＢホスホトランスフェ
ラーゼ遺伝子（Ｇｒｉｔｚ，Ｌ．ａｎｄ Ｄａｖｉｅ
ｓ，Ｊ．，１９８３，Ｇｅｎｅ ２５，１７９）の、公
表された配列からの３′Ｂａｍ ＨＩ位のＤＮＡ領域を
補完するようにオリゴヌクレオチドを構築した。そのオ
リゴヌクレオチドをシアノエチルホスホルアミダイト化
学法（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｇｅｎｅ Ａｓｓｅｍｂｌ
ｅｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）によって合成
した。そのオリゴ配列は次のようだった。 その突然変異を、制限酵素分析によって、確認した。そ
の後、突然変異ヒグロマイシン耐性遺伝子をＳｍａ Ｉ
／Ｘｂａ Ｉフラグメントとして（アガロースゲル上で
の電気泳動とそのゲルからの溶出とによって）単離し、
Ｓｍａ Ｉ／Ｘｂａ Ｉ消化ベクターｐＵＣ１８に連結
した。Ｎｃｏ ＩカットベクターｐＵＴＺ−２（既出の
ベクター）から、１．２ｋｂ Ｎｃｏ Ｉフラグメント
として、そのＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ＩＰＮＳプロモ
ーターを（アガロースゲル上の電気泳動と、アガロース
ゲルからの溶出によって）、単離した。合成オリゴヌク
レオチドリンカーを合成して、ＩＰＮＳプロモーターフ
ラグメントの末端上のＮｃｏ Ｉ部位からＢａｍ ＨＩ
部位を創生し、そうしてヒグロマイシン耐性遺伝子のＡ
ＴＧ近くの５′Ｂａｍ ＨＩ中に、ＩＰＮＳプロモータ
ーを配置した。そのオリゴをシアノエチルホスホルアミ
ダイト化学法（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｇｅｎｅ Ａｓｓ
ｅｍｂｌｅｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）によ
って合成した。そのオリゴ配列は次のようだった。 この配列は、ＩＰＮＳプロモーターの天然配列を保持し
ているが、ヒグロマイシン耐性遺伝子中に、２つのアミ
ノ酸が挿入されていた。そのオリゴをアニーリングし、
リン酸化し、次いで、Ｎｃｏ ＩカットＩＰＮＳプロモ
ータフラグメントに連結した。それは、ＩＰＮＳプロモ
ーターフラグメントの５′、３′両末端にＢａｍ ＨＩ
部位を生じさせる。この連結プロモーターを、ｐＵＣ１
８中のＢａｍ ＨＩカットヒグロマイシン耐性遺伝子に
連結した。この配置を制限酵素分析によって確認した。
その後、このＩＰＮＳプロモーター：ヒグロマイシン耐
性遺伝子カセットを（アガロースゲル上での電気泳動と
それからの溶出とによって）、２．１ｋｂ Ｘｈｏ Ｉ
／Ｓａｌ Ｉを単離した（Ｘｈｏ Ｉ部位はＩＰＮＳプ
ロモーターの５′末端に位置し、Ｓａｌ Ｉ部位はｐＵ
Ｃポリリンカーからのものであり、Ｓａｌ Ｉ消化ベク
ターｐＳＥＬＥＣＴに連結した。このカセットの配置
は、制限酵素によって分析した。このベクターをｐＩＰ
ＮＳ／ＨＹＧと示す。ＣｅＰｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ
Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｇｅｎｅの組
み込み １．８ｋｂ Ｂａｌ ＩＩ／Ｓａｌ Ｉフラグメントと
してＣｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍアセチルトランスフ
ェラーゼ遺伝子を、アガロースゲル上の電気泳動とその
ゲルからの溶出とによってゲノムクローン（既出）から
単離した。そのアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を、
Ｂａｍ ＨＩ／Ｓａｌ Ｉ消化ベクターｐＳＥＬＥＣＴ
に連結した。Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍアセチルト
ランスフェラーゼ遺伝子のＡＴＧへのＰｅｎｉｃｉｌｌ
ｉｕｍ ＩＰＮＳプロモーターの配置を容易とするた
め、アセチルトラトンスフェラーゼ遺伝子中のＡＴＧに
新規Ｎｃｏ Ｉ部位で創生し、内部Ｎｃｏ Ｉ部位をＡ
ｌｔｅｒｅｄ Ｓｉｔｅｓ（登録商標）インビトロ突然
変異法系（Ｐｒｏｍｅｇａ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
を用いた部位特異的突然変異法によって、除去した。そ
の方法は、その系の製造者の指示によって行なった。そ
のオリゴヌクレオチドを構築し、そうしてＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１と２中に、上でセットアウトしたＣｅｐｈａ
１ｏｓｐｏｒｉｕｍアセチルトランスフェラーゼの配列
から問題のＤＮＡ領域のコード配列を補完した。構造遺
伝子中、内部Ｎｃｏ Ｉ部位を除去するため用いられた
オリゴヌクレオチド配列は次の通りであった。 ＡＴＧ開始コドンで新規なＮｃｏ Ｉ部位を創生するの
に用いたオリゴヌクレオチド配列は次の通りであった。 これらのオリゴヌクレオチドをシアノエチルホスホルア
ミダイト化学法（既出）によって合成した。突然変異は
制限酵素分析によって確認した。このベクターをｐＭＵ
ＴＡＣＴと呼称する。上の実施例で記述したベクターｐ
ＵＴＺ−２から、１．２ｋｂ Ｎｃｏ Ｉフラグメント
として（アガロースゲル上での電気泳動とそのゲルから
の溶出とによって）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ＩＰＮ
Ｓプロモーターを単離した。このプロモーターフラグメ
ントを、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍｏ
ｎｉｕｍアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＡＴＧで
ＩＰＮＳプロモーターを今直接配置したＮｃｏ Ｉカッ
トベクターｐＭＵＴＡＣＴに、連結した。そのプロモー
ターの配置は、制限酵素分析によって確認した。このＩ
ＰＮＳプロモーターＡ：アセチルトランスフェラーゼ遺
伝子カセットをＸｈｏ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ（ＸｈｏＩ部位
はＩＰＮＳプロモーターの５′末端に位置し、Ｓａｌ
Ｉ部位はアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の３′末端
に位置する）と呼称する。このフラグメントの配置は、
制限酵素分析によって定量した。このベクターをｐＭＵ
ＴＡＣＴ／ＩＰＮＳと呼称する。アセチルトランスフェ
ラーゼ遺伝子のＡＴＧで新規Ｎｃｏ Ｉ部位を創生する
のに用いた突然変異によって、第２のアミノ酸において
セリンからアラニンに変わった。天然の遺伝子と同一の
コード配列を保持するために、部位特異的突然変異を、
Ａｌｔｅｒｅｄ Ｓｉｔｅｓ（登録商標）インビトロ突
然変異系を利用して起こした。そのオリゴヌクレオチド
を構築し、そうして、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と２とし
て、上でセットアウトしたアセチルトランスフェラーゼ
遺伝子の配列からの問題のＤＮＡ領域のコード配列を補
完した。２番目のアミノ酸をアラニンからセリンに換え
るのに用いたオリゴヌクレオチド配列は、次のものであ
る。 そのオリゴヌクレオチドをシアノエチルホスホルアミダ
イト化学法（既出）を利用して合成した。その突然変異
をＵＳＢ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅバージョン２．０ＤＮＡ
配列用キットを利用したＤＮＡ配列法によって確認し
た。このベクターをｐＭＵＴＡＣＴ／ＩＰＮＳ−２と呼
称する。ＩＰＮＳプロモーター：ヒグロマイシン耐性遺
伝子カセットを、Ｘｂａ Ｉフラグメントとして、ベク
ターｐＩＰＮＳ／ＨＹＧから除去し、Ｘｂａ Ｉ消化ベ
クターｐＭＵＴＡＣＴ／ＩＰＮＳ−２に連結し、最終変
異ベクターｐＰｅｎＣＡＣＴを生成させた。ヒグロマイ
シンカセットの配置を制限酵素分析によって決定した。実施例１３ Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ
のエキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼとアセチルトラ
ンスフェラーゼの両遺伝子を発現するＰｅｎｉｃｉｌｌ
ｉｕｍ形質転換ベクターｐＴＳ−８の構築 ゲノムクローンから、１．８ｋｂ Ｂｇｌ ＩＩ／Ｓａ
ｌ Ｉフラグメントとして（アガロースゲル上での電気
泳動とそのゲルからの溶出によって）、Ｃｅｐｈａｌｏ
ｓｐｏｒｉｕｍアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を単
離し、ＢａｍＨＩ／Ｓａｌ Ｉ消化ベクターｐＳＥＬＥ
ＣＴ（プロメガコーポレーション）に連結した。Ｃｅｐ
ｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍアセチルトランスフェラーゼ遺
伝子のＡＴＧへのＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ＩＰＮＳの
配置を容易とするため、新規Ｎｃｏ Ｉ部位を、塩基−
４２（マチソン等、カレントジェネティック）に配した
ＡＴＧコドンで創生し、構造遺伝子中の内部Ｎｃｏ Ｉ
部位を、ＡｌｔｅｒｅｄＳｉｔｅｓインビトロ突然変異
系（プロメガコーポレーション）を用いた部位特異的突
然変異法によって除いた。突然変異法は、系の製造者の
指示によって行なった。そのオリゴヌクレオチドを構築
し、そうして問題のＤＮＡ領域のコード配列を補完し
た。しかし、Ｎｃｏ Ｉ部位を創生又は除去するためい
くつかの変化を組み込んだ。構造遺伝子中の内部Ｎｃｏ
Ｉ部位を除くために用いたオリゴヌクレオチド配列は
次のものである。 塩基−４２でのＡＴＧで新規Ｎｃｏ Ｉ部位を創生する
のに用いたオリゴヌクレオチド配列は次のものである。 オリゴヌクレオチドを、シアノエチルホスホルアミダイ
ト化学法（既出）によって合成した。両突然変異の発生
を制限酵素分析によって確認した。このベクターをｐＭ
ＵＴＡＣＴと呼称する。前記したｐＵＴＺ−２ベクター
から、１．２ｋｂＮｃｏ Ｉフラグメントとして（アガ
ロースゲル上での電気泳動とそのゲルからの溶出によっ
て）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ＩＰＮＳプロモーター
を単離した。このプロモーターフラグメントを、Ｃｅｐ
ｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍアセチルトランスフェラーゼ遺
伝子の−４２ＡＴＧに直接ＩＰＮＳプロモーターを今配
置したＮｃｏ ＩカットベクターｐＭＵＴＡＣＴに、連
結した。そのプロモーターの配置を制限酵素分析によっ
て確認した。このベクターをｐＭＵＴＡＣＴ／ＩＰＮＳ
と呼称する。ＩＰＮＳプロモーター：アセチルトランス
フェラーゼカセットを含むベクターｐＭＵＴＡＣＴ／Ｉ
ＰＮＳから（アガロース上での電気泳動とそのゲルから
の溶出によって）、２．５ｋｂ Ｘｈｏ Ｉ／Ｓａｌ
Ｉフラグメントによって単離し、（既述の）Ｓａｌ Ｉ
消化ベクターｐＵＴＺ−２に連結した。次に、この中間
体ベクターをＸｂａ Ｉで消化し、ＩＰＮＳプロモータ
ー：エキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼカセットを含
む（既述の）ｐＰＥＮ／ＣＥＰＨ−１ベクターからの
２．１ｋｂ Ｘｂａ Ｉフラグメントで連結した。こう
して最終変異ベクターｐＴＳ−８が生じた。実施例１４ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの形質
転換 上で記載したＰｅｎｉｃｉｌｌｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅ
ｎｕｍ株からのプロトプラストを、２２０ｒｐｍの回転
シェーカー上に１×１０７個の胞子を含むＣＭブロスの
５０ｍＬを接種して、２５℃、６７時間で、生じさせ
た。その菌糸体を、チーズクロス（寒冷紗）濾紙の上に
濾過によって集め、５００ｍＬのフラスコに移し、１０
０ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍｅ２３４（Ｎｏｖｏ ＢｉｏＬ
ａｂｓ，Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，デンマーク）を含む２５
ｍＬのＫＭＰ（０．７Ｍ Ｋｃｌ、０．８Ｍマンニトー
ル、０．０２Ｍ ＫＰＯ４、ｐＨ６．３）に再懸濁し、
１００ｒｐｍで３０℃にてインキュベートした。そのス
フェロプラストをチーズクロス／ガラスウールフィルタ
ーによって分離し、１０分間３５０×ｇで遠心分離して
ペレット状にした。その後、そのスフェロプラストをＫ
ＭＰ緩衝液の１０ｍＬで，３度洗った。次いでＫＭＰＣ
（ＣａＣｌ２ ５０ｍｍを含むＫＭＰ）中に再懸濁し、
室温に２０分間放置した。そのＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ
の形質転換のために、２００μｌのスフェロプラスト懸
濁液を、５０μｌのＰＰＣ（４０％ＰＥＧ ＭＷ ３５
００，２０ｍＭ ＫＰＯ４、ＰＨ６．３、５％ＣａＣｌ
２が使用の直前に付加された）と共に、ＤＮＡ（５ｍｇ
／ｍＬを含むＫＭＰＣの６．２μｌ中の５μｇベクター
ＤＮＡ）に付加した。その形質転換混合物を３０分間氷
上でインキュベートした。新しく調製したＰＰＣの１ｍ
Ｌを加え、その混合物を５０ｍＬの溶融（５０℃）再生
寒天（ＣＭと１．３Ｍモンニトールと３％寒天）に移し
た。その後、その形質転換混合物を５つのペトリ皿に配
分した。２５℃で２４時間の再生の後、皿を、１００μ
ｇ／５０ｍＬのフレオマイシンＯＬを含むＯＬ（１％寒
天中の１％ペプトン）に重ねた。上層の量は再生寒天の
量に等しかった。皿を７〜１４日間２５℃でインキュー
ベートし、形質転換コロニーの発生を観察した。実施例１５ 生物活性試験 寒天拡散生物試験を利用して、ＨＰＬＣで単離したアジ
ポイル−６−ＡＰＡとアジポイル−７−ＡＤＣＡ醗酵生
成物の抗生物活性を調べた。Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔ
ｉｌｕｓ ＡＴＣＣ ３３６７７またはＥ．ｃｏｌｉ超
感受性株（ＭＩＴのＡｒｎｏｌｄ Ｌ． Ｄｅｍａｉｎ
教授により入手）が植え付けられた３％寒天（Ｇｉｂｃ
ｏ、Ｐａｉｓｌｅｙ、スコットランド）を含むＬＢ寒天
皿（２０ｇ／ＬのＬＢブロス）上に、５ｍｍの円板状と
して単離生成物の２０μＬを塗布した。Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓを指示株として用い、アジポイル
−６−ＡＰＡ生成物を分析し、またＥ．ｃｏｌｉ超感受
性株を指示株として用い、アジポイル−７−ＡＤＣＡ生
成物を分析した。３７℃でのインキュベーションの１５
時間後、円板状部の周りの指示用バクテリアの増殖禁止
を示すかさ状模様によって、上記生成物は生物活性があ
ることがわかった。この実験の対照は、β−ラクトン構
造の確認用対照としてペニシリンアーゼを含まないか含
む寒天、デアセトキシセファロースポリンＣ、セファロ
ースポリンＣ、ペニシリンＶ含んでいた。実施例１６ アジポイル−６−ＡＰＡ、７−ＡＤＣＡ、７−ＡＤＡＣ
及び７−ＡＣＡの同時分析用ＨＰＬＣ法 形質転換したＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ株（アジポイル−
６−ＡＰＡ、アジポイル−７−ＡＤＣＡ、アジポイル−
ＡＤＡＣ及びアジポイル−７−ＡＣＡ）からの醗酵生成
物を、高性能液体クロマト（ＨＰＬＣ）によって同時分
析した。そのＨＰＬＣ系は次のＷａｔｅｒｓ成分からな
る。６２５溶媒分散系、４０９Ｅ可変波長検出器（２２
０ｎｍと２６０ｎｍにセット）、８２５Ｍａｘｉｍａデ
ータシステム。静止層は、Ｎｏｖａ−ＰａＫ Ｃ１８
Ｇｕａｒｄ−ＰａＫインサートを含むＮｏｖａ−ＰａＫ
Ｃ１８ ５×１００ｍｍラジアル圧縮カートリッジで
あった。可動層（１ｍｌ／分の流れ）は、初期条件（５
％メタノールと９５％１０ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ５）か
ら、４０％メタノールと６０％ＫＰＯ４、ｐＨ５への１
０分・線形勾配からなる。アジポイル−６−ＡＰＡを、
２２０ｎｍで、ペニシリンＮの標準カーブに対する比較
によって定量した。伸張生成物を、合成アジポイル−７
ＡＤＣＡとアジポイル−７−ＡＣＡの２６０ｎｍでの標
準カーブとの比較によって定量した。実施例１７ ＲＡＥＶ酵素分析 化学合成アジポイル−７−ＡＤＣＡとアジポイル−７−
ＡＣＡを基質として用い、ＲＡＥＶ酵素（ＲＡＥＶ社か
ら入手）の特異的活性を分析した。反応混合物は、全５
０μｌで、０．１６Ｍ ＫＨ２ＰＯ４中、１０ｍＭの基
質、１μｇのＲＡＥＶ酵素、５％グリセロールを含んで
おり、３７℃でインキューベートした（もっとより良い
反応条件は、リン酸カリウム緩衝液の２０〜５０ｍＭ中
２０ｍＭ以上の基質を用いることである）。５μｌのア
リコートを０、１、３、５、１０、２０、３０分で取り
出した。それをｐＨ３．５の０．０１０Ｍ ＫＨ２ＰＯ
４の３５μｌで希釈し、既に記述した条件でＨＰＬＣに
よる分析の前−７０℃で凍らせた。比色定量アジポイル
−ｐ−アミノ安息香酸基質に対するＲＡＥＶ酵素の活性
を、０．０６５Ｍ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．０）中の、
５ｍＭ基質、８．２５μｇのＲＡＥＶ酵素及び１０％グ
リセロール（全５０μｌ）を用いて、３７℃３０分間で
分析した。反応を９６ウェルのマイクロタイターデッシ
ユ中で実行した。０．２５Ｍ酢酸中、１Ｍ ＮａＮＯ２
の１／１００希釈物の５μｌを加えて、反応を終え、次
いで反応物を３分間室温に放置した。４−アミノ−５−
ヒドロキシ−２，７−ナフタレン−ジスルホン酸モノナ
トリウム塩水和物の水溶液１０ｍｇ／ｍＬの１／１００
希釈物の１００μｌを０．５Ｍ ＮａＣＯ３に加え、比
色変化をＥＬ ３１２バイオキネティックプレートリー
ダ（バイオテック インストゥルメントを用いて、５１
５ｎｍですぐにモニターした。実施例１８ 代替アジポイルアシラーゼの評価 ＲＡＥＶ酵素を用いた検討に加え、アジプロイル−７−
ＡＤＣＡ（と他のアジポイル化合物）からのアジポイル
側鎖の除去を、いろいろな微生物源から生じた酵素で示
した。初めの検討において、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−８１７及びＦＥＲＭＢＰ−８１８で、ファーメ
ンテーションリサーチインスティテュートによって寄託
された、Ａｓａｈｉ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．
株ＳＥ−８３とＳＥ−４９５；及び、受託番号ＮＲＲＬ
Ｂ−８０７０でノーザンレジオナルリサーチラボラト
リーによって寄託されたＴｏｙｏ Ｊｏｚｏ Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ株ＳＹ−７７−１を、次の培地で７２時
間増殖した。その培地は、ＨｙＣａｓｅ ＳＦ２．０％
（ｗ／ｖ、以下同）、グルタミン酸モノナトリウム０．
５％、酵母菌抽出物０．５％、コーンスティープパウダ
ー０．２％、綿実油０．５％及びグルタミン酸０．１％
を含んでいる。細胞を遠心分離で集め、５０ｍＭのリン
酸塩緩衝液ｐＨ８．０で洗浄した。その後、それらを、
緩衝液中で再懸濁し、少量のクロロホルムを加えて外膜
を透過性とした。その後、細胞懸濁液のアリコートをア
ジポイル−ｐ−ニトロアニリド（ａｄ−ｐＮＡ）と混合
し、２〜１８時間３０℃でインキューベートした。それ
に続いて、混合物を１０％（ｖ／ｖ）酢酸の添加によっ
て、酸性化した。その後ガンマーグルタミル−トランス
フェラーゼの分析用シグマケミカルカンパニー（シグマ
製品Ｎｏ，５４５−Ａ）によってキットとして提供され
た試薬を用いたジアゾ化合物への転換による比色法によ
って、遊離ｐ−ニトロアニリンを検出した。３つの株の
相対活性は、ＳＥ−４９５、ＳＥ−８３、ＳＹ−７７−
１それぞれに対して１００％、８５．５％、４８％であ
った。ＲＡＥＶ酵素に関して既述したのと同様な方法に
よって、アジポイル−７−ＡＤＣＡへのＳＥ−８３とＳ
Ｅ−４９５酵素の活性も示した。ＳＹ−７７−１による
β−ラクタマーゼの産生により、アジポイル−７−ＡＤ
ＣＡに対する脱アシル化活性の発揮を阻害した。同様な
方法によって、アジポイル−アシラーゼ生成が２つの菌
株（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｐ．ＭＡ−１３３、ＡＴ
ＣＣ Ｎｏ．２０４９２とＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓ
ｐ．ＭＡ−１３、ＡＴＣＣ Ｎｏ．２０４９１：明治製
菓の米国特許第４１４１７９０号）と、別の３つの細菌
株（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＡＴＣＣ Ｎｏ．
１４６４９、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＡＴ
ＣＣ Ｎｏ．１４６４８及びＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ、ＡＴＣＣ Ｎｏ．１４６５０）について示され
た。これらはメルク社の米国特許第３２３９３９４中
に、セファロスポリンＣアシラーゼプロドゥーサーとし
て記述されている。
が、これらは例示しただけであり、本発明のいかなる限
定をも意図するものではない。実施例１ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの培
養条件 本方法で使うＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇ
ｅｎｕｍ株は、ラクトース（一水和物）１．５％（ｗ／
ｖ）、コーンスティープリカー０．５％（ｖ／ｖ）、ペ
プトン０．５％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ ０．４％（ｗ／
ｖ）、ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ ０．０５％（ｗ／ｖ）、
ＫＨ２ＰＯ４ ０．０６％（ｗ／ｖ）、ＦｅＣｌ３−６
Ｈ２Ｏ ０．０００５％（ｗ／ｖ）、ＣｕＳＯ４−５Ｈ
２Ｏ ０．０００２％（ｗ／ｖ）、寒天３．０％（ｗ／
ｖ）、１ｌの蒸留水ｐＨ４．８から成るＬＣＳＢ培地を
含むプレート上で維持した。２５℃、相対湿度６５％で
１２日後、単コロニーをガラスビーズの入ったねじ付管
に移し２ｍＬの蒸留水を加えた。うず巻撹拌により培養
増殖物を懸濁した後、懸濁液をライスフラスコ（ｒｉｃ
ｅ ｆｌａｓｋ）の接種に使った。ライスフラスコは２
５０ｍＬフラスコ中に２５ｇのアンクルベン変換ライス
（ＵｎｃｌｅＢｅｎ′ｓ ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ ｒｉｃ
ｅ）を含んでいた。かかるライスは天然の長い穀物で、
３〜４容量倍の蒸留水で７分間、３０分毎に混合して洗
浄し、次いでライス中への水の取り込みが約２５％にな
るように水を排出した。２５℃、相対湿度６５％で１２
日後に、ライスからの胞子は５０ｍＬの無菌水で洗浄し
た。胞子懸濁液は、液体培地に接種するのに使い、４℃
で保存するために凍結乾燥にも使われた。胞子を等容量
の５％脱脂乳に加え、殺菌アンプル中で凍結乾燥した。
振盪フラスコ中の株の二段階発酵によりペニシリンの生
産又はＲＮＡあるいはＤＮＡ源としての菌糸体の生産を
行なった。種段階は、５００ｍＬフラスコ中の次の組成
の培地５０ｍＬに１×１０８個の胞子を加えて開始し
た。培地の組成は、グルコース３．０％（ｗ／ｖ）、フ
ァーマメディア１．０％（ｗ／ｖ）、コーンスティープ
リカー３．０％（ｖ／ｖ）、硫酸アンモニウム０．２％
（ｗ／ｖ）、ＣａＣＯ３０．５％（ｗ／ｖ）、無水リン
酸モノカリウム０．０５％（ｗ／ｖ）、ラクトース１．
０％（ｗ／ｖ）、一次ドライイースト１．０％（ｗ／
ｖ）の１ｌ蒸留水溶液であった。インキュベーション
は、２５℃、相対湿度６５％で、７０ｍｍ直径の振幅、
２２０ｒｐｍの回転シェーカーにて行った。４８時間イ
ンキュベーションした後、生産段階は５００ｍＬフラス
コ中の次の組成の培地３５ｍＬに増殖期の種を２ｍＬ移
すことにより開始した。培地の組成は、ＫＨ２ＰＯ４
０．０５％（ｗ／ｖ）、Ｋ２ＳＯ４ ０．５％（ｗ／
ｖ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １．０％（ｗ／ｖ）、ラク
トース １２．０％（ｗ／ｖ）、ファーマメディア２．
７５％（ｗ／ｖ）、ＣａＣＯ３（沈殿性）１．０％（ｗ
／ｖ）、ラード油１．０％（ｖ／ｖ）の１ｌ蒸留水溶液
（ｐＨ６．６）であった。オートクレーブにかけた後、
しかし接種に先立って、無菌のアジピン酸ナトリウム２
５％溶液（ｐＨ６．６）を、最終のアジピン酸ナトリウ
ムの濃度が２．５％になるように加えた。接種にひきつ
づき、インキュベーションを、種段階と同じ条件下で５
〜７日間継続した。菌糸体が形質転換のためあるいはＤ
ＮＡ源としてプロトプラストを発生させる必要があると
きは、株を２５０ｍＬフラスコ中の次の組成の完全培地
（ＣＭ）５０ｍＬにて生育させた。培地の組成は２０Ｘ
クラッターバックの塩（Ｃｌｕｔｔｅｒｂｕｃｋ′ｓ
ｓａｌｔｓ）５０ｍＬ（１２０ｇ Ｎａ２ＮＯ３、１
０．４ｇ ＫＣｌ、１０．４ｇ ＭｇＳＯ４−７Ｈ
２Ｏ、３０．４ｇ ＫＨ２ＰＯ４）、２．０ｍＬフォー
ゲルの微量元素（Ｖｏｇｅｌ′ｓ Ｔｒａｃｅ Ｅｌｅ
ｍｅｎｔｓ）（０．３Ｍクエン酸、０．２Ｍ ＺｎＳＯ
４、２５ｍＭ Ｆｅ（ＮＨ４）２（ＳＯ４）２−６Ｈ２
Ｏ、１０ｍＭ ＣｕＳＯ４、３ｍＭ ＭｎＳＯ４ ８ｍ
Ｍホウ酸、２ｍＭ Ｎａ２ＭｏＯ４−２Ｈ２Ｏ）、５ｇ
トリプトン、５ｇイースト抽出物、１０ｇグルコースの
１ｌ蒸留水溶液であった。インキュベーションは、２５
℃、２２０ｒｐｍの回転シェーカーで行なった。実施例２ Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ
の培養条件Ｃ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ 株は次の組成の完全培地を含
む斜面培地上で維持した。培地はシュークロース２０
ｇ、寒天２０ｇ、ペプトン４ｇ、イースト抽出物４ｇ、
ＮａＮＯ３ ３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．５ｇ、Ｋ２ＨＰ
Ｏ４ ０．５ｇ、ＫＣｌ ０．５ｇ、ＭｇＳＯ４／７Ｈ
２Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ４／７Ｈ２Ｏ０．０１ｇの１
ｌ蒸留水溶液（ｐＨ６．６）であった。２８℃、相対湿
度６６％で１０日間生育させた後、６ｍｌの殺菌水を斜
面培地に加え、培養増殖物を寒天表面からはがした。得
られた懸濁液をガラスビーズの入った無菌のねじ付管に
移した。数分間、培養増殖物をうず巻き撹拌により懸濁
した後、得られた懸濁液の３．５ｍｌを液体培地に接種
した。この懸濁液は４℃での保存のため凍結乾燥にも使
われた。培養増殖物の懸濁液は、遠心分離し、ペレット
は５％脱脂乳に再び懸濁し、そしてその一部を無菌のア
ンプル中で凍結乾燥した。振盪フラスコ中の株の二段階
発酵により、セファロスポリンの生産又はＤＮＡ及びＲ
ＮＡ源としての菌糸体の生産を行なった。種段階は、１
５ｍｌの次の組成の培地を有する２５０ｍｌフラスコに
接種することにより開始した。培地の組成は、グルコー
ス５ｇ、シュークロース４０ｇ、コーンスーチ３０ｇ、
ビート糖蜜５０ｇ、大豆ミール６５ｇ、ＣａＳＯ４／２
Ｈ２Ｏ １５．８ｇ、酢酸アンモニウム８ｇ、ＣａＣＯ
３（沈殿性）５ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ７．５ｇ、Ｍ
ｇＳＯ４／７Ｈ２Ｏ ３．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１ｇ、大
豆油フラスコ当り０．１５ｍｌの１ｌ蒸留水溶液（ｐＨ
６．２）であった。インキュベーションは２５℃、相対
湿度６５％で、７０ｍｍ直径の振幅、２２０ｒｐｍの回
転シェーカーにて行なった。９６時間インキュベーショ
ンの後、生産段階を、上記培地の新しい１５ｍｌを含む
２５０ｍｌフラスコに増殖期の種２ｍｌを移すことによ
り開始した。インキュベーションは、同条件で更に９６
時間継続した。菌糸体が形質転換のためのＤＮＡ源とし
て必要な時は、株は５００ｍｌフラスコ中の次の組成の
完全培地１００ｍｌで生育させた。培地の組成はグリセ
リン２０ｇ、ペプトン４ｇ、イースト抽出物４ｇ、ＫＨ
２ＰＯ４ ０．５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．５ｇ、ＫＣｌ
０．５ｇ、ＭｇＳＯ４／７Ｈ２Ｏ １ｇ、ＮａＮＯ３
３ｇ、ＦｅＳＯ４／７Ｈ２Ｏ ０．０１ｇの１ｌ蒸留水
溶液であった。インキュベーションは、３０℃で回転シ
ェーカー（２００ｒｐｍ）にて行なった。実施例３ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ 及びＣｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉ
ｕｍのゲノムＤＮＡ及び全ＲＮＡの分離 上記で調製した４８時間培養物からの増殖期菌糸体増殖
物をチーズクロスを通し濾過することにより集め、液体
窒素中で凍結し、一夜凍結乾燥した。乾燥菌糸体を、乳
鉢と乳棒により砂と共にすりつぶし、１００ｍＭ Ｌｉ
ｃｌ、５０ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭトリス ｐＨ８．
０、４％ＳＤＳ溶液２５ｍＬ中に再懸濁した。懸濁液を
６０℃水浴中で５０−５５℃に加熱後、混合物を最初に
１Ｍトリス（ｐＨ８）飽和フェノールで、次いでトリス
飽和フェノール：クロロホルム（１：１、ｖ／ｖ）で、
そしてクロロホルムで抽出した。等容量の冷６Ｍ Ｌｉ
Ｃｌを加え、次いで混合物を−２０℃に２〜３時間保
ち、ＲＮＡを水相から沈殿させた。１２０００×ｇ、４
℃で２０分間遠心分離した後、上澄を６６％（ｖ／ｖ）
エタノール溶液にし、−２０℃で１５分間冷却しＤＮＡ
を沈殿させた。上記のように遠心分離後、ＤＮＡペレッ
トを７０％エタノールで洗浄し乾燥後、ＴＥバッファー
（１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）中に再度懸濁した。ＤＮＡ濃度はアガロースゲル電
気泳動においてエチジウムブロミドで染色することによ
り、濃度既知のＤＮＡ標準液と比較して決定した。ＲＮ
Ａの抽出のため、上記実施例１及び２に記載のようにＰ
ｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ及びＣ
ｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍの
培養を醗酵培地３５ｍＬ（醗酵条件は既に記述した）、
２５℃にて２２０ｒｐｍの回転シェーカーにおいて９６
時間行なった。菌糸体は減圧下でワットマン＃１フィル
ターにより濾過して集め、約５０ｍＬの水で洗った。菌
糸体は、すぐにフィルターからはがしとり、ブレーキン
グバッファー（ｂｒｅａｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（５
０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、５％ ＳＤＳ）５
ｍＬ中に再懸濁し、液体窒素で凍結し、凍結乾燥した。
一夜の凍結乾燥後、０．１％ＤＥＰＣを含有する水５ｍ
Ｌ及び１Ｍトリス（ｐＨ８）飽和フェノール：クロロホ
ルム：イソアミルアルコール（５０：５０：１）の５ｍ
Ｌを加え、混合物を３７℃で２０分間振りながらとかし
た。混合物を、４℃で１２０００×ｇ １０分間遠心分
離し、水層を取り、最初に１Ｍトリス（ｐＨ８）飽和フ
ェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（５
０：５０：１）で、二番目に１Ｍトリス（ｐＨ８）飽和
フェノールで、三番目にクロロホルムで再抽出した。等
容量の６Ｍ ＬｉＣｌを最後の水層に加え、溶液を−２
０℃で４時間以上静置する。全ＲＮＡは４℃、１２，０
００×ｇ、２０分間でペレット化し、ペレットはＴＥバ
ッファー０．３ｍＬ＋３Ｍ酢酸ナトリウム０．０３ｍＬ
中に再溶解し、２．５倍容のエタノールを加えＲＮＡを
再沈殿させた。最後のペレットをＴＥバッファー０．１
ｍＬに溶解し、ＲＮＡ濃度を２６０ｎｍの吸光度から分
光光学的に決定した。実施例４ Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ
遺伝子ライブラリーの構築及びＣ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕ
ｍエキスパンダーゼ（Ｅｘｐａｎｄａｓｅ）／ヒドロキ
シラーゼそしてアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の分
離Ｃ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ エキスパンダーゼ／ヒドロキ
シラーゼ遺伝子の分離Ｃ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ゲノムＤＮＡをＳａｕ３ＡＩ
で部分消化し、１０−２０ｋｂの平均フラグメントサイ
ズにして、このサイズ範囲のものを消化物の５−２０％
ＮａＣｌ密度勾配遠心分離により濃縮した。λ２００１
ベクターのＢａｍＨＩ部位とライゲーションすること、
ギガパック（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使いファージ粒
子中にパッケージングすること及びＥ．ｃｏｌｉを感染
することによりＣ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍゲノムＤＮＡ
ライブラリーを作るためにサイズ分取ＤＮＡを使った。
得られたプラークは、ニトロセルロースに移し、エキス
パンダーゼ／ヒドロキシラーゼ遺伝子の公知の配列（Ｓ
ａｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７）の３′末端に対
して相補的なオリゴヌクレオシドプローブに対するハイ
ブリッド形成によりスクリーニングした。プローブは、
Ｔ４ポリヌクレオシドキナーゼを使い、［τ−３２Ｐ］
ＡＴＰで末端ラベルした。陽性のクローンを分離し、制
限エンドヌクレアーゼ部位をマップし、遺伝子の配向
を、遺伝子の５′末端に相補的な配列をもつ上記オリゴ
ヌクレオシド及び他のヌクレオシドに対するサザンブロ
ットハイブリッド形成法により確定した。Ｃ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍアセチルトランスフェラーゼ
遺伝子の分離 下記実施例１１および１２で記載のベクター構築のため
にアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を分離するのに使
った方法ではないが、次の方法は最近公知になったＤＮ
Ａ配列を使用し、通常の熟練者であれば使用しえた。上
記で構築されたＣ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍゲノムライブ
ラリーから、アセチルトランスフェラーゼ配列に相補的
な合成オリゴヌクレオシドプローブに対してハイブリッ
ド形成をするアセチルトランスフェラーゼ遺伝子をコー
ド化するクローンを選ぶ。このことはＭａｔｓｕｄａ
ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１８２巻、９９５−１０
０１頁（１９９２）に記載されている。実施例５ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ
の培養条件 これらの方法で使ったＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌ
ａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ株はＡＴＣＣ ２７０６４であっ
た。この株は、イースト抽出物４ｇ、モルト抽出物１０
ｇ、グルコース４ｇ、寒天２０ｇ、１ｌの蒸留水より成
るｐＨ７．２の平板培地上で維持した。３０℃で５日間
増殖させた後、平板培地に２ｍＬの無菌水を加え、そし
て培養増殖物を寒天表面からはがしとった。得られた懸
濁液をガラスビーズを入れた無菌のねじ付管に移した。
うず巻き撹拌により培養増殖物を懸濁後、懸濁液は液体
培地に接種するのに使用した。懸濁液は、グリセリンを
最終容量の１５％になるように加え−７０℃での長期の
保存にも使用した。菌糸体が、形質転換のためあるいは
ＤＮＡ源のためクロロプラストを発生する必要がある場
合には、その株は１ｌフラスコ中の次の組成から成るＹ
ＥＭＥ培地２００ｍＬにて生育させた。培地の組成は、
イースト抽出物３ｇ、ペプトン５ｇ、モルト抽出物３
ｇ、グルコース１０ｇ、シュークロース３４０ｇ、Ｍｇ
Ｃｌ２−６Ｈ２Ｏ １．０２ｇ、グリシン５ｇ、寒天１
８ｇ、１ｌの蒸留水であった。インキュベーションは２
８℃、２２０ｒｐｍの回転シェーカーでおこなった。実施例６ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ゲノムＤＮＡの分離 上記のように調製した４８時間培養の増殖増殖物を２２
１００×ｇ、１０分間の遠心分離により集めた。その細
胞はＴＥバッファー１０ｍＬ中に再懸濁し、リゾチーム
１０ｍｇを加え、その混合物を３０℃で１５分間インキ
ュベートした。そして２０％ｓＤｓ １ｍＬを加え、す
ぐにＴＥ（ｐＨ８）飽和フェノール１０ｍＬ及び５Ｍ
ＮａＣｌ １．５ｍＬを加えた後、混合物を２０分間ゆ
るやかに転倒撹拌した。１２０００×ｇで１０分間の遠
心分離により相分離し、その後水層を取り新しい管に移
した。等容量のクロロホルムを加え、混合物を１０分間
ゆるやかに転倒撹拌した。再び１２０００×ｇで１０分
間の遠心分離により相分離し、水層を取り、新しい管に
再度移した。２倍容のイソプロパノールを注意深く加
え、沈殿したＤＮＡを巻き取り、最少量のＴＥバッファ
ーに再溶解した。ＲＮＡｓｅＡを最終濃度２０μｇ／ｍ
Ｌになるように加え、溶液を５０℃で１時間インキュベ
ートした。次いで、１００ｍＭ ＮａＣｌ及び０．４％
ＳＤＳと共にプロテアーゼＫを最終濃度１００μｇ／ｍ
Ｌになるように加え、そして混合物を３７℃で１時間イ
ンキュベートした。溶液を、再び等容量のＴＥ（ｐＨ
８）飽和フェノールで抽出し、次いでクロロホルムで抽
出した。２倍容のイソプロパノールを加えた後、最終抽
出物からのＤＮＡを巻き取り、濃度を２６０ｎｍの吸光
度を使い分光光学的に決定した。実施例７ 遺伝子ライブラリーの構築とＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓエキスパンダーゼ及びヒド
ロキシラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡフラグメントの分
離Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓエキスパンダーゼ遺伝子
の分離 前述の方法により得られたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓゲノムＤＮＡを、制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ及びｓａｌＩにより消化した。消化ＤＮＡを
０．８％アガロースゲル上で電気泳動し、１．８−２．
２ｋｂサイズのフラグメントを溶出し、以前にＢａｍＨ
Ｉ及びｓａｌＩで消化されたＰＵＣ１８ＤＮＡとライゲ
ーションを行なった。ライゲーション混合物の希釈液
は、エレクトロポーレーション（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅ
ｒ， Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， ＣＡ）
により、コンピテントなＪＭ１０９細胞を形質転換する
のに使った。コンピテントな細胞の調製及びエレクトロ
ポーレーションの条件は、製造業者の忠告に従った。形
質転換混合物はアンピシリン１００μｇ／ｍＬ及び２％
Ｘ−Ｇａｌ ７５μｌを含有するＬＢ培地で平面培養し
た。３７℃で一夜インキュベーションした後、組換えコ
ロニーを、プラスミドベクタ−β−ガラクトシダーゼ遺
伝子活性が不活性化されて外観が無色となることにより
同定した。無色コロニーをアンピシリン１００μｇ／ｍ
Ｌを含有する新しいＬＢ平板培地に植えた。３７℃で一
夜増殖させた後、コロニーをニトロセルロースに移し、
塩基５２−９１８が公知のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓエキスパンダーゼ遺伝子配列
［Ｋｏｖａｃｅｖｉｃｅｔ ａｌ，（１９８９）Ｊ．Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１；７５４−７６０；及びＩｎ
ｇｏｌｉａ ｅｔ ａｌ．Ｕ．Ｓ．５，０，７０，０２
０］に対応した、ポリメラーゼ連鎖反応により生産され
るプローブでハイブリッド形成を行なった。ポリメラー
ゼ連鎖反応生産物のラベリングは、（３２Ｐ）ｄＣＴＰ
及びオリゴラベリングキットを使い、製造業者の指示書
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅ
ｗ Ｊｅｒｓｅｙ）に基づきランダムプライマー伸長反
応（ｒａｎｄｏｍ−ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎ）により行なった。ハイブリッド形
成反応は、１０６ＣＰＭの放射線ラベル化したプロー
ブ、３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ７）、
０．１％ＳＤＳ、５×デンハート溶液（５ｇフィコー
ル、５ｇポリビニルピロリドン、５ｇＢｓＡで、これは
５０×回分の５００ｍＬのため）、そして１００μｇ／
ｍＬのウシ胸腺ＤＮＡの存在下で３７℃一夜行なった。
いくつかの形質転換物はプローブと強くハイブリッドを
形成した。１つのコロニーが、制限酵素分析により、エ
キスパンダーゼ遺伝子をはこぶベクターを含有している
ことを確認し、このプラスミドをｐＦＴＳＯ−１とし
た。Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓヒドロキシラーゼ遺伝子
の分離 Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ
ゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、層状遺伝子（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ）からのラムダＤａｓｈＩＩベクター
とライゲーションをした。得られたゲノムライブラリー
を、ヒドロキシラーゼ遺伝子のために、公知の配列の最
初の３０塩基と同じ配列をもつ３０塩基のオリゴヌクレ
オシドとのハイブリッド形成によりスクリーニングした
（Ｋｏｖａｃｅｖｉｃ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，１９９
１， Ｊ． Ｂａｃｔ．，１７３：３９８）。２つの陽
性のファージクローンからのＢａｍＨＩ消化ＤＮＡとの
サザン法によるハイブリッド形成は予想通り６ｋｂフラ
グメントを示し、それをサブクローン化した。このサブ
クローンは、ヒドロキシラーゼ遺伝子周辺領域に対する
公知の制限酵素地図と一致するＫｐｎＩによる消化後に
フラグメント−式を与えた。実施例８ プラスミドＤＮＡの分離 問題のプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉ培養菌を、１
５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含むＬＢブイヨン５
００ｍＬ（２０ｇ／ＩのＬＢブイヨンベース（Ｇｉｂｃ
ｏ，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ））中で、２２
０ｒｐｍの回転シェーカーにて、３７℃で１２〜１６時
間増殖させた。細胞を、４℃で４０００×ｇ、１０分間
の遠心分離によりペレット化した。細胞ペレットを１８
ｍＬグルコースバッファー（５０ｍＭグルコース、２５
ｍＭトリスｐＨ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸
濁し、そして２ｍＬのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ，ｓｔ．
Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）グルコースバッファー溶液（４０ｍ
ｇ／ｍＬ）を加え、混合し、そして混合物を室温で１５
分間インキュベートした。新しく調製した０．２％Ｎａ
ＯＨ、１％ＳＤＳの溶液４０ｍＬを加え、混合物をかる
くうず巻き撹拌し、氷上に１０分間置いた。次いで３０
ｍＬの５Ｍ酢酸カリウムｐＨ４．８を加えよく混合し、
得られた混合物は更に氷上に１０分間置いた。細胞の破
片を４℃、４０００×ｇ １０分間の遠心分離によりペ
レット化し、得られた上澄をチーズクロスフィルターを
通して濾過した。透明な上澄にイソプロパノール（０．
６倍容）を加え、プラスミドＤＮＡを沈殿させ、室温で
２０分間インキュベーションし、その沈殿を形成させ
た。プラスミドＤＮＡは、４℃で４０００×ｇ ２０分
間の遠心分離によりペレット化し、次いで７０％エタノ
ールで洗浄し、手短に乾燥した。ペレットは９ｍＬＴＥ
バッファーに再懸濁し、ＣｓＣｌ １０ｇ及び１０ｍｇ
／Ｌエチジウムプロミド溶液０．３８７ｍＬを加えた。
この溶液を３１３，１００×ｇで２４時間遠心分離し
た。得られた塩化セシウムグラジエント中のプラスミド
帯を紫外線ランプにより可視化し、分離し、次いで水飽
和ブタノールで抽出しエチジウムブロミドを除去した。
次にプラスミドプレパレーション中のＣｓＣｌを、ＴＥ
バッファーに対する透析により除去し、最後にＤＮＡを
ＰＥＧ（ＭＷ ８０００）を使い濃縮した。ＤＮＡ濃度
は、２６０ｎｍの吸光度により分光光学的に決定した。実施例９ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ 形質転換ベクターｐＰｅｎＦＴ
ＳＯの構築フレオマイシン耐性遺伝子の取り込み Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ 形質転換ベクターを、優性選択
マーカーとしてのフレオマイシン耐性遺伝子により構成
した。これを、最初にフレオマイシン耐性遺伝子（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａ
ｎｕｓからのフレオマイシン結合タンパク質）を含有
し、またイーストのチトクロームＣｌのターミネーター
と結合している６６０ｂｐフラグメントをアガロースゲ
ル上の電気泳動及びアガロースゲルから溶離によりプラ
スミドｐＵＴ７１３（ＣＡＹＬＡ，Ｔｏｕｌｏｕｓｅ
Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ）のＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ
消化物から分離することにより達成した。分離したフラ
グメントを、ベクターｐＳＥＬＥＣＴ（商標）１（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のＢａｍＨＩ部
位とライゲーションし、遺伝子の配向を制限酵素分析に
より決定した。得られたプラスミドの特異なＨｉｎｄ
ＩＩＩ部位を、ＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素切断し、クレ
ノウポリメラーゼで充填し、再ライゲーションすること
により除去した。次いで、適切なサイズの挿入体が含ま
れているときベクターがコスミド形成に使用できるよう
にするラムダｃｏｓ部位を含む５５０ｂｐ ＰｓｔＩフ
ラグメントを挿入した。このベクターをｐＳＣＰ４とす
る。Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍゲノムＤＮＡを、Ｓａ
ｕ３Ａで部分的に消化し、ファージベクターラムダＥＭ
ＢＬ３におけるライブラリーの調製に使用した。イソペ
ニシリンＮシンセターゼ（ＩＰＮＳ）遺伝子を含むクロ
ーンをこのライブラリーから分離し、一連のサブクロー
ンの調製に使用した。その１つは、ＩＰＮＳ遺伝子の最
初のＢａｍＨＩ部位上流から、遺伝子の最初のＨｉｎｄ
ＩＩＩ部位下流までの３．６ｋｂフラグメントを含んで
いた。このサブクローンの唯一のｓａｌＩ部位は、ｓａ
ｌＩによる制限酵素切断し、クレノウポリメラーゼで奥
まった末端を満たし、ライゲーションして除いた。次
に、唯一のＸｂａＩ部位を、同じように、ＸｂａＩで制
限酵素切断し、充填し、ライゲションして除いた。得ら
れたプラスミドはｐＳＸＦ−１とする。工学的に作り出
したＩＰＮＳプロモーターは、上記のように、１．２ｋ
ｂ ＮｃｏＩフラグメントとしてｐＳＸＦ−１から分離
し、ｐＳＣＰ４のＮｃｏＩ部位とライゲーションしたゲ
ルであった。制限酵素消化により決定した配向を選択
し、それによりプロモーターをフレオマイシン耐性遺伝
子のＡＴＧ開始コドンのに対して融合した。このプラス
ミドをｐＵＴＺ−２とする。Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓエキスパンダーゼ遺伝子
の取り込み ＳｔｒｅＰｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ
エキスパンダーゼ遺伝子を含む１．６４５ｋｂフラグメ
ントを、ｐＦＴＳＯ−１（前述したベクター）のＢａｍ
ＨＩ及びＳａｌＩ消化物から、０．８％アガロースゲル
上の電気泳動及びアガロースゲルからの溶離により精製
した。分離したフラグメントを、同じくＢａｍＨＩ及び
ｓａｌＩで消化したベクターｐＳＥＬＥＣＴ（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）とライゲーションし
た。このベクターはｐＦＴＳＯ−８とした。新しいＮｃ
ｏＩ部位を、エキスパンダーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コド
ンに、Ａｌｔｅｒｅｄ Ｓｉｔｅｓ（登録商標）ｉｎ
ｖｉｔｒｏ突然変異導入システム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃ
ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使うｐＦＴＳＯ−８の部位特
異的突然変異導入法により創り出した。突然変異導入は
製造業者の指示書に基づいて行なった。Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓエキスパンダーゼ遺伝子の公知の配列（Ｋｏ
ｖａｃｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，（１９９０），Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７１，
ｐ．３９５２−３９５８）からＡＴＧスタートコドンに
おけるＤＮＡ領域のコード化配列と相補体を作るように
オリゴヌクオレシドを構成した。オリゴヌクレオシドを
シアノエチルホフフォラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａ
ｍｉｄｉｔｅ）化学（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｇｅｎｅ
Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏ
ｎ）により合成し、オリゴ配列は以下の通りであった。 配列番号：８ ３′ ＣＧＡＧＡＧＧＡＴＣＡＧＴＧＡＧＡＧＴＣＣＡ
ＴＧＧＡＣＡＣＧＡＣＧＧ ５′ 突然変異を制限酵素分析により確定した。次に、工学的
に作り出したＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ＩＰＮＳプ
ロモーター領域を含むｐＵＴＺ−２からの１．２ｋｂ
ＮｃｏＩフラグメントを、ＮｃｏＩによる制限酵素切
断、次いでアガロースゲルの電気泳動により分離した。
ＩＰＮＳ−プロモーター領域を、エキスパンダーゼ遺伝
子のＡＴＧスタートコドンに突然変異により作られた新
しいＮｃｏＩ部位でｐＦＴＳＯ−８ベクターとライゲー
ションした。エキスパンダーゼ遺伝子に対するプロモー
ターの配向は、制限酵素分析により決定した。このＩＰ
ＮＳ−プロモーター：エキスパンダーゼ遺伝子カセット
を、前述のように、ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩフラグメント
として、ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ切断Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉ
ｕｍ形質転換ベクター中に移した。最終構成物はｐＰｅ
ｎＦＴＳＯとした。実施例１０ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ 形質転換ベクターｐＰＥＮ／Ｃ
ＥＰＨ−１の構築ＩＰＮＳプロモータ領域の挿入 ＩＰＮＳ領域を、実施例９で上記したｐＵＴＺ−２から
Ｘｈｏ Ｉ／ＳｍａＩを用いる消化により単離した。ｐ
ＵＴＺ−２ベクターをＢａｍ ＨＩを用いて切断し、付
着末端をｄＮＴＰ’ｓおよびＫｌｅｎｏｗ断片を用いて
充填し、平滑末端を作成し、次いでＸｈｏ Ｉで消化し
た。単離したＸｈｏ Ｉ／Ｓｍａ ＩＩＰＮＳプロモー
タ断片をこの切断したベクターに連結して２つのＩＰＮ
Ｓプロモータ領域を含む構築物を得た。このベクターを
ｐＵＴＺ−７と称した。Ｃ．ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ Ｅｘｐａｎｄａｓｅ／Ｈｙ
ｄｒｏｘｙｌａｓｅ 遺伝子の挿入 次に、ＩＰＮＳプロモータ領域の一つをｐＵＴＺ−７か
ら（電気泳動およびアガロースゲルからの溶離により）
Ｘｈｏ Ｉ／Ｘｂａ Ｉ断片として単離し、Ｘｈｏ Ｉ
／Ｘｂａ Ｉ切断ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｉ
Ｉ ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、
ＣＡ）に連結した。このベクターをＰＩＰＮＳｐ／ｂｌ
ｕｅと称した。Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍエキスパ
ンダーゼ／ヒドロキシラーゼ遺伝子を、上で同定した一
つのゲノムクローンから（電気泳動およびアガロースゲ
ルからの溶離により）１．６ｋｂ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／
Ｘｂａ Ｉ断片として単離し、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ／Ｘｂ
ａ Ｉ消化ベクターｐＳＥＬＥＣＴに連結した。新規な
Ｂｓｐ ＨＩサイトを、Ａｌｔｅｒｅｄ Ｓｉｔｅｓ
（商標）インビトロ突然変異誘発システム（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、部位特異的
突然変異誘発によりエキスパンダーゼ／ヒドロキシラー
ゼ遺伝子のＡＴＧ出発コドンに作成した。突然変異誘発
は製造業者の指示にしたがって実施した。オリゴヌクレ
オチドを、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍ
ｏｎｉｕｍエキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ遺伝子
の公表された配列からＡＴＧ出発コドンにおけるＤＮＡ
領域のコーディング配列に相補すべく構築した（Ｓａｍ
ｓｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．
５、Ｎｏｖｅｍｂｅｒ、１９８７）。オリゴヌクレオチ
ドをシアノエチルホスホルアミデート化学により合成し
た（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｇｅｎｅ Ａｓｓｅｍｂｌｅ
ｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）。オリゴ配列は
次の通りであった： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９ ３’ ＧＴＴＴＴＧＧＴＧＴＣＧＴＡＧＴＡＧＴＡＣＴ
ＡＡＧＧＴＴＣＣＡＧ ５’． 突然変異誘発を制限酵素分析により確認した。次いで、
Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ
エキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ遺伝子を、（電気
泳動およびアガロースゲルからの溶離により）Ｂｓｐ
ＨＩ／Ｘｂａ Ｉ断片として単離し、先の実施例に記載
したＮｃｏ Ｉ／Ｘｂａ Ｉ消化ベクターｐＩＰＮＳｐ
／ｂｌｕｅに連結した。このベクターは、Ｃｅｐｈａｌ
ｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍエキスパンダ
ーゼ／ヒドロキシラーゼ遺伝子のＡＴＧにＰｅｎｉｃｉ
ｌｌｉｕｍ ＩＰＮＳプロモータを含んでいた。このベ
クターをｐＩＰＮＳｐ／ｂｌｕｅと称した。このＩＰＮ
Ｓプロモータ：エキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼカ
セットをＸｈｏ Ｉで部分的に消化し、Ｘｂａ Ｉで完
全に消化し、（電気泳動およびアガロースゲルからの溶
離により）断片を単離し、先の実施例に記載したＸｈｏ
Ｉ／Ｘｂａ Ｉ消化ベクターに連結して、最終形質転
換ベクターｐＰＥＮ／ＣＥＰＨ−１を得た。実施例１１ Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ のエキスパンダーゼ／ヒ
ドロキシラーゼ遺伝子を発現させるためのＰｅｎｉｃｉ
ｌｌｉｕｍ形質転換ベクターの構築Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ βーチュープリン遺伝子
を、ラムダゲノムライブラリーからＡｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓ ｎｉｇｅｒ β−チューブリン遺伝子を用いてハ
イブリッド形成プローブとしてクローン化した。Ｐｅｎ
ｉｃｉｌｌｉｕｍ β−チューブリンプロモータを含有
する２．０ｋｂのＸｂａ ｌ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、
ｐＳＥＬＥＣＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＸｂａ Ｉ／Ｈｉ
ｎｄＩＩＩサイトに連結させた。ＮｃｏＩサイトを、配
列ＡＡＡＡＴＧＣＧＴからＡＣＣＡＴＧＧＧＴへの部位
特異的突然変異誘発によりＡＴＧ開始コドンに導入し
た。得られたベクターから、１．４ｋｂのＢａｍＨＩ／
ＮｃｏＩ断片をゲル単離し、（前記した）ｐＵＴＺ−２
のＢａｍＨＩサイトとＮｃｏＩサイトとの間に結合し、
ベクターｐＣＩ−６を形成した。Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅ
ｎｕｍゲノムクローンから、ＩＰＮＳおよびアシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子を含む５．１ｋｂのｓａｌＩ断片
をゲル単離し、ｐＵＴＺ−２のｓａｌＩサイトに連結さ
せてｐＵＴＺ−５を作成した。ＩＰＮＳ遺伝子の３’タ
ーミネータ配列を、ｐＵＴＺ−５からＢａｍＨＩおよび
ＨｉｎｄＩＩＩを用いて制限後１．３ｋｂ断片をゲル単
離することにより単離し、これを（上記した）ｐＣＩ−
６のＢａｍＨＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイトとの間に
連結し、ｐＣＩ−１３を形成した。ｐＣＩ−１３におけ
るＢａｍＨＩサイト近くの非反復ＳａｌＩサイトを制
限、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼを用いる充填および再連
結により除去した。あたらしいＳａｌＩサイトを、配列
ＧＧＡＡＧＡＣＧからＧＧＴＣＧＡＣＧへの部位特異的
突然変異誘発によりＢａｍＨＩサイトの反対側に導入し
た。次に、アンピシリン耐性遺伝子を、プラスミドから
ｐｖｕＩによる制限、大きな断片のゲル単離および再連
結により除去して、ｐＣＩ−１５を得た。最後に、ＩＰ
ＳＮＳプロモータ：エキスパンダーゼ遺伝子カセットを
ｐＰＥＮＦＴＳＯから２．４ｋｂのＢａｍＨＩ／Ｓａｌ
Ｉ断片としてゲル単離し、ｐＣＩ−１５に連結してｐＥ
ＸＰ−１を得た。Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓのヒド
ロキシラーゼ遺伝子およびエキスパンダーゼ遺伝子を発
現させるためのベクターの構築は次のステップを含む。
ヒドロキシラーゼ遺伝子を含む２．９ｋｂのＫｐｎＩ断
片をｐＳＥＬＥＣＴにサブクローニングして、ポリリン
カー中のＥｃｏＲＩサイトを遺伝子の５’末端に接近さ
せる。プラスミド内の非反復ＮｃｏＩサイトを配列ＴＣ
ＣＡＴＧＧＧＣから配列ＴＣＧＡＴＧＧＧＣへの部位特
異的突然変異誘発により除去すると同時に、あたらしい
ＮｃｏＩサイトを配列ＡＡＣＡＴＧＧＣからＡＣＣＡＴ
ＧＧＣへ変化させることにより開始コドンに導入する。
両変化ともコード化したアミノ酸配列を保存する。作成
したＩＰＮＳプロモータを含む１．０ｋｂのＥｃｏＲＩ
／ＮｃｏＩ断片をｐＵＴＺ−２からゲル単離し、改変し
たヒドロキシラーゼ遺伝子を含む上記ベクターのＥｃｏ
ＲＩサイトとＮｃｏＩサイトとの間に連結させる。次い
で、得られたベクター中の非反復ＥｃｏＲＩサイトを部
位特異的突然変異誘発によりＨｉｎｄＩＩＩに変化させ
る。５’ＩＰＮＳ：ヒドロキシラーゼ融合構築物を得ら
れたベクターからＨｉｎｄＩＩＩ断片として単離する。
これを、上記したベクターｐＥＸＰ−１の非反復Ｈｉｎ
ｄＩＩＩサイトに連結させる。最終ベクターは、それぞ
れＩＰＮｓプロモータにより動作するエキスパンダーゼ
遺伝子およびヒドロキシラーゼ遺伝子と、β−チューブ
リン遺伝子により動作するブレオマイシン耐性マーカー
を含む。実施例１２ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ 形質転換ベクターｐＰｅｎＣＡ
ＣＴの構築 ヒグロマイシン耐性遺伝子の組み込み 優性（ｄｏｍｉｎａｔｅ）選択性マーカーとしてヒグロ
マイシン耐性遺伝子によってＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ形
質転換ベクターを構築した。そのＥ．ｃｏｌｉヒグロマ
イシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子を、ベクター
ｐＨｐＨ−１（Ｂｏｃｈｒｉｎｇｅｎ Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から、１．１５
ｋｂ Ｂａｍ ＨＩフラグメントとして、（アガロース
ゲル上での電気泳動とそのゲルからの溶出によって）単
離し、次に、Ｂａｍ ＨＩ消化ベクターｍｐ１９に連結
した。ｍｐ１９内のヒグロマイシン耐性遺伝子の配置
を、ＲＦ ＤＮＡの制限酵素分析から、決定した。５′
Ｂａｍ ＨＩ位は、ヒグロマイシン耐性遺伝子のＡＴＧ
開始コドンの近くにあった。３′Ｂａｍ ＨＩ位を、Ｍ
ｕｔａｔｏｒ（登録商標）部位特異的突然変異導入用キ
ット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌｅ，Ｃ
Ａ）を用いた、部位特異的突然変異法によって除去し
た。その方法は、キットの製造者の指示に応じて実施し
た。Ｅ．ｃｏｌｉヒグロマイシンＢホスホトランスフェ
ラーゼ遺伝子（Ｇｒｉｔｚ，Ｌ．ａｎｄ Ｄａｖｉｅ
ｓ，Ｊ．，１９８３，Ｇｅｎｅ ２５，１７９）の、公
表された配列からの３′Ｂａｍ ＨＩ位のＤＮＡ領域を
補完するようにオリゴヌクレオチドを構築した。そのオ
リゴヌクレオチドをシアノエチルホスホルアミダイト化
学法（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｇｅｎｅ Ａｓｓｅｍｂｌ
ｅｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）によって合成
した。そのオリゴ配列は次のようだった。 その突然変異を、制限酵素分析によって、確認した。そ
の後、突然変異ヒグロマイシン耐性遺伝子をＳｍａ Ｉ
／Ｘｂａ Ｉフラグメントとして（アガロースゲル上で
の電気泳動とそのゲルからの溶出とによって）単離し、
Ｓｍａ Ｉ／Ｘｂａ Ｉ消化ベクターｐＵＣ１８に連結
した。Ｎｃｏ ＩカットベクターｐＵＴＺ−２（既出の
ベクター）から、１．２ｋｂ Ｎｃｏ Ｉフラグメント
として、そのＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ＩＰＮＳプロモ
ーターを（アガロースゲル上の電気泳動と、アガロース
ゲルからの溶出によって）、単離した。合成オリゴヌク
レオチドリンカーを合成して、ＩＰＮＳプロモーターフ
ラグメントの末端上のＮｃｏ Ｉ部位からＢａｍ ＨＩ
部位を創生し、そうしてヒグロマイシン耐性遺伝子のＡ
ＴＧ近くの５′Ｂａｍ ＨＩ中に、ＩＰＮＳプロモータ
ーを配置した。そのオリゴをシアノエチルホスホルアミ
ダイト化学法（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｇｅｎｅ Ａｓｓ
ｅｍｂｌｅｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）によ
って合成した。そのオリゴ配列は次のようだった。 この配列は、ＩＰＮＳプロモーターの天然配列を保持し
ているが、ヒグロマイシン耐性遺伝子中に、２つのアミ
ノ酸が挿入されていた。そのオリゴをアニーリングし、
リン酸化し、次いで、Ｎｃｏ ＩカットＩＰＮＳプロモ
ータフラグメントに連結した。それは、ＩＰＮＳプロモ
ーターフラグメントの５′、３′両末端にＢａｍ ＨＩ
部位を生じさせる。この連結プロモーターを、ｐＵＣ１
８中のＢａｍ ＨＩカットヒグロマイシン耐性遺伝子に
連結した。この配置を制限酵素分析によって確認した。
その後、このＩＰＮＳプロモーター：ヒグロマイシン耐
性遺伝子カセットを（アガロースゲル上での電気泳動と
それからの溶出とによって）、２．１ｋｂ Ｘｈｏ Ｉ
／Ｓａｌ Ｉを単離した（Ｘｈｏ Ｉ部位はＩＰＮＳプ
ロモーターの５′末端に位置し、Ｓａｌ Ｉ部位はｐＵ
Ｃポリリンカーからのものであり、Ｓａｌ Ｉ消化ベク
ターｐＳＥＬＥＣＴに連結した。このカセットの配置
は、制限酵素によって分析した。このベクターをｐＩＰ
ＮＳ／ＨＹＧと示す。ＣｅＰｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ
Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｇｅｎｅの組
み込み １．８ｋｂ Ｂａｌ ＩＩ／Ｓａｌ Ｉフラグメントと
してＣｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍアセチルトランスフ
ェラーゼ遺伝子を、アガロースゲル上の電気泳動とその
ゲルからの溶出とによってゲノムクローン（既出）から
単離した。そのアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を、
Ｂａｍ ＨＩ／Ｓａｌ Ｉ消化ベクターｐＳＥＬＥＣＴ
に連結した。Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍアセチルト
ランスフェラーゼ遺伝子のＡＴＧへのＰｅｎｉｃｉｌｌ
ｉｕｍ ＩＰＮＳプロモーターの配置を容易とするた
め、アセチルトラトンスフェラーゼ遺伝子中のＡＴＧに
新規Ｎｃｏ Ｉ部位で創生し、内部Ｎｃｏ Ｉ部位をＡ
ｌｔｅｒｅｄ Ｓｉｔｅｓ（登録商標）インビトロ突然
変異法系（Ｐｒｏｍｅｇａ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
を用いた部位特異的突然変異法によって、除去した。そ
の方法は、その系の製造者の指示によって行なった。そ
のオリゴヌクレオチドを構築し、そうしてＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１と２中に、上でセットアウトしたＣｅｐｈａ
１ｏｓｐｏｒｉｕｍアセチルトランスフェラーゼの配列
から問題のＤＮＡ領域のコード配列を補完した。構造遺
伝子中、内部Ｎｃｏ Ｉ部位を除去するため用いられた
オリゴヌクレオチド配列は次の通りであった。 ＡＴＧ開始コドンで新規なＮｃｏ Ｉ部位を創生するの
に用いたオリゴヌクレオチド配列は次の通りであった。 これらのオリゴヌクレオチドをシアノエチルホスホルア
ミダイト化学法（既出）によって合成した。突然変異は
制限酵素分析によって確認した。このベクターをｐＭＵ
ＴＡＣＴと呼称する。上の実施例で記述したベクターｐ
ＵＴＺ−２から、１．２ｋｂ Ｎｃｏ Ｉフラグメント
として（アガロースゲル上での電気泳動とそのゲルから
の溶出とによって）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ＩＰＮ
Ｓプロモーターを単離した。このプロモーターフラグメ
ントを、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍｏ
ｎｉｕｍアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＡＴＧで
ＩＰＮＳプロモーターを今直接配置したＮｃｏ Ｉカッ
トベクターｐＭＵＴＡＣＴに、連結した。そのプロモー
ターの配置は、制限酵素分析によって確認した。このＩ
ＰＮＳプロモーターＡ：アセチルトランスフェラーゼ遺
伝子カセットをＸｈｏ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ（ＸｈｏＩ部位
はＩＰＮＳプロモーターの５′末端に位置し、Ｓａｌ
Ｉ部位はアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の３′末端
に位置する）と呼称する。このフラグメントの配置は、
制限酵素分析によって定量した。このベクターをｐＭＵ
ＴＡＣＴ／ＩＰＮＳと呼称する。アセチルトランスフェ
ラーゼ遺伝子のＡＴＧで新規Ｎｃｏ Ｉ部位を創生する
のに用いた突然変異によって、第２のアミノ酸において
セリンからアラニンに変わった。天然の遺伝子と同一の
コード配列を保持するために、部位特異的突然変異を、
Ａｌｔｅｒｅｄ Ｓｉｔｅｓ（登録商標）インビトロ突
然変異系を利用して起こした。そのオリゴヌクレオチド
を構築し、そうして、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と２とし
て、上でセットアウトしたアセチルトランスフェラーゼ
遺伝子の配列からの問題のＤＮＡ領域のコード配列を補
完した。２番目のアミノ酸をアラニンからセリンに換え
るのに用いたオリゴヌクレオチド配列は、次のものであ
る。 そのオリゴヌクレオチドをシアノエチルホスホルアミダ
イト化学法（既出）を利用して合成した。その突然変異
をＵＳＢ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅバージョン２．０ＤＮＡ
配列用キットを利用したＤＮＡ配列法によって確認し
た。このベクターをｐＭＵＴＡＣＴ／ＩＰＮＳ−２と呼
称する。ＩＰＮＳプロモーター：ヒグロマイシン耐性遺
伝子カセットを、Ｘｂａ Ｉフラグメントとして、ベク
ターｐＩＰＮＳ／ＨＹＧから除去し、Ｘｂａ Ｉ消化ベ
クターｐＭＵＴＡＣＴ／ＩＰＮＳ−２に連結し、最終変
異ベクターｐＰｅｎＣＡＣＴを生成させた。ヒグロマイ
シンカセットの配置を制限酵素分析によって決定した。実施例１３ Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ
のエキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼとアセチルトラ
ンスフェラーゼの両遺伝子を発現するＰｅｎｉｃｉｌｌ
ｉｕｍ形質転換ベクターｐＴＳ−８の構築 ゲノムクローンから、１．８ｋｂ Ｂｇｌ ＩＩ／Ｓａ
ｌ Ｉフラグメントとして（アガロースゲル上での電気
泳動とそのゲルからの溶出によって）、Ｃｅｐｈａｌｏ
ｓｐｏｒｉｕｍアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を単
離し、ＢａｍＨＩ／Ｓａｌ Ｉ消化ベクターｐＳＥＬＥ
ＣＴ（プロメガコーポレーション）に連結した。Ｃｅｐ
ｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍアセチルトランスフェラーゼ遺
伝子のＡＴＧへのＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ＩＰＮＳの
配置を容易とするため、新規Ｎｃｏ Ｉ部位を、塩基−
４２（マチソン等、カレントジェネティック）に配した
ＡＴＧコドンで創生し、構造遺伝子中の内部Ｎｃｏ Ｉ
部位を、ＡｌｔｅｒｅｄＳｉｔｅｓインビトロ突然変異
系（プロメガコーポレーション）を用いた部位特異的突
然変異法によって除いた。突然変異法は、系の製造者の
指示によって行なった。そのオリゴヌクレオチドを構築
し、そうして問題のＤＮＡ領域のコード配列を補完し
た。しかし、Ｎｃｏ Ｉ部位を創生又は除去するためい
くつかの変化を組み込んだ。構造遺伝子中の内部Ｎｃｏ
Ｉ部位を除くために用いたオリゴヌクレオチド配列は
次のものである。 塩基−４２でのＡＴＧで新規Ｎｃｏ Ｉ部位を創生する
のに用いたオリゴヌクレオチド配列は次のものである。 オリゴヌクレオチドを、シアノエチルホスホルアミダイ
ト化学法（既出）によって合成した。両突然変異の発生
を制限酵素分析によって確認した。このベクターをｐＭ
ＵＴＡＣＴと呼称する。前記したｐＵＴＺ−２ベクター
から、１．２ｋｂＮｃｏ Ｉフラグメントとして（アガ
ロースゲル上での電気泳動とそのゲルからの溶出によっ
て）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ＩＰＮＳプロモーター
を単離した。このプロモーターフラグメントを、Ｃｅｐ
ｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍアセチルトランスフェラーゼ遺
伝子の−４２ＡＴＧに直接ＩＰＮＳプロモーターを今配
置したＮｃｏ ＩカットベクターｐＭＵＴＡＣＴに、連
結した。そのプロモーターの配置を制限酵素分析によっ
て確認した。このベクターをｐＭＵＴＡＣＴ／ＩＰＮＳ
と呼称する。ＩＰＮＳプロモーター：アセチルトランス
フェラーゼカセットを含むベクターｐＭＵＴＡＣＴ／Ｉ
ＰＮＳから（アガロース上での電気泳動とそのゲルから
の溶出によって）、２．５ｋｂ Ｘｈｏ Ｉ／Ｓａｌ
Ｉフラグメントによって単離し、（既述の）Ｓａｌ Ｉ
消化ベクターｐＵＴＺ−２に連結した。次に、この中間
体ベクターをＸｂａ Ｉで消化し、ＩＰＮＳプロモータ
ー：エキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼカセットを含
む（既述の）ｐＰＥＮ／ＣＥＰＨ−１ベクターからの
２．１ｋｂ Ｘｂａ Ｉフラグメントで連結した。こう
して最終変異ベクターｐＴＳ−８が生じた。実施例１４ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍの形質
転換 上で記載したＰｅｎｉｃｉｌｌｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅ
ｎｕｍ株からのプロトプラストを、２２０ｒｐｍの回転
シェーカー上に１×１０７個の胞子を含むＣＭブロスの
５０ｍＬを接種して、２５℃、６７時間で、生じさせ
た。その菌糸体を、チーズクロス（寒冷紗）濾紙の上に
濾過によって集め、５００ｍＬのフラスコに移し、１０
０ｍｇのＮｏｖｏｚｙｍｅ２３４（Ｎｏｖｏ ＢｉｏＬ
ａｂｓ，Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，デンマーク）を含む２５
ｍＬのＫＭＰ（０．７Ｍ Ｋｃｌ、０．８Ｍマンニトー
ル、０．０２Ｍ ＫＰＯ４、ｐＨ６．３）に再懸濁し、
１００ｒｐｍで３０℃にてインキュベートした。そのス
フェロプラストをチーズクロス／ガラスウールフィルタ
ーによって分離し、１０分間３５０×ｇで遠心分離して
ペレット状にした。その後、そのスフェロプラストをＫ
ＭＰ緩衝液の１０ｍＬで，３度洗った。次いでＫＭＰＣ
（ＣａＣｌ２ ５０ｍｍを含むＫＭＰ）中に再懸濁し、
室温に２０分間放置した。そのＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ
の形質転換のために、２００μｌのスフェロプラスト懸
濁液を、５０μｌのＰＰＣ（４０％ＰＥＧ ＭＷ ３５
００，２０ｍＭ ＫＰＯ４、ＰＨ６．３、５％ＣａＣｌ
２が使用の直前に付加された）と共に、ＤＮＡ（５ｍｇ
／ｍＬを含むＫＭＰＣの６．２μｌ中の５μｇベクター
ＤＮＡ）に付加した。その形質転換混合物を３０分間氷
上でインキュベートした。新しく調製したＰＰＣの１ｍ
Ｌを加え、その混合物を５０ｍＬの溶融（５０℃）再生
寒天（ＣＭと１．３Ｍモンニトールと３％寒天）に移し
た。その後、その形質転換混合物を５つのペトリ皿に配
分した。２５℃で２４時間の再生の後、皿を、１００μ
ｇ／５０ｍＬのフレオマイシンＯＬを含むＯＬ（１％寒
天中の１％ペプトン）に重ねた。上層の量は再生寒天の
量に等しかった。皿を７〜１４日間２５℃でインキュー
ベートし、形質転換コロニーの発生を観察した。実施例１５ 生物活性試験 寒天拡散生物試験を利用して、ＨＰＬＣで単離したアジ
ポイル−６−ＡＰＡとアジポイル−７−ＡＤＣＡ醗酵生
成物の抗生物活性を調べた。Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔ
ｉｌｕｓ ＡＴＣＣ ３３６７７またはＥ．ｃｏｌｉ超
感受性株（ＭＩＴのＡｒｎｏｌｄ Ｌ． Ｄｅｍａｉｎ
教授により入手）が植え付けられた３％寒天（Ｇｉｂｃ
ｏ、Ｐａｉｓｌｅｙ、スコットランド）を含むＬＢ寒天
皿（２０ｇ／ＬのＬＢブロス）上に、５ｍｍの円板状と
して単離生成物の２０μＬを塗布した。Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓを指示株として用い、アジポイル
−６−ＡＰＡ生成物を分析し、またＥ．ｃｏｌｉ超感受
性株を指示株として用い、アジポイル−７−ＡＤＣＡ生
成物を分析した。３７℃でのインキュベーションの１５
時間後、円板状部の周りの指示用バクテリアの増殖禁止
を示すかさ状模様によって、上記生成物は生物活性があ
ることがわかった。この実験の対照は、β−ラクトン構
造の確認用対照としてペニシリンアーゼを含まないか含
む寒天、デアセトキシセファロースポリンＣ、セファロ
ースポリンＣ、ペニシリンＶ含んでいた。実施例１６ アジポイル−６−ＡＰＡ、７−ＡＤＣＡ、７−ＡＤＡＣ
及び７−ＡＣＡの同時分析用ＨＰＬＣ法 形質転換したＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ株（アジポイル−
６−ＡＰＡ、アジポイル−７−ＡＤＣＡ、アジポイル−
ＡＤＡＣ及びアジポイル−７−ＡＣＡ）からの醗酵生成
物を、高性能液体クロマト（ＨＰＬＣ）によって同時分
析した。そのＨＰＬＣ系は次のＷａｔｅｒｓ成分からな
る。６２５溶媒分散系、４０９Ｅ可変波長検出器（２２
０ｎｍと２６０ｎｍにセット）、８２５Ｍａｘｉｍａデ
ータシステム。静止層は、Ｎｏｖａ−ＰａＫ Ｃ１８
Ｇｕａｒｄ−ＰａＫインサートを含むＮｏｖａ−ＰａＫ
Ｃ１８ ５×１００ｍｍラジアル圧縮カートリッジで
あった。可動層（１ｍｌ／分の流れ）は、初期条件（５
％メタノールと９５％１０ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ５）か
ら、４０％メタノールと６０％ＫＰＯ４、ｐＨ５への１
０分・線形勾配からなる。アジポイル−６−ＡＰＡを、
２２０ｎｍで、ペニシリンＮの標準カーブに対する比較
によって定量した。伸張生成物を、合成アジポイル−７
ＡＤＣＡとアジポイル−７−ＡＣＡの２６０ｎｍでの標
準カーブとの比較によって定量した。実施例１７ ＲＡＥＶ酵素分析 化学合成アジポイル−７−ＡＤＣＡとアジポイル−７−
ＡＣＡを基質として用い、ＲＡＥＶ酵素（ＲＡＥＶ社か
ら入手）の特異的活性を分析した。反応混合物は、全５
０μｌで、０．１６Ｍ ＫＨ２ＰＯ４中、１０ｍＭの基
質、１μｇのＲＡＥＶ酵素、５％グリセロールを含んで
おり、３７℃でインキューベートした（もっとより良い
反応条件は、リン酸カリウム緩衝液の２０〜５０ｍＭ中
２０ｍＭ以上の基質を用いることである）。５μｌのア
リコートを０、１、３、５、１０、２０、３０分で取り
出した。それをｐＨ３．５の０．０１０Ｍ ＫＨ２ＰＯ
４の３５μｌで希釈し、既に記述した条件でＨＰＬＣに
よる分析の前−７０℃で凍らせた。比色定量アジポイル
−ｐ−アミノ安息香酸基質に対するＲＡＥＶ酵素の活性
を、０．０６５Ｍ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．０）中の、
５ｍＭ基質、８．２５μｇのＲＡＥＶ酵素及び１０％グ
リセロール（全５０μｌ）を用いて、３７℃３０分間で
分析した。反応を９６ウェルのマイクロタイターデッシ
ユ中で実行した。０．２５Ｍ酢酸中、１Ｍ ＮａＮＯ２
の１／１００希釈物の５μｌを加えて、反応を終え、次
いで反応物を３分間室温に放置した。４−アミノ−５−
ヒドロキシ−２，７−ナフタレン−ジスルホン酸モノナ
トリウム塩水和物の水溶液１０ｍｇ／ｍＬの１／１００
希釈物の１００μｌを０．５Ｍ ＮａＣＯ３に加え、比
色変化をＥＬ ３１２バイオキネティックプレートリー
ダ（バイオテック インストゥルメントを用いて、５１
５ｎｍですぐにモニターした。実施例１８ 代替アジポイルアシラーゼの評価 ＲＡＥＶ酵素を用いた検討に加え、アジプロイル−７−
ＡＤＣＡ（と他のアジポイル化合物）からのアジポイル
側鎖の除去を、いろいろな微生物源から生じた酵素で示
した。初めの検討において、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−８１７及びＦＥＲＭＢＰ−８１８で、ファーメ
ンテーションリサーチインスティテュートによって寄託
された、Ａｓａｈｉ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．
株ＳＥ−８３とＳＥ−４９５；及び、受託番号ＮＲＲＬ
Ｂ−８０７０でノーザンレジオナルリサーチラボラト
リーによって寄託されたＴｏｙｏ Ｊｏｚｏ Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ株ＳＹ−７７−１を、次の培地で７２時
間増殖した。その培地は、ＨｙＣａｓｅ ＳＦ２．０％
（ｗ／ｖ、以下同）、グルタミン酸モノナトリウム０．
５％、酵母菌抽出物０．５％、コーンスティープパウダ
ー０．２％、綿実油０．５％及びグルタミン酸０．１％
を含んでいる。細胞を遠心分離で集め、５０ｍＭのリン
酸塩緩衝液ｐＨ８．０で洗浄した。その後、それらを、
緩衝液中で再懸濁し、少量のクロロホルムを加えて外膜
を透過性とした。その後、細胞懸濁液のアリコートをア
ジポイル−ｐ−ニトロアニリド（ａｄ−ｐＮＡ）と混合
し、２〜１８時間３０℃でインキューベートした。それ
に続いて、混合物を１０％（ｖ／ｖ）酢酸の添加によっ
て、酸性化した。その後ガンマーグルタミル−トランス
フェラーゼの分析用シグマケミカルカンパニー（シグマ
製品Ｎｏ，５４５−Ａ）によってキットとして提供され
た試薬を用いたジアゾ化合物への転換による比色法によ
って、遊離ｐ−ニトロアニリンを検出した。３つの株の
相対活性は、ＳＥ−４９５、ＳＥ−８３、ＳＹ−７７−
１それぞれに対して１００％、８５．５％、４８％であ
った。ＲＡＥＶ酵素に関して既述したのと同様な方法に
よって、アジポイル−７−ＡＤＣＡへのＳＥ−８３とＳ
Ｅ−４９５酵素の活性も示した。ＳＹ−７７−１による
β−ラクタマーゼの産生により、アジポイル−７−ＡＤ
ＣＡに対する脱アシル化活性の発揮を阻害した。同様な
方法によって、アジポイル−アシラーゼ生成が２つの菌
株（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｐ．ＭＡ−１３３、ＡＴ
ＣＣ Ｎｏ．２０４９２とＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓ
ｐ．ＭＡ−１３、ＡＴＣＣ Ｎｏ．２０４９１：明治製
菓の米国特許第４１４１７９０号）と、別の３つの細菌
株（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＡＴＣＣ Ｎｏ．
１４６４９、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＡＴ
ＣＣ Ｎｏ．１４６４８及びＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ、ＡＴＣＣ Ｎｏ．１４６５０）について示され
た。これらはメルク社の米国特許第３２３９３９４中
に、セファロスポリンＣアシラーゼプロドゥーサーとし
て記述されている。
【配列表】
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:82） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:82） (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:82） (72)発明者 アンソニー・マイケル・ステパン アメリカ合衆国、ワシントン・98155、シ アトル、トウエンテイーエイス・アベニユ ー・ノース・イースト・19433、アパート メント・デイー (72)発明者 ロリリー・クローフオード アメリカ合衆国、ワシントン・98011、ボ セル、ナインテイーフアースト・プレイ ス・ノース・イースト・14049 (72)発明者 ジヨン・エイ・ランボセツク アメリカ合衆国、ワシントン・98115、シ アトル、セブンテイーンス・アベニユー・ ノース・イースト・7701 (72)発明者 フイリス・シー・マカダ アメリカ合衆国、ワシントン・98072、ウ デインビル、ワンハンドレツドアンドセブ ンテイーサード・アベニユー・ノース・イ ースト・15611 (72)発明者 クリストフアー・デイー・リーブス アメリカ合衆国、ワシントン・98072、ウ デインビル、ノース・イースト・トウーハ ンドレツドアンドサード・プレイス・ 19403
Claims (16)
- 【請求項１】 ７−アミノデアセチルセファロスポラン
酸（７−ＡＤＡＣ）を製造するためのバイオプロセスで
あって、 （１）イソペニシリンＮを産生するペニシリウム・クリ
ソゲナム菌株をその増殖を支持し得る培地中に維持し、
アジポイル−６−アミノペニシラン酸（アジポイル−６
−ＡＰＡ）を産生するために前記ペニシリウム・クリソ
ゲナム菌株によって同化され利用され得るアジピン酸ま
たはその塩及びエステルのいずれか１種以上から成るア
ジペート原液を前記培地に添加することによって前記ア
ジポイル−６−ＡＰＡを産生させる段階と、 （２）対応する遺伝子をその場で発現させることによっ
て以下の酵素的変換を生起させる段階、即ち、（ａ）エ
キスパンダーゼ酵素によってアジポイル−６−ＡＰＡを
その場で環拡張させてアジポイル−７−アミノデスアセ
トキシセファロスポラン酸（アジポイル−７−ＡＤＣ
Ａ）を形成させるために、前記アジポイル−６−ＡＰＡ
を基質として受容し得るエキスパンダーゼ酵素の活性を
コードするＤＮＡによって前記ペニシリウム・クリソゲ
ナム菌株を形質転換させ、その発現の結果として次に、
前記菌株によって産生された前記アジポイル−６−ＡＰ
Ａをその場で環拡張させてアジポイル−７−ＡＤＣＡを
形成させる段階、及び、（ｂ）ヒドロキシラーゼ酵素に
よってアジポイル−７−ＡＤＣＡの３−メチル側鎖をそ
の場でヒドロキシル化してアジポイル−７−アミノデア
セチルセファロスポラン酸（アジポイル−７−ＡＤＡ
Ｃ）を形成するために、前記アジポイル−７−ＡＤＣＡ
を基質として受容し得るヒドロキシラーゼ酵素の活性を
コードするＤＮＡによって前記ペニシリウム・クリソゲ
ナム菌株を形質転換させ、その発現の結果として次に、
前記菌株によって産生された前記アジポイル−７−ＡＤ
ＣＡをその場でヒドロキシル化してアジポイル−７−Ａ
ＤＡＣを形成させる段階と、 （３）前記アジポイル−７−ＡＤＡＣをアジポイルアミ
ダーゼと接触させることによってアジポイル側鎖を除去
し、７−ＡＤＡＣ産生物を形成させ、この産生物を単離
する段階とから成ることを特徴とするバイオプロセス。 - 【請求項２】 アジペート原液がアジピン酸二ナトリウ
ムであることを特徴とする請求項１に記載のバイオプロ
セス。 - 【請求項３】 エキスパンダーゼ及びヒドロキシラーゼ
の酵素活性をコードするＤＮＡがセファロスポリウム・
アクレモニウムに由来することを特徴とする請求項１に
記載のバイオプロセス。 - 【請求項４】 エキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼの
２つの酵素機能を有する単一の酵素を使用することを特
徴とする請求項３に記載のバイオプロセス。 - 【請求項５】 アジポイルアミダーゼがプソイドモナス
種に由来することを特徴とする請求項１に記載のバイオ
プロセス。 - 【請求項６】 ７−アミノセファロスポラン酸（７−Ａ
ＣＡ）を製造するためのバイオプロセスであって、 （１）イソペニシリンＮを産生するペニシリウム・クリ
ソゲナム菌株をその増殖を支持し得る培地中に維持し、
アジポイル−６−アミノペニシラン酸（アジポイル−６
−ＡＰＡ）を産生するために前記ペニシリウム・クリソ
ゲナム菌株によって同化され利用され得るアジピン酸ま
たはその塩及びエステルのいずれか１種以上から成るア
ジペート原液を前記培地に添加することによって前記ア
ジポイル−６−ＡＰＡを産生させる段階と、 （２）対応する遺伝子をその場で発現させることによっ
て以下の酵素的変換を生起させる段階、即ち、（ａ）エ
キスパンダーゼ酵素によってアジポイル−６−ＡＰＡを
その場で環拡張させてアジポイル−７−アミノデスアセ
トキシセファロスポラン酸（アジポイル−７−ＡＤＣ
Ａ）を形成させるために、前記アジポイル−６−ＡＰＡ
を基質として受容し得るエキスパンダーゼ酵素の活性を
コードするＤＮＡによって前記ペニシリウム・クリソゲ
ナム菌株を形質転換させ、その発現の結果として次に、
前記菌株によって産生された前記アジポイル−６−ＡＰ
Ａをその場で環拡張させてアジポイル−７−ＡＤＣＡを
形成する段階、及び、（ｂ）ヒドロキシラーゼ酵素によ
ってアジポイル−７−ＡＤＣＡの３−メチル側鎖をその
場でヒドロキシル化してアジポイル−７−アミノデアセ
チルセファロスポラン酸（アジポイル−７−ＡＤＡＣ）
を産生させるために、前記アジポイル−７−ＡＤＣＡを
基質として受容し得るヒドロキシラーゼ酵素の活性をコ
ードするＤＮＡによって前記ペニシリウム・クリソゲナ
ム菌株を形質転換させ、その発現の結果として次に、前
記菌株によって産生された前記アジポイル−７−ＡＤＣ
Ａをその場でヒドロキシル化してアジポイル−７−ＡＤ
ＡＣを形成させる段階、及び、（ｃ）アセチルトランス
フェラーゼ酵素によってアジポイル−７−ＡＤＡＣをそ
の場でアセチル化してアジポイル−７−アミノセファロ
スポラン酸（アジポイル−７−ＡＣＡ）を産生させるた
めに、前記アジポイル−７−ＡＤＡＣを基質として受容
し得るアセチルトランスフェラーゼ酵素の活性をコード
するＤＮＡによって前記ペニシリウム・クリソゲナム菌
株を形質転換させ、その発現の結果として次に、前記菌
株によって産生された前記アジポイル−７−ＡＤＡＣを
その場でアセチル化してアジポイル−７−ＡＣＡを形成
させる段階と、 （３）前記アジポイル−７−ＡＣＡをアジポイルアミダ
ーゼと接触させることによって、アジポイル側鎖を除去
し、７−ＡＣＡ産生物を形成させ、前記産生物を単離す
る段階とから成るバイオプロセス。 - 【請求項７】 アジペート原液がアジピン酸二ナトリウ
ムであることを特徴とする請求項６に記載のバイオプロ
セス。 - 【請求項８】 エキスパンダーゼ、ヒドロキシラーゼ及
びアセチルトランスフェラーゼの酵素活性をコードする
ＤＮＡがセファロスポリウム・アクレモニウムに由来す
ることを特徴とする請求項６に記載のバイオプロセス。 - 【請求項９】 エキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼの
２つの機能を有する単一の酵素を使用することを特徴と
する請求項８に記載のバイオプロセス。 - 【請求項１０】 アジポイルアミダーゼがプソイドモナ
ス種に由来することを特徴とする請求項６に記載のバイ
オプロセス。 - 【請求項１１】 セファロスポリウム・アクレモニウム
に由来のエキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ及びアセ
チルトランスフェラーゼの酵素活性をコードするＤＮＡ
と、前記エキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ及びアセ
チルトランスフェラーゼの酵素活性をコードするＤＮＡ
の発現を促進するプロモーターとを含み、前記プロモー
ターがペニシリウム・クリソゲナムのＩＰＮＳ遺伝子の
プロモーターから成ることを特徴とする組換えＤＮＡ発
見ベクター。 - 【請求項１２】 プラスミドｐＰＥＮ／ＣＥＰＨ−１、
ｐＰｅｎＣＡＣＴ及びｐＴＳ−８を含むことを特徴とす
る請求項１１に記載の発現ベクター。 - 【請求項１３】 セファロスポリウム・アクレモニウム
に由来のエキスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ及びアセ
チルトランスフェラーゼの酵素活性をコードするＤＮＡ
と、ペニシリウム・クリソゲナムのＩＰＮＳ遺伝子のプ
ロモーターから成り前記エキスパンダーゼ／ヒドロキシ
ラーゼ及びアセチルトランスフェラーゼの酵素活性をコ
ードするＤＮＡの発現を促進するプロモーターとを含む
組換えＤＮＡ発現ベクターによって形質転換されたペニ
シリウム・クリソゲナム宿主細胞。 - 【請求項１４】 発現ベクターが、プラスミドｐＰＥＮ
／ＣＥＰＨ−１、ｐＰｅｎＣＡＣＴ及びｐＴＳ−８から
成ることを特徴とする請求項１３に記載の形質転換宿主
細胞。 - 【請求項１５】 遺伝子発現に適した条件下で組換えペ
ニシリウム・クリソゲナム宿主細胞を培養する方法であ
って、前記組換え宿主細胞が、セファロスポリウム・ア
クレモニウムに由来のエキスパンダーゼ／ヒドロキシラ
ーゼ及びアセチルトランスフェラーゼの酵素活性をコー
ドするＤＮＡと、ペニシリウム・クリソゲナムのＩＰＮ
Ｓ遺伝子のプロモーターから成り前記エキスパンダーゼ
／ヒドロキシラーゼ及びアセチルトランスフェラーゼの
酵素活性をコードするＤＮＡの発現を促進するプロモー
ターとを含む組換えＤＮＡ発現ベクターを含んでいるこ
とを特徴とする方法。 - 【請求項１６】 組換え宿主細胞が、プラスミドｐＰＥ
Ｎ／ＣＥＰＨ−１、ｐＰｅｎＣＡＣＴ及びｐＴＳ−８か
ら成る組換えＤＮＡ発現ベクターを含んでいることを特
徴とする請求項１５に記載の方法。
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