PL172155B1 - Sposób biotechnologiczny wytwarzania pochodnych kwasu cefalosporanowego - Google Patents

Abstract

. Sposób biotechnologiczny wytwarzania pochodnych kwasu cefalosporanowego, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania kwasu 7-aminodezacetylosporanowego (7-ADAC) obejmuje etapy: 1) hodowlę w podłożu odpowiednim dla wzrostu szczepu Penicillium chrysogenum, który wytwarza izopenicylinę N 1 dodawanie do wymienionego podłoża adypinianowego roztworu zasilającego zawierają­ cego jeden lub więcej następujących składników: kwas adypinowy lub jego sole i estry asymilowane i wykorzystywane przez wymieniony szczep Penicillium chrysogenum, z wytworzeniem kwasu adypoilo-6- aminopenicylanowego (adypoilo-6-APA), 2) przeprowadzenie następujących konwersji enzymatycznych przez ekspresję in situ odpowiednie - go genu: a) rozszerzenie pierścienia adypoilo-6-APA in situ, z wytworzeniem kwasu adypoilo-7-aminodeza - cetoksycefalosporanowego (adypoilo-7-ADCA) przez enzym ekspandazę wytworzony przez ekspresję DNA kodującego aktywność enzymu ekspandazy, zdolnego do wykorzystania adypoilo-6-APAjako substratu, którym stransfonnowano wymieniony szczep Penicillium chrysogenum, b) hydroksylowa^ bocznego łańcucha 3-metylowego w adypoiio-7-ADCA in situ z wytworzeniem kwasu adypoilo-7-amidoacotylocefalosporanowogo (adypoilo-7-ADAC) przez enzym hydroksylazę wytworzony przez ekspresję DNA kodującego aktywność enzymu hydroksylazy, zdolnego do wykorzystania adypoiIo-7-ADCA jako substratu, którym stransformowane wymieniony szczep P. chrysogenum; i 3) doprowadzenie do kontaktu adypoilo-7-ADAC z amidazą adypoilową, w wyniku czego boczny łańcuch adypoilowy jest usuwany 1 powstaje jako produkt 7-ADAC; i następnie izolację wymienionego produktu. 6. Sposób biotechnologiczny wytwarzania pochodnych kwasu cefalosporanowego, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania kwasu 7-aminocefalosporanowego (7-ACA) obejmuje etapy

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób biotechnologiczny wytwarzania pochodnych kwasu cefalosporanowego a w szczególności kwasu 7-aminodezacetylocefalosporanowego (7-ADAC) i kwasu 7-aminocefalosporan(^y^O-go (7-ACA).

1. Dziedzina wynalazku.

Niniejszy wynalazek dotyczy metod syntezy, służących do otrzymywania antybiotyków cefalosporynowych, reprezentujących czwartą generację spośród znanej obecnie ogromnej ilości tych środków leczniczych. Duża różnorodność bocznych łańcuchów występujących w handlowych cefalosporynach i duże znaczenie ekonomiczne cefalosporyn spowodowały, że coraz większe znaczenie ma opracowanie bardziej ekonomicznych i wydajnych sposobów otrzymywania kluczowych związków pośrednich, które pozwalają na syntezę różnych cefalosporyn.

Jednym z tych kluczowych związków pośrednich jest kwas 7-amino-cefalosporanowy (7-ACA) o następującym wzorze:

COOH

Obecnie 7-ACA otrzymuje się z cefalosporyny C. Cefalosporyna C jest produktem fermentacji i wyjściowym związkiem do otrzymywania prawie wszystkich znajdujących się obecnie na rynku cefalosporyn. Jednakże, procesy syntezy służące do otrzymywania tych różnych handlowych cefalosporyn rozpoczynają się w większości przypadków od kwasu 7aminocefalosporynowego, który jest pochodną cefalosporyny C, otrzymaną przez odcięcie bocznego łańcucha 7-aminoadipoilowego. Typowe handlowe cefalosporyny są syntetycznymi pochodnymi 7-ACA, posiadającymi boczny łańcuch 3-acetyloksymetylenowy i obejmują cefotaksim, cefaloglicynę, cefalotin i cefapiryn.

Innym kluczowym związkiem pośrednim jest kwas 7-aminodeacetylocefalosporynowy (7-ADAC) o następującym wzorze:

172 155

Η_ΖΝ· ₀- ρ

COOH

Obecnie 7-ADAC otrzymuje się również z cefalosporyny C przez odcięcie bocznego łańcucha 7-D-a-aminoadipoilowego równocześnie z konwersją łańcucha bocznego 3-acetyloksymetylenowego do 3-hydroksymetylowego. 7-ADAC jest użytecznym związkiem pośrednim w syntezie cefalosporyn, posiadających zmodyfikowane podstawniki w pozycji C-3.

Obecnie stosuje się chemiczny sposób rozszczepiania bocznego łańcucha 7-aminoadipoilowego. Podstawowa metoda imino-halogenkowa wymaga zablokowania grup aminowych i karboksylowych w bocznym łańcuchu 7-aminoadipoilowym i obecnie stosuje się kilka sposobów przeprowadzania tego procesu. Jednakże, w postaci obecnie stosowanej, sposób chemicznego odcinania ma poważne niedogodności. Należą do nich wymagania wieloetapowych i skomplikowanych procesów, skrajnie niskie temperatury, drogie odczynniki, znaczne ilości produktów ubocznych, które powodują problemy unieszkodliwiania ścieków i konieczność oczyszczania w znacznym stopniu zanieczyszczonych materiałów wyjściowych przed rozpoczęciem procesów chemicznych. Konsekwencją tego są nieustanne poszukiwania sposobów mikrobiologicznych lub fermentacyjnych, które pozwoliłyby osiągnąć enzymatyczną deacylację cefalosporyny C w celu otrzymania kwasu 7-aminocefalosporynowego w bardziej ekonomiczny sposób niż obecnie stosowane chemiczne procesy.

Jednakże, poszukiwanie zapewniającego powodzenie procesu mikrobiologicznego przeważnie okazywało się bezskuteczne. Jest to spowodowane, jak jasno wynika z literatury, strukturą, a zwłaszcza stereochemią bocznego łańcucha aminoadipoilowego cząsteczki cefalosporyny C, chociaż deacylację penicyliny można z powodzeniem przeprowadzać używając do enzymatycznego cięcia acylazy penicylowej, wytwarzanej przez różne mikroorganizmy. Doniesienia literaturowe o udanej jednostopniowej enzymatycznej deacylacji cefalosporyny C, z drugiej strony, są często nieodtwarzalne lub osiągają tylko bardzo niskie wydajności.

Zgodnie z powyższym, niniejszy wynalazek dotyczy w szczególności przygotowywania kluczowego związku pośredniego dla cefalosporyny - 7-ACa, a zwłaszcza procesów biotechnologicznych otrzymywania 7-ACA.

Do tej pory poszukiwania zapewniającego powodzenie procesu biotechnologicznego otrzymywania 7-ACA przeważnie okazywały się bezskuteczne, zwłaszcza w odniesieniu do skali produkcyjnej. Na przykład, chociaż jest możliwe przygotowanie kwasu 6-amino penicylinowego przez bezpośrednią fermentację i/lub enzymatyczne cięcie penicyliny G, co pozostawia tylko konieczność rozszerzenia pierścienia w celu otrzymania 7-ADCA, jednak niestety okazało, się że enzymy Cephalosporium i Streptomyces, które przeprowadzają rozszerzenie pierścienia w normalnych szlakach metabolicznych tych mikroorganizmów, nie przyjmują 6-APA jako substratu. Te enzymy objęte w literaturze wspólną nazwą DAOCS lub enzymy ekspandazy, definiuje się jako enzymy, które katalizują rozszerzenie struktury pierścienia penamowego obecnego w cząsteczkach typu penicyliny do pierścieni cef-3-emowych obecnych w cefalosporynach. Zatem enzymy te określa się wspólną nazwą enzymu ekspandazy. Substratem, na który działa enzym ekspandaza, jest penicylina N, która po rozszerzeniu pierścienia i hydroksylacji, daje kwas deacetylocefalosporynowy (DAC). Następnie należy tylko odciąć boczny łańcuch (D)-a-aminoadipoilowy w celu otrzymania 7-ADAC, lecz ten boczny łańcuch jest uporczywie odporny na cięcie enzymatyczne, co daje niemożliwe do zaakceptowania niskie wydajności.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem możliwe jest osiągnięcie wydajnego procesu biotechnologicznego, w którym związek penicyliny (zawierający boczny łańcuch adipoilowy) jest wytwarzany w nowym procesie fermentacyjnym w dużych ilościach, gdzie niniejszy związek penicyliny jest przyjmowany jako substrat przez enzym ekspandazę, wytwarzany in situ przez ten sam mikroorganizm, który produkuje związek penicyliny i został poddany transformacji zapewniającej ekspresję wspomnianego enzymu ekspandazy. W wyniku tego enzym ekspandaza powoduje rozszerzenie pierścienia związku penicyliny do związku cefalosporyny z wysoką wydajnością.

Adipoil-7-ADCA wytwarzany in situ przez działanie enzymu ekspandazy na łańcuch boczny 3-metylowy (-CH3), podczas gdy 7-ACA, produkt końcowy, ma boczny łańcuch 3-acetyloksymetylowy [-CH2OC(O)CH3], W celu konwersji łańcucha bocznego 3-metylowego do

3-acetyloksymetylowego, zgodnie z niniejszym wynalazkiem, służą dwie następne aktywności enzymatyczne, również wyrażane in situ razem z aktywnością ekspandazy. Są to, w kolejności, hydroksylaza i acetylotransferaza, obie będące produktami ekspresji genów, którymi również stransformowano mikroorganizm wytwarzający związek penicyliny. Enzym hydorksylaza przeprowadza konwersję 3-metylowego łańcucha bocznego adipoil-7-ADCA do 3-hydroksymetylowego, a enzym acetylotransferaza przeprowadza konwersję tego 3-hydrolkymetylowego łańcucha bocznego do 3-acetyloksymetylowego łańcucha bocznego 7-ACA.

1, co jest najważniejsze w ostatnim krytycznym etapie sposobu niniejszego wynalazku, boczny łańcuch związku penicyliny, teraz związku cefalosporyny, jest usuwalny przez inny układ enzymatyczny z zaskakująco dużą wydajnością. Nieoczekiwanym wynikiem tego ujednoliconego, całkowitego procesu biotechnologicznego, który zawiera niniejszy wynalazek, jest wytwarzanie 7-ACA z nieoczekiwanie wysoką wydajnością i w sposób wystarczająco ekonomiczny, aby stanowiło to sensowną alternatywę dla obecnie stosowanych sposobów chemicznej i biochemicznej obróbki.

2. Krótki opis poprzednich sposobów.

Nowy proces biotechnologiczny niniejszego wynalazku dostarcza jedynego w swoim rodzaju i niezwykle wydajnego sposobu otrzymywania 7-ACA jako ekonomicznie istotnej alternatywy dla znanej obecnie syntezy chemicznej. Ponawianie wysiłków w sztuce, mających na celu wynalezienie takiego procesu biotechnologicznego, kończyło się ciągłym niepowodzeniem. Na przykład EP-A-O 422 790 opisuje DNA kodujący aktywność acylotransferazy izopenicylina N: acylo-CoA z Aspergillus nidulans i jego zastosowanie w wytwarzaniu użytecznych cefalosporyn w grzybach produkujących penicylinę, co było dotychczas nie znane. Jednak opisuje się to jako sposób rozerwania lub przemieszczenia genu acyltransferazy razem z dodatkowymi genami kodującymi enzymy epimerazę i ekspandazę, pochodzącymi z organizmów wytwarzających cefalosporynę; ponadto, do tej pory najwidoczniej nie otrzymano zadowalających wyników transformacji i ekspresji. Ponadto, gdyby transformacja zakończyła się sukcesem, nadal nie byłaby ona użyteczna dla celów niniejszego wynalazku, ponieważ pozostawałby problem jak usunąć boczny łańcuch D-a-aminodipoilowy. Ta nieudana próba mająca na celu uzyskanie znaczących wyników w przemysłowej produkcji związków pośrednich do wytwarzania cefalosporyn z kultur grzybów produkujących penicylinę pozostaje w całkowitym kontraście do wyników osiągniętych sposobem niniejszego wynalazku.

Pierwszym enzymatycznym etapem procesu biotechnologicznego w sposobie niniejszego wynalazku jest rozszerzenie pierścienia adipoil-6-APA, przeprowadzane przez enzym ekspandazę, będącego produktem ekspresji genu ekspandazy, którym stransformowano nierekombinowany szczep-gospodarz P. chrysogenum. Użycie tego enzymu ekspandazy wykorzystywano już poprzednio. Na przykład, Cantwell i wsp., w Curr Genet (1990) 17: 213-221, zaproponowali proces biotechnologiczny otrzymywania 7-ADCA przez rozszerzenie pierścienia penicyliny V, a następnie enzymatyczną hydrolizę powstałej deacetoksycefalosporyny V do formy 7-ADCA. Ta propozycja opierała się na dostępności sklonowanego genu ekspandazy penicyliny N (cefE) z S. clavuligerus: Kovacevic 1 wsp., J. Bactenol. (1989) 171: 754-760; i Ingolia 1 wsp. U.S. 5 070 020. Ponieważ ekspandaza działa na penicylinę N, swój naturalny substrat lecz nie działa na penicylinę V, więc propozycja ta wymaga zastosowania inżynierii genetycznej w celu wytworzenia zmodyfikowanego genu ekspandazy, który może rozszerzyć pierścień penicyliny V. Cantwell i wsp. jednakże nie wykonali tej wymaganej modyfikacji i osiągnęli sukces tylko w transformacji Penicyllium chrysogenum genem cef E ze Streptomyces clavuligerus i otrzymaniu niskiego poziomu ekspresji enzymu DAOCS (ekspandazy). Enzym ekspandaza został dokładnie przebadany, zarówno pod względem swojej aktywności jak i sekwencji genetycznej. Na przykład, w Wolfe U.S. 4 510 246 i 4 536 476, wyizolowano oddzielnie cyklazę, epimerazę

1712155 i enzymy rozszerzające pierścień z ekstraktów wolnych od komórek organizmów prokariotycznych wytwarzających związki β-laktamowe, obejmujących Strtept<^^ay<ces clavuligerus, w celu dostarczenia stabilnych odczynników enzymatycznych. Dotzlaf U.S. 5 082 772 (EP-A-O 366 354) opisuje wyizolowany i oczyszczony enzym ekspandazę z S. clavuligerus, którego charakterystyka obejmuje resztę końcową i skład aminokwasowy i którego masa cząsteczkowa wynosi około 34 600 daltonów. Jednakże pozostaje to w sprzeczności z ma.są cząsteczkową 29 000 przypisywaną białku, które wydaje się być tym samym enzymem w U.S. 4 536 476. EP-A-O 233 715 opisuje izolację i mapę restrykcyjną genu ekspandazy otrzymanego z S. clavuligerus i ekspresję rekombinowanego DNA kodującego ekspandazę (dającego aktywny enzym ekspandazę) w szczepie S. clavuligerus pozbawionym zdolności do produkcji cefalosporyny. Ingoliai wsp. U.S. 5 070 020 (EP-A-O 341 892) podaje sekwencję DNA kodującą enzym ekspandazę otrzymany z S. clavuligerus i opisuje transformację szczepu P. chrysogenum wektorem ekspresyjnym zawierającym niniejszą sekwencję DNA, co prowadzi do otrzymania ekspresji enzymu ekspandazy. Chociaż sugerowano, że ten enzym jest użyteczny do rozszerzania substratów innych niż penicylina N, to do tej pory nie zademonstrowano takiego rozszerzenia.

Opisana wyzej praca koncentruje się na enzymie ekspandazie pochodzącym z piORiuioiy^- cznego S. clavuligerus. Enzym ten najwidoczniej posiada taką samą aktywność rozszerzającą pierścień, jaka jest wytwarzana przez szczepy eukariotycznego Cephalosporium acremonium (dotyczy to również Acremonium chrysogenum). Jednakże w tych szczepach aktywność ekspandazy jest kodowana przez bifunkcjonalny gen (cefEF), który również koduje aktywność DACS (hydroksylazy), której naturalnąfunkcjąjest konwersja produktu kwasu dezacetoksycefalosporynowego (DaOC), otrzymanego przy udziale enzymu ekspandazy do deacetylo-cefalosporyny C (DAC). Wynikiem tej ekspresji jest pojedynczy, lecz bifunkcjonalny enzym ekspandaza/hydrolaza. Chociaż podejmowano wysiłki mające na celu rozdzielenie aktywności tych dwóch produktów genu, żaden z nich nie zakończył się sukcesem. Na przykład, EP-A-O 281 391 opisuje izolację i identyfikacje sekwencji DNA genu DAOCS/DACS otrzymanego z C. acremonium ATCC 11550 razem z odpowiadającą sekwencją aminokwasową tego enzymu. Chociaż stransformowano Penicillium i uzyskano ekspresję tego enzymu, jednakże nigdy nie przeprowadzono konwersji penicylin G i V do odpowiednich cefalosporyn.

Ponadto, pomimo sugestii, że techniki inżynierii genetycznej dostarczają gotowych sposobów do rozdzielenia informacji genetycznej kodującej DAOCS od DACS i ich oddzielnej ekspresji, to dotychczas nie przeprowadzono demonstracji takiego rozdzielania.

Enzym DAOCS/DACS (ekspandaza/hydroksylaza) z C. acremonium jest również dobrze· poznany, zarówno pod względem jego aktywności jak i cech charakterystycznych i sekwencji genetycznej. Na przykład, w Demain U.S. 4 178 210; 4 248 966 i 4 307 192 różne wyjściowe materiały traktowano ekstraktem komórkowym z C. acremonium, który epimeryzował i rozszerzał pierścień dając jako produkt antybiotyk cefalosporynowy. Wu-Kuang Yeh U.S. 4 753 881 opisuje enzym C. acremonium pod względem jego punktu izoolektrycznego, mas cząsteczkowych, reszt aminokwasowych, stosunku aktywności hydroksylazy do ekspandazy i fragmentów peptydowych. Enzym acetylotransferaza z C. acremonium jest również opisany, pod względem jego aktywności, cech charakterystycznych, mapy restrykcyjnej i sekwencji nukleotydowej i aminokwasowej. Na przykład, patrz EP-A-O 437 378 i EP-A-O 450 758.

Poprzednio dyskutowane zagadnienia dotyczą tylko pojedynczego aspektu niniejszego wynalazku, to znaczy transformacji szczepu P. chrysogenum genami kodującymi enzymy ekspandazę i ekspandazę/hydroksyiazę i uzyskiwaniem ekspresji tych enzymów. W wynalazkach tych jednakże używa się wytwarzanych enzymów tylko do rozszerzania pierścienia penicyliny N, a nie penicylin G i V. Nawet w tym przypadku, penicylina N ma w pozycji 7 boczny łańcuch, którego nie można enzymatycznie przeciąć w celu pozostawienia wolnej grupy aminowej. Niniejszy wynalazek opiera się na zaskakującym odkryciu, że boczny łańcuch adipoilowy może być wydajnie dodawany przez szczep P. chrysogenum, to znaczy że enzym ekspandaza, wytwarzany in situ, może wydajnie używać tego związku jako substratu do rozszerzania pierścienia do adipoil- 7 - ADCA i że enzymy hydroksylaza i acetylotransforaza również wytwarzane in situ mogą używać adipoil-7-ADCA jako substratu do produkcji boczne172 155 go łańcucha 3-acetoksymetylowego z 7-ACA i że zatem boczny łańcuch adipoilowy może być wydajnie usuwany przez jeszcze inny enzym, dając 7-ACA. Mimo że różne izolowane fragmenty ninieiszego wynalazku można spotkać w poprzednich wynalankach, ło dotyzhczas nie było

V* * XXXV v v >Aą »«v>crr/-ł ranilinłv Atrrzmnttć» cnnanntm m«im_

OUgUdlil, ζ,ν ujv vuv xc£V'X>v/uv vxixjciv ιπνυνΔνΛΐ vr unv iv/ZjU.iŁtłŁjf , uli^jinunv ορυονύνιη imiie-jszego wynalazku.

Na przykład, produkcja kwasu 6-adipoilo penicylanowego była znana; patrz Ballio, A. i wsp.; Nature (1960) 185,97-99. Enzymatyczne rozszerzenie kwasu 6-adipoilo penicylanowego, lecz tylko w oparciu o metody in vitro, jest również znane; patrz Baldwin i wsp., Tetrahedrom (1987) 43, 3009-3014; i EP-A-O 268 343. I, enzymatyczne odciecie bocznych łańcuchów adipoilowych jest również znane; patrz na przykład, Matsuda i wsp., J. Bact. (1987) 169, 5815-5820.

Boczny łańcuch adipoilowy ma następującą strukturę: COOH-(CH2)4-CO-, podczas gdy dwa boczne łańcuchy są bardzo zbliżone swoją strukturą do glutarylu i posiadają następujący wzór; COOH-(CH₂)3-CO- i do (D)-a-aminoadipoilowego o wzorze: cOoH-CH(NH2)3-cO-. Enzymatyczne cięcie bocznych łańcuchów glutaylowych jest znane w sztuce. Patrz, na przykład, Snibuya i wsp., Agric. Biol. Chem. (1981) 45, 1561-1567, i U.S. 3 960 662; Matsuda i Komatsu, J. Bact. (1985) 163,1222-1228; Matsuda i wsp., J. Bact. (1987) 169, 5815-5820; Jap. 53-086084 (1978 - Banyu Pharmaceutical Co. Ltd.); i Jap. 52-128293 (1977 - Banyu Pharmaceutical Co. Ltd.). Również EPA-A-O 453 048 opisuje metody podniesienia aktywności odcinania łańcucha adipoilowego acylazy glutarylowej wytwarzanej przez Pseudomonas SY-77-1. Po podstawieniu różnych aminokwasów w pewnych pozycjach podjednostki alfa obserwuje się od trzech do pięciu razy wyzsze tempo odcinania łańcucha adipoilowego (z adipoilo-seryny). Należy odnotować, że chociaż EP-A-O 453 048 jasno przedstawia acylazę z podniesioną aktywnością w stosunku do bocznych łańcuchów adipoilowych, to nie opisano żadnych sposobów (zarówno chemicznych jak i biotechnologicznych w jakikolwiek sposób analogicznych do opisanych w bieżącym doniesieniu), w których adipoilo-cefalosporynę można wytwarzać na pierwszym miejscu.

Tam, gdzie przedstawia się łańcuch boczny (D)-a-aminoadipoilowy, jest znane najpierw enzymatyczne usuwanie grupy aminowej i skracanie łańcucha bocznego za pomocą oksydazy (D)-aminokwasów, pozostawiające boczny łańcuch glutaylowy (GL-7) z usunięciem bocznego łańcucha glutarylowego przez drugi enzym (acylazę glutarylową). To dwuetapowe cięcie opisano w Matsuda U.S. 3 960 662; EP-A-O 275 901; Jap. 61-218057 (1988 - Komatsu, Asahi Chemical Industry Co.); WO 90/12110 (1990 - Wong, Biopure Corp.); i EP-A-0 436 355, Isogai i wsp., również Bio/Technology (1991) 9,188-191.

Jest również znane przeprowadzenie jednoetapowego cięcia bocznego łańcucha (D)-aaminoadipoilowego, zwłaszcza przy użyciu technik rekombinacji. Patrz, na przykład: Jednoetapowe cięcie łańcucha bocznego (D)-a-aminoadipoilowego:

- Jap. 53-94093 (Meiji, Pseudomonas sp. BN-188);

- Jap. 52-143289 (= US 4 141 790, Meiji, Aspergillus sp.);

- US 4 774 179 (Asahi 1988, Pseudomonas sp. SE-83 i Se-495), = Jap. 61-21097 i Jap. 61-152286;

- Fr. Pat. 2 241 557 (Aries 1975. Bacillus cereus var. fluorescens);

- Jap. 52-082791 (Toyo Jozo 1977, Bacillus megaterium NRRL B 5385);

- EP-A-0 321 849 (Hoechst, Pseudomonas, Bacillus subtilis, transpeptydaza T-glutamylu;

- EP-A-0 322 032, EP-A-0 405 846, i U.S. 5 104 800 (Merck, Bacillus megaterium);

- EP-A-O 283 218 i U.S. 4 981 789 (Merck, Arthrobacter viscosus);

Jednoetapowa rekombinacja: Ceph C - 7-ACA:

- Jap. 60-110292 (Asahi 1985, Comamonas, rekombinowana E. coli z genem z Comamonas sp. SY-77-1, jednoetapowa konwersja);

- Jap - 61-152-286 (Asahi 1986, Pseudomonas rekombinowana E - coii z genem z Pseudomonas sp. SE83, sekwencje genetyczne opisane i zgłoszone, jednoetapowa metoda zgłoszona w U.S. 4 774 179);

- Jap. 63-74488 (Asahi 1988, Trigonopsis variabilis, Comamonas, prekombinznaną E. coli, niosąca konstrukt, warunkujący ekspresję oksydazy D-aminokwasu i acylazy GL-7-ACA).

- RP-A-O 475 652 (Fujisawa, acylaza cofalzsporyry C i jej produkcja na Οι^Ο^ technologii rekombinacyjnej).

Różne aspekty sposobów produkcji 7-ADAC są znane w sztuce. Na przykład, patrz U.S. 3 304 236 i 3 972 774 (Eli Lilly & Co.); EP-A-O 454 478 (Shionogi & Co., Ltd.); i opublikowane zgłoszenie japońskie 04 53,499 (Shionogi & Co., Ltd.).

Referencje do rozpattywanych zgłoszeń

Referencję sporządzono do rozpatrywanego zgłoszenia numer serii 07/933, 469. zgłoszonego 28 sierpnia, 1992 (numer sprawy rzecznika 18532IA), które opisuje proces biotechnologiczny przygotowania 7-ADCA, polegający na ekspresji enzymu ekspandazy w str;ar.s^rzrmowarym szczepie P. chrysogenum w ten sam sposób jak w procesie biotechnologicznym przygotowania 7-ADAC i 7-ACA opisanym tutaj. Jednakże w niniejszym procesie biotechnologicznym zastosowano dodatkowe transformacje do uzyskania ekspresji dodatkowych aktywności enzymatycznych w celu uzyskania całkowicie różnego szlaku metabolicznego, uzyskanego na drodze rekombinacji, w celu rozróżnienia końcowych produktów, z których żadnego me sugerowano w równolegle rozpatrywanym zgłoszeniu.

W celu osiągnięcia lepszego zrozumienia sposobu niniejszego wynalazku i poznania referencji dotyczących wynalazków dyskutowanych powyżej, zaprezentowano poniżej różne etapy szlaków metabolicznych prowadzące do adipoilo^-APA, adipoiioA-ADCA, adipoilo^-ACA i 7-ACA, produkty pośrednie i enzymy, które biorą udział w przeprowadzaniu transformacji.

Kwas L-alfa-aminoadypinowy +

L-alpha-aninoadipic acid +

L-Cysteina + L-Walina

L-cysteine + L-valine

Synteza ACV

ACV SYNTHETASE

Syntetaza izopenicyliny N

ISOPENICILLIN N SYNTHETASE (IFNS) /IPN3/

ISOPENICILLIN N (IPN) /IPN/

Amidoliaza IPN IPN AMTDOLYASE

172 155

Acylotiαΰώίέι sza Acylu CoA ;ó-APA

ACYL'CoA 6-APA

ACYLTRANSFERASE

Fenyloacetylo CoA

PHENYLACETYL CoA

CL)

Penicilina G nrn,TT^^{TT T T}V

O H

HDOCv. || |

H,N

O

Izopenlcylina N

ISOPENICILLIN N (IPN) /IPN/

NCH₃ % COOH

Izopenlcylina N

ISOPENICILLIN N (IPN) / IPN/

Epimeraza IPN

IPN EPIMERASE

Fenyloacetylo CoA

PHENYLACETYL CoA

Penicylina N

PENICILLIN N

Ekspandaza Penicyliny N

PENICILLIN N

EXPANDASE

172 155

DESACETOXYCEPHALOSPORANIĆ ACID (DAOC)

3*-Hydroksylaza DAOC

DAOC 3' -HIDROXYLASE

Kwas Dezacetoksycefalosporynowy /DAC/

DESACETOXYCEPHALOSPORANIĆ

ACID (DAC)

Acetylotransferaza DAC

DAC ACETYLTRANSFERASE

172 155

CEPHAUO5PORIN C

Streszczenie wynalazku.

Niniejszy wynalazek dotyczy nowego procesu biotechnologicznego wytwarzania kwasu 7-aminodeacetylocefalo-sporynowego (7-ADAC), obejmującego etapy

1) utrzymywanie szczepu Penicillium chrysogenum w podłożu hodowli zdolnym do podtrzymywania jego wzrostu, który produkuje izopenicylinę N i dodawanie do wspomnianego podłoża hodowli roztworu adypinianu wzbogacającego podłoże, zawierającego jeden lub więcej z następujących składników: kwas adipowy lub jego sole i estry, które mogą być asymilowane i użytkowane przez wspomniany szczep Penicillium chrysogenum do produkcji kwasu adipoilo-6-aminopenicylanowego(adipoilo-6-APA), gdzie wytwarza się niniejszy adipoilo-6-APA;

2) wykonanie następujących konwersji enzymatycznych przez konwersję in situ odpowiedniego genu:

a) adipoilo-6-APA poddaje się in situ rozszerzaniu pierścienia w celu wytworzenia kwasu adipoilo-7-aminodezacetoksycefalosporynowego (adipoilo-7-ADCA) przez enzym ekspandazę, w którym niniejszy szczep P. chrysogenum stransformowano DNA kodującym aktywność enzymu ekspandazy, zdolnego do użycia niniejszego adipoilo-6-APA jako substratu, po czym jako wynik tej ekspresji niniejszy szczep wytwarza adipoilo-6-APA, który jest również później poddawany in situ rozszerzaniu pierścienia w celu utworzenia adipoilo-7-ADCA;

b) boczny łańcuch 3-metylowy adipoilo-7-ADCA jest hydroksylowany in situ w celu wytworzenia kwasu adipoilo-7-aminodeacetylocefalosporynowego, gdzie niniejszy szczep P. chrysogenum stransformowano DNA kodującym aktywność enzymu hydroksylazy, zdolnego do użycia niniejszego adipoiio-7-ADCA jako substratu, po czym jako wynik tej ekspresji powstaje adipoilo-7-ADCA wytwarzany przez niniejszy szczep, który potem poddaje się również hydroksylacji in situ w celu wytworzenia adipoilo-7-ADAC; i

3) umożliwienie kontaktu niniejszego adipoilo-7-ADAC z adipoiloamidazą, w wyniku którego następuje usunięcie bocznego łańcucha adipoilowego i powstaje produkt 7-ADAC; niniejszy produkt poddaje się izolacji.

Niniejszy wynalazek dotyczy następnie nowego procesu biotechnologicznego otrzymy wania kwasu 7-aminocefalosporynowego (7-ACA), obejmującego etapy:

1) utrzymywanie w podłożu hodowlanym zdolnym do podtrzymywania wzrostu szczepu Penicillium chrysogenum, który wytwarza izopenicylinę N i dodawanie do niniejszego podłoża hodowlanego roztworu adypinianu wzbogacającego podłoże, zawierające jeden lub więcej z następujących składników: kwas adipowy lub jego sole i estry, które mogą być asymilowane i używane przez niniejszy szczep Penicillium chrysogenum do wytwarzania kwasu adipoilo-6aminopenicylanowego (adipoilo-6-APA), wytwarzając w ten sposób niniejszy adipoilo-6-APA;

2) przeprowadzenie następujących konwersji enzymatycznych przez ekspresję in situ odpowiedniego genu:

a) adipoilo-6-ΑΡΑ poddaje sięrozszerzznίopierśjientainsitu w cehi wytworzenίa kwnsu adipoilo-7-aminodezacetoksycefalosporynowego (adipoilo-7-ADCA) przez enzym ekspandazę, w którym niniejszy szczep P. chrysogenum stransfomlowano DNA kodującym aktywność

172 155 enzymu ekspandazy, zdolnego do użycia adipoilo-6-APA jako substratu, później jako wynik tej ekspresji adipoilo-6-APA jest wytwarzany przez niniejszy szczep, a następnie poddawany in situ rozszerzaniu pierścienia w celu wytworzenia adipoilo-7-ADCA;

I uch 3-met^rlAwv adintoiin_7_-ADCA ject hydr^kcylnwany in situ w celu lUil ilissij IV 11 J f Λ a a il j Ul V»1VLJJ Ił «11 j Λ·.* ’’ ww.v.

b\ Κλαίπι t łori/·»· 1 l/VV4Uy 1'.....

wytworzenia kwasu adipoilo-7-aminodeacetylocefalosporynowego, gdzie niniejszy szczep P. chrysogenum stransformowane DNA kodującym aktywność enzymu hydroksylazy, zdolnego do użycia niniejszego adipoilo-7-ADCA jako substratu, po czym jako wynik tej ekspresji powstaje adipoilo-7-ADCA wytwarzany przez niniejszy szczep, który potem poddaje się również hydroksylacji in situ w celu wytworzenia adipoilo-7-ADAC; i

c) adipoilo-7-ADAC poddaje się acetylacji in situ w celu otrzymania kwasu adipoilo-7aminocefalosporynowego (adipoilo-7-ACA) przez enzym acetylotransferazę, gdzie niniejszy szczep P. chrysogenum transformowano DNA kodującym aktywność enzymu acetylotransferazy, zdolnego do użycia niniejszego adipoilo-7-ADAC jako substratu, a później jako wynik tej ekspresji niniejszy szczep wytwarzał adipoilo-7-ADAC, który następnie poddawano acetylacji in situ w celu wytworzenia adipoilo-7-ACA; i

3) umożliwienie onnίakίu uiitiejnzngó adipoildi7-ABAC z adipoadiid<aą, wwyniku którego następuje usunięcie bocznego łańcucha adipoilowego i powstaje produkt 7-CDCC; niniejszy produkt poddaje się izolacji.

Znaczenia używanych tutaj terminów są następujące:

7-ACA oznacza kwas 3-[(acetyloksy)-metylo]-7-awino-8-ekso-5-tia-1-apabicyklo[4.2.0]okt2-ene-2-karboksylowy;

adipono^-APA oznacza kwas [2S-(2a, 5α, 6 β ]-3,3-dwuwetylo-7-okso-6-[heksano1,6-diol)amino]-4-tia-1-apabicyklo[3.2.0]he7tane-2-karboksylowy·;

adipono^-ADCA oznacza kwas 3-moty]e-7-[(heksano-1,6--diol)arwino]-3-metylo-8-okso5-tia-1-azabicyklo[4.2.0]okt-2-eno-2-karboksylouy; i adiipoio-7-ADAC oznacza kwas 3-motylo-7-[(heksano-1,6-diol)amino]-3-wetylo-8-okso5-tia-1 -azabicyk.lo[4.2.0|okt-2-eno-2-karboksylowy.

W szczególności niniejszy wynalazek dotyczy nowego procesu biotechnologicpnoge otrzymywania kwasu 7-aminodeacetylocefalosporynowego (7-aDaC) i kwasu 7-aminocefalesporanowcgo, wymienionych powyżej, w których roztwór wzbogacający podłoże jest solą dwusodową adypinianu, w których wszystkie DNA, tzn. kodujący aktywność enzymu ekspandazy, enzymu hydrolazy i enzymu acetylotransferazy pochodzą z Cefalosporium acremonium i w których acylaza adypoilowa pochodzi z gatunków Pseudomonas.

W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się rekombinowane wektory ekspresyjne zawierające DNA kodujący aktywność enzymów ekspandazy, hydroksylazy i acetylotransferap.γ pochodzący z Cephalosporiuw acremonium i promotory, które kierują ekspresją genów kodujących wymienione enzymy, które stanowią plazmidy pPEN/CEPH-1, pPeNcaCt i pTS-8, jak opisane poniżej.

W sposobie według wynalazku stosuje się komórki gospodarza Penicilium chrysogenum stransformowane wektorami ekspresyjnymi niosącymi DNA kodujący aktywność enzymów ekspandazy, hydroksylazy i acetylotransferapy, korzystnie pochodzący z Cephalosporium acrewoniuw i promotor, który kieruje ekspresją tego DNA kodującego enzym, stanówmy promotor genu IPNS z Penicilium chrysogenum. Szczególnie korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się komórki gospodarza Penicillium chrysogenum, stransformowane wektorami ekspresyjnymi stanowiącymi plazmidy pPEN/CEPH-1, pPenCACT i pTS-8, jak opisane poniżej.

Szczegółowy opis wynalazku.

Wynalazek dotyczy nowego biotechnologicznego sposobu wytwarzania kwasu 7-aminocefalosporanowego (7-ACA) i kwasu 7-aminodezacetylocefalosporanowego (7-ADAC), kluczowych związków pośrednich w otrzymywaniu syntetycznych handlowych cefalosporyn, o następujących wzorach strukturalnych:

172 155

Η,ΝΑ—κτ Λ.

Η,Νch₃ COOH

Α 'X \ ) γ ch₂oh COOH

Poza jądrem cefalosporynowym czynnikami odróżniającymi 7-ACA są grupa 7-aminowa i grupa S-acetyloksymetylowa (lub 3-acetoksymetylona, jak jest to częściej spotykane). Grupa 7-aminowa jest jedną z takich grup, które mogą być poddane konwersji do każdej liczby pochodnych bocznych łańcuchów i te formy są podstawą do syntetyzowania różnych handlowych cefalosporyn. Grupa 3-acetyloksymetylowa będzie często poddawana konwersji do kilku pewnego innego bocznego łańcucha w celu psyntotyzowania handlowej cefalosporyny.

Końcowy produkt 7-ACA i produkt pośredni adipoilo-7-ACA w sposobie niniejszego wynalazku mogą być przeciwstawione cefalosporynie C, innemu pośreOniomy związkowi kluczowemu cefalosporyny o następującym wzorze strukturalnym:

W tym związku pośrednim boczny łańcuch 7-(D)-α-ammoa0ipoilowy nie może być użyty do dalszej syntezy pochodnych i trzeba go odciąć w celu otrzymania grupy 7-aminowoj, której można użyć do syntezy. Niestety, boczny łańcuch 7-(D)-a-aminoadipoilowy często okazuje się trudny do usunięcia, czy to za pomocą chemicznych czy biochemicznych metod.

Definicjo.

Zgodnie z użyciom w bieżącym spisie, a w szczególności w części zatytułowanej Opis Najkorzystniejszych Worsji Wynalazku” następująco terminy mają podano niżej znaczenia:

7-ACA Kwas 7-amiensefaissporynnwy

7-ADAC Kwas 7^ia^si^c^c^¢^ia'^it^-l^c^^^i^ai<z:s{^tp^r/-^ΊC^^Λn}7-ADCA Kwas 7-aminoOopacotoksycofalosporyrowy

6-APA Kwas ó-aminopenicyamowy

DAOC Kwas deeaset.opayoefalnsooaynpwy

DAOCS S^^ntt^t^a DAOC

DAC Deacclylocenaiosporyna C

DACS Synazaa DAC

IPNS Synteaza izopenicyiirly N

Tris T ris [hydroksymetylo] aminometan

EDTA Kwas t?tytenodwuaminoczterooctowy

DEPC Dwue-ylopirowęgian

TE Bufor Tris/EDTA

SSC Buffo sól lcclooeo sooo), cctryn^^a n ooo

SDS Sól sodowa sńarczanu dodecyfu

PEG Glikol polietylenowy

Hodowla Penicillium chrysogenum.

Pierwszy etap sposobu niniejszego wynalazku obejmuje otap hodowli w podłożu zdolnym do podtrzymania wzrostu szczepu Penicillium chrysogonym, który wytwarza izoponicylinę N i dodawania do niniejszego podłoża hodowlanego roztworu adnpininnu wzbogacającego podłoże, zawierającego jeden lub więcej następujących składników: kwas adnpirony lyb jogo solo i ostry,

172 155 które mogą być asymilowane i wykorzystywane przez mniejszy szczep Penicillium chrysogenum do wytwarzania adipoilo-6-APA. Roztworu adypinianu wzbogacającego podłoże można dodawać do podłoża hodowlanego po zaszczepieniu go P. chrysogenum, lecz lepiej jest, jeżeli jest on obecny w podłożu hodowlanym już w momencie szczepienia.

Zarówno inne rodzaje niż Penicillium, na przykład, Aspergillus nidulans, jak i inne gatunki rodzaju Penicillium, oprócz gatunku chrysogenum, wytwarzają izopenicylinę N. Jednakże, historycznie wszystkie wysokoprodukcyjne szczepy wytwarzające izopenicylinę N otrzymano za pomocą powszechnie znanych technik przez doskonalenie gatunku chrysogenum. Jako zagadnienie praktyczne, niniejszy wynalazek ograniczono do szczepów Penicillium chrysogL'num, chociaż jego zastosowanie do innych gatunków jest oczywiste. Każdy zdeponowany szczep Penicillium chrysogenum lub inne powszechnie dostępne źródło tego szczepu jest odpowiednie jako punkt wyjściowy do zastosowania sposobu niniejszego wynalazku.

Podłoże hodowlane podtrzymujące wzrost szczepu Penicillium chrysogenum, który wytwarza izopenicylinę N jest tego typu podłożem, z którym zaznajomiona jest każda osoba posiadająca podstawowe umiejętności w tej dziedzinie. Na przykład, hodowle można przeprowadzać metodą płynnej fermentacji tlenowej i używane podłoże można wybierać spośród dużej ilości odpowiednich dostępnych podłoży. Typowe podłoże zawiera źródła węgla takie jak sacharozę, glukozę i skrobię; źródła azotu takie jak mąkę sojową i łuszczony owies, olej z nasion bawełny, mąkę z orzechów ziemnych i różne aminokwasy zmieszane razem oraz peptony. Produkcja wymaga dużej wydajności i łatwej izolacji, toteż najkorzystniejszymi podłożami w tych sytuacjach są melasa jako źródło węgla oraz mąka sojowa i aminokwasy jako źródło azotu.

Powszechnie do podłoża hodowlanego dodaje się jako składników odżywczych soli nieorganicznych, które obejmują sole dostarczające następujących składników jonowych: jonów sodowych, potasowych, amonowych, wapniowych, fosforanowych, siarczanowych, chlorkowych, bromkowych, azotowych, węglanowych, żelazowych, żelazawych, magnezowych, manganowych, i tak dalej. Również elementy śladowe są zwykle ważna dla wzrostu, rozwoju i metabolizmu Penicillium chrysogenum i mogą być dodawane bezpośrednio do podłoża hodowlanego, o ile nie zostały już one dostarczone jako zanieczyszczenia, szczególnie z innymi składnikami podłoża hodowlanego.

Szczepy Penicillium chrysogenum można hodować używając sprzętu o małej pojemności, takiego jak 1-litrowe kolby do wytrząsania, jeżeli wymagane jest otrzymywanie tylko małych ilości adipoilo-7-ACA i ewentualnie 7-ACA. Jednakże, jeżeli wymagane są większe ilości adipoilo-7-ACA, należy używać fermentorów do dużej skali w warunkach płynnej fermentacji tlenowej.

W przeprowadzaniu preparatyki adipoilo-7-ACA na dużą skalę, zarodniki szczepu Penicillium chrysogenum utrzymuje się na skosach agarowych. Zarodników ze skosu używa się do zaszczepienia małej objętości podłoża wegetatywnego. Podłoże wegetatywne inkubuje się w celu otrzymania gęstej świeżej, aktywnie rosnącej hodowli mikroorganizmów. Tej wegetatywnej hodowli używa się następnie do zaszczepienia podłoża fermentacyjnego na dużą skalę. W niektórych przypadkach może być wymagane jeszcze następne podłoże wegetatywne do zaszczepienia podłoża fermentacyjnego. Zwykle używa się tego drugiego stadium wegetatywnego wzrostu, kiedy objętość podłoża fermentacyjnego jest znacznie większa niż pierwszego podłoża wegetatywnego. W ten sposób zarodniki mikroorganizmu hoduje się najpierw w małej objętości podłoża wegetatywnego w celu otrzymania materiału do zaszczepienia podłoża wegetatywnego o większej objętości. Następnie podłoże wegetatywne o większej objt^i^t^ości dostarcza wystaczającego stężenia mikroorganizmu do zapoczątkowania szybkiego startu fermentacji w fermentorze do dużej skali. Podłoże wegetatywne może mieć taki sam skład jak podłoże fermentacyjne lub może zawierać dodatkowe składniki, pobudzające wzrost i rozwój mikroorganizmu na małą skalę.

Szczepy Penicillium chrysogenum używane w metodzie niniejszego wynalazku najbardziej efektywnie hoduje się w temperaturach między około 20° i 30°C, ale optymalne wydajności otrzyma się, gdy temperatura jest między około 22° i 28°C, najbardziej korzystnie około 25°C.

Maksymalne wytwarzanie adipoilo-7-ACA zachodzi, gdy szczep Penicillium chrysogenum jest hodowany w fermentorach na dużą skalę przez okres między około 10 i 30 dni, najkorzystniej 15 do 25 dni. Jednakże, gdy hodowlę prowadzi się w urządzeniach na małą skalę, takich jak 250 ^al kolby do wytrząsania, wzrost ^mikroorganizmu jest szybszy i wytwarza on adipoilo-7-ACA w krótszym czasie, na przykład, 4 do 15 dni, najczęściej 5 do 7 dni.

Jeżeli końcowe pH w fermentorach do dużej skali osiągnie 8,0 lub więcej, wydajność otrzymywania adipoilo-7-ACA może być znacznie obniżona. W tych sytuacjach wymagane jest monitorowanie p podłoża hodowlanego podczas trwania fermentacji. Jeżeli wydaje się, że pH będzie osiągało te poziomy przed czasem zachodzenia maksymalnego wytwarzania adipoilo-7ACA, można w dogodny sposób obniżać pH przez dodawanie odpowiedniego kwasu lub czynnika buforującego do podłoża fermentacyjnego.

Wytwarzany adipoilo-7-ACA można następnie sprawdzać testując chromatograficznie próbki podłoża fermentacyjnego.

Jak w przypadku większości płynnych fermentacji tlenowych, przez podłoże hodowlane przepuszcza się sterylne powietrze w celu otrzymania bardziej wydajnego wzrostu szczepu Penicillium chrysogenum i zwiększenia wytwarzania adipoilo-7-ACA. Objętość powietrza przepuszczanego przez podłoże hodowlane wynosi zwykle przynajmniej około 0,2 objętości powietrza na minutę na objętość podłoża hodowlanego. Jednakże, zwiększone tempo przepływu powietrza może często mieć dodatni wpływ na wytwarzanie adipoilo-7-ACA.

Typowo szczep Penicillium chrysogenum będzie wytwarzał, obok adipoilo-7-ACA, wiele produktów ubocznych i metabolitów. J^:żeH niektóre z nich są niestabilne w środowisku kwaśnym to koniecznejest w celu odzyskania adipoilo-7-ACA z podłoża fermentacyjnego, doprowadzenie całej pożywki fermentacyjnej do kwaśnego pH na krótki czas, aby zniszczyć niektóre równocześnie wytwarzane zanieczyszczenia. Produkt fermentacji adipoilo-7-ACA uzyskuje się z przefiltrowanej w ten sposób pożywki lub alternatywnie można oddzielić go od innych składników podłoża fermentacyjnego na drodze chromatograficznego przepuszczania przez żywicę jonowymienną i można go dalej oczyszczać chromatograficznie, jeżeli jest to konieczne przed następnym etapem enzymatycznego odcięcia bocznego łańcucha adipo. Można również przeprowadzić ten rozdział za pomocą chromatografii jonowymiennej po odcięciu łańcucha bocznego. Jednym z głównych produktów ubocznych, które sprawiają trudności podczas rozdziału, jest adipoilo-6-APA, i możliwe jest chemiczne lub enzymatyczne zdegradowanie tego produktu ubocznego w celu ułatwienia rozdziału. Najpierw przefiltrowaną pożywkę filtracyjną poddaje się pierwszej procedurze oczyszczającej, która może obejmować początkową ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym nie mieszającym się z wodą, takim jak n-butanol lub octan amylu, przeprowadzaną w celu usunięcia zanieczyszczeń. Taką wyekstrachowaną pożywkę można następnie oczyszczać w zgrubny sposób na drodze chromatografii na aktywowanym węglu.

Dodawanie roztworu adypinianu wzbogacającego podłoże.

Najkorzystniej hodowlę fermentacyjną Penicillium chrysogenum zakłada się jak opisano wyżej, to znaczy przed zaszczepieniem dodaje się roztworu adypinianu wzbogacającego podłoże do innych składników fermentacyjnego podłoża hodowlanego. .Fakultatywnie- roztworu adypinianu wzbogacającego podłoże można dodawać po pewnym czasie od zaszczepienia, na przykład po 1,2 i/lub 3 dni po zaszczepieniu. Roztwór adypinianu wzbogacającego podłoże definiuje się jako złożony z jednego lub więcej następujących składników: kwasu adypinowego lub soli albo estrów kwasu adypinowego, które mogą być asymilowane i wykorzystywane przez hodowany szczep Penicillium chrysogenum do wytwarzania adipoilo-6-APA. Kwasu adypinowego, soli i estrów można używać pojedynczo lub w każdej kombinacji. Preferowana jest sól dwusodowa, chociaż sole potasowe lub zmieszane z sodem mogą być również odpowiednie. Można używać estru metylowego, ale ester etylowy jest nierozpuszczalny w wodzie. Sól lub ester kwasu adypinowego musi występować w takiej formie, która może być asymilowana i wykorzystywana przez szczep Penicillium chrysogenum do wytwarzania adipoilo-6-APA. Na przykład, sam kwas adypinowy może być odpowiedni, chociaż jest on nierozpuszczalny w wodzie, jeżeli w odpowiednich warunkach pH powstaje sól, która może być asymilowana.

172 155

Odpowiednie enzymy ekspandaza i/lub hydroksylaza.

Hodowany szczep Penicillium chrysogenum, któremu dostarcza się roztworu adypinianu wzbogacającego podłoże jak opisano wyżej, aby wytwarzał adipoilo-6-APA, można również transformować DNA kodującym aktywność enzymów ekspandazy i hydroksylazy i w wyniku ekspresji tego DNA następuje in situ rozszerzenie pierścienia adipoiło-6-APA i powstaje adipoilo-7-ADCA oraz również zachodzi konwersja bocznego łańcucha 3-metyłowego do 3 -hydrok sy me ty Iow ego.

Adipoilo-6-APA jest wytwarzany wewnątrzkomórkowe przez hodowany Penicillium chrysogenum z dodatkiem roztworu adypinianu wzbogacającego podłoże. Wewnątrzkomórkowo, to znaczy in situ, .stransformowany Penicillium chrysogenum również wykazuje ekspresję DNA kodującego aktywność enzymów ekspandazy i hydroksylazy, w wyniku czego enzymy te działają na substrat adipoilo-6-APA i rozszerzają jego pierścień tworząc adipoilo-7-ADCA, który następnie ulega hydroksylacji do adipoiio-7-ADAC (kwas adipoilo-7-aminodeacetylocefalosporynowy).

Nowy proces biotechnologiczny niniejszego wynalazku zawiera w swoim zakresie transllium chrysogenum typu opisanego wyżej każdym dna kodującym aktywność enzymów ekspandazy i hydroksylazy, w wyniku ekspresji których następuje in situ rozszerzenie pierścienia adipoilo-6-APA z wytworzeniem adipoilo-7-ADCA, który jest następnie hydroksylowany do adipoilo-7-ADAC. Zatem, DNA którym transformuje się Penicillium chrysogenum musi kodować enzymy posiadające nie tylko aktywność enzymu ekspandazy jak rozumie się to w sztuce, to znaczy zdolność do rozszerzania pierścienia izopenicyliny N do DAOC, lecz zdolność rozszerzania pierścienia adipoilo-6-APA do adipoilo-7-ADCA. Dodatkowo, enzym hydroksylaza musi mieć zdolność hydroksylowania adipoilo-7-ADCA do adipoilo7-ADAC.

fArr

.....

Ρ^·. Ό,_____ .

u. x umm

Rozważa się dwa alternatywne podejścia odpowiednich wykonań w zakresie niniejszego wynalazku z uwzględnieniem sposobu, który dostarcza aktywności enzymu ekspandazy i hydroksylazy. W jednym z przykładów wykonania, który jest preferowany, funkcje ekspandazy i hydroksylazy osiągnięto przez ekspresję aktywności pojedynczego, choć zasadniczo dwufunkcyjnego, genu Cephalosporium acremonium, którym stransformowano P. chrysogenum. Ten gen, który koduje jednocześnie aktywności ekspandazy i hydroksylazy, moze być opisany jako gen ekspandazy/hydroksylazy, ponieważ produktem tego genu jest enzym(-y) ekspandaza/hydroksylaza. Typowo, kiedy P. chrysogenum stransformowano dNa z C. aremonium, kodującym aktywność ekspandazy/hydroksylazy, ekspresja tej aktywności mogła być pod kontrolą pojedynczej sekwencji promotorowej, co wskazywało na obecność pojedynczego genu.

Alternatywny sposób wykonania niniejszego wynalazku, który jest równie odpowiedni, polega na transformowaniu gospodarza P. chrysogenum DNA kodującym aktywności ekspandazy i hydroksylazy jako produkty oddzielnych genów, w pr/ztciwioństw'io do pojedynczego genu ekspandazy/hydroksylazy. Należy odnotować, że oddzielne geny ekspandazy i hydroksylazy i odpowiednie aktywności enzymatyczne, które one kodują, spotyka się raczej w prokariotycznych mikroorganizmach takich jak S. clavuligerus niż w mikroorganizmach eukariotycznych takich jak C. acremonium, który zawiera pojedynczy gen i enzym ekspandazę/hydroksylazę, jak zostało to zaobserowane wyżej. Sekwencję prok^ri;^tt^c^c^I^ttgo enzymu hydroksylazy i nukleotydów kodujących go opisano w Kovacevic i wsp., J. Bacteriol., 173( i), 398-400 (1991) i EP-A-O 465 189, który dotyczy izolacji wymienionego enzymu. Badacze powinni docenić to, że na podstawie sekwencji hydroksylazy jest możliwe przeprowadzenie syntezy DNA kodującego enzym hydroksylazę dobrze znanymi ręcznymi metodami lub za pomocą automatycznych syntetyzatorów DNa. DNA lub sekwencje alternatywnie kodujące tę samą sekwencję aminokwasową hydroksylazy albo fragmenty lub ich pochodne posiadające aktywność równoważną hydroksylazie mogą być ponownie używane jako podstawa do przygotowania rożnych wektorów do klonowania lub wektorów ekspresyjnych, składających się z promotora i innych sekwencji regulatorowych, którymi można następnie transformować gospodarza P. chrysogenum w celu uzyskania ekspresji enzymu hydroksylazy i tym samym przeprowadzać metodą niniejszego wynalazku. Również jest możliwe użycie związku DNA jako sondy, za pomocą której można przeszukiwać bibliotekę

1Ί2.155 genomową w celu znalezienia szczepu posiadającego użyteczny enzym hydroksylazę metodą identyfikacji sekwencji homologicznych za pomocą hybrydyzacji. Aktywność każdej czystej hydroksylazy, zidentyfikowaną w powyższy sposób, można potwierdzić używając substratu ad;poi!o7-ADCA zgodnie ze sposobem niniejszego wynalazku i izolując produkt jego hydroksylacji za pomocą HPLC.

Jeżeli używa się tego wykonania niniejszego wynalazku to znaczy pojedynczego genu kodującego tylko aktywność hydroksylazy, to następnie może być konieczne dostarczenie DNA, kodującego również aktywność enzymu ekspandazy, a więc P. chrysogenum można transformować odpowiednim wektorem transmisyjnym, który pozwala na ekspresję in situ funkcji ekspandazy w celu zapewnienia etapu rozszerzenia pierścienia w sposobie niniejszego wynalazku. Znanych jest dużo enzymów o aktywności ekspandazy; i, jak to zaplanowano w oparciu o podobieństwo łańcucha bocznego, wiele enzymów o aktywności ekspandazy może działać w nowym procesie biotechnologicznym niniejszego wynalazku.

Inne użyteczne wykonania niniejszego wynalazku są oparte na fakcie, że DNA kodujący aktywność więcej niż jednej ekspandazy i/lub więcej niż jednej hydroksylazy można używać do transformacji liierekohibinowanego szczepu P. chrysogenum. W tych wykonaniach możliwe jest otrzymanie wzmocnionej aktywności ekspandazy i/lub hydroksylazy na skutek zwiększonych ilości białek enzymatycznych, ulegających ekspresji.

W rozdziale opisującym poprzedni stan wiedzy należy również odnotować, że enzym ekspandaza pochodzący z Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 jest całkowicie zsekwencjonowany jak i scharakteryzowany przez mapowanie endonukleazami rekstrykcyjnymi. Jednakże, to co pojawia się jako ten sam enzym, pochodzący z S. clavuligerus NRRL 3585, przedstawiano jako posiadający różną masę cząsteczkową, lecz nie zsekwencjonowano go. I, jak to opisano powyżej w rozdziale dotyczącym poprzedniego stanu wiedzy, enzym DAOCS/DACS z Cephalosporium acremonium ATCC 11550 również zsekwencjonowano [Samson i wsp., Bio/Technology (1987) 5: 1207-1214 i EP-A-O 281 391],

Enzymy o aktywności ekspandazy zidentyfikowane poprzednio są użyteczne w nowym procesie biotechnologicznym niniejszego wynalazku. Inne, jeszcze nie zidentyfikowane enzymy ekspandazy, pochodzące z różnych szczepów S. clavuligerus lub C. acremonium lub nawet pochodzące z mikroorganizmów innych rodzajów, mogą również okazać się odpowiednie do przeprowadzenia nowego procesu biotechnologicznego niniejszego wynalazku. Procedury identyfikacji tych nowych szczepów i rodzajów użytecznych mikroorganizmów i procedury izolacji domniemanych enzymów ekspandazy oraz ustalenia, że są one odpowiednie do użycia w sposobie niniejszego wynalazku są proste i powszechnie znane. Przeszukiwanie ekstraktów wolnych od komórek kandydatów nowych szczepów i rodzajów użytecznych mikroorganizmów można przeprowadzić w sposób niezawodny i powtarzalny przez dodanie wymienionych ekstraktów do substratu adipoilo-6-APA w obecności znanych kofaktorów DAOCS, które obejmują jony żelazawe (Fe^), askorbinianu, α-ketoglutaranu i trójfosforanu adenozyny (ATP). Adipoilo-6-APA można przygotować w wystarczających ilościach przez podanie roztworu adypinianu wzbogacającego podłoże nietransformowanym Penicillium chrysogenum w sposób analogiczny do opisanego szczegółowo niżej. Żądany enzym (lub ekspandaza/hydroksylaz.a) jest obecny, jeżeli powstał adipoilo-7-ADCA i/lub adipoiio-7-ADAC. których obecność można wykryć za pomocą chromatografii.

Jest również możliwe, przy użyciu dobrze znanych technik rekombinacyjnych, wytworzenie sond, opartych na sekwencjach nukleotydowych genów ekspandazy z S. clavuligerus i C. acremonium, na przykład, w celu przeszukania zawartości DNA kandydatów' mikroorganizmów, które prawdopodobnie wytwarzają ekspandazę odpowiednią do użycia w sposobie niniejszego wynalazku.

Potencjalne źródła enzymów ekspandazy, hydroksylazy i ekspandazy/hydroksylazy. Enzymy ekspandazy, jakjuż zostało zaznaczone, sąenzymami katalizującymi rozszerzanie struktur pierścienia penamowego (znajduj ącego się w cząsteczkach typu penicyliny) do pierścienie cef-3-emowego (znajdujących się w cefalosporynach). Zatem każdy organizm, wytwarzający metabolity, które zawierają pierścień cefemowy jest potencjalnym źródłem DNA kodującego

172 155 ekspandazę. Podobnie każdy organizm, który wytwarza cefalosporyny zawierające grupę 3hydroksymetylową, jest potencjalnym źródłem DNA kodującego hydroksylazę (lub ekspandazę/hydroksylazę). Przykłady takich organizmów podano niżej, lecz lista tajest tylko przykładowa i nie można jej uważać za wyczerpującą·.

Grzyby.

Cephalosporium acremonium

Cephalosporium sp.

Emericellopsis

Paecilomyces

Scopulariopsis

Diheterospora

Spiroidium

Annxiopsis

Promieniowce.

Streptomyces clavuligerus

S. lipmanii

S. wadayamensis

S. todorominensis

S. fdipinensis cephamycini

S. heteromorphus

S. panayensis

S. griseus

S. cattleya

Nocardia lactamdurans

Inne bakterie.

Flavobacterium sp.

Alcaligenes denitrificans

Mycoplana bullata

Providencja rettgeri

Lysobacter lactamgerus

Ekspandazy i hydroksylazy organizmów wymienionych wyżej są tylko kandydatami do przyszłych badań i być może nie wszystkie z nich będą odpowiednie do nowego procesu biotechnologicznego niniejszego wynalazku.

Izolacja fragmentów DNA kodujących aktywność ekspandazy.

Gdy, tylko wykryto obecność żądanego enzymu ekspandazy w sposób opisany wyżej, metody izolacji DNA kodującego aktywność enzymu ekspandazy stały się również proste i dobrze znane. Skonstruowano sondy DNA w oparciu o całkowicie i częściowo znane sekwencje genów kodujących aktywność enzymów ekseanduzy, które będą hybrydyzowały z DNA kodującym izolowany enzym. Konstrukcja tych sond opiera się zarówno na znajomości sekwencji aminokwasów i zasad nukleotydowych kodujących enzym ekspandazę jak i na preferencji kodonów, występujących u danego mikroorganizmu. Szczegółowy opis typowych metod tego rodzaju, zastosowanych do genomowego DNA Streptomyces clavuligerus ATCC 27064, podano niżej.

Izolację DNA, kodującego aktywność enzymu ekspandazy, wykonano używając metod cięcia enzymami restrykcyjnymi i ligacji, dobrze znanych w technologii rekombinacji DNA. Niezbędna jest znajomość mapy restrykcyjnej genomu mikroorganizmu, aby można było otrzymać odpowiedni fragment restrykcyjny i wyizolować go. Dostępne są już mapy restrykcyjne S. calvuligerus i C. acremonium; tak więc do pierwszego z nich użyto enzymów restrykcyjnych Bam HI i Sal I i po rozdziale elektroforetycznym otrzymano żądane fragmenty wielkości od 1,8 do 2,2 tysiąca par zasad.

Źródła enzymu acetylotransferazy i izolacja fragmentów DNA kodujących wymienioną aktywność.

1ΊΤ. 155

Klonowanie gony acotylotransforazy DAC z C. acremoniuin można przeprowadzić przy pomocy dobrzo znanych technik rekombinac^nych, któro ogólnie opisano niżoj.

W colu sklonowania gony acotnlptynnsfoynpn należy najpierw otrzymać mutanty C acremoniUm niezdolno do konwersji kwasy oZnCctyΪ0CcfnIoS7oyyn0Wogo (DAC) do cofaiospotyny C. Proces ton wymaga poddania komórek C. acremonium działaniu mutagonów takich jak N-nitrozogunniOnnn (NTG), kwas azotawy lub promieniowanie ultraiolotowo, pozwalających na uzyskanie mutantów w hodowli na odpowiednim podłożu i następnie oznaczonio ich za pomocą, na przykład, metod chromatograficznych lub biologicznych, oznaczających akumulację

DAC.

Następnym otapom identyfikacji odpowiedniego mutanta przoz znalezienie gonu kodującego acotylotyansforapę jost izolacja DNA C. acremonium zo szczepu wytwarzającego cofalosporynę C. Fragmenty odpowiednich rozmiarów, uzyskano zarówno przez trawienie onOonukloazami ^^st^l^i^^yjnymi jak i przoz fragmentowanie mechaniczno, włącza się do plazmidu łub kosmidu, któro jako wektory transformacyjne zawierają również odpowiedni znacznik w postaci gonu dominującego, kodującego oporność na lub floomycynę. Woktor powinien również. zawierać sekwencjo DNA ułatwiające późniejszo oOznsknnlo wstawionego DNA, na przykład, miejsca cos lambda (fag), któro pozwalają na oOznsknnio sklonowanogo DNA przez pakowanie in vitro po infekcji E. coli, co można przeprowadzić powszechnie znanymi metodami.

Protoplasty zmutowanego szczepu acotylotrnnsfoyapn minus transformowano następie używając wektorów niosących przypadkowo fragmenty gonomowogo DNA i transformanty selekcjonowano na podstawie· oporności na antybiotyki. Potom transformanty oznaczano pod względom odzyskania zdolności do wytwarzania cofalzspornnn C, co wskazywało na zajście udanej komplomontacji przoz wektor niosący gon acotylotransforazę. Mutanty, podejrzano o to, żo zawierają sklonowane kopio gonów można następnie hodować, izolować ich, DNA i odzyskiwać DNA wektora metodą opisaną w-żoJ.

Potwierdzenie, żo woktor rzeczywiście· zawiera gon acotylotransforazy, uzyskiwano przez subk^onowanio w E. coli, używając standardowych metod i powszechnie dostępnych wektorów, a następnie ponownie transformując mutanta acotylotransforaza minus. Gon można następnie wyizolować, psokwoncjonować i oporować nim jak opisano tutaj w roboczych przykładach, używając rutynowych technik, pnnklo stosowanych w gonotyco molekularnej.

Według alternatywnych motod, równio/, powszechnie znanych, Matsuda i wsp. wyizolowali i zsokwoncjonowali gon z C. acremonium, kodujący aktywność ncotylotransfornpn, a takżo wndoOykownli sokwoncję aminokwasową togo enzymu, jak opisano w EP-A-O 450 758. To alternatywno metody obojmują izolację enzymy acotylotyansforapn, sokwoncjonowanio aminokwasów z N-końca i wnOodukowario sokwoncji rykleotydoneJ, kodującej tę część enzymy. Na podstawie toj informacji ponownie wytwarzano sondy, hnbyyOnz,ująco z całą sekwencją kodującą co pozwalało na joj izolację.

Transformacja szczepu Ponicillium chtysogonum.

Kiedy otrzyma się fragmenty DNA kodujące aktywności okspandazn/hndyΌksnlazn, okspandazy i hndyok.snlaz.n oraz acotylotrnnsforaznt można jo wprowadzać (ligować) do plazmidu lub innego wektora ekspresyjnego, razom z fragmentami DNA, obejmującymi promotory, sekwencjo aktywujące translację, znaczniki oporności, sokwoncjo regulatorowe, sokwoncjo odpowiedzialno za tworzenie kosmidów i każdo inno sokwoncjo DNA, któro pozwalają na transformację lub ją wzmacniają, kiorują ekspresją produktów gonu i ułatwiają izolację transformanrów. Wektora ekspresyjnego, skonstruowanego w ton sposób, używano następnie do transformacji szczepu Ponicillium chrysogenum i uzyskania wewnątrzkomórkowej ekspresji aktywności enzymów okspnrOazn/hndyoksnlapn, okspandazy i hndyoksylapn oraz acotylotyarsforap.n. Techniki stosowano do przeprowadzenia transformacji i ekspresji są dobrze znano i szczegółowy opis tych motod zamieszczono niżej.

Jak zostało to szczegółowo opisano nnżoj styansformυwann szczep Ponicillium chrysogonum wytwarza wewnątrzkomórkowo aktywność okspnr(Onty/hydroksylnpn, ekspandazy i hydroksylazy oraz ncotnlotynnsforazn, któro następnie działają o0ponio0nio in situ na substrat adipoilo-fnAPA,

172 155 rozszerzając jego pierścień do adipoiIo-7-ADCA, hydroksylując ten ostatni do adipoilo-7ADAC, który następnie ulega acetylacji do adipoilo-7-ACA.

Nowy transformant.

Specyficzne transformanty Penicillium chrysogenum wytwarzające aktywności kodowane przez geny ekspandazy/hydroksylazy i ekspandazy/hydroksylazy plus acetylotransferazy, które są najbardziej korzystnymi przykładami wykonania niniejszego wynalazku, są nowe w stosunku do podobnych konstrukcji opisanych poprzednio, jak np. przez Cantwella i wsp. (1990) w Current Genetics, 17, 213-221, EP-A-O 281 391 i EP-A-O 437 378. Konstrukcja Cantwella posiada gen ekspandazy ze Streptomyces clavuligerus umieszczony pod kontrolą promotora syntetazy izopenicyliny N (IPNS) i różni się od konstruktów niniejszego wynalazku brakiem DNA kodującego aktywności hydroksylazy lub acetylotransferazy.

Igolia i wsp. w EP-A-O 281 391 opisują wektory transformacyjne P. chrysogenum, które zawierają DNA z C. acremonium, kodujący dwufunkcjonalny enzym ekspandazę/hydroksylazę, którego ekspresjajest regulowana przez, promotor IPNS Penicillium. W jednej z tych konstrukcji (pPS62). gen ekspandazy/hydroksylazy jest podłączony zgodnie* z ramką odczytu pod gen fosfotransferazy hygromycyny. Produkt genu, białko fuzyjne fosfotransferaza : ekspandaza/hydroksylaza, różni się od produktu niniejszego wynalazku, enzymu ekspandazy/hydroksylazy zasadniczo identycznego z wytwarzanym przez C. acremonium. Inny wektor opisany w EP-A-O 281 391 skonstruowano na drodze wielu serii manipulacji molekularnych, obejmujących użycie syntetycznych linkerów DNA. W końcowej konstrukcji (pP6ó 1) zastosowano fragment Ncol wielkości 1,2 tysiąca par zasad, pochodzących z promotora IPNS Penicillium kontrolujący ekspresję genu ekspandi^/zy/hydroksylaz.y i gen acetamidazy z Aspergillus nidulans jako selekcyjny znacznik do transformacji Penicillium. Sekwencje dziewiątego i dziesiątego kodonu w genie ekspandazy/hydroksylazy, kodujących odpowiednio argininę i leucynę, zmieniono z CGTCTC na CGCCTA, co nie zmienia kodowanej sekwencji aminokwasów.

W konstrukcji niniejszego wynalazku fragment Ncol wielkości 1,2 tysięcy par zasad promotora IPNS podłączono do genu ekspandazy/hydroksylazy bez zmiany naturalnej sekwencji genu ekspandazy/hydroksylazy. Promotor IPNS, użyty do konstrukcji w niniejszym wynalazku, posiada dwa oddzielne powtórzenia czterech zasad zgodne z posiadanymi przez promotor naturalny, jedno w miejscu SaII, znajdującym się 760 par zasad powyżej kodonu początkowego ATG i drugie w miejscu Xbal, znajdującym się pięć zasad powyżej kodonu początkowego w sekwencji liderowej na 5'-końcu nie ulegającej translacji. Te zmiany nie obniżały wysokiego poziomu ekspresji genu ekspandazy/hydroksylazy.

Następne różnice w wektorach polegały na różnicach w użyciu znaczników selekcyjnych. W konstruktach opisanych w EP-A-O 281 391 używano acetamidazy i hygromycyny jako znaczników selekcyjnych. Pozostaje to w kontraście do wektora transformacyjnego Penicillium, niosącego gen ekspandazy/hydroksylazy, używanego w niniejszym wynalazku (pPEN/CEPH-1), który zawiera znacznik oporności na fleomycynę. Szczep Penicillium chrysogenum transformowany wektorem pPEN/CEPH-1 i zdolny do ekspresji aktywności ekspandazy/hydroksylazy zidentyfikowanojako PC200. Jego cechy taksonomiczne obejmują typowo wytwarzanie szeroko rozprzestrzeniających się kolonii, w kolorze od niebieskozieionego do zielonego, delikatnie aksamitnych z żółtymi skupieniami zarodników; w sposób odwracalny dyfundujących na żółto do agaru; z główkami konidialnymi rozgałęziającymi się gładko we wszystkich częściach grzybni; konidia mają kształt od eliptycznego do kulistego długości 3-4 pm.

Jako odpowiednie warunki hodowli dla P. chrysogenum stosuje się podłoże stale zawierające monohydrat laktozy, 1,5% (wagowo-objętościowych); wyciąg namokowy kukurydzy, 0,5% (wagowo-objętościowych); pepton, 0,5% (wagowo-objętościowych); NaCl, 0,4% (wagowo-objętościowych); MgSO4-7H20,0,05% (wagowo-objętościowych); KH2PO5,0,06% (wagowo-objętościowych); FeCb - 6H20,0,0005%> (wagowo-objętościowych); CuSO4 - 5H2O, 0,0002%(wagowo-objętościowych); agar, 3,0% (wagowo-objętościowych); w jednym litrze wody destylowanej, pH 4,8. P. chrysogenum opisany i oznaczony jako PC200 zdeponowano w American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, pod numerem przyjęcia ATCC 74186 (data zdeponowania: 23 września, 1992).

172 155

Drugi nowy transformant Penicillium chrysogenum niniejszego wynalazku zdolny do produkcji adipoilo-7-ACA wytwarza aktywności zarówno ekspandazy/hydroksylazy jak i acetylotransferazy na skutek transformacji pojedynczym wektorem (pTS-8), zawierającym DNA koóuj nrtmr kUn dn ĄJQVy WUO. ΙΛ/li V11ZjJ tlij .

Ttr r^a meium imEtyr dn rA4ni mr* yd r wiectArmravioi j iii oumjiu Trvi\.ivi wu luzan oiy wkj. uutior vi uiuv j juj ν·ιι

Penicillium, wspomnianych w EP-A-0 437 378, który obejmuje DNA kodujący tylko acetylotransferazę z C. acremonium lub w połączeniu z sekwencją DNA, kodującą zmutowany polipeptyd ekspandazy/hydroksylazy. W konstrukcji pTS-8 ekspresja każdego z genów ekspandazy/hydroksylazy i acotylotransferazy jest kierowana przez oddzielne kopie promotora IPNS z P. chrysogenum; trzeciej kopii promotora IPNS użyto w celu kierowania transkrypcją genu oporności na fleomycynę, stosowanego jako znacznik selekcyjny.

W alternatywnym wykonaniu niniejszego wynalazku, geny ekspandazy/hydroksylazy i acetylotransferazy, można włączyć do oddzielnych wektorów i wprowadzić kolejno do szczepu gospodarza Penicillium. Porządek, w którym fragmenty DNA kodujące aktywności enzymatyczne ekspandazy/hydroksylazy i acetylotransferazy wprowadza się do szczepu Penicillium jest ważny tylko z praktycznego punktu widzenia. Najlepiej, jeżeli transformacja Penicillium genem(-ami) ekspandazy/hydroksylazy poprzedza wprowadzenie genu acetylotransferazy, ponieważ jest to kolejność, w której enzymy te działają in vivo. Zatem ekspresję ekspandazy/hydroksylazy można monitorować przez oznaczanie wytwarzania adipoilo-7-ADAC. Adipoilo-7-ADAC będący substratem dla enzymu acetylotransferazy, ekspresja którego jest uwarunkowana przez później wprowadzony gen kodujący acetylotransferazę, oznacza się na podstawie wytwarzania adipoilo-7-ACA. Przy użyciu odpowiedniego oznaczenia acetylotransferazy in vitro możliwa jest transformacja Penicillium najpierw genem acetylotransferazy przy potwierdzeniu jego ekspresji oznaczeniem in vitro, a następnie wprowadzenie genu ekspandazy/hydroksylazy. Zatem każde z tych podejść jest odpowiednim wykonaniem sposobu niniejszego wynalazku, którego celem jest wytworzenie 7-ACA.

Jednakże w najlepszym wykonaniu wprowadza się jednocześnie wszystkie trzy aktywności enzymatyczne przez konstrukcję pojedynczego wektora plazmidowego, obejmującego DNA kodujący aktywności ekspandazy/hydroksylazy i acetylotransferazy z C. acremonium. Szczep Penicillium chrysogenum .stransfonmowany tym pojedynczym wektorem plazmidowym, wektorem pTS-8, i zdolny do ekspresji aktywności ekspandazy/hydroksylazy i acetylotransferazy oznaczono jako PC300. Jego cechy systematyczne są takie same jak opisanego poprzednio PC200. Odpowiednie warunki hodowli dla PC300 są takie same jak opisane wyżej dla PC200. Szczep P. chrysogenum oznaczony jako PC300 zdeponowano w American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, pod numerem przyjęcia ATCC 74187 (data zdeponowania: 23 września, 1992).

Specyficzny szczep Penicillium chrysogenum stransformowany wektorem pPenFTSO, wytwarzający aktywność genu ekspandazy z S. clavuligerus, będący najbardziej korzystnym przykładem wykonania niniejszego wynalazku jest nowy w stosunku do podobnych konstrukcji opisanych poprzednio na przykład w Cantwell i wsp. (1990) Current Genetics, 17, 213-221. W obu konstrukcjach zastosowano mutagenezę in vitro w celu połączenia promotora z genem ekspandazy. W konstrukcji Cantwella wprowadzono miejsce Ndel przy ATG genu ekspandazy, które połączono z miejscem Xbal na 3'-końcu promotora IPNS za pomocą linkera Xbal/Ndel. W konstrukcji niniejszego wynalazku utworzono miejsce Ncol przy ATG genu ekspandazy i połączono je z miejscem Ncol na 3'-końcu linkera IPNS. Utworzyło to następujące sekwencje w otoczeniu połączeń promotora z genem w tych konstrukcjach:

(Skrót SEQ ID NO, stosowany dalej w opisie, oznacza numer identyfikacyjny sekwencji)

172 155

	XbaI Ncol
promotor IPNS NO: 1	5' TCTAGACACCATGG	3' SEQID
ekseandazu Strep. NO:2	5' GTGAGAGTTGATGGAC	3' SEQ ID
Cantwell NO:3	5' TCTAGACACIATGGAC	3' SEQ ID
niniejszy wynalazek NO:4	5' TCTAGACACCATGGAC	3' SEQ ID

W konstrukcji Cantwella C zastąpiono T, podczas gdy w konstrukcje niniejszego wynalazku zachowano C, tak więc sekwencja promotora IPNS bezpośrednio połączona z początkowym kodonem ATG dokładnie odtwarza tę sekwencję, która znajduje się w naturalnym genie IPNS. Jest możliwe, że poprzednio opisany promotor chociaż różni się tylko pojedynczą zasadą nukleotydową, może obniżać poziom wydajności translacji i w konsekwencji obniżać poziom ekspresji genu ekspandazy.

Inne różnice w tych konstrukcjach znajdują się w rejonach promotora lub genu. Konstrukcja Cantwella zawiera region promotora IPNS 5'BamHI do XbaI3', podczas gdy wektor niniejszego wynalazku zawiera rejon promotora 5' Ncol do Ncol 3' [Diez i wsp., (1990), J. Biol. Chem. 265, 16358-16365]. Powoduje to dodanie około 250 par zasad na 5'-końcu promotora IPNS w konstrukcji Cantwella. Jednakże, rejon ten znajduje się w otwartej ramce odczytu genu syntetazy ACV powyżej genu IPNS.

Konstrukcja Canl^iwella zawiera również gen Streptomyces od ATG do miejsca BamHI na 3'-końcu genu, podczas gdy wektor niniejszego wynalazku zawiera rejon genu od ATG do miejsca SaII na 3'-końcu [Kovacevic i wsp. (1989), J. Bacteriol., 171, 754-760]. Powoduje to występowanie dodatkowo około 1000 par zasad na 3'-końcu sekwencji w konstrukcji Cantwella. Konstrukcja niniejszego wynalazku nadal zawiera region powyżej genu ekspandazy do miejsca BanHI, leżącego w rejonie 5' w stosunku do ATG; jednakże region ten jest oddzielony od ramki odczytu genu ekspandazy przez promotor IPNS. Inna różnica konstruktu pPenETSO niniejszego wynalazku, oprócz różnic opisanych w poprzednich badaniach, dotyczy użytego znacznika selekcyjnego. Użycia fuzji promotora IPNS z Penicillium z genem fleomycyny w konstrukcje niniejszego wynalazku zmierzało do osiągnięcia integracji wielu kopii lub integracji w odpowiednim miejscu, co powoduje wysoki poziom ekspresji; i w ten sposób może dawać wyższy poziom transformantów o wysokiej ekspresji genu ekspandazy.

Odcinanie bocznego łańcucha adipoilowego.

Ostatnim etapem w nowym procesie biotechnologicznym jest odcięcie bocznego łańcucha adipoilowego od adipoilo-7-ADAC lub adipoilop7-ACA, które wymaga działania enzymu amidazy adipoilowej na produkty poprzednich etapów. Jak wspomniano wyżej, jednym ze znaczących osiągnięć niniejszego wynalazku jest zdolność do przeprowadzenia wszystkich etapów prowadzących do wytworzenia adipoilo-7-ADAC i adipoilo-7-ACA w pojedynczej hodowli fermentacyjnej. To osiągnięcie polega na uzyskaniu wyjątkowo wysokiej wydajności bez konieczności izolacji i częściowego oczyszczania produktów pośrednich w kolejnych etapach metody. Jednakże w ostatnim etapie nie ma systemu enzymu amidazy adipoilowOj, to znaczy nie utworzono go in situ w oryginalnej hodowli fermentacyjnej a nie na drodze naturalnej, ani na drodze rekombinacyjnej ekspresji genów P. chrysogenum.

Jeżeli nowy proces biotechnologiczny niniejszego wynalazku przeprowadza się w sposób okresowy to konieczna jest izolacja i częściowe oczyszczenie produktu pierwszego etapu, a procedury poprzedzające wykonanie tego opisano wyżej.

Tym niemniej proces niniejszego wynalazku można przeprowadzić w każdy sposób, który efektywnie doprowadza do kontaktu amidazy adipo z adipoilo-7-ADAC lub adipoilo-7-ACA, tak że zachodzi enzymatyczna konwersja tego związku do 7-ADAC lub 7-ACA. Jest to definicja terminu kontaktowania w najszerszym kontekście. Podejście to jest skuteczne, ponieważ nie

172 155 wymaga na początku dokładnego oczyszczenia reagujących substancji. Oczywiście możliwe są jego modyfikacje. Na przykład substancje reagujące można oczyszczać do pewnego stopnia wymaganego przed ich wzajemnym kontaktem. Jednak możliwe jest przeprowadzenie procesu raat-ra-t ·»» e oj» /ύπΑΙλ DmAnż,-» xo«-k k γ»Λο < Λ o z·* w + rt Iz.» i P >r o + p « ł ♦Ό ζ» Wił a Tn οζα!·*<5 w tpaSOD viu,i- ulu UMv^4v»a · m^vjuw<w^mv gumó&iu duuyuuivji i v^^^4^vJ^vn oUu 4 można modyfikować różnymi sposobami w celu udoskonalenia technologii procesu. Tak więc można używać enzymu immobilizowanego, na przykład w formie kolumny zawierającej acylazę adipoilową z adipoilo-7-ADAC lub adipoiloA-ACA przepuszczanymi przez kolumnę. Można również dodawać immobilizowany enzym do roztworu adipoilo-7-CDAC lub adipoilo-y-CCC jako zawiesinę. Takie układy enzymu iwmebilipowanego pozwalają na łatwe odzyskanie enzymu i jego wielokrotne użycie. Innym przykładem takiego pnocesu technologicznego jest użycie reaktorów błonowych. Najlepszą metodą doprowadzenia do kontaktu reagujących substancji jest zastosowanie kolumny z immobilipowanyw enzymem.

Enzymy amidazy adipoilowej używane w etapie odcinania.

Znanych jest wiele enzymów specyficznych w stosunku do bocznego łańcucha adipoilowepo. Wyniki otrza^/wane prz^v mży^u haϋdί7Άi€< wTej-z?^v wwy'ΌiłAwV z firp^v RAEV Coro. u a w a i aa y a a k* opisano szczegółowo w podanych niżej roboczych przykładach. Siedem innych enzymów, które usuwają łańcuchy boczne z cząsteczek typu cefalosporyny, podano w literaturze. Sześć z tych siedmiu enzymów pochodzi z gatunków Pseudomonas, a siódmy z gatunków Bacillus. Między pewnymi enzymami z Peudomonas istnieje parę podobieństw, lecz wszystkich siedem enzymów różni się od siebie w pewnym zakresie swoich fizyczno-biologicznych własności. Niektóre z ich cech charakterystycznych podsumowano niżej:

Enzym (szczepy Pesudomonas i Bacillus)	Referencje	Przybliżona masa cząsteczkowa (podje-dnostka)
P. SY-77-1 (Toyo Jozo) niżej	Shibuya i wsp. (1981)	w przybliżeniu taka sama jak GK 16
P. GK 16 (Asahi)	Matsuda, Komatsu (1985)	16 000 54 000
P. SE85 (.^;c^-i) (Asahi)	Matsuda i wsp. (1987)	jó 2vu 19900
P. SE83 (acyll) (Asahi)	Matsuda i wsp. (1987)	25 400 58 200
P diminutaN176 (Fujisawa)	Aramon i wsp. (1991a)*	58 000 26 000
P. diminuta V22 (Fujisawa)	Aramori i wsp. (1991a)*	?
Bacillus latero-s7erus J1 (Fuji.)	Aramori i wsp. (1991b)**	70 000 (monoworyczny)
Pseudewonas sp. (RAEV Corp.)		16 000 54 000

* Aramori i wsp., J. Ferment. Bioeng. (1991) 72: 232-243.

** Aramon i wsp. J. Bacteriol. (1991) 173: 7848-7855.

Wszystkie wyżej wymienione enzymy amidazy adipo są użyteczne w nowym procesie biotechnologicznym niniejszego wynalazku. Obecność innych amidaz adipo w metodzie niniejszego wynalazku można łatwo stwierdzić testując przypuszczalny enzym względem adipoilo-7ACA lub adipoilo-7-ADAC - substratów, na które musi on działać. Pozytywny wynik daje niezawodną i powtarzalną metodę określenia, czy badany enzym jest rzeczywiście użyteczny w sposobie niniejszego wynalazku. Substrat można przygotować na drodze reakcji bezwodnika kwasu adypinowego z 7-ACA używając zmodyfikowanej metody opisanej przez Szefczuka i

172 155

Wellman-Bednawską w Clin. Chim. Acta (1978) 84,19-26. Jest również możliwe zaadaptowanie metody opisanej w Agric. Biol. Chem. (1981) 45(7), 1561-1567, która służy do przygotowania glutarylo-7-ACA. Bezwodnik kwasu adypinowego można przygotować zgodnie z metodą

Aj^bertson i Lundmark opis?mw w J. Nircrnolol.Sci. Chcni. (1990) A27, 39^4-11 2 7-CAA.jęst dostępny w paru handlowych źródłach, między innymi w Sigma Chemical Co..

Wymagane jest przeprowadzenie· przybliżonego oznaczenia enzymów - kandydatów szybką metodą kolorymetryczną, w której zastępuje się substrat adipoilo-7-ACA substratem kolorymetrycznym takim jak adipóloPABA (kwas parauninotenreisawy) lub adipoilo-pNA (para-nitroanilina). Metoda ta jest przystosowaną wersją metody, opisanej dla T-glutamylo PABA opisaną przez Szewczuka i wsp., Clinica Chimica Acta, 84 (1987) 19-26. Odcięcie bocznego łańcucha daje rodzaje związków wytwarzających kolor, których obecność i stężenie można łatwo określić przy pomocy kolorymetru. W celu uzyskania bardziej szczegółowych informacji, dotyczących tej i innych odpowiednich metod kolorymetrycznych, patrz Marelli, L. P. (1968) J. Pharm. Sci. 57: 2172-2173; Szasz, G. (1969) Clin. Chem. 15: 124-136; Szewczuk, A. i wsp. (1980) Anal. Biochem. 103: 1ó6-169; i Reyes, F. i wsp. (1989) J. Pharma. Pharmacol. 41: 136-137.

Przeprowadzone ρoΓÓwnanio N-końcowych sekwencji aminokwasów enzymu RAEV z dużymi podjednostkami enzymów acyll i GK16 zamieszczono w tabeli poniżej. Wyniki porównania pokazano niżej (gdzie nawiasy oznaczają obecność nioostatecznie rozstrzygniętych aminokwasów): RAEV - SEQ ID NO: 5 (S) N (S) (G) AV APGKT AN G N AL (L) L Q N (P) GK 16-SEQIDNO;6

S N S W AVAPGKTANGNALL LQN P acyll - SEQ ID NO; 7

S NNW AVAPGRTATGRPI L AGDP

Z sekwencji tych widać wyraźnie, że wszystkie trzy peptydy są spokrewnione. Jednakże, białko posiadające N-końcową sekwencję podobną do tych pokazanych wyżej niekoniecznie będzie posiadało aktywność amidazy adipoilowej, jak dzieje się to w przypadku acylazy penicyliny G, wytwarzanej przez szczep Arthrobacter. Z drugiej strony, istnieją amidazy adipo użyteczne w metodzie niniejszego wynalazku, które nie wykazują znaczącej homologii do powyższej sekwencji N-końcowej. Na przykład, acyl Asahi i acylazy z B. laterosporus Fujisawa zamieszczone w poprzedniej tabeli, które wykazują pewną aktywność acylazy adipoilo-7-ACA, nie mają żadnej homologii sekwencji z innymi enzymami wymienionymi wyżej. W konsekwencji, zakres niniejszego wynalazku pod względem amidaz adipoilowych użytecznych w ostatnim etapie nowego procesu biotechnologicznego określa się przez to, czy enzym - kandydat jest czy nie jest użyteczny do odcinania bocznego łańcucha adipoilowego z adipoilo-7-ACA, co można łatwo i powtarzalnie określić jak opisano wyżej.

Opis najbardziej korzystnych przykładów wykonania.

Poniżej następuje szczegółowy opis najbardziej korzystnych przykładów wykonania niniejszego wynalazku, lecz jego celem jest tylko zilustrowanie, a nie ograniczenie w jakikolwiek sposób niniejszego wynalazku.

Przykład 1. Warunki hodowli Penicillium chrysogenum.

Szczepy Ponicillium chrysogenum, używane w tych metodach, hodowano na szalkach z pożywką LCSB, zawierającą monohydrat laktozy, 1,5% (wagowo-objętościowych); wyciąg namokowy kukurydzy, 0,5% (wagowo-objętościowych); pepton, 0,5% (wagowo-objętościowych); NaCl, 0,4% (wagowo-objętościowych); MgSO4-7H₂O, 0,05% (wagowo-objętościowych); KH2PO4, 0,06% (wagowo-objętościowych); FoCH^HA). 0,0005% (wagowo-objętościowych) CuSO4-5H20,0,0002%' (wagowo-objętościowych); agar, 3,0% (wagowo-objętościowych); w jednym litrze wody destylowanej, pH 4,8. Po 12 dniach hodowli w 25°C i 65% względnej wilgotności, zbierano pojedyncze kolonie i dodawano do 2 ml sterylnej wody w zakręcanej probówce, zawierającej szklane kulki. Po rozdrobnieniu kultury przez energiczne mieszanie roztworu, używano jej do zaszczepienia kolb zawierających ryż. Kolby te zawierały 25 g rozdrobnionego ryżu Uncle Ben's o naturalnie długich ziarnach na 250 ml, kolbę, który przemywano trzema lub czterema objętościami wody destylowanej przez siedem minut, mieszano co 30 sekund, a następnie osuszano dopóki ryż nie wchłonął około 25% wody. 'Po dwunastu dniach hodowli w 25°C i 65% wilgotności, zarodniki wymywano z ryżu 50 ml sterylnej wody. Zawiesiny zaród172 155 ników używano do zaszczepienia płynnych hodowli i przygotowano z nich również liofilizaty kultur do przechowywania w 4°C. Zarodniki dodawano do równej objętości 5% odtłuszczonym mleku i liofilizowano w sterylnych ampułkach.

Do wytwarzania penicylin lub grzybni, siużącej jako źródio albo dna stosowano dwuetapową fermentację szczepu w wytrząsanych kolbach. Szczepiono przez dodanie 1 x 10⁸ zarodników do kolb 50 ml/500 ml z pożywką złożoną z glukozy, 3,0% (wagowo-objętościowych); maki z nasion bawełny, 1,0% (wagowo-objętościowych); wyciągu namokowego kukurydzy, 3,0% (wagowo-objętościowych); siarczanu amonu, 0,2% (wagowo-objętościowych), CaCO3,0,5% (wagowo-objętościowych); bezwodnego fosforanu jednopotasowego, 0,05% (wagowo-objętościowych); laktozy, 1,0% (wagowo-objętościowych); ekstraktu drożdżowego, 1,0% (wagowo-objętościowych) w jednym litrze destylowanej wody. Inkubację prowadzono w 25°C i 65% względnej wilgotności w wytrząsarce obrotowej o amplitudzie 70 mm przy 220 obrotów na minutę. Po 48 godzin inkubacji zapoczątkowywano etap produkcji przez przeniesienie 2 ml zarodników wegetatywnych do kolby 35 ml/500 ml z pożywką o następującym składzie: KH2PO4, 0,05% (wagowo-objętościowych); K2SO4 0,5% (wagowo-objętościowych); (NH4)2SO4, 1,0% (wagowo-objętościowych); laktoza, 12,0% (wagowo-objętościowych), mąka z nasion bawełny, 2,75% (wagowo-objętościowych); CaCO3 (wytrącony), 1,0% (wagowo-objętościowych), płynny smalec, 1,0% (wagowo-objętościowych) w jednym litrze destylowanej wody o pH 6,6. Po autoklawowaniu, lecz przed zaszczepieniem, dodawano 25% sterylnego roztworu adypinianu sodu (pH 6,6) do końcowego stężenia adypinianu sodu 2,5%. Po zaszczepieniu kontynuowano inkubację w tych samych warunkach jak dla etapu wytwarzania zarodników przez 5 do 7 dni.

Jeżeli była potrzebna grzybnia do otrzymywania protoplastów do transformacji lub jako źródło DNA, szczep hodowano w kolbie 50 ml/250 ml zawierającej kompletne podłoże (CM) złożone z: 50 ml 20X soli Clutterbucka (120 g Na2NO3, 10,4 g KCl, 10,4 g MgSC)4-7H?O, 30,4 g KH2PO4)ó 2,0 ml elementów śladowych Vogela (0,3 M kwas cytrynowy, 0,2 M ZnSO4, 25 mM Fe(NH4)-(SO4)--6H-O, 10 mM CuSO4, 3 mM MnSO4, 8 mM kwas bomy, 2 mM Na2MoO42H2O), 5 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g glukozy w jednym litrze destylowanej wody. Inkubację prowadzono w 25°C w wytrząsarce obrotowej przy 220 obrotach na minutę.

Przykład 2. Warunki hodowli Cephalosporium acremonium.

Szczepy C. acremonium utrzymywano na skosach zawierających kompletne podłoże złożone z sacharozy, 20 g; agaru, 20 g, peptonu, 4 g; ekstraktu drożdżowego, 4 g; NaNO3, 3 g; KH2PO4,0,5 g; K2HPO4,0,5 g; KCl, 0,5 g; MgSO4/7 H20, 0,5 g; FeSO4/7H20,0,01 g; w jednym litrze destylowanej wody, pH 6,6. Po dziesięciu dniach wzrostu w 28°C i 66% względnej wilgotności, do skosów dodawano 6 ml sterylnej wody i zdrapywano hodowlę z powierzchni agaru. Otrzymaną zawiesinę przenosz.ono do sterylnej zakręcanej probówki zawierającej szklane kulki. Po rozdrobnieniu kultury przez energiczne mieszanie przez parę minut 3,5 ml otrzymaj zawiesiny używano do zaszczepienia płynnych hodowli. Zawiesiny tej używano również do przygotowania liofilizatów kultur do przechowywania w 4°C. Zawiesinę rozdrobnionej kultury wirowano, osad zawieszano w 5% odtłuszczonego mleka i porcje liofilizowano w sterylnych ampułkach.

Do wytwarzania cefalosporyn i do produkcji grzybni, używanej jako źródło DNA i RNA., stosowano dwuetapową fermentację szczepów w wytrząsanych kolbach. Etap wytwarzania zarodników zapoczątkowywano przez zaszczepienie 250 ml kolb, z których każda zawierała 15 ml pożywki o następującym składzie: glukoza, 5 g; sacharoza, 40 g; skrobia kukurydziana, 30 g; melasa buraczana, 50 g; mączka sojowa, 65 g; CaSO4/'2H20, 15,8 g; octan amonu 8 g; CaCO3 (pptd), 5 g; (NHO2SO4,7,5 g; MgSO4/7H20, 3,5 g; KH2PO4,1 g; olej sojowy, 0,15 ml na kolbę w jednym litrze destylowanej wody o pH 6,2. Inkubację prowadzono w 25°C i 65% względnej wilgotności w wytrząsarce obrotowej o amplitudzie obrotów 70 mm przy 220 obrotach na minutę. Po 96 godzinach inkubacji zapoczątkowano etap produkcji przez przeniesienie 2 ml zarodników wegetatywnych do 250 ml kolby zawierającej 15 ml świeżej pożywki opisanej wyżej. Inkubację kontynuowano przez dodatkowe 96 godzin w tych samych warunkach.

Jeżeli grzybnia była potrzebna jako źródło DNA do transformacji szczepy hodowano w 100 ml/500 kolbie z kompletnym podłożem złożonym z: glicerolu, 20 g; peptonu 4 g; ekstraktu drożdżowego, 4 g; KH2PO4, 0,5 g; K2HPO4, 0,5 g; KCl, 0,5 g; MgSC>4/7 H2O, 1 g; NaNO3, 3 g; FeSOąTHjO, 0,01 g w jednym litrze destylowanej wody. Inkubację prowadzono w 30°C w wytrząsarce obrotowej przy 200 obrotach na minutę.

3. kzol&cjH gβΏoπlGwcgQ DNA i c aieowRcgo i^NA z Pcnicilliurn i

Cephalosporium.

Wegetatywną grzybnię z 48 godzinnej hodowli, przygotowanej jak opisano wyżej, zbierano przez przefiltrowanie przez gazę, zamrażano w ciekłym azocie i liofilizowano przez noc. Wysuszoną grzybnię z piaskiem rozgniatano tłuczkiem w moździerzu i zawieszano w 25 ml 100 mM LiCl, 50 mm EDTA, 10 mM Tris pH 8,0, 4% SDS. Po ogrzaniu zawiesiny do 50-55°C w łaźni wodnej o temperaturze 60°C, mieszaninę ekstrahowano najpierw fenolem nasyconym, 1M Tris (pH 8), a następnie fenolem : chloroformem (1 : 1, objętość : objętość) nasyconym Tris i potem chloroformem. RNA wytrącano z fazy wodnej przez dodanie równej objętości zimnego 6 M LiCl i mieszaninę pozostawiano w -20°C na dwie do trzech godzin. Po odwirowaniu przy 12 000 x g przez 20 minut w 4°C do supernatantu dodawano 66% etanolu (objętość/objętość) i chłodzono do -20°C przez 15 minut w celu strącenia DNA. Po odwirowaniu jak opisano wyżej, osad DNA

............nw a* .o, , ______: __o ... ^L τη /ιλ λ i tz; a τνη aTtt o 1 z eutHOiu, auMUiiui m<iwiCi>z,<uiu w uuiuho ιβμυηιινιιιΐ7*η5ι,pn /,u, imivi

EDTA). Stężenie DNA określano przez porównanie ze znanymi wzorcami DNA po wybarwieniu bromkiem etydyny po rozdziale elektroforetycznym w żelu agarozowym.

Do ekstrakcji RNA hodowle Penicillium chrysogenum i Cephalosporium acremonium prowadzono jak opisano wyżej w przykładach 1 i 2 przez 96 godzin w 35 ml pożywki fermentacyjnej (warunki fermentacji opisano poprzednio), w 25°C w wytrząsarce obrotowej przy 220 obrotach na minutę. Grzybnię zbierano filtrując ją przez filtr Whatman #1 pod próżnią i przemywano około 50 ml wody. Grzybnię natychmiast zdrapywano z filtru, zawieszano w 5 ml buforu rozbijającego (50 mM Tric-HCl pH 7,4,150 mM NaCl, 5 mM EDTA pH 8,0,5% SDS), zamrażano w ciekłym azocie i liofilizowano. Po liofilizacji przez noc dodawano 5 ml wody zawierającej 0,1 % DEPC i 5 ml fenol: chloroform: alkohol izoamylowy (50: 50: 1) nasyconym 1 M Tris (pH 8) i mieszaninę pozostawiano do rozmrożenia w 37°C przez 20 minut z wytrząsaniem. Mieszaninę wirowano przy 12 000 x g przez dziesięć minut w 4°C, zbierano fazę wodną i ponownie ekstrahowano ją fenol : chloroform : alkohol izoamylowy (50 : 50 : 1) nasyconym 1 M Tris (pH 8), potem fenolem nasyconym 1M Tris (pH 8) i na końcu chloroformem. Końcową fazę wodną łączono z równą objętością 6 M LiCl i roztwór pozostawiano w -20°C na minimum cztery godziny. Całkowity RNA strącano przy 12 000 x g przez 20 minut w 4°C, osad rozpuszczano w 0,3 ml buforu TE i 0,03 ml 3 M octanu sodu i dodawano 2,5 objętości etanolu w celu ponownego strącenia RNA. Końcowy osad rozpuszczano w 0,1 ml buforu TE i określano stężenie RNA spektrofotometrycznie mierząc absorpcję przy 260 nm.

Przykład 4. Konstrukcja biblioteki genów z Cephalosporium acremonium i izolacja genów ekspandazy/hydroksylazy i acetylotransferazy z C. acremonium.

Izolacja genu ekspandazy/hydroksylazy z C. acremonium.

Genomowy DNA C. acremonium trawiono częściowo Sau3AI w ceu otrzymania fragmentów o średniej wielkości od 10 do 20 tysięcy par zasad i fragmenty te zagęszczano przez wirowanie trawionego DNA na gradiencie NaCl o gęstości od 5 do 20%. Fragmentów DNA rozdzielonych pod względem wielkości użyto do sporządzenia biblioteki genomowego DNA C. acremonium nadrodze ligacji w miejsce BamHI w wektorze X 2001, pakowania w cząstki fagowe przy użyciu Gigapak (Stratagene) i infekcję E. coli. Otrzymane łysinki przenoszono na nitrocelulozę i przeszukiwano za pomocą hybrydyzacji do sondy oligonukleotydowej komplementarnej do 3'-końca opublikowanej sekwencji genu ekspandazy/hydroksylazy (Samson i wsp., 1987) Sondę znakowano na końcach [τ- P]ATP używając kinazy polinukleotydowej T4. Pozytywne klony izolowano, wykonywano mapowanie restrykcyjne i określano orientację genu za pomocą hybrydyzacji Southerna do powyższego oligonukleotydu i drugiego oligonukleotydu komplementarnego do 5'-końca genu.

Izolacja genu acetylotransferazy z C. acremonium.

Chociaż nie opisano poniżej metody użytej do izolacji genu acetylotransferazy w odpowiedniej konstrukcji wektora w przykładach 11 i 12, można użyć następującej metody przy

172 155 zastosowaniu powszechnie znanych technik korzystając z obocnio dostępnych opublikowanych informacji dotyczących sokwoncji DNA. Zo skonstruowanej biblioteki gonomowoj z C. acromznium jak opisano wyżoj wyselekcjonowano klon, niosący gon kodujący acotyiotrarsfoyazę w oparciu o hnbryOnzację Oo syntetycznych sond oligonuklootydow-ch komplementarnych do sokwoncji acotnlotransforazy, jak opisano w Matsuda i wsp. (1992) Biochom. Biophys. Ros. Commun. 182: 995-1001.

Przykład 5. Warunki hodowli Streptomycos clavuligorus.

Szczepom Streptomycos clavuligorus używanym w tych metodach był ATCC 27064. Szczep utrzymywano na szalkach składających się z: ekstraktu drożdżowego, 4 g; ekstraktu słodowego, 10 g; glukozy, 4 g; agaru, 20 g; w jednym litrze destylowanej wodn, pH 7,2. Po 5 dniach wzrostu w 30°C do szalek dodawano 2 ml sterylnej wody i hodowlę zdrapywano z powierzchni agaru. Otrzymaną w wyniku togo zawiosinę przenoszono Oo stoyylnoj zakręcanej probówki zawierającej szklane kulki. Po rozdrobnieniu kultury przez onorgiczno mioszanio, zawiesin- używano do zaszczepienia płynnych hodowli. Zawiesiny używano również 0o przygotowania hodowli ciągłych przcchow-wanych w -70°C dodając glicerol do 15% końconoJ objętości.

Jeżeli grzybni potrzebowano do otrzymania protoplastów 0o transformacji lub jako źródła DNA, szczepy hodowano w kolbach 200 ml/l litr zawierających pożywkę YEME złożoną z: ekstraktu drożdżowego, 3 g; peptonu, 5 g; ekstraktu słodowego, 3 g; glukozy, 10 g; sacharozy, 340 g; MgCl2 - 6H2O, 1,02 g; glicyny, 5 g; agaru, 18 g w joOn-m litrzo destylowanej wody. Inkubację prowadzono w 28°C w wytrząsarce obrotowej przy 220 obrotach na minutę.

Przykład 6. Izolacja gonomowogo DNA z Streptomycos.

Grzybnię wegetatywną z 48-go0zinnoj hodowli, prz-gotowanoj jak opisano wyżoj, zbierano przez wirowanie przy 22 100 x g przoz 10 minut. Komórki zawioszano w 10 ml buforu TE i dodawano 10 mg lipopnmy i następnie mieszaninę inkubowano w 30°C przez 15 minut. Następnie dodawano joOon ml 20% SDS i natychmiast potom fenolu nasyconego 10 ml TE (pH 8) oraz 1,5 ml 5 M NaCl i mieszaninę ostrożnie mieszano przez odwracanio przoz dwadzieścia minut. Faz- rozdzielano przy 12 000 x g przoz 10 minut, po czym usuwano wodną fazę i przenoszono ją Oo świeżej probówki. Ostrożnie dodawano trzy objętości ipopropnroly i strącony DNA nawijano na bagietkę oraz rozpuszczano w minimalnej objętości buforu TE. Dodawano RNazy A Oo końcowego stężonia 20 gg/ml i roztwór inkubowano w 50°C przez joOną godzinę. Następnie dodawano proteaz- K Oo końcowego stężenia 100 gg/ml razom z 100 mM NaCl oraz 0,4% SDS i mieszaninę inkubowano w 37°C przez jedną godzinę. Roztwór ekstrahowano ponownie równą objętością fonolu nasyconego Te (pH 8), a następnie przeprowadzano drugą ekstrakcję chloroformom. DNA pochodzący z końcowej ekstrakcji nawijano na bagietkę po Oodaniu dwóch objętości izopropanolu i określano stężenie spoktrofotometrycznio oOczytyjąc absorpcję przy 260 nm.

Przykład 7. Konstrukcja biblioteki gonów i izolacja fragmentów DNA zawierających gony okspanOazy i h-droksylazy ze Streptomycos clavuligeyus.

Izolacja gonu okspanOaz- zo S. clavyligorus.

Gonomow- DNA Streptomycos clavuligorus, otrz-man- według opisanej poprzednio motod-, trawiono onz-mami restrykcyjnymi Bam HI i Sal I. Strawiony DNA rozdzielano oloktroforetycznio w 0,8% żelu ngarozonym i eluowano fragment- wielkości od 1,8 do 2,2 tysiąca par zasad oraz ligowano jo Oo DNA pUC18, który najpierw strawiono Bam HI i Sal I. Rozciończoń mieszaniny ligacyjnoj użyto do transformacji kompetentnych komórek JM 109 przy zastosowaniu oloktroporacji (Gont Pulsor, Bio-Rad, Richmond, CA). Warunki przygotowania komórek kompetentnych i oloktroporacji były zgodno z instrukcjami obsługi. Mieszaninę transformacyjną wysiewano na szalki z LB zawierające 100 gg/ml ampicylin- i 75 gl 2% X-Gal. Po nocnoj inkubacji w 37°C zrokombinowano kolonio rozpoznawano na podstawie braku koloru, spowodowanego inaktywacją gonu bota-galaktoz-dazy, znajdującego się w tym plazmidowym wektorze. Bezbarwno kolonio przeszczepiano na świeżo szalki z LB zawierające 100 gg/ml ampicylin-. Po nocnym wzroście w 37°C kolonio praonoszono na nitrocelulozę i hybyn0nzznanz z sondą, otrzymaną przy użyciu łańcuchowej reakcji polimorazy, która odpowiadała sekwencją

172 155 zasad 52-918 opublikowanej sekwencji genu ekspandazy ze Streptomyces clavuligerus [Kovacevic i wsp. (1989) J. Bacteriol. 171: 754-760; Ingolia i wsp. U. S. 5 070 020], Znakowanie produktu łańcuchowej reakcji polimerazy erzeerowudzono metodą syntezy drugiej nici przy •użyciu losowych primerów C³²!^) dCTP i zestawu do znakowania Oligolubelling Kit zgodnie z instrukcjami (Pharmacia, Piscataway, New Jersey). Reakcję hybrydyzacji przeprowadzono w obecności 10& CPM radioaktywnie wyznakowanej sondy, 30% formalidu, 5X SSC (0,15 M NaCl, 0,015 M cytrynian sodu pH 7), 0,1% SDS, 5X roztwór Denhardta (5 g fikolu, 5 g poliwinylopirolidonu i 5 g BSA na 500 ml 50X roztworu podstawowego) i 100 gg/ml DNA z grasicy cielęcej, w 37°C przez noc. Kilka transformantów silnie hybrydyzowało do sondy. Potwierdzono analizą restrykcyjną, że jedna kolonia zawiera wektor niosący gen ekspandazy i plazmid ten oznaczono pFTSO-1.

Izolacja geny hydroksylazy ze S. cliwuligerus.

Genomowy DNA ze Streptomyces clavuligerus trawiono częściowo BamHI i ligowano do wektora lambda Dash II z firmy Stratagene. Otrzymaną bibliotekę genomową przeszukano metodą hybrydyzacji do oligonukleotydu wielkości 30 par zasad, posiadającego identyczną sekwencję jak pierwsze 30 zasad opublikowanej sekwencji genu hydroksyiazy (Kovacevic i Miller, 1991, J. Bact. 173: 398). Hybrydyzacja Southema z DNA trawionym BamHI z dwóch pozytywnych klonów fagowych ujawniła oczekiwany fragment wielkości 6 tysięcy par zasad, które następnie subklonowano. Ten subklonowany fragment po trawieniu KpnI daje zbiór fragmentów zgodnych z opublikowaną mapą restrykcyjną dla regionu wokół genu hydroksylazy (Kovacevic i Miller, 1991).

Przykład 8. Izolacja plazmidowego DNA.

Hodowle E. coli, niosące interesujący plazmid, rosły w 500 ml pożywki LB (20 g/litr LB Broth Base (Gibco, Paisley, Scotland), z dodatkiem tetracykliny 15 gg/ml w wytrząsarce obrotowej przy 220 obrotów na minutę przez 12-16 godzin przy 37°C. Komórki osadzano przez wirowanie przy 4 000 x g przez dziesięć minut przy 4°C. Osad komórek zawieszano w 18 ml buforu glukozowego (50 mM glukoza, 25 mM Tris pH 8,0, 10 mM EDTA) i dodawano 2 ml lizozymu 40 mg/ml (Sigma, St. Louis, MO) w buforze glukozowym, mieszano i mieszaninę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Dodawano czterdzieści mililitrów świeżo przygotowanego roztworu 0,2 N NaOH, 1% SDS i mieszaninę wstrząsano delikatnie przez obracanie probówki oraz pozostawiano w lodzie na dziesięć minut. Następnie dodawano trzydzieści ml 5 M octanu potasu pH 4,8, dobrze mieszano i otrzymaną w wyniku tego mieszaninę umieszczano w lodzie na dodatkowe dziesięć minut. Resztki komórek osadzano przez wirowanie przy 4 000 x g przez dziesięć minut w 4°C i otrzymany supernatant filtrowano przez gazę. Do czystego sueornatantu dodawano izopropanolu (0,6 objętości) w celu wytrącenia plazmidowego DNA, którego osad powstawał podczas inkubacji w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Plazmidowy DNA osadzano przy 4 000 x g przez 20 minut w 4°C, następnie przemywano 70% etanol i krótko suszono. Osad zawieszano w 9 mi buforu TE, następnie dodawano 10 g CsCl i 0,387 ml roztworu bromku etydyny 10 mg/ml. Roztwór ten wirowano przy 313 100 x g przez 24 godziny. Otrzymany prążek plazmidu w gradiencie chlorku cezu oglądano w świetle ultrafioletowym, izolowano i następnie usuwano bromek etydyny przy pomocy butanolu nasyconego do ekstrakcji wodą. CsCl z preparatu plazmidu usuwano następnie przez dializę względem buforu TE i na końcu zatężano DNA przy użyciu PEG (masa cząsteczkowa 8 000). Stężenie DNA określano spektrofotometry cznie odczytując absorpcję przy 260 nm.

Przykład 9. Konstrukcja wektora premFTSO do transformacji Penicillium.

Włączenie genu oporności na fleomycynę.

Wektor do transformacji donicillium skonstruowano z genem oporności na fleomycynę jako dominującym znacznikiem selekcyjnym. Osiągnięto to przez wyizolowanie przez elucję z żelu agurozowego po rozdziale elektroforetycznym fragmentu wielkości 660 par zasad, zawierającego gen oporności na fleomycynę (gen ze Streptoul!oteichus hindustanus, kodujący białko kodujące fleomycynę) połączony z terminatorem drożdżowego genu cytochromu Cl z plazmidu pUT713 (CAYLA, Toulouse Cedex, Francja), strawionego Bam HI/Bgl II. Wyizolowany fragment ligowano do miejsca BamHI wektora pSELECT^R 1 (Promega Corporation) i orientację

17.155 tego genu określano przez analizę restrykcyjną. Pojedyncze miejsce Hindlll w powstałym plazmidzie usuwano przez trawienie HingIII, wypełnianie końców fragmentem Klenowa polimerazy i ponownie ligację. Następnie włączano fragment PsitT wielkości 550 par zasad, zawierający miejsce cos lambda, który umożliwiał użycie wektora do tworzenia kosmidów, jeżeli włączono wstawki odpowiedniej wielkości. Wektor ten nazwano pSCP4.

Geniomowy DNA P. chrysogenum trawiono częściowo Sau3A i używano do sporządzenia biblioteki w wektorze fagowym lambda EMBL3. Klon zawierający gen syntetazy izopenicyliny N (IPNS) wyizolowano z tej biblioteki i użyto do przygotowania serii subklonów, z których jeden zawierał fragment wielkości 3,6 tysiąca par zasad od pierwszego miejsca BamHI, znajdującego się powyżej genu IPNS do pierwszego miejsca HindIII, znajdującego się poniżej genu. Pojedyncze miejsce SaII w tym subklonie usuwano przez trawienie restryktazą SaII, wypełnienie lepkich końców fragmentem Klenowa polimerazy i ponowną ligację. Następnie pojedyncze miejsce XbaI usuwano podobnie przez trawienie restryktazą Xbal, wypełnianie końców i ponowną ligację. Otrzymany plazmid nazwano pSXF-1. Przekształcony metodami inżynierii genetycznej promotor IPNS wyizolowano z żelu w postaci fragmentu Ncol wielkości 1,2 tysiąca par zasad z plazmidu pSXF-I i zligowano z miejscem NcoI w plazmidzie pSCP4, jak opisano wyżej. Orientacja, określona przez trawienie restrykcyjne, została tak zmieniona, że promotor był przyłączony do genu oporności na fleomycynę przed kodonem początkowym ATG. Plazmid ten nazwano pUTZ-2.

Włączenie genu ekspandazy z S. clavuligerus.

Fragment wielkości 1,645 tysięcy par zasad, zawierający gen ekspandazy ze Streptomyces clavuligerus, wyizolowano przez rozdział elektroforetyczny i elucję z 0,8% żelu agarozowego z plazmidu pFTSO-1 (poprzednio opisany wektor) straw ionego Bam HI i Sal I. Ten wyizolowany fragment zligowano z wektorem pSELECT (Promega Corporation), również strawionym Bam HI i Sal I, Wektor ten nazwano pFTSO-8. Nowe miejsca Nco I utworzono przy kodonie początkowym ATG genu ekspandazy przez ukierunkowaną mutagenezę pFTSO-8, używając zestawu do mutagenezy Altered Sites^K in vitro Mutagenesis System (Promega Corporation). Mutagenezę przeprowadzono zgodnie z instrukcją. Skonstruowano oligonukleotyd, komplementarny do regionu DNA sekwencji kodującej przy kodonie początkowym ATG z opublikowanej sekwencji genu ekspandazy Streptomyces (Kovacevic i wsp., (1990) Journal of Bacteriology, 171, str. 3952-3958). Oligonukleotyd zsyntetyzowano używając fosforoamidyny cyjanoetylu (aparat Pharmacia Gene Assembler), sekwencja oligonukleotydu była następująca:

SEQ ID NO; 8

3' CGAGAGGATCAGTGAGAGTCCATGGACACGACGG 5'.

Mutagenezę potwierdzono przez analizę enzymem restrykcyjnym. Następnie fragment Ncol wielkości 1,2 tysięcy par zasad z pUTZ-2, zawierający rejon promotorowy IPNS z P. chrysogenum, zmieniony metodami inżynierii genetycznej wyizolowano przez rozdział elektroforetyczny w żelu agarozowym po trawieniu enzymem Ncol. Rejon promotora IPNS połączono z wektorem pFTSO-8 w nowym miejscu Nco I, utworzonym przez mutagenezę w początkowym kodonie ATG genu ekspandazy. Orientację promotora genu ekspandazy określono przez analizę enzymem restrykcyjnym. Następnie kasetę zawierającą promotor IPNS : gen ekspandazy wstawiono jako fragment Bam HI/Sal I do opisanego wyżej wektora transformacyjnego Penicillium pUTZ-II, przeciętego Bam HI/Sal I. Końcowy konstrukt nazwano pPenFTSO.

Przykład 10. Konstrukcja wektora transformacyjnego Penicillium pPEN/CEPH-1.

Włączenie regionu promotorjvwego IPNS.

Region promotorowy IPNS wyizolowano z opisanego wyżej w przykładzie 9 pUTZ-2 przez trawienie Xho I/Sma I. Wektor pUTZ-2 przecięto Bam HI i lepkie końce wypełniono używając dNTP i fragmentu Klenowa w celu uzyskania tępych końców, następnie strawiono Xho I i wyizolowany fragment Xho I/Sma I promotora IPNS zligowano z przeciętym wektorem, uzyskując w wyniku tego konstrukt, zawierający dwa regiony promotora IPNS. Wektor ten nazwano pUTZ-7.

Włączenie genu ekspandazy/hydroksylazy C. acremonium.

172 155

Następnie wyizolowano jeden z regionów promotora IPNS (przez elektroforezę i elucję z żelu agorozowogo) z pUTZ-7 jako fragment Xho VXba I i zligowano z wektorem pBluescript II SK (Stratagene, La Jolla, CA), przeciętego Xho IXba I. Wektor ten nazwano pIPNSp/blue. Gen ekspandazy/hydroksylazy Cephalosporium wyizolowano (przez rozdział ol.oktroforotyczny i elucję z żelu ogorozowogo) jako fragment Hind III/Xba I wielkości 1,6 tysięcy par zasad z jednego z klonów genomowych zidentyfikowanego poprzednio i połączono z wektorem pSELECT, strawionego Hind III/Xba I. Nowe miejsce Bsp HI utworzono w kodonie początkowym genu ekspandazy/hydroksylazy przez ukierunkowaną mutagenezę przy użyciu zestawu do mutagenezy Altered Sites™ in vitro Mutagenesis System (Promcga Corporation). Mutagenezę przeprowadzono zgodnie z instrukcją. Skonstruowano oligonukleotyd, komplementarny do regionu DNA sekwencji kodującej przy kodonie początkowym ATG z opublikowanej sekwencji genu ekspandazy/hydroksylazy Cephalosporium acremonium (Samson i wsp., Bio/Technology, tom 5, listopad, 1987). Oligonukleotyd zsyntetyzowano używając fosforoamidynu cyjanoetylu (aparat Pharmacia Gene Assomblor), sekwencja oligonukleotydu była następująca:

SEQ ID NO; 9

-1/ Γνι»ι>Ίΐą /-π-» a /-'Τ’ a a a z^,z^'i«i’/~i/~i a /-i et j lti i 11 *JL· i vj i vL· i AL· i i i vj/vavjL· i i j .

Mutagenezę potwierdzono przez analizę enzymem restrykcyjnym. Gen ekspandazy/hydroksylazy Cephalosporium acremonium wyizolowano (przez rozdział elektroforetyczny i elucję z żelu agarozowego) jako fragment Bsp HI/Xba I i zligowano z opisanym w przykładzie powyżej wektorem pIPNSp/blue, strawionym Nco I/Xba I. Wektor ten zawierał teraz promotor IPNS Penicillium w ATG genu ekspandazy/hydroksylazy Cephalosporium acremonium. Wektor ten nazwano pIPNS/EXP/blue. Kasetę zawierającą promotor IPNS: ekspandazę/hydroksylazę trawiono częściowo Xho I i trawiono całkowicie Xba I oraz izolowano fragment (przez rozdział elektroforetyczny i elucję z żelu agarozowego) oraz ligowano z opisanym w poprzednim przykładzie wektorem pUTZ-2, strawionym Xho I/Xba I, otrzymując w końcowym rezultacie wektor transformacyjny pPEN/CEPH-1.

Przykład 11. Konstrukcja wektora do transformacji Penicillium, niosącego oba geny ekspandazy i hydroksylazy z S. clavuligerus.

Gen P. chrysogenum kodujący β-tubulinę sklonowano z biblioteki genomowej na wektorze lambda, używając genu β-iubuliny z Aspergillus niger jako sondy hybrydyzacyjnej.

Fragment Xba 1/Hind ΙΠ wielkości 2,0 tysięcy par zasad, zawierający promotor β-tubuliny z Penicillium połączono z wektorem pSELECT (Promega) w miejscach Xba I/Hind HI. Miejsce Nco I wprowadzono w kodonie początkowym ATG przez ukierunkowaną mutagenezę sekwencji AAAATGCGT do ACCATGGGT. Z otrzymanego wektora wyizolowano z żelu fragment Barn HI/Nco I i włączono go w miejscach Barn Hi i Nco I pUTZ-2 (opisanego poprzednio), tworząc wektor pCI-6. Z klonu genomowego P. chrysogenum wyizolowano z żelu fragment Sal I wielkości 5,1 tysięcy par zasad, zawierający geny zarówno acetylotransferazy jak i IPNS i włączonu ^gg w miejsce SoI I pUTZ-2, ‘eworzącpUTZ-S. Smkwencje tyjromatora oo 3'-knńaugenu ffNS wyuzotawanoz pUT^ó^/eu iruw^lznicsaitcy^yżytz2 Barn HI i Hio² nfa n astępnie izolację r żelu wicl.oś ci 1,3tysibay pzr zosad, Uóoy soT^nie wieżowe w ι^^ορ

BemEni Hind IH bCI-6 (r^wanegm wyApfbtazy ιηιιΐςο ^r CT-IT ROrotyzcze yucjsce S al Iw PoWiżu miei.soa fUmin oseyiętd m/hz Ircwienie oos^tpykcyiyc,wⁿpał2^ten^leleⁿkichkońców fragmentem KlInownpo^timerazy^ę ponown^pligayję. Nowe miejsce Spllń pnbl^jżumⁱejsaeBrm ^wi w^wa^owo precz tiki2oun^cnwcoą nuitcgo n^⁰ tokwznejii GGAAGACGdo GGTCGACG. Nestęifte uyumtfo z p^midu gen oporce^csi no amp^iz ylm^ przez prawieci- rcotsykcy-ne^ńnuC izolacja iz żel li w^tcc go fragmentui ponowną hgacś^ otrzymując pC 145. Na lcońcowyizalowonor że^gT ^f arct^appnmptora ICNS : gen ekspandazy z pPENFTSO jako fragment Barn HI/Sal I i w^zozy ^co ^gw pCIol5,o^trzymgj^ucpE^2g0-^l. Konslru^coyp PoLcra dm e^^ą-sji obu^genów tyctoteyliyŁy i ekcpaydίezy z S. obejmowała następujące etapy. Fragment KpnI wielkośei 2,9 ^r^cy .nu cacad,ząw^j erat^ ^ę hy^oroks^g-az^e bybk^looowano w p^u]^ρLECT,t^A że mⁱWbCńEdoR^s wpo^jilⁱnkrrzdzną-dowało t^rę na^s końcu^nu. Pojed^bnuńem^lejsce Nco I w plazmidzte ζοηπΐ^ο przeτukⁱesunkowaną mujaⁿyuez^a sekwencrⁱ TCCATGG.C ^or rekwunTii TCGATGGW ilednocτc śniw wprowapSononowe mlcjteg Nc o Iwkoch) nib go(^z^ińo\’^'ym ppsco

Π2155 zmianę sekwencji AACATGGC do ACCATGGC. Obie zmiany zachowywały kodowaną sekwencję aminokwasów. Fragment EcoRI/Nco I wielkości 1,0 tysięcy par zasad, zawierający zmieniony metodami inżynierii genetycznej promotor IPNS, wyizolowano z żelu z pUTZ-2 i włączono między miejscami EcoRI i Nco I powyższego wektora, niosącego zmieniony gen hydroksylazy. Następnie pojedyncze miejsce EcoRI w otrzymanym wektorze zmieniono na miejsce Hind III metodą ukierunkowanej mutagenezy. Konstrnkt fuzyjny 5'IPNS : hydroksylaza wyizolowano z otrzymanego wektora jako fragment Hind III, który następnie włączono w pojedyncze miejsce Hind III opisanego wyżej wektora pEXP-1. Końcowy wektor zawiera geny ekspandazy i hydroksylazy, których ekspresja jest regulowana przez promotor IPNS oraz znacznik oporności na fleomycynę, którego ekspresja jest regulowana przez promotor β-tubuliny.

Przykład 12. Konstrukcja wektora pPenCACT do transformacji Penicillium.

Włączenie genu oporności na hygromycynę.

Wektor do transformacji Penicillium skonstruowano z genem oporności na hygromycynę jako dominującym znacznikiem selekcyjnym. Gen fosfotransferazy hygromycyny B z E. coli wyizolowano (przez rozdział elektroforetyczny i elucję z żelu agarozowego) jako fragment Bam HI wielkości 1,15 tysięcy par zasad z wektora pHp’n-1 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) i zligowano z wektorem mp 19, strawionym Bam HI. Orientację genu oporności na hygromycynę w mpl9 określono za pomocą analizy restrykcyjnej RF DNA. Miejsce 5' Bam HI znajduje się w pobliżu kodonu początkowego ATG genu oporności na hygromycynę. W celu ułatwienia wstawienia alternatywnego promotora w miejsce 5' Bam Hi miejsce 3' Bam HI usunięto za pomocą ukierunkowanej mutagenezy, używając zestawu do mutagenezy Mutator™ Site Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA). Mutagenezę przeprowadzono zgodnie z instrukcją. Skonstruowano oligonukleotyd komplementarny do regionu DNA, zawierającego miejsce 3' Bam HI z opublikowanej sekwencji genu fosfotransferazy hygromycyny B (Gritz, L. Davies, J., 1983, Gene 25,179). Oligonukleotyd zsyntetyzowano używając fosforoamidynucyjanoetylu (aparat Pharmacia Gene Assembler), sekwencja oligonukleotydu była następująca:

SEQIDNO: 10

5' TACCCGGGGTTC.CCGCGAACT 3'.

Mutagenezę potwierdzono przez analizę enzymem restrykcyjnym. Następnie zmutowany gen oporności na hvgroπlvcvne wyizolowano jako fragment Sma 1/Xba I (przez rozdział elektroforetyczny i elucję z żelu agarozowego) i zligowano z wektorem pUC 18, strawionym Sma I/Xba I.

Promotor IPNS Penicillium wyizolowano (przez rozdział elektroforetyczny i elucję z żelu agarozowego) jako fragment Nco I wielkości 1,2 tysięcy par zasad z wektora pUTZ-2 (wektor opisany poprzednio), przeciętego Nco I. Zsyntetyzowano linkery oligonukleotydowe w celu utworzenia miejsca Bam HI z miejsc Nco I na końcach fragmentu promotora IPNS, tak aby umieścić promotor IPNS w miejscu 5' Bam HI w pobliżu ATG genu oporności na hygromycynę. Oligonukleotyd zsyntetyzowano z użyciem fosforoamidynu cyjanoetylu (aparat Pharmacia Gene Assembler), sekwencja oligonukleotydu była następująca:

SEQIDNO: 11

5' CATGAAGAAG 3'

SEOIDNO: 12

3' TTCTTCCTAG 5'.

Sekwencja ta zachowywała naturalną sekwencję promotora IPNS, lecz wprowadzała dwa aminokwasy do genu oporności na hygromvcvne. Oligcnukleotvdv połączono ze sobą, ufosforylowano i zligowano z fragmentem promotora IPNS, otrzymanym po przecięciu Nco I, w wyniku czego otrzymano miejsca Bam HI na końcach 5' i 3' fragmentu promotora IPNS. Promotor zaopatrzony w linker zligowano w pUC 18 z genem oporności na hygromycynę, przeciętym Bam HI i orientację potwierdzono analizą enzymem restrykcyjnym. Następnie wyizolowano (przez rozdział elektroforetyczny i elucję z żelu agarozowego) kasetę promotor IPNS : gen oporności na hygromycynę jako fragment Xho I/Sal I wielkości 2,1 tysięcy par zasad (miejsce Xho I znajduje się na 5'-końcu promotora IPNS, a miejsce Sal I pochodzi z polylinkera

172 155 pUC) i zligowano z wektorem pSELECT, strawionym Sal I. Orientację kasety określono za pomocą analizy restrykcyjnej. Wektor nazwano pIPNS/HYG.

Włączenie genu acotyletransferazy z Cephalosporium acremoniuw.

Gen acetylotransferapy z Cephalosporium wyizolowano z klonu genomowego (opisanego wyżej) jako fragment Bg1 Π/Sal I wielkości 1,8 tysięcy par zasad przez rozdział elektroforetyczny i elucję z żelu agarozowego. Gen acetylotransferapy zligowano z wektorem pSELECT, strawionym Bam HI/Sal I. W celu ułatwienia wstawienia promotora IPNS z Penicillium w ATG genu acetylotransferazy Ce7hales7eriuw, nowe miejsce Nco I utworzono w ATG genu acetylotransferazy i wewnętrzne miejsce Nco I w genie struktury usunięto przez ukierunkowaną mutagenezę, używając zestawu do mutagenezy Altered Sites™ in vitro Mutagenesis System (Promega Corporation). Mutagenezę przeprowadzono zgodnie z instrukcją. Skonstruowano oligonukleotydy komplementarne do sekwencji kodującej interesujących regionów DNA z sekwencji genu acetylotransferazy Cephalesperium, zamieszczone powyżej w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 1 i 2. Sekwencje eligonukleotydu, użyte do usunięcia wewnętrznego miejsca Nco I w genie struktury były następujące:

dcę jlD γνΟ:

3' GTCGGCGCATCGATGGGTGGAAT 5'.

Sekwencja oligonukleotydu, użyta do utworzenia nowego miejsca Nco I w początkowym kodonie ATG była następująca:

SEQIDNO: 14

3' CGCCCACCATGGCGCCTCAGAT 5'.

Oligonukleotydy zsyntetyzowano przy użyciu fosforoamidynu cyjanoetylu (aparat Pharmacia Gene Assembler). Mutagenezę potwierdzono analizą restrykcyjną. Wektor nazwano pMUTACT.

Promotor IPNS z Penicillium wyizolowano (przez rozdział elektroforetyczny i elucję z żelu agarozowego) jako fragment Nco I wielkości 1,2 tysięcy par zasad z wektora pUTZ-2 opisanego w przykładzie zamieszczonym wyżej. Ten fragment promotora zligowano z wektorem pMUTACT, przeciętym Nco I, co powodowało umieszczenie promotora IPNS bezpośrednio w ATG genu acetylotransferazy Cephalosporium acremonium. Orientację promotora potwierdzono za pomocą analizy enzymem restrykcyjnym. Kasetę zawierającą promotor IPNS : gen acelylotransferazy trawiono Xho I/Sal I (miejsce Xho I znajduje się na 5'-końcu promotora IPNS i miejsce Sal I znajduje się na 3'-końcu genu acetylotransferazy) i zligowano z wektorem pSELECT, strawionym Sal I. Orientację fragmentu określono za pomocą analizy enzymem restrykcyjnym. Wektor nazwano pMUTACT/IPNS.

Mutageneza, przeprowadzona w celu utworzenia nowego miejsca Nco I w ATG genu acetylotransferazy, spowodowała zmianę drugiego aminokwasu seryny na alaninę. W celu utrzymania sekwencji kodującej identycznej z naturalnym genem wykonano ukierunkowaną mutagenezT, użycajcc ZTdtawu do GTGgesesT A.tered Sites™ in vitro Mutagenesis System. Skonstruowano o-iggonkteo-yd komplemeo tarny ronekeoWującea interesująeepOI'egioml DNo z seTGencji genu azetklotransferazy, zamieszczony wyżej jako SEQ ID NO: 1 i 2. Sekwencja oligonukUotydu, użyta do zmiany drugiego aminokwasu z alaniny na serynę, była następuj cg:

^ΕςΠΟΝΟ^

3' TCTAGCWAGACACCATGTCGCCTCAGAT5i.

OliCTnukleotyd zsyntetyzowano używając fosforoamidynu cyjanoetylu (aparat Pharmacia Gene Ar-wmb^-er). Ms tageeezę pom Uczono jDazeo S7kwznc-ρeowao^le DNA, eży wając ecHown ^poie^kweozjouowania USB Se^oneMase Vm'sion ^^,0 DNA Sequ7kcipgKit t^B^Dyeland, ohio). Primepr do aekwekcjonowania wsuntżtyzτwankuwoer77ąe foreoaoaπύUynu cytaooerolh papiUTt AdTrmacia Gem Nsse mMe i'). Ueektur nazwam pPeUOACT/ePNk -2.

Kmetc zdw^reaająer pytc^iphal IPNS : gan e^rnuśc⁵ nr hy^krom^re^wc^t- wydęto zwo^Dza pePNSąHYGjako eadwmwwtXbz I i zjżnyw-nos wektorem zMUTUCTOIP.NN-S , sirawionyπ-Xba

O,orazymuteckońcouy wektom trannfoπneeyjna eaznCACT.Orientac7zWaee-rz pcnsiti mycynn odreślono aaeuz ooaliaę enzymcm[esrtykcornam.

m 155

Przykład 13. Konstrukcja wektora pTS-8 do transformacji Penicillium zapewniającego ekspresję genów ekspandazy/hydroksylazy i acetylotransferazy z Cephalosporium acremonium.

Gen acetylotransferazy z Cephalosporium wyizolowano (przez rozdział elektroforetyczny i elucję z żelu agarozowego) jako fragment Bgl i/SuI 1 wielkości 1,8 tysięcy par zasad z klonu genomowego i zligowano z wektorem pSELECT (Promega Corporation), trawionym Bam Hi/Sal I. W celu ułatwienia wstawienia promotora IPNS z Penicillium w ATG genu acetylotransferazy Cephalosporium, nowe miejsce Neo I utworzono w kodonie ATG zlokalizowanym w pozycji -42 (Mathison i wsp., Current Genetics, złożone) i wewnętrzne miejsce Neo I w genie struktury usunięto za pomocą ukierunkowanej mutagenezy, używając zestawu do mutagenezy Altered Sites in vitro Mutagenesis System (Promega Corporation). Mutagenezę przeprowadzono zgodnie z instrukcją. Skonstruowano oligonukleotydy komplementarne do sekwencji kodującej interesujące regiony DNA, które jednak wprowadzały parę zmian w celu utworzenia lub usunięcia miejsca Nco I. Sekwencja oligonukleotydu, użyta do usunięcia wewnętrznego miejsca Nco I w genie struktury była następująca:

SEQIDNO; J6 __

3' GTCGGCGCATCGATGGGTGGAAT 5'.

Sekwencja oligonukleotydu, użyta do utworzenia nowego miejsca Neo I w ATG w pozycji -42 była następująca:

SEQIDNO; 17

5' CTCCGATAGGGCGTGGTACCCGGCCCTACTCTTAT 3'.

Oligonukleotydy zsyntetyzowano używając fosforoamidynu cyjanoetylu (aparat Pharmacia Gene Assembler). Oba przypadki mutagenezy potwierdzono przez analizę enzymem restrykcyjnym. Wektor nazwano pMUTACT. Promotor IPNS Penicillium wyizolowano (przez rozdział elektroforetyczny i elucję z żelu agarozowego) jako fragment Nco I wielkości 1,2 tysięcy par zasad z wektora pUTZ-2, opisanego poprzednio. Ten fragment promotora zligowano z wektorem pMUTACT, przeciętym Nco I, w wyniku czego promotor IPNS umieszczono dokładnie w pozycji -42 ATG genu acetylotransferazy Cephalosporium. Orientację promotora potwierdzono przez analizę enzymem restrykcyjnym. Wektor ten nazwano pMUTACT/IPNS. Fragment Xho I/Sal I wielkości 2,5 tysięcy par zasad wyizolowano (przez rozdział elektroforetyczny i elucję z żelu agarozowego) z wektora elvlUTAcT/TPNS, który zawierał kasetę promotor IPNS : acetylotransferaza i zligowano z wektorem pUTZ-2 (opisanym poprzednio), strawionym Sal I. Ten pośredni wektor strawiono następnie Xba I i zligowano z fragmentem Xba I wielkości 2,1 tysięcy par zasad z wektora p^^iN/CEPl^-1 (opisanympoprzednio), zawierającym kasetę promotor IPNS : ekspandazu/hydroksylaza, otrzymując końcowy wektor transformacyjny pTS-8.

Przykład 14. Transformacja Penicillium chrysogenum.

Protoplasty ze szczepu Penicillium chrysogenum, opisane wyżej, otrzymywano przez zaszczepienie 50 ml pożywki CM 1 x 10⁷ zarodników i hodowlę przez 67 godzin w 25°C w wytrząsarce obrotowej przy 220 obrotach na minutę. Grzybnię zbierano przez przefiltrowanie przez gazę, przenoszono do kolb 500 ml i zawieszano w 25 ml KMP (0,7 M KC1,0,8 M mannitol, 0,02 M KPO4 pH 6,3), zawierający 100 mg Novozyme 234 (Novo Biolabs, Bagsvaerd, Dania) i inkubowano w 30°C przy 100 obrotach na minutę. Sferoplasty oddzielano stosując filtrację przez filtry z gazy i waty szklanej i osadzano przez wirowanie przy 350 x g przez 10 minut. Sferoplasty przemywano następnie trzy razy 10 ml buforu KMP i następnie zawieszano w KMPC (KMP z 50 mM CaCh) do stężenia 5 X 107 komórek/mililitr i pozostawiano w temperaturze pokojowej na 20 minut. Do transformacji Penicillium 200 μΐ zawiesiny sferopiastów dodawano do DNA (5 gg DNA wektora w 6,2 gl KMPC z 5 mg/ml heparyny) razem z 50 gl PPC (40% PEG o masie cząsteczkowej 3 500, 20 mM KPO4, pH 6,3, 5% CaCh dodawany bezpośrednio przed użyciem) i mieszaninę transformacyjną inkubowano w lodzie przez 30 minut. Dodawano jeden ml świeżo przygotowanego PPC i mieszaninę przenoszono do 50 ml rozpuszczonego (50°C) agaru regeneracyjnego (CM z dodatkiem 1,3 M mannitolu i 3% agaru). Następnie .mieszaninę transformacyjną rozdzielano na 5 szalek Petriego. Ilość pożywki stałej była równa ilości agaru regeneracyjnego. Szalki inkubowano w 25°C przez 7-14 dni i obserwowano tworzenie kolonii transformantów.

172 155

Przykład 15. Oznaczenia aktywności biologicznej.

Aktywność wyizolowanych przy użyciu HPLC produktów fermentacji adipoilo-APA i adipoilo-7-ADCA oznaczano testem dyfuzji w agarze. Dwadzieścia gl wyizolowanego produktu _ _1.l„ Jz,— _ a ...Hllrr. £ MA ma , ma « z Zł zzz zam za ma «łl, z 4-lz-z-» zaIa rr X» z ZA »-zA łłł Τ Ό Z O T\ Z /1 « ♦· T D D «-(ΛΙ-Ια lldKldUdllU nu. WiCiKuac-i j nnn uIruęuA,&uuc na piy uvavii l. α^αινιη g,nvi i->x> jlhvvii

Base z 3% agarem (Gibco, Paisley, Szkocja), na których uprzednio hodowano Bacillus subtilus ATCC 33677 lub super wrażliwy szczep E. coli (otrzymany od profesora Arnolda L. Demain, MIT). Jako szczep wskaźnikowy do oznaczenia produktu adipoilo-6-APA używano Bacillus subtilus, a jako szczep wskaźnikowy do oznaczenia produktu adipoilo-7-ADCA używano superwrażliwy szczep E. coli. Po 15 godzinach inkubacji w 37°C przejaśnienie wokół krążka spowodowane zahamowaniem wzrostu bakterii wskaźnikowych, świadczyło o aktywności biologicznej produktów. Kontrole w tym doświadczeniu obejmowały deacetyloksycefalosporynę C, cefalosporynę C, penicylinę V i agar zawierający penicylinazę lub agar bez penicylinazy w celu potwierdzenia struktur β-l aktamowych.

Przykład 16. Metoda HPLC do jednoczesnej analizy adipoilo-: 6-APA, 7-ADCA,

7-ADAC i 7-ACA.

Produkty fermentacji stransformowanych szczepów Penicillium (adipoilo-6-AFA, adipoilo-7-ADCA, adipoilo-7-ADAC i adipoilo-7-ACA) analizowano jednocześnie stosując wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC). System HPLC składał się z następujących części firmy Waters: układ 625 dostarczania rozpuszczalnika, detektor 409E do różnych długości fali (zestaw do 220 nm i 260 nm), system danych Maxima 825. Fazą stacjonarną był wkład ciśnieniowy o przekroju koła Nova-Pak Cis 5x100 mm z wkładem Nova-Pak Cu Guard-Pak. Faza ruchoma (przy przepływne 1 ml/min) składał się z 10-minutowego gradientu liniowego od warunków początkowych 5% metanolu i 95% 10 mM KPO4, pH 5 do 40% metanolu i 60% KPO4, pH 5. Ilość adipoilo-6-APA określano przez porównanie z krzywą wzorcową dla penicyliny N przy 220 nm. Ilość produktów z rozszerzonym pierścieniem mierzono przez porównanie z krzywymi wzorcowymi dla syntetycznych adipoilo-7-ADCA i adipoilo-7-ACA przy 260 nm.

Przykład 17. Oznaczenia enzymu RAEV.

Zsyntetyzowanych chemicznie adipoilo-7-ADCA i adipoilo-7-ACA używano jako substratów do określania specyficznej aktywności enzymu RAEV (dostępny handlowo w RAEV Corp.). Mieszaninę reakcyjną zawierającą 10 mM subsiratu, 1 gg enzymu RAEV, 5% glicerolu w 0,16 M KH2PO4 w całkowitej objętości 50 gl inkubowano w 37°C. (Bardziej optymalne warunki reakcji obejmowały użycie 20 mM lub więcej substratu w 20-50 mM buforu fosforanu potasowego). Porcje po pięć gl pobierano w odstępach czasowych 0,1, 3, 5, 10, 20 i 30 minut, rozcieńczano 35 gl 0,010 M KH2PO4 pH 3,5 i zamrażano w -70°C przed analizą za pomocą HPLC w warunkach opisanych poprzednio.

Aktywność enzymu RaeV w stosunku do substratu kolorymetrycznego - kwasu adipo-Paminobenzowego oznaczano używając 5 mM substratu, 8,25 gg enzymu RAEV, 10% glicerolu w 0,065 M KH2PO4 pH 7,0 w całkowitej objętości 50 gl, inkubowanych przez 30 minut w 37°C. Reakcję przeprowadzano na płytce 96-dołkowej. W celu zahamowania reakcji dodawano pięćdziesiąt gl 1 M NaNO2 rozcieńczonego w stosunku 1/100 w 0,25 M kwasie octowym i reakcję pozostawiano w temperaturze pokojowej na 3 minuty. Dodawano sto gl roztworu uwodnionej H2O solijednosodowej kwasu 4-amino-5-hydroksy-2,7-naftaleno-dwusulfonowego w 0,5 M NaCO3 o stężeniu 10 mg/ml, rozcieńczonego 1/100 powstawanie koloru mierzono natychmiast przy 515 nm używając EL 312 Bio-kinetics Plate Reader (BioTek Instruments).

Przykład 18. Oszacowanie alternatywnych acylaz adipoilowych.

Oprócz badań z zastosowaniem enzymu RAEV, zademonstrowano usuwanie bocznego łańcucha adi^p^i^<^-wego z adipoiło-7-ADCA (i innych związków adipoilowych) z udziałem enzymów pochodzących z różnych źródeł mikroorganizmów. W początkowych badaniach szczepy Asahi Pseudomonas sp. SE-83 i SE-495 (zdeponowane w Fermentation Research Institute pod numerami depozytów odpowiednio FERM BP-817 i FERM BP-818) i szczep Toyo Joso Pseudomonas SY-77-1 (zdeponowanym w Northern Regional Research Laboratory pod numerem depozytu NRRL B-8070) szczepy hodowano przez 72 godziny w pożywce zawierającej HyCase SF, 2,0% (wagowo-objętościowych); glutaminian jednosodowy, 0,5% (wagowo172 155 objętościow-ch); ekstrakt drożdżow-, 0,5% (wagowo-objętościowych); namoczona mączka kukurydziana, 0,2% (wagowo-objętościow-ch); olej z nasion bawełny, 0,5% (nagono-objętościowych); i kwas glutarowy, 0.1 % (nngonp-objętościowych);. Komórki zbierano przoz odwirowanie i przemywano 50 mM buforom fzsforano’n—mt pH 8,0, następnio zawieszano jo w buforze i uszkadzano ich zewnętrzne ścian- przez dodanie małoj objętości chloroformu. Porcjo zawiesiny komórek mieszano następnie z n0i7oilo-pnya-nitroanili0om (aO-pNA) i inkubowano w 30°C przez okros od 2 Oo 18 godzin. Po inkubacji mieszaniny zakwaszano przez dodanie 10% (objętościowo-objętosciowych) kwasu octowego. Uwolnioną p-nitroanilinę oznaczano następnie kolorymetrycznie mierząc joj konwersję Oo związku diazowogo, używając odcz-rrlkón z zestawu Sigma Chemical Company Oo oznaczeń transforazy gamma-g^tam-lowej (numor produktu Sigma 545-A). Względno aktywności otrzymano z trzech szczepów wynosiły 100%, 85,5% i 48% odpowiednio dla SE-495, SE-83 i Sy-77-1. Oznaczano również aktywności onz-mów z SE-83 i SE-495 w stosunku do adipożio-7-ADCA, uż-wając motod podobnych Oo opisanych poprzednio dla onzymu RAEV. Wytwarzanie bota-laktamaz- przez SY-77-1 przeszkodziło w zaOomonstrowaniu Ooacylacji adipoilo-A-ADCA przez ton szczop.

Wytwarzanie adipoilo-acnlazy zademonstrowano podobnymi metodami dla dwóch szczepów grzybów (Altornaria sp. MA-133, numer ATCC 20492 i Aspergillus sp. MA-13, numer ATCC 20491; numor referencyjny U.S. 4 141 790 prz-znany Moiji Soika Kaisha Ltd.) i trzech dodatkowych szczepów bakterii (Brovibactoyium, numor ATCC 14,649, Achromobactorium, numor ATCC 14,648 i Flavobactoriym, numer ATCC 14, 650, któro opisano jako producentacylazy cofalosporyry C w U.S. 3 239 394 przyznanym Merck & Co., Inc.).

WYKAZ SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:

(i) ZGŁASZAJĄCY: ConOor, Michael J.

McAda, Phyllis Rambosok, John Roovos, Christophor D.

(ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Now- proces biotechnologiczny otrzymywania 7-ACA i

7-ADAC (iii) LICZBA SEKWENCJI: 17 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:

(A) ADRESAT: Morck & Co., Inc.

(B) ULICA: 126 E. Lincoln Avo (C) MIAST i Rahna(D) STAN: Now Jersey (E) KRAJ: USA (F) KOD: 07065 (v) SPECYFIKACJA TECHNICZNA KOMPUTERA:

(A) TYP NOŚNIKA: stacja dyskietek (B) KOMPUTER: zgodny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: PatontIn Roloaso #1.0, wersja #1.25 (vi) DANE DOTYCZĄCE NINIEJSZEGO ZGŁOSZENIA (A) NUMER ZGŁOSZENIA:

(B) DATA ZGŁOSZENIA:

(C) KLASYFIKACJA:

(viii) DANE DOTYCZĄCE RZECZNIKA PATENTOWEGO:

(A) NAZWISKO: Sporr, Raymond M.

(B) NUMER REJESTRACYJNY: 26,810 (C) REFERENCJA/NUMER SPRAWY RZECZNIKA: 18572IA (xi) INFORMACJE DOTYCZĄCE TELEKOMUNIKACJI:

(A) TELEFON: (908) 594-4481 (B) TELEFAX: (908) 594-4720 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

Z A \ TM ΤΤΓ’Γ\0/'. 1 A — (m) ii pal óodau (B) TYP: kwas nukleinowy (C) TYP NICI: podwójna (D) STRUKTURA PRZESTRZENNA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:1:

TCTAGACACC ATGG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 16 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) TYP NICI: podwójna (D) STRUKTURA PRZESTRZENNA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:2:

GTGAGAGTTG ATGGAC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 16 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) TYP NICI: podwójna (D) STRUKTURA PRZESTRZENNA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:3:

TCTAGACACT ATGGAC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 16 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) TYP NICI: podwójna (D) STRUKTURA PRZESTRZENNA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:4:

TCTAGACACC ATGGAC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) TYP NICI: pojedyncza (D) STRUKTURA PRZESTRZENNA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:5:

Ser Asn Ser Gly Ala Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn 1 5 10 15

Ala Leu Leu Leu Gln Asn Pro 20 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas

172 155 (C) TYP NICI: pojedyncza (D) STRUKTURA PRZESTRZENNA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd

z..;\ Γιητο crT/ufCMrTT. crn tt-» υπό V» nu.u.

Ser Asn Ser Trp Ala Val Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn 1 5 10 15

Ala Leu Leu Leu Gin Asn Pro 20 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasy (B) TYP: aminokwas (C) TYP NICI: pojedyncza (D) STRUKTURA PRZESTRZENNA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ru NO:7:

Ser Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg 1 5 10 15

Pro Ile Leu Ala Gly Asp Pro 20 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 34 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) TYP NICI: pojedyncza (D) STRUKTURA PRZESTRZENNA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:8:

CGAGAGGATC AGTGAGAGTC CATGGACACG ACGG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ED NO:9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) TYP NICI: pojedyncza (D) STRUKTURA PRZESTRZENNA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:9:

GTTTTGGTGT CGTAGTAGTA CTGAAGTTC CAG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) TYP NICI: pojedyncza (D) STRUKTURA PRZESTRZENNA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 10:

TACCCGGGGT TCCCGCGAAC T (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 10 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) TYP NICI: pojedyncza (D) STRUKTURA PRZESTRZENNA: liniowa

172 155 (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:11:

COTGOOGOOG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 10 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (c) TYP NICI : pojI-pocza (D) STRUKTURA PRZESTRZENNA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 12:

TTCTTCCTAG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 pary zasad (B) TyT: kwas nukleinowy (C) TYP MCI : pojedpocza (D) STRUKTURA PRZESTRZENNA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 13:

GTCGGCGCAT CGANGGGNGG AAT (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) TYP NICI: pojedyncza (D) STRUKTURA PRZESTRZENNA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 14:

CGCCCACCAT GGCGCCTCAG AT (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO: 15:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI.:

(A) DŁUGOŚĆ: 28 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) TYP NICI: pojedyncza (D) STRUKTURA PRZESTRZENNA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 15:

TCTAGCTAGA CACCATGTCG CCTCAGAT (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO: 16:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) TYP MCI : pojedpocza (D) STRUKTURA PRZESTRZENNA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: c DNA wykonany na matrycy mRNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 16:

GTCGGCGCAT CGATGGGTGG AAT (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

z z (A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) TYP NICI: pojedyncza

172 155 (D) STRUKTURA PRZESTRZENNA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA wykonany na matrycy mRNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEO ID NO 17:

CTCCGATAGG GCGTGGTACC CGGCCCTACT CTTAT

172 155

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 6,00 zł

Claims (10)

Zastrzeżenia patentowe

1) hodowlę w podłożu odpowiednim dla wzrostu szczepu Penicillium chrysogenum, który wytwarza izopenicylinę N i dodawanie do wymienionego podłoża adypinianowego roztworu zasilającego zawierającego jeden lub więcej następujących składników: kwas adypinowy lub jego sole i estry asymilowane i wykorzystywane przez wymieniony szczep Penicillium chrysogenum, z wytworzeniem kwasu adypoilo-6-aIninopenicylanowogo (adypoilo-6-APA);

1) hodowlę w podłożu odpowiednim dla wzrostu szczepu Penicillium chrysogenum, który wytwarza izopenicylinę N i dodawanie do wymienionego podłoża adypinianowego roztworu zasilającego zawierającego jeden lub więcej następujących składników: kwas adypinowy lub jego sole i estry asymilowane i wykorzystywane przez wymieniony szczep Penicillium chrysogenum, z wytworzeniem kwasu adypoiło-6-aminopenicylannwego (adypoilo-6-APA);

1. Sposób biotechnologiczny wytwarzania pochodnych kwasu cefalosporanowego, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania kwasu 7-aminodezacetylosporanowego (7-ADAC) obejmuje etapy:

2) przeprowadzenie następujących konwersji enzymatycznych przez ekspresję in situ odpowiedniego genu:

a) rozszerzznie pierścienia aeypoilo-p-APA A sitią z wytw orzeniom kwasu adypoilo-7aminodezacetoksycefalosporanowego (adypoilo-7-ADCA) przez enzym ekspandazę wytworzony przez ekspresję DNA kodującego aktywność enzymu ekspandazy, zdolnego do wykorzystania adypoilo-6-APA jako substratu, którym stransfoimowano wymieniony szczep Penicillium chrysogenum,

172 155

b) hydroksylowanie bocznego łańcucha 3-metylowego w adypoilo-7-ADCA in situ z wytworzeniem kwasu adypoilo-7-amidoacetylocefalosporanowego (adypoilo-7-ADAC) przez enzym hydroksylazę wytworzony przez ekspresję DNA koduj ącego aktywność enzymu hydroksylazy, zdolnego do wykorzystania adypoilo-7-ADCAjako substratu, którym stiansioiniowano wymieniony szczep P. chrysogenum; i

c) acetylowanie adypoilo-7-ADAC in situ do kwasu adypoiło-7-aminocefalosporanowego (adypoilo-7-ACA) przez enzym acetylotransferazę wytworzony w wyniku ekspresji DNA kodującego aktywność acetylotransferazy, zdolnego do użycia wymienionego adypoilo-7-ADAC jako substratu, którym stransfoirnowano wymieniony szczep P. chrysogenum; i

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że adypinianowym roztworem zasilającym jest adypinian disodowy.

2) przeprowadzenie następujących konwersji enzymatycznych przez ekspresję in situ odpowiedniego genu:

a) rozszerzenie pierścienia adypoilo-6-APA in situ, z wytworzeniem kwasu adypoilo-7aminodezacetoksycefalosporanowego (adypoilo-7 -ADCA) przez enzym ekspandazę wytworzony przez ekspresję DNA kodującego aktywność enzymu ekspandazy, zdolnego do wykorzystania adypoilo-6-APA jako substratu, którym stransformowane wymieniony szczep Penicillium chrysogenum,

b) hydroksylowanie bocznego łańcucha 3-metylowego w adypoilo-7-ADCA in situ z wytworzeniem kwasu adypoilo-7-amidoacetylocefalosporanowego (adypoi!o-7-ADAC) przez enzym hydroksylazę wytworzony przez ekspresję DNA kodującego aktywność enzymu hydroksylazy, zdolnego do wykorzystania adypoilo-7-ADCAjako substratu, którym stransformowano wymieniony szczep P. chrysogenum; i

3) doprowadzenie do kontaktu adypoilo-7-ACA z amidazą adypoilową, w wyniku czego boczny łańcuch adypoilowy jest usuwany i powstaje produkt 7-ACA; i następnie izolację wymienionego produktu.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że DNA kodujący aktywność enzymów ekspandazy i hydroksylazy pochodzi z Cephalosporium acremonium.

3) doprowadzenie do kontaktu adypoilo-7-ADAC z amidazą adypoilową, w wyniku czego boczny łańcuch adypoilowy jest usuwany i powstaje jako produkt 7-ADAC: i następnie izolację wymienionego produktu.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się jeden dwufunkcjonalny enzym ekspandaza/hydroksylaza.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że amidaza adypoilowa pochodzi z gatunku Pseudomonas.

6. Sposób biotechnologiczny wytwarzania pochodnych kwasu cefalosporanowego, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania kwasu 7-aminocefalosporanowego (7-ACA) obejmuje etapy:

7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że adypinianowym roztworem zasilającym jest adypinian disodowy.

8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że DNA kodujący aktywność enzymów ekspandazy, hydroksylazy i acetylotransferazy pochodzi z Cephalosporium acremonium.

9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że stosuje się jeden dwufunkcjonalny enzym ekspandaza/hydroksylaza.

10. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że amidaza adypoilowa pochodzi z gatunku Pseudomonas.