JP2928884B2 - Ｄｎａおよびその用途 - Google Patents
Ｄｎａおよびその用途Info
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- JP2928884B2 JP2928884B2 JP2003762A JP376290A JP2928884B2 JP 2928884 B2 JP2928884 B2 JP 2928884B2 JP 2003762 A JP2003762 A JP 2003762A JP 376290 A JP376290 A JP 376290A JP 2928884 B2 JP2928884 B2 JP 2928884B2
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はリゾバクター・ラクタムゲヌス（Lysobacter
lactamgenus）などの細菌由来の、β−ラクタム系抗生
物質の生合成に関与する複数の遺伝情報をコードしてい
る遺伝子群を有するDNA断片およびその用途に関する。
lactamgenus）などの細菌由来の、β−ラクタム系抗生
物質の生合成に関与する複数の遺伝情報をコードしてい
る遺伝子群を有するDNA断片およびその用途に関する。
リゾバクター・ラクタムゲヌス（Lysobacter lactamg
enus）などの細菌が生産するセファバシン類抗生物質
（特開昭60−66987号および特開昭60−141296号公報参
照）は、数多くの抗生物質の中でも、臨床上きわめて重
要な半合成セフェム抗生物質の製造に使用するペニシリ
ン、セファロスポリン類に属し、その生合成酵素遺伝子
群は、セファバシン類のみならず、カビや放線菌が生産
するペニシリン、セファロスポリン類抗生物質の生産性
向上や、それらの生合成酵素の生産をはじめ、新規な抗
生物質やそれらの誘導体の生産への利用が期待できる。
enus）などの細菌が生産するセファバシン類抗生物質
（特開昭60−66987号および特開昭60−141296号公報参
照）は、数多くの抗生物質の中でも、臨床上きわめて重
要な半合成セフェム抗生物質の製造に使用するペニシリ
ン、セファロスポリン類に属し、その生合成酵素遺伝子
群は、セファバシン類のみならず、カビや放線菌が生産
するペニシリン、セファロスポリン類抗生物質の生産性
向上や、それらの生合成酵素の生産をはじめ、新規な抗
生物質やそれらの誘導体の生産への利用が期待できる。
従来の技術 ペニシリンやセファロスポリンなど医薬産業上重要
な、β−ラクタム系抗生物質は、従来、主としてカビに
よって生産されていたが、近年、放線菌、細菌からもβ
−ラクタム系抗生物質生産菌が発見されている。それら
のうち、β−ラクタム系抗生物質の生合成酵素遺伝子と
しては、アクレモニウム・クリソゲナム（Acremonium c
hrysogenum）のイソペニシリンＮシンセターゼ（IPS）
遺伝子（S.M.Samson et al:ネイチャー（Nature），31
8,191（1985）参照）、デアセトキシセファロスポリン
Ｃシンセターゼ／デアセトキシセファロスポリンＣヒド
ロキシラーゼ遺伝子（S.M.Samson et al:バイオ・テク
ノロジー（Bio/Technology），5,1207（1987）参照）が
よく知られており、イソペニシリンＮシンセターゼ遺伝
子は、アクレモニウム・クリソゲナム以外にもペニシリ
ウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）（L.
G.Carr et al:ジーン（Gene），48,257（1986）参
照）、アスパージーラス・ニドランス（Aspergillus ni
dulans）（D.Roman et al:ジーン（Gene），57,171（19
87）参照）、ストレプトマイセス・リプマニ（Steptomy
ces lipmanii）（B.J.Weigel et al:ジャーナル・オブ
・バクテリオロジー（J.Bacteriol.），170,3817（198
8）参照）からもクローン化されている。またデアセト
キシセファロスポリンＣシンセターゼ遺伝子について
も、アクレモニウム・クリンゲナム以外に、ストレプト
マイセス・クラブリゲルス（Streptomyces elavuligeru
s）（B.J.Weigel et al:ジャーナル・オブ・バクテリオ
ロジー（J.Bacteriol.），170,3817（1988）参照）から
もクローン化されている。一方、放線菌などでは抗生物
質の生合成に関与する遺伝子は遺伝子群を形成している
ことが知られており（C.R.Bailey et al:バイオテクノ
ロジー（Biotechnology）,808（1984）参照）、Strepto
myces clavuligerus（特開昭62−198394号公報参照）の
セファマイシン生合成酵素遺伝子群のうちイソペニシリ
ンＮシンセターゼ遺伝子、イソペニシリンＮエピメラー
ゼ遺伝子、デアセトキシセファロスポリンＣシンセター
ゼ遺伝子、Ｏ−カルバモイルデアセチルセファロスポリ
ンC 7−ヒドロキシラーゼ遺伝子を含むDNA断片、ストレ
プトマイセス・カトレア（Streptomyces cattleya）
（特開昭62−224292号公報参照）のセファマイシン生合
成酵素遺伝子群を含む29.3K bpのDNA断片が知られてい
る。
な、β−ラクタム系抗生物質は、従来、主としてカビに
よって生産されていたが、近年、放線菌、細菌からもβ
−ラクタム系抗生物質生産菌が発見されている。それら
のうち、β−ラクタム系抗生物質の生合成酵素遺伝子と
しては、アクレモニウム・クリソゲナム（Acremonium c
hrysogenum）のイソペニシリンＮシンセターゼ（IPS）
遺伝子（S.M.Samson et al:ネイチャー（Nature），31
8,191（1985）参照）、デアセトキシセファロスポリン
Ｃシンセターゼ／デアセトキシセファロスポリンＣヒド
ロキシラーゼ遺伝子（S.M.Samson et al:バイオ・テク
ノロジー（Bio/Technology），5,1207（1987）参照）が
よく知られており、イソペニシリンＮシンセターゼ遺伝
子は、アクレモニウム・クリソゲナム以外にもペニシリ
ウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）（L.
G.Carr et al:ジーン（Gene），48,257（1986）参
照）、アスパージーラス・ニドランス（Aspergillus ni
dulans）（D.Roman et al:ジーン（Gene），57,171（19
87）参照）、ストレプトマイセス・リプマニ（Steptomy
ces lipmanii）（B.J.Weigel et al:ジャーナル・オブ
・バクテリオロジー（J.Bacteriol.），170,3817（198
8）参照）からもクローン化されている。またデアセト
キシセファロスポリンＣシンセターゼ遺伝子について
も、アクレモニウム・クリンゲナム以外に、ストレプト
マイセス・クラブリゲルス（Streptomyces elavuligeru
s）（B.J.Weigel et al:ジャーナル・オブ・バクテリオ
ロジー（J.Bacteriol.），170,3817（1988）参照）から
もクローン化されている。一方、放線菌などでは抗生物
質の生合成に関与する遺伝子は遺伝子群を形成している
ことが知られており（C.R.Bailey et al:バイオテクノ
ロジー（Biotechnology）,808（1984）参照）、Strepto
myces clavuligerus（特開昭62−198394号公報参照）の
セファマイシン生合成酵素遺伝子群のうちイソペニシリ
ンＮシンセターゼ遺伝子、イソペニシリンＮエピメラー
ゼ遺伝子、デアセトキシセファロスポリンＣシンセター
ゼ遺伝子、Ｏ−カルバモイルデアセチルセファロスポリ
ンC 7−ヒドロキシラーゼ遺伝子を含むDNA断片、ストレ
プトマイセス・カトレア（Streptomyces cattleya）
（特開昭62−224292号公報参照）のセファマイシン生合
成酵素遺伝子群を含む29.3K bpのDNA断片が知られてい
る。
発明が解決しようとする課題 上記のようにカビの場合、よく解析されているβ−ラ
クタム系抗生物質生合成酵素遺伝子はまだ全体の一部に
すぎず、放線菌の場合もセファマイシン生合成酵素遺伝
子群を含むDNA断片が取得されているものの、まだその
構造が十分に解析されているとはいいがたい。セファバ
シン類抗生物質など細菌が生産するβ−ラクタム系抗生
物質の生合成酵素遺伝子については、まだ全く知られて
いない状況にある。
クタム系抗生物質生合成酵素遺伝子はまだ全体の一部に
すぎず、放線菌の場合もセファマイシン生合成酵素遺伝
子群を含むDNA断片が取得されているものの、まだその
構造が十分に解析されているとはいいがたい。セファバ
シン類抗生物質など細菌が生産するβ−ラクタム系抗生
物質の生合成酵素遺伝子については、まだ全く知られて
いない状況にある。
一方、一般的にカビ，放線菌の成育は細菌に比べて遅
いため、醗酵生産物の製造には不利を伴うのみならず、
抗生物質生産に際して形態変化（分化）を必要とするの
で、その制御方法が十分解明されていない現在、生産性
の向上に困難を生ずることも少なくない。これに反し細
菌は成育が速く、製造条件の管理が比較的容易であるた
め、多くの醗酵生産に利用されているものの、β−ラク
タム系抗生物質の生産には未だ用いられていない。した
がって、細菌に対して遺伝子操作技術を駆使することに
よって、カビまたは放線菌を用いた場合よりも生産性の
向上が期待できる。さらに、遺伝子産物を細菌などで生
産しようとする場合、その遺伝子が細菌由来のものであ
れば、遺伝子の発現の強さや安定性に期待が持てる。
いため、醗酵生産物の製造には不利を伴うのみならず、
抗生物質生産に際して形態変化（分化）を必要とするの
で、その制御方法が十分解明されていない現在、生産性
の向上に困難を生ずることも少なくない。これに反し細
菌は成育が速く、製造条件の管理が比較的容易であるた
め、多くの醗酵生産に利用されているものの、β−ラク
タム系抗生物質の生産には未だ用いられていない。した
がって、細菌に対して遺伝子操作技術を駆使することに
よって、カビまたは放線菌を用いた場合よりも生産性の
向上が期待できる。さらに、遺伝子産物を細菌などで生
産しようとする場合、その遺伝子が細菌由来のものであ
れば、遺伝子の発現の強さや安定性に期待が持てる。
課題を解決するための手段 本発明者らは、リゾバクター・ラクタムゲヌス（Lyso
bacter lactamgenus）のDNAからセファバシン類抗生物
質の生合成酵素遺伝子を分離して解析したところ、この
DNA断片に複数の生合成酵素遺伝子が遺伝子群として存
在していることをつきとめ、さらに解析を進めた結果、
それらが、δ−（Ｌ−α−アミノアジピル）−Ｌ−シス
テイニル−Ｄ−バリンシンセターゼ、イソペニシリンＮ
シンセターゼ、イソペニシリンＮエピメラーゼ、デアセ
トキシセファロスポリンＣシンセターゼ、デアセトキシ
セファロスポリンＣハイドロキシラーゼ、β−ラクタマ
ーゼの各遺伝子を含むものからなることを見出し、さら
にそれら遺伝子を大腸菌をはじめとして、カビ，放線菌
などで効率的に発現させうることを知って、本発明を完
成するに至った。すなわち本発明は、 （１）セファロスポリン系抗生物質の生合成に関与する
酵素遺伝子群を有する細菌由来のDNA断片、 （２）該細菌がリゾバクター・ラクタムゲヌスである、
前記（１）のDNA断片、 （３）セファロスポリン系抗生物質の生合成に関与する
酵素遺伝子群が、δ−（Ｌ−α−アミノアジピル）−Ｌ
−システイニル−Ｄ−バリンシンセターゼ、イソペニシ
リンＮシンセターゼ、イソペニシリンＮエピメラーゼ、
デアセトキシセファロスポリンＣシンセターゼ、デアセ
トキシセファロスポリンＣハイドロキシラーゼ、β−ラ
クタマーゼの遺伝子のうち少なくとも１種を含むもので
ある、前記（１）または（２）のDNA断片、 （４）DNA断片の塩基配列が、第１図に示すものである
前記（１）ないし（３）のDNA断片、 （５）前記（１）〜（４）のDNA断片または、それを構
成する少なくとも一つの酵素遺伝子の発現に必要な大き
さのDNA断片を組み込んだプラスミド、 （６）前記（５）のプラスミドで形質転換した微生物お
よび （７）セファロスポリン系抗生物質を産生する能力を有
する前記（６）の形質転換体を培養し、セファロスポリ
ン系抗生物質を培養液中に蓄積させ、それを採取するこ
とを特徴とするセファロスポリン系抗生物質の製造法に
関する。
bacter lactamgenus）のDNAからセファバシン類抗生物
質の生合成酵素遺伝子を分離して解析したところ、この
DNA断片に複数の生合成酵素遺伝子が遺伝子群として存
在していることをつきとめ、さらに解析を進めた結果、
それらが、δ−（Ｌ−α−アミノアジピル）−Ｌ−シス
テイニル−Ｄ−バリンシンセターゼ、イソペニシリンＮ
シンセターゼ、イソペニシリンＮエピメラーゼ、デアセ
トキシセファロスポリンＣシンセターゼ、デアセトキシ
セファロスポリンＣハイドロキシラーゼ、β−ラクタマ
ーゼの各遺伝子を含むものからなることを見出し、さら
にそれら遺伝子を大腸菌をはじめとして、カビ，放線菌
などで効率的に発現させうることを知って、本発明を完
成するに至った。すなわち本発明は、 （１）セファロスポリン系抗生物質の生合成に関与する
酵素遺伝子群を有する細菌由来のDNA断片、 （２）該細菌がリゾバクター・ラクタムゲヌスである、
前記（１）のDNA断片、 （３）セファロスポリン系抗生物質の生合成に関与する
酵素遺伝子群が、δ−（Ｌ−α−アミノアジピル）−Ｌ
−システイニル−Ｄ−バリンシンセターゼ、イソペニシ
リンＮシンセターゼ、イソペニシリンＮエピメラーゼ、
デアセトキシセファロスポリンＣシンセターゼ、デアセ
トキシセファロスポリンＣハイドロキシラーゼ、β−ラ
クタマーゼの遺伝子のうち少なくとも１種を含むもので
ある、前記（１）または（２）のDNA断片、 （４）DNA断片の塩基配列が、第１図に示すものである
前記（１）ないし（３）のDNA断片、 （５）前記（１）〜（４）のDNA断片または、それを構
成する少なくとも一つの酵素遺伝子の発現に必要な大き
さのDNA断片を組み込んだプラスミド、 （６）前記（５）のプラスミドで形質転換した微生物お
よび （７）セファロスポリン系抗生物質を産生する能力を有
する前記（６）の形質転換体を培養し、セファロスポリ
ン系抗生物質を培養液中に蓄積させ、それを採取するこ
とを特徴とするセファロスポリン系抗生物質の製造法に
関する。
本発明において、β−ラクタム系抗生物質を産生する
バクテリアのβ−ラクタム系抗生物質の生合成酵素遺伝
子は、該バクテリアの菌体から公知の方法で分離採取す
ることができる。
バクテリアのβ−ラクタム系抗生物質の生合成酵素遺伝
子は、該バクテリアの菌体から公知の方法で分離採取す
ることができる。
該バクテリアとしては、β−ラクタム系抗生物質を産
生する能力を有する細菌であればとくに制限されない
が、例えばその代表例として、キチノボリン類あるいは
セファバシン類抗生物質の生産菌として知られるリゾバ
クター・ラクタムゲヌス（Lysobacter lactamgenus）、
キサントモナス・ラクタムゲスト（Xanthomonas lactam
gena）、フラボバクテリウム・エスピー（Flavobacteri
umsp.）、フラボバクテリウム・キチノボテム（Flavoba
cterium chitinovorum）等があげられ、その具体例とし
て、リゾバクター・ラクタムゲヌス（Lysobacter lacta
mgenus）YK−90（IFO 14288、FERM BP−575）株、キサ
ントモナス・ラクタムゲナ（Xanthomonas lactamgena）
YK−280（IFO 14330、FERM BP−635）株、同YK−431（I
FO 14385,FERM P−7955）株およびフラボバクテリウム
・キチノボラムFERM− P−7085株等があげられる。上記
のIFO番号は、財団法人発酵研究所（Institute For Fer
metation、Osaka;IFO）における受託番号を、また、FER
M P番号は通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
（FRI）における受託番号を、FERM BP番号はFRIにおけ
るブタペスト条約に基づく受託番号をそれぞれ示す。
生する能力を有する細菌であればとくに制限されない
が、例えばその代表例として、キチノボリン類あるいは
セファバシン類抗生物質の生産菌として知られるリゾバ
クター・ラクタムゲヌス（Lysobacter lactamgenus）、
キサントモナス・ラクタムゲスト（Xanthomonas lactam
gena）、フラボバクテリウム・エスピー（Flavobacteri
umsp.）、フラボバクテリウム・キチノボテム（Flavoba
cterium chitinovorum）等があげられ、その具体例とし
て、リゾバクター・ラクタムゲヌス（Lysobacter lacta
mgenus）YK−90（IFO 14288、FERM BP−575）株、キサ
ントモナス・ラクタムゲナ（Xanthomonas lactamgena）
YK−280（IFO 14330、FERM BP−635）株、同YK−431（I
FO 14385,FERM P−7955）株およびフラボバクテリウム
・キチノボラムFERM− P−7085株等があげられる。上記
のIFO番号は、財団法人発酵研究所（Institute For Fer
metation、Osaka;IFO）における受託番号を、また、FER
M P番号は通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
（FRI）における受託番号を、FERM BP番号はFRIにおけ
るブタペスト条約に基づく受託番号をそれぞれ示す。
β−ラクタム抗生物質の生合成酵素遺伝子をコードす
るDNAは、該バクテリアの染色体DNAもしくはプラスミド
DNAから常法により制限酵素で切り出すことによって得
ることができる。該DNAの調製は、菌体から公知の方
法、たとえば「エクスペリメンツ・ウィズ・ジーン・フ
ュージョンズ」（Experiments with Gene Fusions.198
4、Gold Spring Harbor Laboratory）137〜139頁記載の
DNA分離法に従い、あるいはこれに準じた方法により得
ることができる。該DNAからβ−ラクタム系抗生物質の
生合成酵素遺伝子を含むDNA断片を切り出して、ある宿
主−ベクター系を用いてクローニングするための宿主と
しては特に限定されないが、通常大腸菌が用いられ、具
体的には市販されているエシェリヒア・コリ（Escheric
hia coli）LE392株［ストラタジーン・クローニング・
システム（STRATAGENE Cloning System）社製、USA］が
好ましい。該ベクターとしては、大腸菌に導入しうるも
のであれば如何なるものであっても差し支えないが、pB
R322、pUC18、pUC19などのプラスミドベクターや、λフ
ァージベクターなどが好んで用いられる。具体的には、
市販のラムダ・フイックス（Lambda FIX）［ストラタジ
ーン・クローニング・システム（STRATAGENE Cloning S
ystem）社製、USA］などが例示される。
るDNAは、該バクテリアの染色体DNAもしくはプラスミド
DNAから常法により制限酵素で切り出すことによって得
ることができる。該DNAの調製は、菌体から公知の方
法、たとえば「エクスペリメンツ・ウィズ・ジーン・フ
ュージョンズ」（Experiments with Gene Fusions.198
4、Gold Spring Harbor Laboratory）137〜139頁記載の
DNA分離法に従い、あるいはこれに準じた方法により得
ることができる。該DNAからβ−ラクタム系抗生物質の
生合成酵素遺伝子を含むDNA断片を切り出して、ある宿
主−ベクター系を用いてクローニングするための宿主と
しては特に限定されないが、通常大腸菌が用いられ、具
体的には市販されているエシェリヒア・コリ（Escheric
hia coli）LE392株［ストラタジーン・クローニング・
システム（STRATAGENE Cloning System）社製、USA］が
好ましい。該ベクターとしては、大腸菌に導入しうるも
のであれば如何なるものであっても差し支えないが、pB
R322、pUC18、pUC19などのプラスミドベクターや、λフ
ァージベクターなどが好んで用いられる。具体的には、
市販のラムダ・フイックス（Lambda FIX）［ストラタジ
ーン・クローニング・システム（STRATAGENE Cloning S
ystem）社製、USA］などが例示される。
該DNAからβ−ラクタム系抗生物質の生合成酵素遺伝
子を含むDNA断片を切り出す方法は如何なる方法を用い
てもよいが、通常制限酵素が用いられる。また、該DNA
断片をベクターに挿入する方法は如何なる方法を用いて
もよいが、通常は該DNAを適当な制限酵素を用いて切
断、もしくは部分切断し、一方ベクターDNAを染色体DNA
の切断に用いたものと同じ制限酵素、もしくは切断され
た染色体DNAと連結可能な切断点を生じさせうる制限酵
素を用いて切断したのち、両者をDNAリガーゼの作用に
より連結して、ベクターDNAに染色体DNA断片を挿入した
組換え体DNAとすればよい。
子を含むDNA断片を切り出す方法は如何なる方法を用い
てもよいが、通常制限酵素が用いられる。また、該DNA
断片をベクターに挿入する方法は如何なる方法を用いて
もよいが、通常は該DNAを適当な制限酵素を用いて切
断、もしくは部分切断し、一方ベクターDNAを染色体DNA
の切断に用いたものと同じ制限酵素、もしくは切断され
た染色体DNAと連結可能な切断点を生じさせうる制限酵
素を用いて切断したのち、両者をDNAリガーゼの作用に
より連結して、ベクターDNAに染色体DNA断片を挿入した
組換え体DNAとすればよい。
このような目的に用いられる制限酵素の具体例として
は、例えばモレキュラー・クローニング［（Molecular
Cloning）、Maniatisら著、Cold Spring Horbor Labora
tory,New York 1982年］第100〜101頁記載の制限酵素な
どが単独ないしは適宜組み合わせて用いられる。また必
要に応じてモレキュラー・クローニング第107〜148頁記
載のDNA修飾酵素が適宜用いられる。ここで用いる制限
酵素の切断条件、DNA修飾酵素の反応条件、およびリガ
ーゼによる連結条件は、特に制限はなく通常の反応条件
でよい。
は、例えばモレキュラー・クローニング［（Molecular
Cloning）、Maniatisら著、Cold Spring Horbor Labora
tory,New York 1982年］第100〜101頁記載の制限酵素な
どが単独ないしは適宜組み合わせて用いられる。また必
要に応じてモレキュラー・クローニング第107〜148頁記
載のDNA修飾酵素が適宜用いられる。ここで用いる制限
酵素の切断条件、DNA修飾酵素の反応条件、およびリガ
ーゼによる連結条件は、特に制限はなく通常の反応条件
でよい。
上記により得られた組換え体DNAを宿主に導入するた
めには、公知の方法を用いればよく、たとえばプラスミ
ドをベクターとして用いた場合は、コンピテントセル法
を用いればよく、λ−ファージベクターを用いた場合
は、インビトロ・パッケイジング法を用いればよい。具
体的には、染色体DNAが組み込まれたラムダ・フイック
ス（Lambda FIX）を市販のインビトロ・パッケイジング
キット［例えば、Gigapackgold,ストラタジーン・クロ
ーニング・システム（STRATAGENE Cloning System）社
製、USA］を用いてインビトロ・パッケイジングした
後、大腸菌宿主に感染させ、プラークを形成させればよ
い。目的とするβ−ラクタム系抗生物質の生合成酵素遺
伝子を含むλファージベクターを検出するには、ベクタ
ーDNAに挿入されたDNA断片上にβ−ラクタム系抗生物質
の生合成酵素遺伝子の存在が確認できるものであれば、
如何なる手段を用いてもよく、たとえば宿主のβ−ラク
タム系抗生物質の生合成酵素遺伝子欠損株の相補性を利
用する方法、既知である糸状菌または放線菌のβ−ラク
タム系抗生物質の生合成関連酵素遺伝子またはその一部
を放射能ラベルしてプローブとし、ハイブリダイゼーシ
ョンによって検出する方法などを用いることができる。
具体的には、S.M.Samsonらの報告［ネイチャー（Natur
e），318,191（1985）参照］にあるアクレモニウム・ク
リソゲナム（Acremonium chrysogenum）由来のイソペニ
シリンＮシンセターゼ遺伝子が、プローブとして好適に
用いられる。この場合、既知である糸状菌または放線菌
のβ−ラクタム系抗生物質の生合成酵素遺伝子と、バク
テリアのβ−ラクタム系抗生物質の生合成酵素遺伝子と
は、完全に同一ではないので、通常用いられるハイブリ
ダイゼーションの条件（前記、「モレキュラー・クロー
ニング」第387〜389頁参照）では検出できないこともあ
るので、相同性の低いDNAでも検出できうる条件（たと
えば、通常のハイブリダイゼーション溶液中のホルムア
ミド濃度（50（v/v）％）を約30（v/v）％）を約30（v/
v）％に低下させる）を選択する必要が生じることもあ
る。
めには、公知の方法を用いればよく、たとえばプラスミ
ドをベクターとして用いた場合は、コンピテントセル法
を用いればよく、λ−ファージベクターを用いた場合
は、インビトロ・パッケイジング法を用いればよい。具
体的には、染色体DNAが組み込まれたラムダ・フイック
ス（Lambda FIX）を市販のインビトロ・パッケイジング
キット［例えば、Gigapackgold,ストラタジーン・クロ
ーニング・システム（STRATAGENE Cloning System）社
製、USA］を用いてインビトロ・パッケイジングした
後、大腸菌宿主に感染させ、プラークを形成させればよ
い。目的とするβ−ラクタム系抗生物質の生合成酵素遺
伝子を含むλファージベクターを検出するには、ベクタ
ーDNAに挿入されたDNA断片上にβ−ラクタム系抗生物質
の生合成酵素遺伝子の存在が確認できるものであれば、
如何なる手段を用いてもよく、たとえば宿主のβ−ラク
タム系抗生物質の生合成酵素遺伝子欠損株の相補性を利
用する方法、既知である糸状菌または放線菌のβ−ラク
タム系抗生物質の生合成関連酵素遺伝子またはその一部
を放射能ラベルしてプローブとし、ハイブリダイゼーシ
ョンによって検出する方法などを用いることができる。
具体的には、S.M.Samsonらの報告［ネイチャー（Natur
e），318,191（1985）参照］にあるアクレモニウム・ク
リソゲナム（Acremonium chrysogenum）由来のイソペニ
シリンＮシンセターゼ遺伝子が、プローブとして好適に
用いられる。この場合、既知である糸状菌または放線菌
のβ−ラクタム系抗生物質の生合成酵素遺伝子と、バク
テリアのβ−ラクタム系抗生物質の生合成酵素遺伝子と
は、完全に同一ではないので、通常用いられるハイブリ
ダイゼーションの条件（前記、「モレキュラー・クロー
ニング」第387〜389頁参照）では検出できないこともあ
るので、相同性の低いDNAでも検出できうる条件（たと
えば、通常のハイブリダイゼーション溶液中のホルムア
ミド濃度（50（v/v）％）を約30（v/v）％）を約30（v/
v）％に低下させる）を選択する必要が生じることもあ
る。
ハイブリダイズすることが認められたプラークからλ
ファージを通常の方法で回収し、それを用いてプラーク
ハイブリダイゼーションの操作を数回繰り返すことによ
り、β−ラクタム系抗生物質の生合成酵素遺伝子を含む
染色体DNA断片が挿入されたλファージを分離すること
ができる。このλファージからλDNAを分離し、適当な
制限酵素で切断後、ベクタープラスミドにサブクローニ
ングしたDNA断片とアクレモニウム・クリソゲナム（Acr
emonium chrysogenum）由来のイソペニシリンＮシンセ
ターゼ遺伝子がハイブリダイズするか否かを調べること
によりβ−ラクタム系抗生物質の生合成酵素遺伝子のお
およその位置と大きさを知ることができる。
ファージを通常の方法で回収し、それを用いてプラーク
ハイブリダイゼーションの操作を数回繰り返すことによ
り、β−ラクタム系抗生物質の生合成酵素遺伝子を含む
染色体DNA断片が挿入されたλファージを分離すること
ができる。このλファージからλDNAを分離し、適当な
制限酵素で切断後、ベクタープラスミドにサブクローニ
ングしたDNA断片とアクレモニウム・クリソゲナム（Acr
emonium chrysogenum）由来のイソペニシリンＮシンセ
ターゼ遺伝子がハイブリダイズするか否かを調べること
によりβ−ラクタム系抗生物質の生合成酵素遺伝子のお
およその位置と大きさを知ることができる。
これら一連の基本操作は公知であり、文献［メソッズ
・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）6
8巻1979年、モレキュラー・クローニング（Molecular C
loning）、1982年］に詳細に記載されている。
・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）6
8巻1979年、モレキュラー・クローニング（Molecular C
loning）、1982年］に詳細に記載されている。
β−ラクタム系抗生物質の生合成酵素遺伝子をコード
するDNAの塩基配列は、公知の方法、例えばジデオキシ
合成鎖停止法［添田栄一ら著、「核酸の塩基配列決定
法」第61〜113頁、学会出版センター、1985年、参照］
およびマキシマムギルバート（Maxam Gilbert）法［プ
ロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・オ
ブ・アメリカ，74,5463（1977）参照］あるいはそれら
に準じた方法に従って決定できる。決定したDNA塩基配
列中におけるβ−ラクタム系抗生物質の生合成酵素遺伝
子の正確な位置は、その解析から容易に知ることができ
る。
するDNAの塩基配列は、公知の方法、例えばジデオキシ
合成鎖停止法［添田栄一ら著、「核酸の塩基配列決定
法」第61〜113頁、学会出版センター、1985年、参照］
およびマキシマムギルバート（Maxam Gilbert）法［プ
ロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・オ
ブ・アメリカ，74,5463（1977）参照］あるいはそれら
に準じた方法に従って決定できる。決定したDNA塩基配
列中におけるβ−ラクタム系抗生物質の生合成酵素遺伝
子の正確な位置は、その解析から容易に知ることができ
る。
放線菌などでは、抗生物質に関与する遺伝子は遺伝子
群を形成していることが知られているが、バクテリアの
β−ラクタム系抗生物質の生合成酵素遺伝子が遺伝子群
を形成しているかは、決定したDNA塩基配列を解析する
ことにより知ることができる。例えば、リゾバクター・
ラクタムゲヌス（Lysobacter lactamgenus）YK−90（IF
O14288、FERM P−7247）株から上記の方法でクローン化
した、イソペニシリンＮシンセターゼ遺伝子を含むDNA
断片の塩基配列および該遺伝子の位置は第１図に示すと
おりである。すなわち第１図に示したDNA塩基配列中に
は、インペニシリンＮシンセターゼ遺伝子をコードする
オープン・リーディング・フレーム（ORF）の前後に合
計９個のORFが遺伝子群として存在している。すなわ
ち、ORFIは第１図のDNA塩基配列中、塩基番号5524のATG
（開始コドン）から塩基番号16690のTAG（終止コド
ン）、ORF2は塩基番号16761のATG（開始コドン）から塩
基番号17739のTGA（終止コドン）、ORF3は塩基番号1780
2のATG（開始コドン）から塩基番号18759のTGA（終止コ
ドン）、ORF4は塩基番号18798のATG（開始コドン）から
塩基番号19737のTGA（終止コドン）、ORF5は塩基番号19
802のATG（開始コドン）から塩基番号21059のTGA（終止
コドン）、ORF6は塩基番号21186のATG（開始コドン）か
ら塩基番号2341のTAG（終止コドン）、ORF7は塩基番号4
211のATG（開始コドン）から塩基番号5441のTGA（終止
コドン）、ORF8は塩基番号2887のATG（開始コドン）か
ら塩基番号4198のTGA（終止コドン）、ORF9は塩基番号
６のATG（開始コドン）から塩基番号2817のTGA（終止コ
ドン）である。ここで、イソペニシリンＮシンセターゼ
遺伝子をコードするORFは、後述するようにORF2であ
る。
群を形成していることが知られているが、バクテリアの
β−ラクタム系抗生物質の生合成酵素遺伝子が遺伝子群
を形成しているかは、決定したDNA塩基配列を解析する
ことにより知ることができる。例えば、リゾバクター・
ラクタムゲヌス（Lysobacter lactamgenus）YK−90（IF
O14288、FERM P−7247）株から上記の方法でクローン化
した、イソペニシリンＮシンセターゼ遺伝子を含むDNA
断片の塩基配列および該遺伝子の位置は第１図に示すと
おりである。すなわち第１図に示したDNA塩基配列中に
は、インペニシリンＮシンセターゼ遺伝子をコードする
オープン・リーディング・フレーム（ORF）の前後に合
計９個のORFが遺伝子群として存在している。すなわ
ち、ORFIは第１図のDNA塩基配列中、塩基番号5524のATG
（開始コドン）から塩基番号16690のTAG（終止コド
ン）、ORF2は塩基番号16761のATG（開始コドン）から塩
基番号17739のTGA（終止コドン）、ORF3は塩基番号1780
2のATG（開始コドン）から塩基番号18759のTGA（終止コ
ドン）、ORF4は塩基番号18798のATG（開始コドン）から
塩基番号19737のTGA（終止コドン）、ORF5は塩基番号19
802のATG（開始コドン）から塩基番号21059のTGA（終止
コドン）、ORF6は塩基番号21186のATG（開始コドン）か
ら塩基番号2341のTAG（終止コドン）、ORF7は塩基番号4
211のATG（開始コドン）から塩基番号5441のTGA（終止
コドン）、ORF8は塩基番号2887のATG（開始コドン）か
ら塩基番号4198のTGA（終止コドン）、ORF9は塩基番号
６のATG（開始コドン）から塩基番号2817のTGA（終止コ
ドン）である。ここで、イソペニシリンＮシンセターゼ
遺伝子をコードするORFは、後述するようにORF2であ
る。
ORFにコードされているタンパク質（酵素）の機能を
決定する方法としては、大腸菌やシュードモナス・プチ
ダなどの宿主−ベクター系を用いてORFにコードされて
いるタンパク質を菌体内で発現させ、その酵素活性を調
べる方法、既知である糸状菌または放線菌のβ−ラクタ
ム系抗生物質の生合成酵素のアミノ酸配列とORFにコー
ドされているタンパク質のアミノ酸配列を比較する方
法、既知のβ−ラクタム系抗生物質の生合成欠損株を宿
主としORFにコードされているタンパク質を菌体内で発
現させ、その生合成欠損の相補性を調べる方法などが例
示される。
決定する方法としては、大腸菌やシュードモナス・プチ
ダなどの宿主−ベクター系を用いてORFにコードされて
いるタンパク質を菌体内で発現させ、その酵素活性を調
べる方法、既知である糸状菌または放線菌のβ−ラクタ
ム系抗生物質の生合成酵素のアミノ酸配列とORFにコー
ドされているタンパク質のアミノ酸配列を比較する方
法、既知のβ−ラクタム系抗生物質の生合成欠損株を宿
主としORFにコードされているタンパク質を菌体内で発
現させ、その生合成欠損の相補性を調べる方法などが例
示される。
本発明者らは、上記のORFを大腸菌およびシュードモ
ナス・プチダ内での発現と、他の微生物由来の既知のβ
−ラクタム系抗生物質生合成酵素のアミノ酸配列との比
較から、ORF1はδ−（Ｌ−α−アミノアジピル）−Ｌ−
システイニル−Ｄ−バリンシンセターゼ、ORF2はイソペ
ニシリンＮシンセターゼ、ORF3はデアセトキシセファロ
スポリンＣシンセターゼ、ORF4はデアセトキシセファロ
スポリンＣハイドロキシラーゼ、ORF5はイソペニシリン
Ｎエピメラーゼ、ORF6はβ−ラクタマーゼをコードして
いることを明らかにした。すなわち細菌においても放線
菌の場合と同様、β−ラクタム系抗生物質生合成酵素遺
伝子が遺伝子群を形成していることをはじめて明らかに
することができた。
ナス・プチダ内での発現と、他の微生物由来の既知のβ
−ラクタム系抗生物質生合成酵素のアミノ酸配列との比
較から、ORF1はδ−（Ｌ−α−アミノアジピル）−Ｌ−
システイニル−Ｄ−バリンシンセターゼ、ORF2はイソペ
ニシリンＮシンセターゼ、ORF3はデアセトキシセファロ
スポリンＣシンセターゼ、ORF4はデアセトキシセファロ
スポリンＣハイドロキシラーゼ、ORF5はイソペニシリン
Ｎエピメラーゼ、ORF6はβ−ラクタマーゼをコードして
いることを明らかにした。すなわち細菌においても放線
菌の場合と同様、β−ラクタム系抗生物質生合成酵素遺
伝子が遺伝子群を形成していることをはじめて明らかに
することができた。
このようにして解析した各々のORF,すなわちβ−ラク
タム系抗生物質生合成酵素の構造遺伝子を含むDNA断片
は、種々の宿主で該遺伝子を発現させるためのDNA断片
として用いることができる。この場合、DNA断片の大き
さとしては、遺伝子の発現に必要な大きさの断片、すな
わち各々のORFの開始コドン（ATG）から終止コドン（TA
GまたはTGA）を含むものであればさしつかえない。
タム系抗生物質生合成酵素の構造遺伝子を含むDNA断片
は、種々の宿主で該遺伝子を発現させるためのDNA断片
として用いることができる。この場合、DNA断片の大き
さとしては、遺伝子の発現に必要な大きさの断片、すな
わち各々のORFの開始コドン（ATG）から終止コドン（TA
GまたはTGA）を含むものであればさしつかえない。
以下にこの遺伝子群の産業上の応用方法について説明
する。
する。
β−ラクタム系抗生物質産生微生物のβ−ラクタム系
抗生物質産生能を増大させるためにβ−ラクタム系抗生
物質の生合成酵素遺伝子は有用である。β−ラクタム系
抗生物質産生能は、β−ラクタム系抗生物質の生合成酵
素に依存しているので、生合成酵素遺伝子を導入するこ
とによる生合成酵素の活性の増加は、β−ラクタム系抗
生物質産生能を増大させうる。β−ラクタム系抗生物質
産生能を有する微生物の具体例としては、アクレモニウ
ム・クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）、ペニシ
リウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）、
ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Streptomyces c
lavuligerus）、リゾバクター・ラクタムゲヌス（Lysob
acter lactamgenus）、キサントモナス・ラクタムゲナ
（Xanthomonas lactamgena）、フラボバクテリウム・キ
チノボラム（Flavobacterium chitinovorum）などが例
示される。β−ラクタム系抗生物質産生能を有する微生
物にβ−ラクタム系抗生物質の生合成酵素遺伝子を導入
する方法としては、通常の形質転換法が用いられる。生
合成酵素遺伝子は単独でもさしつかえないが、さらに複
数のβ−ラクタム系抗生物質の生合成酵素遺伝子を、同
時に形質転換してもよい。
抗生物質産生能を増大させるためにβ−ラクタム系抗生
物質の生合成酵素遺伝子は有用である。β−ラクタム系
抗生物質産生能は、β−ラクタム系抗生物質の生合成酵
素に依存しているので、生合成酵素遺伝子を導入するこ
とによる生合成酵素の活性の増加は、β−ラクタム系抗
生物質産生能を増大させうる。β−ラクタム系抗生物質
産生能を有する微生物の具体例としては、アクレモニウ
ム・クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）、ペニシ
リウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）、
ストレプトマイセス・クラブリゲルス（Streptomyces c
lavuligerus）、リゾバクター・ラクタムゲヌス（Lysob
acter lactamgenus）、キサントモナス・ラクタムゲナ
（Xanthomonas lactamgena）、フラボバクテリウム・キ
チノボラム（Flavobacterium chitinovorum）などが例
示される。β−ラクタム系抗生物質産生能を有する微生
物にβ−ラクタム系抗生物質の生合成酵素遺伝子を導入
する方法としては、通常の形質転換法が用いられる。生
合成酵素遺伝子は単独でもさしつかえないが、さらに複
数のβ−ラクタム系抗生物質の生合成酵素遺伝子を、同
時に形質転換してもよい。
該形質転換体を用いてβ−ラクタム系抗生物質を生産
させる場合、形質転換株が同化しうる炭素源、資化しう
る窒素源その他を含有する培地が用いられる。炭素源と
しては同化しうるものであれば何でもよく、例えばグル
コース、シュークロース、澱粉、可溶性澱粉、グリセリ
ン、ｎ−パラフィンをはじめ、酢酸、フマール酸、安息
香酸などの有機酸類、エタノール、ブタノールなどのア
ルコール類、油脂類（例、大豆油、ラード油）などが単
独でまたは混合して用いられる。また窒素源としては例
えばペプトン、大豆粉、肉エキス、綿実粉、乾燥酵母、
酵母エキス、コーン・スティーブ・リカー、プロフロ、
コーングルテンミール、尿素、アンモニウム塩類（例、
塩化アンモニウム）、硝酸塩類（例、硝酸カリウム）、
その他有機または無機の窒素含有物（例、NZアミン
（Ａ）、硫安）が単独でまたは混合して用いられる。ま
た、前駆体や硫黄源としてメチオニン、システインを添
加したり、バリンなどのアミノ酸を添加してもよい。そ
の他培地成分の無機塩としては、各種リン酸塩（例、リ
ン酸カリウム）、硫酸塩（例、硫酸ナトリウム）、塩酸
塩（例、塩化マグネシウム）などが用いられる。鉄、マ
グネシウム、カルシウム、マンガン、コバルトなどの各
イオンの添加は菌の成育およびセファロスポリン系抗生
物質の生産、安定性などに関係が深い。硫黄源としてチ
オ硫酸ナトリウムやチオ尿素などの添加も有効であり、
さらに消泡剤も適宜用いられる。これら使用する培地原
料は使用する菌株、培養に利用する条件などに応じて適
宜に組合わせ、もしくは選択されうる。実際の培養にあ
たっての培養温度、培養期間、培地のpH、通気撹拌など
の培養条件は使用する菌株、培地組成などによって一定
しないが、目的とするセファロスポリン系抗生物質の蓄
積量が最大になるように選択調節されればよい。一般
に、培養温度は、20〜30℃、培養期間は４〜14日、培地
のpHは5.0〜9.0で好気的に培養を行なうと、培養液中の
セファロスポリン系抗生物質の蓄積は最高に達する。
させる場合、形質転換株が同化しうる炭素源、資化しう
る窒素源その他を含有する培地が用いられる。炭素源と
しては同化しうるものであれば何でもよく、例えばグル
コース、シュークロース、澱粉、可溶性澱粉、グリセリ
ン、ｎ−パラフィンをはじめ、酢酸、フマール酸、安息
香酸などの有機酸類、エタノール、ブタノールなどのア
ルコール類、油脂類（例、大豆油、ラード油）などが単
独でまたは混合して用いられる。また窒素源としては例
えばペプトン、大豆粉、肉エキス、綿実粉、乾燥酵母、
酵母エキス、コーン・スティーブ・リカー、プロフロ、
コーングルテンミール、尿素、アンモニウム塩類（例、
塩化アンモニウム）、硝酸塩類（例、硝酸カリウム）、
その他有機または無機の窒素含有物（例、NZアミン
（Ａ）、硫安）が単独でまたは混合して用いられる。ま
た、前駆体や硫黄源としてメチオニン、システインを添
加したり、バリンなどのアミノ酸を添加してもよい。そ
の他培地成分の無機塩としては、各種リン酸塩（例、リ
ン酸カリウム）、硫酸塩（例、硫酸ナトリウム）、塩酸
塩（例、塩化マグネシウム）などが用いられる。鉄、マ
グネシウム、カルシウム、マンガン、コバルトなどの各
イオンの添加は菌の成育およびセファロスポリン系抗生
物質の生産、安定性などに関係が深い。硫黄源としてチ
オ硫酸ナトリウムやチオ尿素などの添加も有効であり、
さらに消泡剤も適宜用いられる。これら使用する培地原
料は使用する菌株、培養に利用する条件などに応じて適
宜に組合わせ、もしくは選択されうる。実際の培養にあ
たっての培養温度、培養期間、培地のpH、通気撹拌など
の培養条件は使用する菌株、培地組成などによって一定
しないが、目的とするセファロスポリン系抗生物質の蓄
積量が最大になるように選択調節されればよい。一般
に、培養温度は、20〜30℃、培養期間は４〜14日、培地
のpHは5.0〜9.0で好気的に培養を行なうと、培養液中の
セファロスポリン系抗生物質の蓄積は最高に達する。
培養の結果、得られた培養液中にはセファロスポリン
系抗生物質が生成蓄積される。セファロスポリン系抗生
物質の大部分は培養ろ液中に存在するので、培養液を遠
心分離あるいはろ過により菌体を除去した液体部分から
これを得るのが好ましい。セファロスポリン系抗生物質
を分別採取するには、公知の方法、たとえば弱酸性有機
物の一般的な分別採取法が準用できる。すなわちイオン
交換樹脂（例、アンバーライトIRA−900）、活性炭、セ
ルロース、シリカゲルなどを用いるクロマトグラフィー
あるいはゲルろ過法などを組み合わせることにより有利
に目的物を採取することができる。なおセファロスポリ
ン系抗生物質の定量には薄層クロマトグラフィーで各成
分を分離後、被検菌に対する抗菌力を測定する方法、ま
たはネイチャー（Nature）第246巻、154頁（1973）に記
載されているセファロスポリナーゼを用いる方法が用い
られる。またセファロスポリン系抗生物質の同定には元
素分析、核磁気共鳴スペクトル、ろ紙電気泳動、薄層ク
ロマトグラフィーなどが用いられる。
系抗生物質が生成蓄積される。セファロスポリン系抗生
物質の大部分は培養ろ液中に存在するので、培養液を遠
心分離あるいはろ過により菌体を除去した液体部分から
これを得るのが好ましい。セファロスポリン系抗生物質
を分別採取するには、公知の方法、たとえば弱酸性有機
物の一般的な分別採取法が準用できる。すなわちイオン
交換樹脂（例、アンバーライトIRA−900）、活性炭、セ
ルロース、シリカゲルなどを用いるクロマトグラフィー
あるいはゲルろ過法などを組み合わせることにより有利
に目的物を採取することができる。なおセファロスポリ
ン系抗生物質の定量には薄層クロマトグラフィーで各成
分を分離後、被検菌に対する抗菌力を測定する方法、ま
たはネイチャー（Nature）第246巻、154頁（1973）に記
載されているセファロスポリナーゼを用いる方法が用い
られる。またセファロスポリン系抗生物質の同定には元
素分析、核磁気共鳴スペクトル、ろ紙電気泳動、薄層ク
ロマトグラフィーなどが用いられる。
また、第１図に示したDNA塩基配列の一部もしくは全
部をハイブリダイゼーションのプローブとして用いるこ
とにより、他のβ−ラクタム系抗生物質産生微生物から
β−ラクタム系抗生物質の生合成酵素遺伝子、もしくは
遺伝子群をクローン化することが可能となる。かくして
得られた遺伝子（群）を用いて、さらに上記の如き操作
を経て核微生物のβ−ラクタム系抗生物質の生産性を向
上させることも可能である。
部をハイブリダイゼーションのプローブとして用いるこ
とにより、他のβ−ラクタム系抗生物質産生微生物から
β−ラクタム系抗生物質の生合成酵素遺伝子、もしくは
遺伝子群をクローン化することが可能となる。かくして
得られた遺伝子（群）を用いて、さらに上記の如き操作
を経て核微生物のβ−ラクタム系抗生物質の生産性を向
上させることも可能である。
さらに、全くβ−ラクタム系抗生物質を産生しない微
生物に、β−ラクタム系抗生物質の生合成酵素遺伝子群
を導入することによりβ−ラクタム系抗生物質の産生能
を付与することが可能となる。このような目的の微生物
としては、β−ラクタム系抗生物質を産生しない微生物
であれば如何なるものでもよいが、好ましくはその菌体
内にセファロスポリン系抗生物質の前駆体である、Ｌ−
バリン、Ｌ−システイン、Ｌ−α−アミノアジピン酸が
存在する微生物が用いられる。その具体例としてはシュ
ードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）などが例示
される。しかしこれらの前駆体が存在しない微生物も、
それを生合成するのに必要な酵素遺伝子をβ−ラクタム
系抗生物質の生合成酵素遺伝子群と同時に導入すること
によりβ−ラクタム系抗生物質の産生能を付与すること
が可能となる。
生物に、β−ラクタム系抗生物質の生合成酵素遺伝子群
を導入することによりβ−ラクタム系抗生物質の産生能
を付与することが可能となる。このような目的の微生物
としては、β−ラクタム系抗生物質を産生しない微生物
であれば如何なるものでもよいが、好ましくはその菌体
内にセファロスポリン系抗生物質の前駆体である、Ｌ−
バリン、Ｌ−システイン、Ｌ−α−アミノアジピン酸が
存在する微生物が用いられる。その具体例としてはシュ
ードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）などが例示
される。しかしこれらの前駆体が存在しない微生物も、
それを生合成するのに必要な酵素遺伝子をβ−ラクタム
系抗生物質の生合成酵素遺伝子群と同時に導入すること
によりβ−ラクタム系抗生物質の産生能を付与すること
が可能となる。
さらに、第１図に示したDNA塩基配列中のβ−ラクタ
ム系抗生物質の生合成酵素をコードする構造遺伝子を適
当な宿主で大量に発現させることは、通常の遺伝子操作
技術を用いることにより可能である。大量に発現させる
ための宿主としては特に制限はないが、大腸菌をもちい
るのが適切である。ベクターとしては、通常大腸菌で用
いられるものであれば如何なるものでもよく、例えば先
に記述したものが用いられる。この場合、遺伝子を大量
に発現させるために大腸菌で効率よく働くプロモーター
の下流に、該構造遺伝子を接続するのが望ましい。該プ
ロモーターの具体例としては、よく知られているlac、t
rp、tac、λpLプロモーターなどが例示される。また市
販の発現ベクタープラスミド、たとえばpK K233−２
（ファルマシア製、スウェーデン）や、それらの誘導体
を用いてもよい。このようにして大量に発現させた宿主
からβ−ラクタム系抗生物質の生合成酵素は、通常の酵
素精製法で単離、精製される。単離、精製されたβ−ラ
クタム系抗生物質の生合成酵素は、無細胞系で、たとえ
ば固定化酵素として用いることにより、β−ラクタム系
抗生物質（非天然のβ−ラクタム系抗生物質を含む）の
製造にもちいることができる。
ム系抗生物質の生合成酵素をコードする構造遺伝子を適
当な宿主で大量に発現させることは、通常の遺伝子操作
技術を用いることにより可能である。大量に発現させる
ための宿主としては特に制限はないが、大腸菌をもちい
るのが適切である。ベクターとしては、通常大腸菌で用
いられるものであれば如何なるものでもよく、例えば先
に記述したものが用いられる。この場合、遺伝子を大量
に発現させるために大腸菌で効率よく働くプロモーター
の下流に、該構造遺伝子を接続するのが望ましい。該プ
ロモーターの具体例としては、よく知られているlac、t
rp、tac、λpLプロモーターなどが例示される。また市
販の発現ベクタープラスミド、たとえばpK K233−２
（ファルマシア製、スウェーデン）や、それらの誘導体
を用いてもよい。このようにして大量に発現させた宿主
からβ−ラクタム系抗生物質の生合成酵素は、通常の酵
素精製法で単離、精製される。単離、精製されたβ−ラ
クタム系抗生物質の生合成酵素は、無細胞系で、たとえ
ば固定化酵素として用いることにより、β−ラクタム系
抗生物質（非天然のβ−ラクタム系抗生物質を含む）の
製造にもちいることができる。
これら遺伝子群を応用する場合、第１図に示したDNA
塩基配列中のβ−ラクタム系抗生物質の生合成酵素をコ
ードする構造遺伝子をそのまま用いてもさしつかえない
が、その機能が失われないかぎりは、DNA塩基配列を改
変して用いてもよい。たとえば、DNA塩基配列の改変法
としては、部位特異的変異法（Site directed mutagene
sis）、化学合成DNAを用いる方法など通常の方法が例示
される。また異種の宿主で発現させる場合などに、アミ
ノ酸コドンをその宿主での発現に好都合なアミノ酸コド
ンに変化するようにDNA塩基配列を改変して用いてもよ
い。さらにそれぞれのβ−ラクタム系抗生物質の生合成
酵素遺伝子のDNA塩基配列を改変することにより、基質
特異性、Km値、至適pH、至適温度などの酵素の機能が変
化した変異酵素を作製して用いてもよい。
塩基配列中のβ−ラクタム系抗生物質の生合成酵素をコ
ードする構造遺伝子をそのまま用いてもさしつかえない
が、その機能が失われないかぎりは、DNA塩基配列を改
変して用いてもよい。たとえば、DNA塩基配列の改変法
としては、部位特異的変異法（Site directed mutagene
sis）、化学合成DNAを用いる方法など通常の方法が例示
される。また異種の宿主で発現させる場合などに、アミ
ノ酸コドンをその宿主での発現に好都合なアミノ酸コド
ンに変化するようにDNA塩基配列を改変して用いてもよ
い。さらにそれぞれのβ−ラクタム系抗生物質の生合成
酵素遺伝子のDNA塩基配列を改変することにより、基質
特異性、Km値、至適pH、至適温度などの酵素の機能が変
化した変異酵素を作製して用いてもよい。
実施例 以下に実施例および参考例を挙げて、本発明の内容を
より具体的に説明するが、これらはいずれも本発明の内
容を例示するものであり、本発明の範囲を限定するもの
ではない。なお以下において％（パーセント）は特にこ
とわりのない限り重量／容量パーセントを示すものとす
る。
より具体的に説明するが、これらはいずれも本発明の内
容を例示するものであり、本発明の範囲を限定するもの
ではない。なお以下において％（パーセント）は特にこ
とわりのない限り重量／容量パーセントを示すものとす
る。
実施例１ アクレモニウム・クリソゲナムのIPS遺伝子
のクローニング １）アクレモニウム・クリソゲナムの染色体DNAの調製 アクレモニウム・クリソゲナムATCC 11550株の凍結保
存菌体をサッカロース30g/l、肉エキス15g/l、コーン・
スティープ・リカー5g/lおよびCaCl3 1.5g/lを含む培地
（pH7.0）に接種し、28℃で48時間、回転式振盪機（200
rpm）上で培養した。培養液１をろ別して得られる菌
体から、P.F.Hamlynらの方法［エンザイム・マイクロバ
イオロジカル・テクノロジー（Enzyme Microbiological
Technology）3,321（1981）参照］に従ってプロトプラ
ストを調製した。得られたプロトプラストからD.R.Crye
rらの方法［メソッド・イン・セル・バイオロジー（Met
hod in Cell Biology）XII、39（1975）参照］に従い、
約5mgの染色体DNAを得た。
のクローニング １）アクレモニウム・クリソゲナムの染色体DNAの調製 アクレモニウム・クリソゲナムATCC 11550株の凍結保
存菌体をサッカロース30g/l、肉エキス15g/l、コーン・
スティープ・リカー5g/lおよびCaCl3 1.5g/lを含む培地
（pH7.0）に接種し、28℃で48時間、回転式振盪機（200
rpm）上で培養した。培養液１をろ別して得られる菌
体から、P.F.Hamlynらの方法［エンザイム・マイクロバ
イオロジカル・テクノロジー（Enzyme Microbiological
Technology）3,321（1981）参照］に従ってプロトプラ
ストを調製した。得られたプロトプラストからD.R.Crye
rらの方法［メソッド・イン・セル・バイオロジー（Met
hod in Cell Biology）XII、39（1975）参照］に従い、
約5mgの染色体DNAを得た。
２）アクレモニウム・クリソゲナムのジーンライブラリ
の作製 上記１）項で得た染色体DNA30μｇに5.4ユニットの制
限酵素MboＩを37℃で20分間作用させ部分切断した後、d
A TPとdG TPの存在下でDNAポリメレースＩ・ラージ フ
ラグメント（DNA polymerase I large fragment）（宝
酒造製）を作用させた。これとファージベクターλFix
のXhoＩ切断断片、パーシアル・フイル−イン・アーム
（partial fill−in arm）（ストラタジーン・クローニ
ング・システム社製、USA）とをT4DNA リガーゼ（T4DN
A ligase）により連結した。この連結反応液を、ギガパ
ック ゴールド（Gigapack gold）（ストラタジーン・
クローニング・システム社製、USA）を用いて、イン
ビトロ・パッケイジング（in vitro packaging）を行な
った。以上のようにして作製したジーンライブラリ（ge
ne library）のタイターは、指示細菌として大腸菌LE39
2を用いて前記「モレキュラー・クローニング」第64頁
に記載の方法により調べた結果、6.5×106pfu/mlであっ
た。
の作製 上記１）項で得た染色体DNA30μｇに5.4ユニットの制
限酵素MboＩを37℃で20分間作用させ部分切断した後、d
A TPとdG TPの存在下でDNAポリメレースＩ・ラージ フ
ラグメント（DNA polymerase I large fragment）（宝
酒造製）を作用させた。これとファージベクターλFix
のXhoＩ切断断片、パーシアル・フイル−イン・アーム
（partial fill−in arm）（ストラタジーン・クローニ
ング・システム社製、USA）とをT4DNA リガーゼ（T4DN
A ligase）により連結した。この連結反応液を、ギガパ
ック ゴールド（Gigapack gold）（ストラタジーン・
クローニング・システム社製、USA）を用いて、イン
ビトロ・パッケイジング（in vitro packaging）を行な
った。以上のようにして作製したジーンライブラリ（ge
ne library）のタイターは、指示細菌として大腸菌LE39
2を用いて前記「モレキュラー・クローニング」第64頁
に記載の方法により調べた結果、6.5×106pfu/mlであっ
た。
３）イソペニシリンＮシンセターゼ遺伝子検索プローブ
の調製 S.M.Samsonらの報告［Nature.318,191（1985）参照］
をもとに、第２図に示すDNAオリゴマーを調製した。
の調製 S.M.Samsonらの報告［Nature.318,191（1985）参照］
をもとに、第２図に示すDNAオリゴマーを調製した。
４）ジーンライブラリからのIPS遺伝子のスクリーニン
グ 上記３）項で作製したジーンライブラリをプレートあ
たり6000個のプラークが出現するようにSM（NaCl5.8g/
l,MgSO4・７H2O2g/l,50mMトリス−塩酸（pH7.5）,0.01
％ゼラチンを含む，前記「モレキュラー・クローニン
グ」第70頁参照）で希釈したのち、指示細菌として大腸
菌LE392を用いてプレート上にプラークを出現させた。
このプレートから前記「モレキュラー・クローニング」
の第320〜321頁に記載の方法に従ってプラークをニトロ
セルロースフィルターにリフトした。前記「モレキュラ
ー・クローニング」、第396頁記載の方法で第２図のDNA
オリゴマーの５′末端をT4ポリヌクレオチド・キナーゼ
「γ−32P］ATPを用いて32Pで放射能ラベルした。これ
をプローブとして、プラーク・ハイブリダイゼーション
（前記「モレキュラー・クローニング」、第326〜328頁
参照）を行なった。プローブとハイブリダイズが認めら
れたポジティブプラークから前記、「モレキュラー・ク
ローニング」第371〜372頁記載の方法に従いλDNAを分
離した。得られたλDNAを、制限酵素BamHIで切断したの
ち、アガロースゲル（0.8％）電気泳動した。この電気
泳動ゲルから、サザン（Southern）法（前記「モレキュ
ラー・クローニング」、第382〜386頁参照）により、ニ
トロセルロースフィルターにDNAを転写した。32Pでラベ
ルした第２図のDNAオリゴマーと、上記DNA結合ニトロセ
ルロースフィルターのサザン雑種形成（前記「モレキュ
ラー・クローニング」、第387〜389頁参照）を行なっ
た。その結果、3.1KbpのBamHI断片とハイブリダイズが
認められた。
グ 上記３）項で作製したジーンライブラリをプレートあ
たり6000個のプラークが出現するようにSM（NaCl5.8g/
l,MgSO4・７H2O2g/l,50mMトリス−塩酸（pH7.5）,0.01
％ゼラチンを含む，前記「モレキュラー・クローニン
グ」第70頁参照）で希釈したのち、指示細菌として大腸
菌LE392を用いてプレート上にプラークを出現させた。
このプレートから前記「モレキュラー・クローニング」
の第320〜321頁に記載の方法に従ってプラークをニトロ
セルロースフィルターにリフトした。前記「モレキュラ
ー・クローニング」、第396頁記載の方法で第２図のDNA
オリゴマーの５′末端をT4ポリヌクレオチド・キナーゼ
「γ−32P］ATPを用いて32Pで放射能ラベルした。これ
をプローブとして、プラーク・ハイブリダイゼーション
（前記「モレキュラー・クローニング」、第326〜328頁
参照）を行なった。プローブとハイブリダイズが認めら
れたポジティブプラークから前記、「モレキュラー・ク
ローニング」第371〜372頁記載の方法に従いλDNAを分
離した。得られたλDNAを、制限酵素BamHIで切断したの
ち、アガロースゲル（0.8％）電気泳動した。この電気
泳動ゲルから、サザン（Southern）法（前記「モレキュ
ラー・クローニング」、第382〜386頁参照）により、ニ
トロセルロースフィルターにDNAを転写した。32Pでラベ
ルした第２図のDNAオリゴマーと、上記DNA結合ニトロセ
ルロースフィルターのサザン雑種形成（前記「モレキュ
ラー・クローニング」、第387〜389頁参照）を行なっ
た。その結果、3.1KbpのBamHI断片とハイブリダイズが
認められた。
５）IPS遺伝子のサブクローニング 上記４）項で得たλDNAを制限酵素BamHIで切断したの
ち、3.1KbpのBamHI断片をアガロースゲル（1.0％）電気
泳動（前記「モレキュラー・クローニング」、第150〜1
62頁参照）および電気泳動溶出法（高木康敬著「遺伝子
操作マニュアル」第33頁、講談社サイエンティフィク、
1982年参照）により単離した。一方ベクタープラスミド
pUC18を制限酵素BamHIで切断した。このようにして得ら
れた２種類のDNA断片を混合し、T4DNAリガーゼで連結反
応を行なった。この連結反応液を用いて大腸菌JM109株
を形質転換することにより、pUC18のBamHIサイトに3.1K
bpのBamHI断片（アクレモニウム・クリソゲナムのISP遺
伝子を含む）が挿入されたプラスミドpISP6（第３図参
照）を作製することにより、サブクローン化した。
ち、3.1KbpのBamHI断片をアガロースゲル（1.0％）電気
泳動（前記「モレキュラー・クローニング」、第150〜1
62頁参照）および電気泳動溶出法（高木康敬著「遺伝子
操作マニュアル」第33頁、講談社サイエンティフィク、
1982年参照）により単離した。一方ベクタープラスミド
pUC18を制限酵素BamHIで切断した。このようにして得ら
れた２種類のDNA断片を混合し、T4DNAリガーゼで連結反
応を行なった。この連結反応液を用いて大腸菌JM109株
を形質転換することにより、pUC18のBamHIサイトに3.1K
bpのBamHI断片（アクレモニウム・クリソゲナムのISP遺
伝子を含む）が挿入されたプラスミドpISP6（第３図参
照）を作製することにより、サブクローン化した。
実施例２ リゾバクター・ラクタムゲヌスのIPS遺伝子
のクローニング １）リゾバクター・ラクタムゲヌスの染色体DNAの調製 リゾバクター・ラクタムゲヌスYK−90（IFO 14288,FE
RM BP−575）の凍結保存菌体を、TYG培地（酵母エキス
2.5g/l、バクトトリプトン5g/l、グルコース1g/lを含
む）100mlに接種して回転式振盪機（200rpm）上で、24
℃、24時間培養した。遠心分離（6000G、５分）により
得られた菌体から「エクスペリメンツ・ウィズ・ジーン
・フュージョンズ」（Experiments with Gene Fusions.
1984、Gold Spring Harbor Laboratory）137〜139頁記
載の染色体DNA分離法に従い、約1mgの染色体DNAを得
た。
のクローニング １）リゾバクター・ラクタムゲヌスの染色体DNAの調製 リゾバクター・ラクタムゲヌスYK−90（IFO 14288,FE
RM BP−575）の凍結保存菌体を、TYG培地（酵母エキス
2.5g/l、バクトトリプトン5g/l、グルコース1g/lを含
む）100mlに接種して回転式振盪機（200rpm）上で、24
℃、24時間培養した。遠心分離（6000G、５分）により
得られた菌体から「エクスペリメンツ・ウィズ・ジーン
・フュージョンズ」（Experiments with Gene Fusions.
1984、Gold Spring Harbor Laboratory）137〜139頁記
載の染色体DNA分離法に従い、約1mgの染色体DNAを得
た。
２）リゾバクター・ラクタムゲヌスのジーンライブラリ
（gene library）の作製 上記１）項で得た染色体DNA30μｇに5.4ユニットの制
限酵素MobＩを37℃で20分間作用させ、部分切断した
後、dATPとdGTPの存在下でDNAポリメレースＩ・ラージ
フラグメント（DNA polymerase I large fragment）
（宝酒造製）を作用させた。これとファージベクターλ
FixのXhoＩ切断断片、パーシアル フイル−イン・アー
ム（partial fill−in arm）（ストラタジーン・クロー
ニング・システム社製、USA）とをT4DNAリガーゼ（T4DN
A ligase）により連結した。この連結反応液を、ギガパ
ックゴールド（Gigapack gold）（ストラタジーン・ク
ローニング・システム社製、USA）を用いて、イン ビ
トロ・パッケイジング（in vitro packaging）を行なっ
た。以上のようにして作製したジーンライブラリのタイ
ターは、指示細菌として大腸菌LE392を用いて前記と同
様の方法で調べた結果、8.6×106pfu/mlであった。
（gene library）の作製 上記１）項で得た染色体DNA30μｇに5.4ユニットの制
限酵素MobＩを37℃で20分間作用させ、部分切断した
後、dATPとdGTPの存在下でDNAポリメレースＩ・ラージ
フラグメント（DNA polymerase I large fragment）
（宝酒造製）を作用させた。これとファージベクターλ
FixのXhoＩ切断断片、パーシアル フイル−イン・アー
ム（partial fill−in arm）（ストラタジーン・クロー
ニング・システム社製、USA）とをT4DNAリガーゼ（T4DN
A ligase）により連結した。この連結反応液を、ギガパ
ックゴールド（Gigapack gold）（ストラタジーン・ク
ローニング・システム社製、USA）を用いて、イン ビ
トロ・パッケイジング（in vitro packaging）を行なっ
た。以上のようにして作製したジーンライブラリのタイ
ターは、指示細菌として大腸菌LE392を用いて前記と同
様の方法で調べた結果、8.6×106pfu/mlであった。
３）ジーンライブラリからのIPS遺伝子のスクリーニン
グ 上記２）項で作製したジーンライブラリをプレートあ
たり6000個のプラークが出現するようにSMで希釈したの
ち、指示細菌として大腸菌LE392を用いてプレート上に
プラークを出現させた。このプレートから前記「モレキ
ュラー・クローニング」の第320〜321頁に記載の方法に
従ってプラークをニトロセルロースフィルターにリフト
した。ニックトランスレーション法（前記「モレキュラ
ー・クローニング」、第109〜112頁参照）により32Pで
放射能ラベルしたプラスミドpIPS6の1.9KbpのNcoＩ−Ba
mHI断片（アクレモニウム・クリソゲナムのIPS遺伝子を
含む）をプローブとして、プラークハイブリダイゼーシ
ョン（前記「モレキュラー・クローニング」、第326〜3
28頁参照）を30（v/v）％ホルムアミド、0.75M塩化ナト
リウム、0.075Mクエン酸ナトリウム、0.5％ドデシル硫
酸ナトリウム、50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）および1
00μg/ml熱変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーシ
ョン溶液中で42℃、16時間行った。
グ 上記２）項で作製したジーンライブラリをプレートあ
たり6000個のプラークが出現するようにSMで希釈したの
ち、指示細菌として大腸菌LE392を用いてプレート上に
プラークを出現させた。このプレートから前記「モレキ
ュラー・クローニング」の第320〜321頁に記載の方法に
従ってプラークをニトロセルロースフィルターにリフト
した。ニックトランスレーション法（前記「モレキュラ
ー・クローニング」、第109〜112頁参照）により32Pで
放射能ラベルしたプラスミドpIPS6の1.9KbpのNcoＩ−Ba
mHI断片（アクレモニウム・クリソゲナムのIPS遺伝子を
含む）をプローブとして、プラークハイブリダイゼーシ
ョン（前記「モレキュラー・クローニング」、第326〜3
28頁参照）を30（v/v）％ホルムアミド、0.75M塩化ナト
リウム、0.075Mクエン酸ナトリウム、0.5％ドデシル硫
酸ナトリウム、50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）および1
00μg/ml熱変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーシ
ョン溶液中で42℃、16時間行った。
プローブとハイブリダイズが認められたポジティブプ
ラークから（前記「モレキュラー・クローニング」、第
371〜第372頁記載の方法に従いλDNAを分離した。得ら
れたλDNAを、制限酵素SacＩで切断したのちアガロース
ゲル（0.8％）電気泳動した。この電気泳動ゲルから、
サザン（Southern）法（前記「モレキュラー・クローニ
ング」、第382〜386頁参照］により、ニトロセルロース
フィルターにDNAを転写した。32Ｐで放射能ラベルした
プラスミドpIPS6の1.9KbpのNcoＩ−BamHI断片と、上記D
NA結合ニトロセルロースフィルターのサザン雑種形成
（前記「モレキュラー・クローニング」、第387〜389頁
参照）を30（v/v）％ホルムアミド、0.75M塩化ナトリウ
ム、0.075Mクエン酸ナトリウム、0.5％ドデシル硫酸ナ
トリウム、50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）および100μ
g/ml熱変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション
溶液中で42℃、16時間行なった。その結果、4.8KbpのSa
cＩ断片とハイブリダイズが認められた。
ラークから（前記「モレキュラー・クローニング」、第
371〜第372頁記載の方法に従いλDNAを分離した。得ら
れたλDNAを、制限酵素SacＩで切断したのちアガロース
ゲル（0.8％）電気泳動した。この電気泳動ゲルから、
サザン（Southern）法（前記「モレキュラー・クローニ
ング」、第382〜386頁参照］により、ニトロセルロース
フィルターにDNAを転写した。32Ｐで放射能ラベルした
プラスミドpIPS6の1.9KbpのNcoＩ−BamHI断片と、上記D
NA結合ニトロセルロースフィルターのサザン雑種形成
（前記「モレキュラー・クローニング」、第387〜389頁
参照）を30（v/v）％ホルムアミド、0.75M塩化ナトリウ
ム、0.075Mクエン酸ナトリウム、0.5％ドデシル硫酸ナ
トリウム、50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）および100μ
g/ml熱変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション
溶液中で42℃、16時間行なった。その結果、4.8KbpのSa
cＩ断片とハイブリダイズが認められた。
４）IPS遺伝子のサブクローニング 上記３）項で得たλDNAを制限酵素SacＩで切断したの
ち、4.8KbpのSacＩ断片をアガロースゲル（1.0％）電気
泳動（前記「モレキュラー・クローニング」、第150〜1
62頁参照）および電気泳動溶出法（高木康敬著「遺伝子
操作マニュアル」第33頁、講談社サイエンティフィク、
1982年参照）により単離した。一方ベクタープラスミド
pUC18を制限酵素SacＩで切断した。このようにして得ら
れた２種類のDNA断片を混合し、T4DNAリガーゼで連結反
応を行なった。この連結反応液を用いて大腸菌JM109株
を形質転換することにより、pUC18のSacＩサイトに4.8K
bpのSacＩ断片が挿入されたプラスミドpBI1（第４図参
照）をえた。プラスミドpBI1を種々の制限酵素で切断
し、λファージのHind III分解物を分子量の基準にし
て、アガロースゲル（1.0％）電気泳動（前記「モレキ
ュラー・クローニング」、第150〜162頁参照）のパター
ンから、第４図に示す制限酵素切断地図を作製した。
ち、4.8KbpのSacＩ断片をアガロースゲル（1.0％）電気
泳動（前記「モレキュラー・クローニング」、第150〜1
62頁参照）および電気泳動溶出法（高木康敬著「遺伝子
操作マニュアル」第33頁、講談社サイエンティフィク、
1982年参照）により単離した。一方ベクタープラスミド
pUC18を制限酵素SacＩで切断した。このようにして得ら
れた２種類のDNA断片を混合し、T4DNAリガーゼで連結反
応を行なった。この連結反応液を用いて大腸菌JM109株
を形質転換することにより、pUC18のSacＩサイトに4.8K
bpのSacＩ断片が挿入されたプラスミドpBI1（第４図参
照）をえた。プラスミドpBI1を種々の制限酵素で切断
し、λファージのHind III分解物を分子量の基準にし
て、アガロースゲル（1.0％）電気泳動（前記「モレキ
ュラー・クローニング」、第150〜162頁参照）のパター
ンから、第４図に示す制限酵素切断地図を作製した。
実施例３ IPS遺伝子と隣接する領域のクローニング １）プラスミドpBI 1のSacＩ断片（4.8Kb）と隣接する
領域のサブクローニング 実施例２−３）で得たポジティブ プラークから分離
したλDNAを制限酵素XhoＩで切断したのちアガロースゲ
ル（0.8％）電気泳動した。この電気泳動ゲルから、サ
ザン（Southern）法（前記、「モレキュラー・クローニ
ング」、第382〜386頁参照）により、ニトロセルロース
フィルターにDNAを転写した。32Pで放射能ラベルしたプ
ラスミドpBI1の1.3KbpのXhoＩ−SacＩ断片と、上記DNA
結合ニトロセルロースフィルターのサザン雑種形成（前
記「モレキュラー・クローニング」、第387〜389頁参
照）を50（v/v）％ホルムアミド、0.75M塩化ナトリウ
ム、0.075Mクエン酸ナトリウム、0.5％ドデシル硫酸ナ
トリウム、50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）および100μ
g/ml熱変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション
溶液中で42℃、16時間行なった。その結果、5.1KbpのXh
oＩ断片とハイブリダイズが認められた。また同様にし
て32Pで放射能ラベルしたプラスミドpBI1の1.8KbpのXho
Ｉ−SacＩ断片とサザン雑種形成を行なった結果、4.6Kb
pのXhoＩ断片とハイブリダイズが認められた。
領域のサブクローニング 実施例２−３）で得たポジティブ プラークから分離
したλDNAを制限酵素XhoＩで切断したのちアガロースゲ
ル（0.8％）電気泳動した。この電気泳動ゲルから、サ
ザン（Southern）法（前記、「モレキュラー・クローニ
ング」、第382〜386頁参照）により、ニトロセルロース
フィルターにDNAを転写した。32Pで放射能ラベルしたプ
ラスミドpBI1の1.3KbpのXhoＩ−SacＩ断片と、上記DNA
結合ニトロセルロースフィルターのサザン雑種形成（前
記「モレキュラー・クローニング」、第387〜389頁参
照）を50（v/v）％ホルムアミド、0.75M塩化ナトリウ
ム、0.075Mクエン酸ナトリウム、0.5％ドデシル硫酸ナ
トリウム、50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）および100μ
g/ml熱変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション
溶液中で42℃、16時間行なった。その結果、5.1KbpのXh
oＩ断片とハイブリダイズが認められた。また同様にし
て32Pで放射能ラベルしたプラスミドpBI1の1.8KbpのXho
Ｉ−SacＩ断片とサザン雑種形成を行なった結果、4.6Kb
pのXhoＩ断片とハイブリダイズが認められた。
5.1KbpのXhoＩ断片と4.6KbpのXhoＩ断片をそれぞれ実
施例２−４）と同様の方法でベクタープラスミドpblues
cript SK＋のXhoＩサイトに挿入し、プラスミドpBI2
（5.1KbpのXhoＩ断片を含む、第５図参照）pBI3（4.6Kb
pのXhoＩ断片を含む、第６図参照）を作製した。
施例２−４）と同様の方法でベクタープラスミドpblues
cript SK＋のXhoＩサイトに挿入し、プラスミドpBI2
（5.1KbpのXhoＩ断片を含む、第５図参照）pBI3（4.6Kb
pのXhoＩ断片を含む、第６図参照）を作製した。
２）プラスミドpBI2のXhoＩ−NruＩ断片（0.8Kbp）と隣
接する領域のジーンライブラリーからのスクリーニング 実施例３−１）記載のプラスミドpBI2のXhoＩ−NruＩ
断片（0.8Kbp）をプローブとする実施例２−３）と同様
のプラークハイブリダイゼーション法を用いて実施例２
−２）で作製したリゾバクター・ラクタムゲヌスのジー
ンライブラリ（gene library）からプラスミドpBI2のXh
oＩ−NruＩ断片（0.8Kbp）と隣接する領域を含むプラー
クをスクリーニングした。得られたポジティブプラーク
からλDNAを分離した後、制限酵素XhoＩ切断で得られる
DNA断片を実施例２−４）と同様の方法で、ベクタープ
ラスミドpbluescript SK＋のXhoＩサイトに挿入し、プ
ラスミドpBI5（2.0KbpのXhoＩ断片を含む、第８図参
照）、pBI7（8.5KbpのXhoＩ断片を含む、第10図参照）
を作製した。また制限酵素BamHI切断で得られるDNA断片
を実施例２−４）と同様の方法で、ベクタープラスミド
pbluescript SK＋のBamHIサイトに挿入し、プラスミドp
BI4（3.0KbpのBamHI断片を含む、第７図参照）、pBI6
（3.0KbpのBamHI断片を含む、第９図参照）、pBI8（9.3
KbpのBamHI断片を含む、第11図参照）を作製した。
接する領域のジーンライブラリーからのスクリーニング 実施例３−１）記載のプラスミドpBI2のXhoＩ−NruＩ
断片（0.8Kbp）をプローブとする実施例２−３）と同様
のプラークハイブリダイゼーション法を用いて実施例２
−２）で作製したリゾバクター・ラクタムゲヌスのジー
ンライブラリ（gene library）からプラスミドpBI2のXh
oＩ−NruＩ断片（0.8Kbp）と隣接する領域を含むプラー
クをスクリーニングした。得られたポジティブプラーク
からλDNAを分離した後、制限酵素XhoＩ切断で得られる
DNA断片を実施例２−４）と同様の方法で、ベクタープ
ラスミドpbluescript SK＋のXhoＩサイトに挿入し、プ
ラスミドpBI5（2.0KbpのXhoＩ断片を含む、第８図参
照）、pBI7（8.5KbpのXhoＩ断片を含む、第10図参照）
を作製した。また制限酵素BamHI切断で得られるDNA断片
を実施例２−４）と同様の方法で、ベクタープラスミド
pbluescript SK＋のBamHIサイトに挿入し、プラスミドp
BI4（3.0KbpのBamHI断片を含む、第７図参照）、pBI6
（3.0KbpのBamHI断片を含む、第９図参照）、pBI8（9.3
KbpのBamHI断片を含む、第11図参照）を作製した。
これらのプラスミドpBI1、pBI2、pBI3、pBI5、pBI7、
pBI4、pBI6およびpBI8にサブクローニングしたリゾバク
ター・ラクタムゲヌス YK−90の染色体DNA断片の位置
関係および制限酵素切断地図を第12図に示した。
pBI4、pBI6およびpBI8にサブクローニングしたリゾバク
ター・ラクタムゲヌス YK−90の染色体DNA断片の位置
関係および制限酵素切断地図を第12図に示した。
実施例４ クローン化したリゾバクター・ラクタムゲヌ
ス YK−90の染色体DNAの塩基配列 第12図に示したリゾバクター・ラクタムゲヌス YK−
90の染色体DNAの制限酵素切断地図上3.0KbpのNruＩサイ
トから26.7KbpのPstＩサイトまでの約23.7KbpのDNA断片
の塩基配列をジデオキシ合成鎖停止法［添田栄一ら著、
「核酸の塩基配列決定法」第61〜113頁、学会出版セン
ター、1985年参照］に従って決定した。その結果を第１
図に示す。
ス YK−90の染色体DNAの塩基配列 第12図に示したリゾバクター・ラクタムゲヌス YK−
90の染色体DNAの制限酵素切断地図上3.0KbpのNruＩサイ
トから26.7KbpのPstＩサイトまでの約23.7KbpのDNA断片
の塩基配列をジデオキシ合成鎖停止法［添田栄一ら著、
「核酸の塩基配列決定法」第61〜113頁、学会出版セン
ター、1985年参照］に従って決定した。その結果を第１
図に示す。
実施例５ DNA塩基配列の解析 第１図に示したDNA塩基配列を、DNAシークエンス入力
解析システム「DNA SIS」（日立ソフトエンジニアリン
グ製）を用いて解析した結果、第１図に示したDNA塩基
配列中に９個のオープンリーディングフレーム（ORF1〜
ORF9）が存在していた。その結果を第12図に示す。ま
た、それぞれのORFのアミノ酸配列を第13図から第21図
に示す。
解析システム「DNA SIS」（日立ソフトエンジニアリン
グ製）を用いて解析した結果、第１図に示したDNA塩基
配列中に９個のオープンリーディングフレーム（ORF1〜
ORF9）が存在していた。その結果を第12図に示す。ま
た、それぞれのORFのアミノ酸配列を第13図から第21図
に示す。
実施例６ 大腸菌での発現ベクタープラスミドの作製 ベクタープラスミドpBR322（ファルマシア社製、スウ
ェーデン）をPstＩで切断した後、dNTPの存在下でT4DNA
ポリメラーゼ（宝酒造製）を作用させ切断点をフラッシ
ュエンドに転換した。これにEcoRIリンカー（宝酒造
製）をT4DNリガーゼ（宝酒造製）により連結した後、Ec
oRIで切断した。これをT4DNAリガーゼ（宝酒造製）によ
り連結することにより、プラスミドpBR322のEcoRIサイ
トからPstＩサイトまでが欠失したプラスミドpBR322Eco
（第22図参照）を作製した。
ェーデン）をPstＩで切断した後、dNTPの存在下でT4DNA
ポリメラーゼ（宝酒造製）を作用させ切断点をフラッシ
ュエンドに転換した。これにEcoRIリンカー（宝酒造
製）をT4DNリガーゼ（宝酒造製）により連結した後、Ec
oRIで切断した。これをT4DNAリガーゼ（宝酒造製）によ
り連結することにより、プラスミドpBR322のEcoRIサイ
トからPstＩサイトまでが欠失したプラスミドpBR322Eco
（第22図参照）を作製した。
市販の発現プラスミドpKK233−２をScaＩで切断した
後、EcoRIリンカー（宝酒造製）をT4DNAリガーゼ（宝酒
造製）により連結した。これをEcoRIで切断した後、1.1
KbpのEcoRI断片をアガロースゲル（1.0％）電気泳動
（前記「モレキュラー・クローニング」、第150〜162頁
参照）および電気泳動溶出法（高木康敬著「遺伝子操作
マニュアル」第33頁、講談社サイエンティフィク、1982
年参照）により単離した。一方前記、プラスミドpBR322
Ecoを制限酵素EcoRIで切断したのち、アルカリフォスフ
ァターゼ（宝酒造製）を作用させた。このようにして得
られた２種類のDNA断片を混合し、T4DNAリガーゼで連結
反応を行なった。この連結反応液を用いて大腸菌JM109
株を形質転換することによりpBR322EcoのEcoRIサイトに
1.1KbpのEcoRI断片が挿入されたプラスミドpBRTAC8（第
23図参照）をえた。
後、EcoRIリンカー（宝酒造製）をT4DNAリガーゼ（宝酒
造製）により連結した。これをEcoRIで切断した後、1.1
KbpのEcoRI断片をアガロースゲル（1.0％）電気泳動
（前記「モレキュラー・クローニング」、第150〜162頁
参照）および電気泳動溶出法（高木康敬著「遺伝子操作
マニュアル」第33頁、講談社サイエンティフィク、1982
年参照）により単離した。一方前記、プラスミドpBR322
Ecoを制限酵素EcoRIで切断したのち、アルカリフォスフ
ァターゼ（宝酒造製）を作用させた。このようにして得
られた２種類のDNA断片を混合し、T4DNAリガーゼで連結
反応を行なった。この連結反応液を用いて大腸菌JM109
株を形質転換することによりpBR322EcoのEcoRIサイトに
1.1KbpのEcoRI断片が挿入されたプラスミドpBRTAC8（第
23図参照）をえた。
実施例７ ORF2の大腸菌での発現 実施例２−４）記載のプラスミドpBI1をBamHIとXhoＩ
で切断した後、dNTPの存在下でT4DNAポリメラーゼ（宝
酒造製）を作用させ切断点をフラッシュエンドに転換し
た。これをアガロースゲル（1.0％）電気泳動（前記
「モレキュラー・クローニング」、第150〜162頁参照）
した後、電気泳動溶出法（高木康敬著「遺伝子操作マニ
ュアル」第33頁、講談社サイエンティフィク、1982年、
参照）によりORF2を含む1.25KbpのBamHI−XhoＩ断片を
単離した。
で切断した後、dNTPの存在下でT4DNAポリメラーゼ（宝
酒造製）を作用させ切断点をフラッシュエンドに転換し
た。これをアガロースゲル（1.0％）電気泳動（前記
「モレキュラー・クローニング」、第150〜162頁参照）
した後、電気泳動溶出法（高木康敬著「遺伝子操作マニ
ュアル」第33頁、講談社サイエンティフィク、1982年、
参照）によりORF2を含む1.25KbpのBamHI−XhoＩ断片を
単離した。
実施例６記載のプラスミドpBRTAC8をNcoＩで切断した
後、dNTPの存在下でT4DNAポリメラーゼ（宝酒造製）を
作用させ切断点をフラッシュエンドに転換した。このよ
うにして得られた２種類のDNA断片を混合し、T4DNAリガ
ーゼで連結反応を行なった。この連結反応液を用いて大
腸菌JM109株を形質転換することによりpBRTAC8のNcoＩ
サイトに1.25KbpのBamHI−XhoＩ断片が挿入されたプラ
スミドpBI110（第24図参照）をえた。
後、dNTPの存在下でT4DNAポリメラーゼ（宝酒造製）を
作用させ切断点をフラッシュエンドに転換した。このよ
うにして得られた２種類のDNA断片を混合し、T4DNAリガ
ーゼで連結反応を行なった。この連結反応液を用いて大
腸菌JM109株を形質転換することによりpBRTAC8のNcoＩ
サイトに1.25KbpのBamHI−XhoＩ断片が挿入されたプラ
スミドpBI110（第24図参照）をえた。
プラスミドpBI110を保持する大腸菌CPC20株（ampＣ欠
損株、すなわちβ−ラクタマーゼ欠損株、アグリカルチ
ュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agr.
Biol.Chem.），37,1528（1984）参照）を、テトラサイ
クリン（10μg/ml）を含む2XYT培地（酵母エキス10g/
l、バクトトリプトン16g/l、NaCl5g/lおよびジアミノピ
メリン酸50mg/lを含む）20mlに接種して回転式振盪機
（200rpm）上で、30℃、７時間培養した。遠心分離（60
00G、５分）により得られた菌体を、0.1mMジチオスレイ
トール（DTT）、1mMフッ化フェニルメチルスルホニル
（PMSF）を含む50mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）で洗
浄したのち、1.5mlの0.1mM DTT、1mM PMSFを含む50mMト
リス−塩酸緩衝液（pH7.5）に再懸濁した。この菌体懸
濁液を超音波処理（160ワット、２分間）したのち、遠
心分離（20000G、20分間）することにより、粗酵素液を
調製した。この粗酵素液のイソペニシリンＮシンセター
ゼ活性をY.−Q.Shenらの方法［ジャーナル・オブ・アン
ティバイオティクス（J.Antibiotics）37,1044〜1048
（1984）参照］に従って測定した。その結果プラスミド
pBI110（ORF2を含む）を保持する大腸菌CPC20株の粗酵
素液にイソペニシリンＮシンセターゼ活性（δ−（Ｌ−
α−アミノアジピル）−Ｌ−システイニル−Ｄ−バリン
（LLF−ACV）をイソペニシリンＮに転換する活性）が認
められた。
損株、すなわちβ−ラクタマーゼ欠損株、アグリカルチ
ュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agr.
Biol.Chem.），37,1528（1984）参照）を、テトラサイ
クリン（10μg/ml）を含む2XYT培地（酵母エキス10g/
l、バクトトリプトン16g/l、NaCl5g/lおよびジアミノピ
メリン酸50mg/lを含む）20mlに接種して回転式振盪機
（200rpm）上で、30℃、７時間培養した。遠心分離（60
00G、５分）により得られた菌体を、0.1mMジチオスレイ
トール（DTT）、1mMフッ化フェニルメチルスルホニル
（PMSF）を含む50mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）で洗
浄したのち、1.5mlの0.1mM DTT、1mM PMSFを含む50mMト
リス−塩酸緩衝液（pH7.5）に再懸濁した。この菌体懸
濁液を超音波処理（160ワット、２分間）したのち、遠
心分離（20000G、20分間）することにより、粗酵素液を
調製した。この粗酵素液のイソペニシリンＮシンセター
ゼ活性をY.−Q.Shenらの方法［ジャーナル・オブ・アン
ティバイオティクス（J.Antibiotics）37,1044〜1048
（1984）参照］に従って測定した。その結果プラスミド
pBI110（ORF2を含む）を保持する大腸菌CPC20株の粗酵
素液にイソペニシリンＮシンセターゼ活性（δ−（Ｌ−
α−アミノアジピル）−Ｌ−システイニル−Ｄ−バリン
（LLF−ACV）をイソペニシリンＮに転換する活性）が認
められた。
実施例８ ORF3の大腸菌での発現 実施例２−４）記載のプラスミドpBI1をSplＩとNcoＩ
で切断した後、dNTPの存在下でT4DNAポリメラーゼ（宝
酒造製）を作用させ切断点をフラッシュエンドに転換し
た。これをアガロースゲル（1.0％）電気泳動（前記
「モレキュラー・クローニング」、第150〜162頁参照）
した後、電気泳動溶出法（高木康敬著「遺伝子操作マニ
ュアル」第33頁、講談社サイエンティフィク、1982年、
参照）によりORF3を含む1.3KbpのSplＩ−NcoＩ断片を単
離した。
で切断した後、dNTPの存在下でT4DNAポリメラーゼ（宝
酒造製）を作用させ切断点をフラッシュエンドに転換し
た。これをアガロースゲル（1.0％）電気泳動（前記
「モレキュラー・クローニング」、第150〜162頁参照）
した後、電気泳動溶出法（高木康敬著「遺伝子操作マニ
ュアル」第33頁、講談社サイエンティフィク、1982年、
参照）によりORF3を含む1.3KbpのSplＩ−NcoＩ断片を単
離した。
実施例６記載のプラスミドpBRTAC8をNcoＩで切断した
後、dNTPの存在下でT4DNAポリメラーゼ（宝酒造製）を
作用させ切断点をフラッシュエンドに転換した。このよ
うにして得られた２種類のDNA断片を混合し、T4DNAリガ
ーゼで連結反応を行なった。この連結反応液を用いて大
腸菌JM109株を形質転換することによりpBRTAC8のNcoＩ
サイトに1.3KbpのSplＩ−NcoＩ断片が挿入されたプラス
ミドpBI120（第25図参照）をえた。
後、dNTPの存在下でT4DNAポリメラーゼ（宝酒造製）を
作用させ切断点をフラッシュエンドに転換した。このよ
うにして得られた２種類のDNA断片を混合し、T4DNAリガ
ーゼで連結反応を行なった。この連結反応液を用いて大
腸菌JM109株を形質転換することによりpBRTAC8のNcoＩ
サイトに1.3KbpのSplＩ−NcoＩ断片が挿入されたプラス
ミドpBI120（第25図参照）をえた。
プラスミドpBI120を保持する大腸菌CPC20株（ampＣ欠
損株、すなわちβ−ラクタマーゼ欠損株、前記文献参
照）を、テトラサイクリン（10μg/ml）を含む2XYT培地
（酵母エキス10g/l、バクトトリプトン16g/l、NaCl5g/l
およびジアミノピメリン酸50mg/lを含む）20mlに接種し
た回転式振盪機（200rpm）上で、37℃、７時間培養し
た。遠心分離（6000G、５分）により得られた菌体を、
0.1mMDTT、1mM PMSFを含む50mMトリス−塩酸緩衝液（pH
7.5）で洗浄したのち、1.5mlの0.1mM DTT、1mM PMSFを
含む50mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）に再懸濁した。
この菌体懸濁液を超音波処理（160ワット、２分間）し
たのち、遠心分離（20000G、20分間）することにより、
粗酵素液を調製した。この粗酵素液のデアセトキシセフ
ァロスポリンＣシンセターゼ（エクスパンダーゼ）活性
をS.E.Jensenらの方法［ジャーナル・オブ・アンティバ
イオティクス（J.Antibiotics）38,263〜265（1985）参
照］に従って測定した。その結果プラスミドpBI120（OR
F3を含む）を保持する大腸菌CPC20株の粗酵素液にエク
スパンダーゼ活性（ペニシリンＮをデアセトキシセファ
ロスポリンに転換する活性）が認められた。
損株、すなわちβ−ラクタマーゼ欠損株、前記文献参
照）を、テトラサイクリン（10μg/ml）を含む2XYT培地
（酵母エキス10g/l、バクトトリプトン16g/l、NaCl5g/l
およびジアミノピメリン酸50mg/lを含む）20mlに接種し
た回転式振盪機（200rpm）上で、37℃、７時間培養し
た。遠心分離（6000G、５分）により得られた菌体を、
0.1mMDTT、1mM PMSFを含む50mMトリス−塩酸緩衝液（pH
7.5）で洗浄したのち、1.5mlの0.1mM DTT、1mM PMSFを
含む50mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）に再懸濁した。
この菌体懸濁液を超音波処理（160ワット、２分間）し
たのち、遠心分離（20000G、20分間）することにより、
粗酵素液を調製した。この粗酵素液のデアセトキシセフ
ァロスポリンＣシンセターゼ（エクスパンダーゼ）活性
をS.E.Jensenらの方法［ジャーナル・オブ・アンティバ
イオティクス（J.Antibiotics）38,263〜265（1985）参
照］に従って測定した。その結果プラスミドpBI120（OR
F3を含む）を保持する大腸菌CPC20株の粗酵素液にエク
スパンダーゼ活性（ペニシリンＮをデアセトキシセファ
ロスポリンに転換する活性）が認められた。
実施例９ ORF5の大腸菌での発現 実施例３記載のプラスミドpBI3をXhoＩとMluＩで切断
した後、dNTPの存在下でT4DNAポリメラーゼ（宝酒造
製）を作用させ切断点をフラッシュエンドに転換した。
これをアガロースゲル（1.0％）電気泳動（前記「モレ
キュラー・クローニング」、第150〜162頁参照）した
後、電気泳動溶出法（高木康敬著「遺伝子操作マニュア
ル」第33頁、講談社サイエンティフィク、1982年、参
照）によりORF5を含む1.6KbpのXhoＩとMluＩ断片を単離
した。
した後、dNTPの存在下でT4DNAポリメラーゼ（宝酒造
製）を作用させ切断点をフラッシュエンドに転換した。
これをアガロースゲル（1.0％）電気泳動（前記「モレ
キュラー・クローニング」、第150〜162頁参照）した
後、電気泳動溶出法（高木康敬著「遺伝子操作マニュア
ル」第33頁、講談社サイエンティフィク、1982年、参
照）によりORF5を含む1.6KbpのXhoＩとMluＩ断片を単離
した。
実施例６記載のプラスミドpBRTAC8をNcoＩで切断した
後、dNTPの存在下でT4DNAポリメラーゼ（宝酒造製）を
作用させ切断点をフラッシュエンドに転換した。このよ
うにして得られた２種類のDNA断片を混合し、T4DNAリガ
ーゼで連結反応を行なった。この連結反応液を用いて大
腸菌JM109株を形質転換することによりpBRTAC8のNcoＩ
サイトに1.6KbpのXhoＩとMluＩ断片が挿入されたプラス
ミドpBI140（第26図参照）をえた。
後、dNTPの存在下でT4DNAポリメラーゼ（宝酒造製）を
作用させ切断点をフラッシュエンドに転換した。このよ
うにして得られた２種類のDNA断片を混合し、T4DNAリガ
ーゼで連結反応を行なった。この連結反応液を用いて大
腸菌JM109株を形質転換することによりpBRTAC8のNcoＩ
サイトに1.6KbpのXhoＩとMluＩ断片が挿入されたプラス
ミドpBI140（第26図参照）をえた。
プラスミドpBI140を保持する大腸菌CPC20株（ampＣ欠
損株、すなわちβ−ラクタマーゼ欠損株、前記文献参
照）を、テトラサイクリン（10μg/ml）を含む2XYT培地
（酵母エキス10g/l、バクトトリプトン16g/l、NaCl5g/l
およびジアミノピメリン酸50mg/lを含む）20mlに接種し
て回転式振盪機（200rpm）上で、30℃、７時間培養し
た。遠心分離（6000G、５分）により得られた菌体を、
0.1mMDTTを含む100mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.0）で洗
浄したのち、1.5mlの0.1mM DTT、0.1mMリン酸ピリドキ
サール（pyridoxal phosphate）を含む100mMトリス−塩
酸緩衝液（pH7.0）に再懸濁した。この菌体懸濁液を超
音波処理（160ワット、２分間）したのち、遠心分離（2
0000G、20分間）することにより、粗酵素液を調製し
た。この粗酵素液のイソペニシリンＮエピメラーゼ活性
をS.E.Jensenらの方法［カナディアン・ジャーナル・オ
ブ・マイクロバイオロジー（Can.J.Microbiol）、29、1
526〜1531（1983）参照］に従って測定した。その結果
プラスミドpBI140（ORF5を含む）を保持する大腸菌CPC2
0株の粗酵素液にイソペニシリンＮエピメラーゼ活性
（イソペニシリンＮをペニシリンＮに転換する活性）が
認められた。
損株、すなわちβ−ラクタマーゼ欠損株、前記文献参
照）を、テトラサイクリン（10μg/ml）を含む2XYT培地
（酵母エキス10g/l、バクトトリプトン16g/l、NaCl5g/l
およびジアミノピメリン酸50mg/lを含む）20mlに接種し
て回転式振盪機（200rpm）上で、30℃、７時間培養し
た。遠心分離（6000G、５分）により得られた菌体を、
0.1mMDTTを含む100mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.0）で洗
浄したのち、1.5mlの0.1mM DTT、0.1mMリン酸ピリドキ
サール（pyridoxal phosphate）を含む100mMトリス−塩
酸緩衝液（pH7.0）に再懸濁した。この菌体懸濁液を超
音波処理（160ワット、２分間）したのち、遠心分離（2
0000G、20分間）することにより、粗酵素液を調製し
た。この粗酵素液のイソペニシリンＮエピメラーゼ活性
をS.E.Jensenらの方法［カナディアン・ジャーナル・オ
ブ・マイクロバイオロジー（Can.J.Microbiol）、29、1
526〜1531（1983）参照］に従って測定した。その結果
プラスミドpBI140（ORF5を含む）を保持する大腸菌CPC2
0株の粗酵素液にイソペニシリンＮエピメラーゼ活性
（イソペニシリンＮをペニシリンＮに転換する活性）が
認められた。
実施例10 ORF6の大腸菌での発現 実施例３記載のプラスミドpBI3をAatIIとStuＩで切断
した後、dNTPの存在下でT4DNAポリメラーゼ（宝酒造
製）を作用させ切断点をフラッシュエンドに転換した。
これをアガロースゲル（1.0％）電気泳動（前記「モレ
キュラー・クローニング」、第150〜162頁参照）した
後、電気泳動溶出法（高木康敬著「遺伝子操作マニュア
ル」第33頁、講談社サイエンティフィク、1982年、参
照）によりORF6を含む1.7KbpのAatIIとStuＩ断片を単離
した。
した後、dNTPの存在下でT4DNAポリメラーゼ（宝酒造
製）を作用させ切断点をフラッシュエンドに転換した。
これをアガロースゲル（1.0％）電気泳動（前記「モレ
キュラー・クローニング」、第150〜162頁参照）した
後、電気泳動溶出法（高木康敬著「遺伝子操作マニュア
ル」第33頁、講談社サイエンティフィク、1982年、参
照）によりORF6を含む1.7KbpのAatIIとStuＩ断片を単離
した。
実施例６記載のプラスミドpBRTAC8をNcoＩで切断した
後、dNTPの存在下でT4DNAポリメラーゼ（宝酒造製）を
作用させ切断点をフラッシュエンドに転換した。このよ
うにして得られた２種類のDNA断片を混合し、T4DNAリガ
ーゼで連結反応を行なった。この連結反応液を用いて大
腸菌JM109株を形質転換することによりpBRTAC8のNcoＩ
サイトに1.75KbpのAatIIとStuＩ断片が挿入されたプラ
スミドpBI151（第27図参照）をえた。
後、dNTPの存在下でT4DNAポリメラーゼ（宝酒造製）を
作用させ切断点をフラッシュエンドに転換した。このよ
うにして得られた２種類のDNA断片を混合し、T4DNAリガ
ーゼで連結反応を行なった。この連結反応液を用いて大
腸菌JM109株を形質転換することによりpBRTAC8のNcoＩ
サイトに1.75KbpのAatIIとStuＩ断片が挿入されたプラ
スミドpBI151（第27図参照）をえた。
大腸菌CPC20株（ampＣ欠損株、すなわちβ−ラクタマ
ーゼ欠損株、前記文献参照）は、10μg/mlセファロスポ
リンＣを含む寒天培地上で成育できないが、プラスミド
pBI151を保持する大腸菌CPC20株は、10μg/mlセファロ
スポリンＣを含む寒天培地上で成育できた。このことか
らORF6は、β−ラクタマーゼをコードしていることが明
らかである。
ーゼ欠損株、前記文献参照）は、10μg/mlセファロスポ
リンＣを含む寒天培地上で成育できないが、プラスミド
pBI151を保持する大腸菌CPC20株は、10μg/mlセファロ
スポリンＣを含む寒天培地上で成育できた。このことか
らORF6は、β−ラクタマーゼをコードしていることが明
らかである。
実施例11 ORF2のアクレモニウム・クリソゲナムでの発
現 １）プラスミドpGBI1の作製 実施例１−４）記載のプラスミドpBI1をBamHIとXhoＩ
で切断した。これをアガロースゲル（1.0％）電気泳動
（前記「モレキュラー・クローニング」、第150〜162頁
参照）した後、電気泳動溶出法（高木康司敬著「遺伝子
操作マニュアル」第33頁、講談社サイエンティフィク、
1982年、参照）によりORF2を含む1.25KbpのBamHI−Xho
Ｉ断片を単離した。この1.25KbpのBamHI−XhoＩ断片をB
sp1286で切断した後、アガロースゲル（1.0％）電気泳
動および電気泳動溶出法によりORF2を含む1.05KbpのBsp
1286−XhoＩ断片を単離した。
現 １）プラスミドpGBI1の作製 実施例１−４）記載のプラスミドpBI1をBamHIとXhoＩ
で切断した。これをアガロースゲル（1.0％）電気泳動
（前記「モレキュラー・クローニング」、第150〜162頁
参照）した後、電気泳動溶出法（高木康司敬著「遺伝子
操作マニュアル」第33頁、講談社サイエンティフィク、
1982年、参照）によりORF2を含む1.25KbpのBamHI−Xho
Ｉ断片を単離した。この1.25KbpのBamHI−XhoＩ断片をB
sp1286で切断した後、アガロースゲル（1.0％）電気泳
動および電気泳動溶出法によりORF2を含む1.05KbpのBsp
1286−XhoＩ断片を単離した。
後述の参考例において作成した。グリセロアルデヒド
３燐酸脱水素酵素（GLD）遺伝子のプロモーターおよび
翻訳開始部位を含むプラスミドpGH21（第28図参照）をB
glIIとSalＩで切断した後、アルカリフォスファターゼ
（宝酒造製）を作用させた。これをアガロースゲル（1.
0％）電気泳動した後、電気泳動溶出法により3.5KbpのB
glII−SalＩ断片を単離した。３種類の合成オリゴヌク
レオタイド（５′−GATCTATCAAAATG、５′−AACAGACATG
CCGACGTGCC、５′−CGTCGGCATGTCTGTTCATTTTGATA）をそ
れぞれT4ポリヌクレオタイド・キナーゼ（宝酒造製）に
より、５′末端をリン酸化したのち、アニーリングさせ
ることによりBglII−Bsp1286アダプター（第29図参照）
を作製した。以上の1.05KbpのBsp1286−XhoＩ断片、3.5
KbpのBglII−SalＩ断片およびBglII−Bsp1286アダプタ
ーをT4リガーゼを用いて連結することにより、プラスミ
ドpGBI1（第30図参照）を作製した。
３燐酸脱水素酵素（GLD）遺伝子のプロモーターおよび
翻訳開始部位を含むプラスミドpGH21（第28図参照）をB
glIIとSalＩで切断した後、アルカリフォスファターゼ
（宝酒造製）を作用させた。これをアガロースゲル（1.
0％）電気泳動した後、電気泳動溶出法により3.5KbpのB
glII−SalＩ断片を単離した。３種類の合成オリゴヌク
レオタイド（５′−GATCTATCAAAATG、５′−AACAGACATG
CCGACGTGCC、５′−CGTCGGCATGTCTGTTCATTTTGATA）をそ
れぞれT4ポリヌクレオタイド・キナーゼ（宝酒造製）に
より、５′末端をリン酸化したのち、アニーリングさせ
ることによりBglII−Bsp1286アダプター（第29図参照）
を作製した。以上の1.05KbpのBsp1286−XhoＩ断片、3.5
KbpのBglII−SalＩ断片およびBglII−Bsp1286アダプタ
ーをT4リガーゼを用いて連結することにより、プラスミ
ドpGBI1（第30図参照）を作製した。
２）pGHBI21の作製（第31図参照） 第１）項記載のプラスミドpGBI1をHindIIIで切断した
のち、アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）を作用さ
せた。
のち、アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）を作用さ
せた。
前項記載のプラスミドpGH21をHindIIIで切断したの
ち、アガロースゲル（1.0％）電気泳動（前記「モレキ
ュラー・クローニング」、第150〜162頁参照）および電
気泳動溶出法（高木康敬著「遺伝子操作マニュアル」第
33頁、講談社サイエンティフィク、1982年、参照）によ
り、2.9KbpのHidd III断片を単離した。
ち、アガロースゲル（1.0％）電気泳動（前記「モレキ
ュラー・クローニング」、第150〜162頁参照）および電
気泳動溶出法（高木康敬著「遺伝子操作マニュアル」第
33頁、講談社サイエンティフィク、1982年、参照）によ
り、2.9KbpのHidd III断片を単離した。
以上のpGBI1のHindIII断片と、2.9KbpのHindIII断片
をT4リガーゼを用いて連結することによりプラスミドpG
HBI21を作製した。
をT4リガーゼを用いて連結することによりプラスミドpG
HBI21を作製した。
３）アクレモニウム・クリソゲナム Ｎ−２株（IFO 32
177、FERM BP−2204）からのプロトプラストの調製 アクレモニウム・クリソゲナム Ｎ−２株の凍結保存
しておいた分生胞子１×109個を、サッカロース30g/l、
肉エキス15g/l、コーン・スティープ・リカー5g/lを含
む液体培地（pH7.0）に接種して回転式振盪機（200rp
m）上、28℃で18時間培養した。培養液250mlをろ別して
得られた菌体を滅菌水で洗浄したのち、0.01Mジチオス
レイトールを含んだマクイルベイン（McIlvaine）緩衝
液（0.1Mクエン酸−0.2Mリン酸ナトリウム、pH7.3）30m
lに懸濁し、28℃で１時間、穏やかに振盪した。菌体を
ろ別、洗浄したのち、Novozyme234（ノボ・インダスト
リー、デンマーク）5mg/ml、0.7M NaClおよび20mM MgSO
4・７H2Oを含むマクイルベイン緩衝液60mlに懸濁した。
菌体懸濁液を30℃で３時間、穏やかに振盪したのち、グ
ラスフィルター（Ｇ−１、岩城硝子製）により、菌糸と
プロトプラストを分離した。ろ液を遠心分離（1000G、
５分間）することにより、プロトプラストを沈殿させた
のち、0.7M NaClで２回洗浄し、プロトプラストが５×1
08個/mlになるように0.7M NaClに懸濁した。
177、FERM BP−2204）からのプロトプラストの調製 アクレモニウム・クリソゲナム Ｎ−２株の凍結保存
しておいた分生胞子１×109個を、サッカロース30g/l、
肉エキス15g/l、コーン・スティープ・リカー5g/lを含
む液体培地（pH7.0）に接種して回転式振盪機（200rp
m）上、28℃で18時間培養した。培養液250mlをろ別して
得られた菌体を滅菌水で洗浄したのち、0.01Mジチオス
レイトールを含んだマクイルベイン（McIlvaine）緩衝
液（0.1Mクエン酸−0.2Mリン酸ナトリウム、pH7.3）30m
lに懸濁し、28℃で１時間、穏やかに振盪した。菌体を
ろ別、洗浄したのち、Novozyme234（ノボ・インダスト
リー、デンマーク）5mg/ml、0.7M NaClおよび20mM MgSO
4・７H2Oを含むマクイルベイン緩衝液60mlに懸濁した。
菌体懸濁液を30℃で３時間、穏やかに振盪したのち、グ
ラスフィルター（Ｇ−１、岩城硝子製）により、菌糸と
プロトプラストを分離した。ろ液を遠心分離（1000G、
５分間）することにより、プロトプラストを沈殿させた
のち、0.7M NaClで２回洗浄し、プロトプラストが５×1
08個/mlになるように0.7M NaClに懸濁した。
４）プラスミドpGHBI21によるプロトプラスト形質転換 得られた0.1mlのプロトプラスト懸濁液に、プラスミ
ドpGHBI21（10μｇ、５μｌ）を加え、かるく混合した
のち0.7M NaClを0.4mlと36％PEG4000（和光純薬工業
製）、106mM CaCl2を含む0.05Mグリシン緩衝液（pH7.
5）を0.5ml加え、かるく混合した。室温で10分間静置し
たのち、0.7M NaClを5ml加え、遠心分離（1000G、５分
間）した。沈澱となったプロトプラストを0.7M NaCl1ml
に再懸濁した。この形質転換プロトプラスト懸濁液（0.
1ml）をプロトプラスト再生培地（10.3％サッカロース
を含むトリプティカーゼ・ソイ・アガー（ビービーエル
・マイクロバイオロジーシステム（BBL・Microbiology
systems）ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニ
ー製、USA）30mlを含むプレート上に広げ15℃で20時間
培養したのち、ハイグロマイシンＢを350μg/ml含むプ
ロトプラスト再生培地を5ml（45℃に保温）オーバーレ
イした。25℃で６〜12日間培養することにより、ハイグ
ロマイシンＢ耐性となった形質転換株を選択した。1ml
の形質転換プロトプラスト懸濁液から10株のハイグロマ
イシンＢ耐性形質転換株を得た。
ドpGHBI21（10μｇ、５μｌ）を加え、かるく混合した
のち0.7M NaClを0.4mlと36％PEG4000（和光純薬工業
製）、106mM CaCl2を含む0.05Mグリシン緩衝液（pH7.
5）を0.5ml加え、かるく混合した。室温で10分間静置し
たのち、0.7M NaClを5ml加え、遠心分離（1000G、５分
間）した。沈澱となったプロトプラストを0.7M NaCl1ml
に再懸濁した。この形質転換プロトプラスト懸濁液（0.
1ml）をプロトプラスト再生培地（10.3％サッカロース
を含むトリプティカーゼ・ソイ・アガー（ビービーエル
・マイクロバイオロジーシステム（BBL・Microbiology
systems）ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニ
ー製、USA）30mlを含むプレート上に広げ15℃で20時間
培養したのち、ハイグロマイシンＢを350μg/ml含むプ
ロトプラスト再生培地を5ml（45℃に保温）オーバーレ
イした。25℃で６〜12日間培養することにより、ハイグ
ロマイシンＢ耐性となった形質転換株を選択した。1ml
の形質転換プロトプラスト懸濁液から10株のハイグロマ
イシンＢ耐性形質転換株を得た。
５）ハイグロマイシンＢ耐性形質転換株の培養 ４）項で得られたハイグロマイシンＢ耐性形質転換株
を、SBF培地（サッカロース30g/l、DL−メチオニン5g/
l、ソイ・ビーン・フラワー32g/l、コーン・スティーブ
・リカー0.5g/lおよびCaCO31.5g/lを含む、pH6.8）に接
種して、回転式振盪機（240rpm）上で、28℃で５日間培
養した。培養液を遠心分離（1000G、10分）して得られ
た上清液中の全セファロスポリン濃度をペーパーディス
クを用いるバイオアッセイで調べた。その結果を第１表
に示す。
を、SBF培地（サッカロース30g/l、DL−メチオニン5g/
l、ソイ・ビーン・フラワー32g/l、コーン・スティーブ
・リカー0.5g/lおよびCaCO31.5g/lを含む、pH6.8）に接
種して、回転式振盪機（240rpm）上で、28℃で５日間培
養した。培養液を遠心分離（1000G、10分）して得られ
た上清液中の全セファロスポリン濃度をペーパーディス
クを用いるバイオアッセイで調べた。その結果を第１表
に示す。
実施例12 ORF1のシュードモナス・プチダでの発現 １）プラスミドpCP14の作製 実施例４で分離したλDNAをApaＩとNdeＩで切断した
後、dNTPの存在下でT4DNAポリメラーゼ（宝酒造製）を
作用させ切断点をフラッシュエンドに転換した。これに
XbaＩリンカー（宝酒造製）をT4DNAリガーゼ（宝酒造
製）により連結した。これをXbaＩで切断し後、11.56Kb
pのXbaＩ断片（ORF1を含む）をアガロースゲル（1.0
％）電気泳動（前記、「モレキュラー・クローニン
グ」、第150〜162pH参照）および電気泳動溶出法（高木
康敬著「遺伝子操作マニュアル」第33頁、講談社サイエ
ンティフィク、1982年、参照）により単離した。
後、dNTPの存在下でT4DNAポリメラーゼ（宝酒造製）を
作用させ切断点をフラッシュエンドに転換した。これに
XbaＩリンカー（宝酒造製）をT4DNAリガーゼ（宝酒造
製）により連結した。これをXbaＩで切断し後、11.56Kb
pのXbaＩ断片（ORF1を含む）をアガロースゲル（1.0
％）電気泳動（前記、「モレキュラー・クローニン
グ」、第150〜162pH参照）および電気泳動溶出法（高木
康敬著「遺伝子操作マニュアル」第33頁、講談社サイエ
ンティフィク、1982年、参照）により単離した。
一方、広宿主域プラスミドRSF1010の誘導体であるベ
クタープラスミドpDSK519（ジーン（Gene）70,191〜197
（1988）参照）を制限酵素XbaＩで切断したのち、アル
カリフォスファターゼ（宝酒造製）を作用させた。この
ようにして得られた２種類のDNA断片を混合し、T4DNAリ
ガーゼで連結反応を行なった。この連結反応液を用いて
大腸菌JM109株を形質転換することによりpDSK519のXba
Ｉサイトに11.56KbpのXbaＩ断片が挿入されたプラスミ
ドpCP14（第32図参照）をえた。
クタープラスミドpDSK519（ジーン（Gene）70,191〜197
（1988）参照）を制限酵素XbaＩで切断したのち、アル
カリフォスファターゼ（宝酒造製）を作用させた。この
ようにして得られた２種類のDNA断片を混合し、T4DNAリ
ガーゼで連結反応を行なった。この連結反応液を用いて
大腸菌JM109株を形質転換することによりpDSK519のXba
Ｉサイトに11.56KbpのXbaＩ断片が挿入されたプラスミ
ドpCP14（第32図参照）をえた。
２）プラスミドpCP14のシュードモナス・プチダ IFO 1
4146への導入大腸菌JM109株が保持しているプラスミドp
CP14をプラスミドpRK2013をヘルパープラスミドとする
接合伝達法〔プロシーデイングス・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユ
ナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA）76,1648〜1652（1979）参照〕を用いてシ
ュードモナス・プチダ IFO 14146へ導入した。
4146への導入大腸菌JM109株が保持しているプラスミドp
CP14をプラスミドpRK2013をヘルパープラスミドとする
接合伝達法〔プロシーデイングス・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユ
ナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA）76,1648〜1652（1979）参照〕を用いてシ
ュードモナス・プチダ IFO 14146へ導入した。
プラスミドpCP14を保持するシュードモナス・プチダ
IFO 14146を、カナマイシン（100μg/ml）を含む2XYT
培地（酵母エキス10g/l、バクトトリプトン16g/l、NaCl
5g/l）、30mlに接種して回転式振盪機（200rpm）上で、
24℃、16時間培養した。遠心分離（10000G、10分）によ
り得られた菌体を、100mM KClを含む50mMトリス−塩酸
緩衝液（pH7.5）で洗浄したのち、1.5mlの50mM KCl、30
mM 2−メルカプトエタノール、20mM EDTA、50％グリセ
ロールを含む50mM MOPS−NaOH緩衝液（pH7.5）に再懸濁
した。この菌体懸濁液を超音波処理（160ワット、２分
間）したのち、遠心分離（20000G、20分間）することに
より、粗酵素液を調製した。この粗酵素液のδ−（Ｌ−
α−アミノアジピル）−Ｌ−システイニル−Ｄ−バリン
（ACV）シンセターゼ活性をS.E.Jensenらの方法〔エフ
イーエムエス・マイクロバイオロジー・レターズ（FEMS
Microbiology Letters）49,213〜218,（1988）参照〕
に従って測定した。その結果プラスミドpCP14（ORF1を
含む）を保持するシュードモナス・プチダ IFO 14146
の粗酵素液中にδ−（Ｌ−α−アミノアジピル）−Ｌ−
システイニル−Ｄ−バリン（ACV）シンセターゼ活性が
認められた。
IFO 14146を、カナマイシン（100μg/ml）を含む2XYT
培地（酵母エキス10g/l、バクトトリプトン16g/l、NaCl
5g/l）、30mlに接種して回転式振盪機（200rpm）上で、
24℃、16時間培養した。遠心分離（10000G、10分）によ
り得られた菌体を、100mM KClを含む50mMトリス−塩酸
緩衝液（pH7.5）で洗浄したのち、1.5mlの50mM KCl、30
mM 2−メルカプトエタノール、20mM EDTA、50％グリセ
ロールを含む50mM MOPS−NaOH緩衝液（pH7.5）に再懸濁
した。この菌体懸濁液を超音波処理（160ワット、２分
間）したのち、遠心分離（20000G、20分間）することに
より、粗酵素液を調製した。この粗酵素液のδ−（Ｌ−
α−アミノアジピル）−Ｌ−システイニル−Ｄ−バリン
（ACV）シンセターゼ活性をS.E.Jensenらの方法〔エフ
イーエムエス・マイクロバイオロジー・レターズ（FEMS
Microbiology Letters）49,213〜218,（1988）参照〕
に従って測定した。その結果プラスミドpCP14（ORF1を
含む）を保持するシュードモナス・プチダ IFO 14146
の粗酵素液中にδ−（Ｌ−α−アミノアジピル）−Ｌ−
システイニル−Ｄ−バリン（ACV）シンセターゼ活性が
認められた。
実施例13 ORF1〜ORF6のシュードモナス・プチダでの発
現 １）プラスミドpCP7の作製 実施例４で分離したλDNAをApaＩで切断した後、dNTP
の存在下でT4DNAポリメラーゼ（宝酒造製）を作用させ
切断点をフラッシュエンドに転換した。これにXbaＩリ
ンカー（宝酒造製）をT4DNAリガーゼ（宝酒造製）によ
り連結した。これをXbaＩとNdeＩで切断し後、11.56Kbp
のXbaＩ−NdeＩ断片（ORF1とORF2の一部を含む）をアガ
ロースゲル（1.0％）電気泳動（前記、「モレキュラー
・クローニング」、第150〜162頁参照）および電気泳動
溶出法（高木康敬著「遺伝子操作マニュアル」第33頁、
講談社サイエンティフィク、1982年、参照）により単離
した。
現 １）プラスミドpCP7の作製 実施例４で分離したλDNAをApaＩで切断した後、dNTP
の存在下でT4DNAポリメラーゼ（宝酒造製）を作用させ
切断点をフラッシュエンドに転換した。これにXbaＩリ
ンカー（宝酒造製）をT4DNAリガーゼ（宝酒造製）によ
り連結した。これをXbaＩとNdeＩで切断し後、11.56Kbp
のXbaＩ−NdeＩ断片（ORF1とORF2の一部を含む）をアガ
ロースゲル（1.0％）電気泳動（前記、「モレキュラー
・クローニング」、第150〜162頁参照）および電気泳動
溶出法（高木康敬著「遺伝子操作マニュアル」第33頁、
講談社サイエンティフィク、1982年、参照）により単離
した。
実施例２−３）で分離したλDNAをApaＩで切断した
後、dNTPの存在下でT4DNAポリメラーゼ（宝酒造製）を
作用させ切断点をフラッシュエンドに転換した。これに
XbaＩリンカー（宝酒造製）をT4DNAリガーゼ（宝酒造
製）により連結した。これをXbaＩとNdeＩで切断し後、
6.35KbpのXbaＩ−NdeＩ断片（ORF2の一部とORF3〜ORF6
を含む）をアガロースゲル（1.0％）電気泳動（前記、
「モレキュラー・クローニング」、第150〜162頁参照）
および電気泳動溶出法（高木康敬著「遺伝子操作マニュ
アル」第33頁、講談社サイエンティフィク、1982年、参
照）により単離した。
後、dNTPの存在下でT4DNAポリメラーゼ（宝酒造製）を
作用させ切断点をフラッシュエンドに転換した。これに
XbaＩリンカー（宝酒造製）をT4DNAリガーゼ（宝酒造
製）により連結した。これをXbaＩとNdeＩで切断し後、
6.35KbpのXbaＩ−NdeＩ断片（ORF2の一部とORF3〜ORF6
を含む）をアガロースゲル（1.0％）電気泳動（前記、
「モレキュラー・クローニング」、第150〜162頁参照）
および電気泳動溶出法（高木康敬著「遺伝子操作マニュ
アル」第33頁、講談社サイエンティフィク、1982年、参
照）により単離した。
一方、ベクタープラスミドpDSK519（ジーン（Gene）7
0,191〜197（1988）参照）を制限酵素XbaＩで切断した
のち、アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）を作用さ
せた。
0,191〜197（1988）参照）を制限酵素XbaＩで切断した
のち、アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）を作用さ
せた。
以上の11.56KbpのXbaＩ−NdeＩ断片、6.35KbpのXbaＩ
−NdeＩ断片とベクタープラスミドpDSK519を混合し、T4
DNAリガーゼで連結反応を行なった。この連結反応液を
用いて大腸菌JM109株を形質転換することによりpDSK519
のXbaＩサイトに17.91KbpのXbaＩ断片（第１図のDNA塩
基配列中、塩基番号5386のApaＩ部位から塩基番号23284
のApaＩ部位までを含む）が挿入されたプラスミドpCP7
（第33図参照）をえた。
−NdeＩ断片とベクタープラスミドpDSK519を混合し、T4
DNAリガーゼで連結反応を行なった。この連結反応液を
用いて大腸菌JM109株を形質転換することによりpDSK519
のXbaＩサイトに17.91KbpのXbaＩ断片（第１図のDNA塩
基配列中、塩基番号5386のApaＩ部位から塩基番号23284
のApaＩ部位までを含む）が挿入されたプラスミドpCP7
（第33図参照）をえた。
２）プラスミドpCP7のシュードモナス・プチダへの導入 大腸菌JM109株が保持しているプラスミドpCPをプラス
ミドpPK2013をヘルパープラスミドとする接合伝達法
〔プロシーデイングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド
・ステイツ・オブ・アメリカ（Proc.Natl.Acad.Sci.US
A）76,1648〜1652（1979）参照〕を用いてシュードモナ
ス・プチダ IFO 14146へ導入した。
ミドpPK2013をヘルパープラスミドとする接合伝達法
〔プロシーデイングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド
・ステイツ・オブ・アメリカ（Proc.Natl.Acad.Sci.US
A）76,1648〜1652（1979）参照〕を用いてシュードモナ
ス・プチダ IFO 14146へ導入した。
プラスミドpCP7を保持するシュードモナス・プチダ
IFO 14146を、カナマイシン（100μg/ml）を含む2XYT培
地（酵母エキス10g/l、バクトトリプトン16g/l、NaCl 5
g/l）、50mlに接種して回転式振盪機（200rpm）上で、2
4℃、16時間培養した。遠心分離（10000G、10分）によ
り得られた菌体を、滅菌蒸留水で２回洗浄した。この洗
浄菌体を70％アセトン（15ml）で抽出した後、遠心分離
（10000g、10分）により得られた上清を減圧下で濃縮す
ることにより細胞抽出液（4ml）を得た。
IFO 14146を、カナマイシン（100μg/ml）を含む2XYT培
地（酵母エキス10g/l、バクトトリプトン16g/l、NaCl 5
g/l）、50mlに接種して回転式振盪機（200rpm）上で、2
4℃、16時間培養した。遠心分離（10000G、10分）によ
り得られた菌体を、滅菌蒸留水で２回洗浄した。この洗
浄菌体を70％アセトン（15ml）で抽出した後、遠心分離
（10000g、10分）により得られた上清を減圧下で濃縮す
ることにより細胞抽出液（4ml）を得た。
細胞抽出液をTLCプレート（東京化成工業製）を用い
て分離（展開溶媒、ブタノール：酢酸：水＝3:1:1）し
た後、大腸菌PG−８を被験菌とするバイオオートグラフ
ィー〔アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・
ケミストリー（Agr.Biol.Chem.）39,1295〜1301（197
5）参照〕を行なったところ、ペニシリンＮ、デアセト
キシセファロスポリンＣ、デアセチルセファロスポリン
Ｃと同じRf値の所に阻止円が認められた。同様なバイオ
オートグラフィーをペニシリナーゼ（カルビオケム（Ca
lbiochem）製、USA）を含んだプレートで行なうとペニ
シリンＮと同じRf値の所の阻止円は認められなかった。
またエンテロバクター・クロアカ（Enterobacter cloac
ae）由来のセファロスポリナーゼを含んだプレートで行
なうと阻止円は全く認められなかった。
て分離（展開溶媒、ブタノール：酢酸：水＝3:1:1）し
た後、大腸菌PG−８を被験菌とするバイオオートグラフ
ィー〔アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・
ケミストリー（Agr.Biol.Chem.）39,1295〜1301（197
5）参照〕を行なったところ、ペニシリンＮ、デアセト
キシセファロスポリンＣ、デアセチルセファロスポリン
Ｃと同じRf値の所に阻止円が認められた。同様なバイオ
オートグラフィーをペニシリナーゼ（カルビオケム（Ca
lbiochem）製、USA）を含んだプレートで行なうとペニ
シリンＮと同じRf値の所の阻止円は認められなかった。
またエンテロバクター・クロアカ（Enterobacter cloac
ae）由来のセファロスポリナーゼを含んだプレートで行
なうと阻止円は全く認められなかった。
以上の結果からプラスミドpCP7を保持するシュードモ
ナス・プチダ IFO 14146の菌体内にペニシリンＮ、デ
アセトキシセファロスポリンＣ、デアセチルセファロス
ポリンＣが蓄積していることがあきらかとなった。
ナス・プチダ IFO 14146の菌体内にペニシリンＮ、デ
アセトキシセファロスポリンＣ、デアセチルセファロス
ポリンＣが蓄積していることがあきらかとなった。
参考例１ １）サッカロミセス・セレビシェの染色体DNAの調製 サッカロミセス・セラビシェIFO 10147の凍結保存菌
体をYPD培地（酵母エキス10g/l、ポリペプトン20g/lお
よびグルコース20g/lを含む）１に接種して回転式振
盪機（200rpm）上で、30℃、18時間培養した。遠心分離
（5000G、５分）により得られた菌体D.R.Cryerらの方法
［メソッド・イン・セル・バイオロジー（Method in Ce
ll Biology）、XII、39（1975）参照］に従い、約5mgの
染色体DNAを得た。
体をYPD培地（酵母エキス10g/l、ポリペプトン20g/lお
よびグルコース20g/lを含む）１に接種して回転式振
盪機（200rpm）上で、30℃、18時間培養した。遠心分離
（5000G、５分）により得られた菌体D.R.Cryerらの方法
［メソッド・イン・セル・バイオロジー（Method in Ce
ll Biology）、XII、39（1975）参照］に従い、約5mgの
染色体DNAを得た。
２）GLD遺伝子検索プローブの調製 J.P.Hollandの報告［ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、254、9839（197
9）参照］をもとに、第34図に示すDNAオリゴマーを調製
した。
カル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、254、9839（197
9）参照］をもとに、第34図に示すDNAオリゴマーを調製
した。
３）サッカロミセス・セレビシェのジーンライブラリ
（gene library）の作製 上記１）項で得た染色体DNA 30μｇに5.4ユニットの
制限酵素MboＩを37℃で20分間作用させ部分切断した
後、dATPとdGTPの存在下でDNAポリメレースＩ・ラージ
フラグメント（DNA polymerase I large fragment）
（宝酒造製）を作用させた。これとファージベクターλ
FixのXhoＩ切断断片、パーシアル フイル−イン・アー
ム（partial fill−in arm）（ストラタジーンクローニ
ングシステム社製、USA）とをT4DNAリガーゼ（T4DNA li
gase）により連結した。この連結反応液をギガパック
ゴールド（Gigapak gold）（ストラタジーンクローニン
グシステム社製、USA）を用いて、イン ビトロ・パッ
ケイジング（in vitro packaging）を行なった。以上の
ようにして作製したジーンライブラリのタイターは、指
示細菌として大腸菌LE 392を用いて調べた結果、1.0×1
06pfu/mlであった。
（gene library）の作製 上記１）項で得た染色体DNA 30μｇに5.4ユニットの
制限酵素MboＩを37℃で20分間作用させ部分切断した
後、dATPとdGTPの存在下でDNAポリメレースＩ・ラージ
フラグメント（DNA polymerase I large fragment）
（宝酒造製）を作用させた。これとファージベクターλ
FixのXhoＩ切断断片、パーシアル フイル−イン・アー
ム（partial fill−in arm）（ストラタジーンクローニ
ングシステム社製、USA）とをT4DNAリガーゼ（T4DNA li
gase）により連結した。この連結反応液をギガパック
ゴールド（Gigapak gold）（ストラタジーンクローニン
グシステム社製、USA）を用いて、イン ビトロ・パッ
ケイジング（in vitro packaging）を行なった。以上の
ようにして作製したジーンライブラリのタイターは、指
示細菌として大腸菌LE 392を用いて調べた結果、1.0×1
06pfu/mlであった。
４）ジーンライブラリからのGLD遺伝子のスクリーニン
グ 上記３）項で作製したジーンライブラリをプレートあ
たり6000個のプラークが出現するようにSMで希釈したの
ち、指示細菌として大腸菌LE392を用いてプレート上に
プラークを出現させた。このプレートから前記「モレキ
ュラー・クローニング」の第320〜321頁に記載の方法に
従ってプラークをニトロセルロースフィルターにリフト
した。前記、「モレキュラー・クローニング」、第396
項記載の方法で第35図のDNAオリゴマーの５′末端をT4
ポリヌクレオチド・キナーゼ、［γ−32P］ATPを用いて
32Pで放射能ラベルした。これをプローブとして、プラ
ーク・ハイブリダイゼーション（前記、「モレキュラー
・クローニング」、第326〜328頁参照）を行なった。プ
ローブとハイブリダイズが認められたポジティブプラー
クから（前記、「モレキュラー・クローニング」、第37
1〜372頁記載の方法に従いλDNAを分離した。得られた
λDNAを、制限酵素HindIIIで切断したのち、アガロース
ゲル（0.8％）電気泳動した。この電気泳動ゲルから、
サザン（Southern）法（前記、「モレキュラー・クロー
ニング」、第382〜386頁参照）により、ニトロセルロー
スフィルターにDNAを転写した。32Pでラベルした第35図
のDNAオリゴマーと、上記DNA結合ニトロセルロースフィ
ルターのサザン雑種形成（前記、「モレキュラー・クロ
ーニング」、第387〜389頁参照）を行なった。その結
果、2.3KbpのHingIII断片とハイブリダイズが認められ
た。
グ 上記３）項で作製したジーンライブラリをプレートあ
たり6000個のプラークが出現するようにSMで希釈したの
ち、指示細菌として大腸菌LE392を用いてプレート上に
プラークを出現させた。このプレートから前記「モレキ
ュラー・クローニング」の第320〜321頁に記載の方法に
従ってプラークをニトロセルロースフィルターにリフト
した。前記、「モレキュラー・クローニング」、第396
項記載の方法で第35図のDNAオリゴマーの５′末端をT4
ポリヌクレオチド・キナーゼ、［γ−32P］ATPを用いて
32Pで放射能ラベルした。これをプローブとして、プラ
ーク・ハイブリダイゼーション（前記、「モレキュラー
・クローニング」、第326〜328頁参照）を行なった。プ
ローブとハイブリダイズが認められたポジティブプラー
クから（前記、「モレキュラー・クローニング」、第37
1〜372頁記載の方法に従いλDNAを分離した。得られた
λDNAを、制限酵素HindIIIで切断したのち、アガロース
ゲル（0.8％）電気泳動した。この電気泳動ゲルから、
サザン（Southern）法（前記、「モレキュラー・クロー
ニング」、第382〜386頁参照）により、ニトロセルロー
スフィルターにDNAを転写した。32Pでラベルした第35図
のDNAオリゴマーと、上記DNA結合ニトロセルロースフィ
ルターのサザン雑種形成（前記、「モレキュラー・クロ
ーニング」、第387〜389頁参照）を行なった。その結
果、2.3KbpのHingIII断片とハイブリダイズが認められ
た。
５）GLD遺伝子のサブクローニング 上記４）項で得たλDNAを制限酵素HindIIIで切断した
のち、2.3kbpのHindIII切断をアガロースゲル（1.0％）
電気泳動（前記、「モレキュラー・クローニング」、第
150〜162頁参照）および電気泳動溶出法（高木康敬著
「遺伝子操作マニュアル」第33頁、講談社サイエンティ
フィク、1982年、参照）により単離した。一方ベクター
プラスミドpUC18を制限酵素HindIIIで切断した。このよ
うにして得られた２種類のDNA断片を混合し、T4DNAリガ
ーゼで連結反応を行なった。この連結反応液を用いて大
腸菌JM 109株を形質転換することにより、pUC 18のHind
IIIサイトに2.3kbpのHindIII断片（サッカロミセス・セ
レビシェのGLD遺伝子を含む）が挿入されたプラスミドp
GLD19（第36図参照）を得た。
のち、2.3kbpのHindIII切断をアガロースゲル（1.0％）
電気泳動（前記、「モレキュラー・クローニング」、第
150〜162頁参照）および電気泳動溶出法（高木康敬著
「遺伝子操作マニュアル」第33頁、講談社サイエンティ
フィク、1982年、参照）により単離した。一方ベクター
プラスミドpUC18を制限酵素HindIIIで切断した。このよ
うにして得られた２種類のDNA断片を混合し、T4DNAリガ
ーゼで連結反応を行なった。この連結反応液を用いて大
腸菌JM 109株を形質転換することにより、pUC 18のHind
IIIサイトに2.3kbpのHindIII断片（サッカロミセス・セ
レビシェのGLD遺伝子を含む）が挿入されたプラスミドp
GLD19（第36図参照）を得た。
参考例２ １）ジーンライブラリからのGLD遺伝子のスクリーニン
グ 実施例１−１）および２）で作製したジーンライブラ
リをプレートあたり6000個のプラークが出現するように
SMで希釈したのち、指示細菌として大腸菌LE 392を用い
てプレート上にプラークを出現させた。このプレートか
ら前記「モレキュラー・クローニング」の第320〜321頁
に記載の方法に従ってプラークをニトロセルロースフィ
ルターにリフトした。ニックトランスレーション法（前
記、「モレキュラー・クローニング」、第109〜112頁参
照により32Pで放射能ラベルしたプラスミドpGLD19の2.3
kbpのHindIII断片（サッカロミセス・セレビシェのGLD
遺伝子を含む）を、プローブとして、プラークハイブリ
ダイゼーション（前記、「モレキュラー・クローニン
グ」、第326〜328頁参照）を30％ホルムアミド、0.75M
塩化ナトリウム、0.075Mクエン酸ナトリウム、0.5％ド
デシル硫酸ナトリウム、50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.
5）および100μg/ml熱変性サケ精子DNAを含むハイブリ
ダイゼーション溶液中で42℃、16時間行なった。プロー
ブとハイブリダイズが認められたポジティブプラークか
ら（前記、「モレキュラー・クローニング」、第371〜3
72頁記載の方法に従いλDNAを分離した。得られたλDNA
を制限酵素BamHIで切断したのちアガロースゲル（0.8
％）電気泳動した。この電気泳動ゲルから、サザン（So
uthern）法（前記、「モレキュラー・クローニング」、
第382〜386頁参照）により、ニトロセルロースフィルタ
ーにDNAを転写した。32P放射能ラベルしたプラスミドpG
LD 19の2.3kbpのHindIII断片（サッカロミセス・セレビ
シェのGLD遺伝子を含む）と、上記DNA結合ニトロセルロ
ースフィルターのサザン雑種形成（前記、「モレキュラ
ー・クローニング」、第387〜389頁参照）を、30％ホル
ムアミド、0.75M塩化ナトリウム、0.075Mクエン酸ナト
リウム、0.5％ドデシル硫酸ナトリウム、50mMトリス塩
酸緩衝液（pH7.5）および100μg/ml熱変性サケ精子DNA
を含むハイブリダイゼーション溶液中で42℃、16時間行
なった。その結果、4.5kbpのBamHI断片とハイブリダイ
ズが認められた。
グ 実施例１−１）および２）で作製したジーンライブラ
リをプレートあたり6000個のプラークが出現するように
SMで希釈したのち、指示細菌として大腸菌LE 392を用い
てプレート上にプラークを出現させた。このプレートか
ら前記「モレキュラー・クローニング」の第320〜321頁
に記載の方法に従ってプラークをニトロセルロースフィ
ルターにリフトした。ニックトランスレーション法（前
記、「モレキュラー・クローニング」、第109〜112頁参
照により32Pで放射能ラベルしたプラスミドpGLD19の2.3
kbpのHindIII断片（サッカロミセス・セレビシェのGLD
遺伝子を含む）を、プローブとして、プラークハイブリ
ダイゼーション（前記、「モレキュラー・クローニン
グ」、第326〜328頁参照）を30％ホルムアミド、0.75M
塩化ナトリウム、0.075Mクエン酸ナトリウム、0.5％ド
デシル硫酸ナトリウム、50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.
5）および100μg/ml熱変性サケ精子DNAを含むハイブリ
ダイゼーション溶液中で42℃、16時間行なった。プロー
ブとハイブリダイズが認められたポジティブプラークか
ら（前記、「モレキュラー・クローニング」、第371〜3
72頁記載の方法に従いλDNAを分離した。得られたλDNA
を制限酵素BamHIで切断したのちアガロースゲル（0.8
％）電気泳動した。この電気泳動ゲルから、サザン（So
uthern）法（前記、「モレキュラー・クローニング」、
第382〜386頁参照）により、ニトロセルロースフィルタ
ーにDNAを転写した。32P放射能ラベルしたプラスミドpG
LD 19の2.3kbpのHindIII断片（サッカロミセス・セレビ
シェのGLD遺伝子を含む）と、上記DNA結合ニトロセルロ
ースフィルターのサザン雑種形成（前記、「モレキュラ
ー・クローニング」、第387〜389頁参照）を、30％ホル
ムアミド、0.75M塩化ナトリウム、0.075Mクエン酸ナト
リウム、0.5％ドデシル硫酸ナトリウム、50mMトリス塩
酸緩衝液（pH7.5）および100μg/ml熱変性サケ精子DNA
を含むハイブリダイゼーション溶液中で42℃、16時間行
なった。その結果、4.5kbpのBamHI断片とハイブリダイ
ズが認められた。
２）GLD遺伝子のサブクローニング 上記３）で得たλDNAを制限酵素BamHIで切断したの
ち、4.5kbpのBamHI断片をアガロースゲル（1.0％）電気
泳動（前記、「モレキュラー・クローニング」、第150
〜162頁参照）および電気泳動溶出法（高木康敬著「遺
伝子操作マニュアル」第33頁、講談社サイエンティフィ
ク、1982年、参照）により単離した。一方ベクタープラ
スミドpbluescript SK＋を制限酵素BamHIで切断した。
このようにして得られた２種類のDNA断片を混合し、T4D
NAリガーゼで連結反応を行なった。この連結反応液を用
いて大腸菌JM 109株を形質転換することにより、pblues
cript SK＋のBamHIサイトに4.5kbpのBamHI断片（アクレ
モニウム・クリソゲナムのGLD遺伝子を含む）が挿入さ
れたプラスミドpGL 13（第37図参照）を得た。
ち、4.5kbpのBamHI断片をアガロースゲル（1.0％）電気
泳動（前記、「モレキュラー・クローニング」、第150
〜162頁参照）および電気泳動溶出法（高木康敬著「遺
伝子操作マニュアル」第33頁、講談社サイエンティフィ
ク、1982年、参照）により単離した。一方ベクタープラ
スミドpbluescript SK＋を制限酵素BamHIで切断した。
このようにして得られた２種類のDNA断片を混合し、T4D
NAリガーゼで連結反応を行なった。この連結反応液を用
いて大腸菌JM 109株を形質転換することにより、pblues
cript SK＋のBamHIサイトに4.5kbpのBamHI断片（アクレ
モニウム・クリソゲナムのGLD遺伝子を含む）が挿入さ
れたプラスミドpGL 13（第37図参照）を得た。
参考例３ １）プラスミドpCH 1の作製 ハイグロマイシンＢホスフォトランスフェラーゼ遺伝
子を含むプラスミドpGL 62「L.Gritz、et al;ジーン（G
ene）25、179（1983）参照］からハイグロマイシンＢホ
スフォトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターとアミ
ノ基末端から３個のアミノ酸が欠失したプラスミドpCH
1（第38図参照）をKasterらの方法［カレント・ジェネ
ティクス（Current Gnetics）8、353（1984）参照］に
準じて作製した。
子を含むプラスミドpGL 62「L.Gritz、et al;ジーン（G
ene）25、179（1983）参照］からハイグロマイシンＢホ
スフォトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターとアミ
ノ基末端から３個のアミノ酸が欠失したプラスミドpCH
1（第38図参照）をKasterらの方法［カレント・ジェネ
ティクス（Current Gnetics）8、353（1984）参照］に
準じて作製した。
２）プラスミドpGL 6の作製（第39図参照） プラスミドpGL 13をEcoRIとXhoＩで切断したのち、ア
ガロースゲル（1.0％）電気泳動（前記、「モレキュラ
ー・クローニング」、第150〜162頁参照）および電気泳
動溶出法（高木康敬著「遺伝子操作マニュアル」第33
頁、講談社サイエンスティフィク、1982年、参照）によ
り単離した。2.0kbpのEcoRI−XhoＩ断片をSau3AIで切断
したのち、アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）を作
用させた。これをポリアクリルアミドゲル（1.0％）電
気泳動したのち、約80bpのEcoRI−Sau3AI断片を、前
記、「モレキュラー・クローニング」、第173頁記載の
方法に従って単離した。
ガロースゲル（1.0％）電気泳動（前記、「モレキュラ
ー・クローニング」、第150〜162頁参照）および電気泳
動溶出法（高木康敬著「遺伝子操作マニュアル」第33
頁、講談社サイエンスティフィク、1982年、参照）によ
り単離した。2.0kbpのEcoRI−XhoＩ断片をSau3AIで切断
したのち、アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）を作
用させた。これをポリアクリルアミドゲル（1.0％）電
気泳動したのち、約80bpのEcoRI−Sau3AI断片を、前
記、「モレキュラー・クローニング」、第173頁記載の
方法に従って単離した。
一方、２種類の14mer合成オリゴヌクレオタイド
（５′−GATCTATCAAAATG、５′−GATCCATTTTGATA）をそ
れぞれT4ポリヌクレオタイド・キナーゼ（宝酒造製）に
より、５′末端をリン酸化したのち、アニーリングさせ
ることによりBglII−BamHIアダプター（第39図参照）を
作製した。
（５′−GATCTATCAAAATG、５′−GATCCATTTTGATA）をそ
れぞれT4ポリヌクレオタイド・キナーゼ（宝酒造製）に
より、５′末端をリン酸化したのち、アニーリングさせ
ることによりBglII−BamHIアダプター（第39図参照）を
作製した。
次に、ベクタープラスミドpUC19をBamHIで切断したの
ち、アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）を作用さ
せ、さらにEcoRIで切断したのちアガロースゲル（1.0
％）電気泳動（前記、「モレキュラー・クローニン
グ」、第150〜162頁参照）および電気泳動溶出法（高木
康敬「遺伝子操作マニュアル」第33頁、講談社サイエン
ティフィク、1982年、参照）により、2.7kbpのEcoRI−B
amHI断片を単離した。
ち、アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）を作用さ
せ、さらにEcoRIで切断したのちアガロースゲル（1.0
％）電気泳動（前記、「モレキュラー・クローニン
グ」、第150〜162頁参照）および電気泳動溶出法（高木
康敬「遺伝子操作マニュアル」第33頁、講談社サイエン
ティフィク、1982年、参照）により、2.7kbpのEcoRI−B
amHI断片を単離した。
以上の約80bpのEcoRI−Sau3AI断片、BglII−BamHIア
ダプター、及び2.7kbpのEcoRI−BamHI断片をT4DNAリガ
ーゼを用いて連結することにより、プラスミドpGL 6を
作製した。
ダプター、及び2.7kbpのEcoRI−BamHI断片をT4DNAリガ
ーゼを用いて連結することにより、プラスミドpGL 6を
作製した。
３）プラスミドpGL 69の作製（第40図参照） 前項のプラスミドpGL 6をEcoRIとBamHIで切断したの
ち、ポリアクリルアミドゲル（1.0％）電気泳動したの
ち、約90bpのEcoRI−BamHI断片を、前記、「モレキュラ
ー・クローニング」、第173頁記載の方法に従って単離
した。
ち、ポリアクリルアミドゲル（1.0％）電気泳動したの
ち、約90bpのEcoRI−BamHI断片を、前記、「モレキュラ
ー・クローニング」、第173頁記載の方法に従って単離
した。
一方、参考例２−４）記載のプラスミドpGL 13をEcoR
IとPstＩで切断したのち、アガロースゲル（1.0％）電
気泳動（前記、モレキュラー・クローニング」、第150
〜162頁参照）および電気泳動溶出法（高木康敬著「遺
伝子操作マニュアル」第33頁、講談社サイエンティフィ
ク1982年、参照）により、1.2kbpのEcoRI−PstＩ断片を
単離した。
IとPstＩで切断したのち、アガロースゲル（1.0％）電
気泳動（前記、モレキュラー・クローニング」、第150
〜162頁参照）および電気泳動溶出法（高木康敬著「遺
伝子操作マニュアル」第33頁、講談社サイエンティフィ
ク1982年、参照）により、1.2kbpのEcoRI−PstＩ断片を
単離した。
ベクタープラスミドpHSG398（宝酒造製）をPstＩとBa
mHIで切断したのち、アガロースゲル（1.0％）電気泳動
（前記、「モレキュラー・クローニング」、第150〜162
頁参照）および電気泳動溶出法（高木康敬「遺伝子操作
マニュアル」第33頁、講談社サイエンティフィク、1982
年、参照）により2.2kbpのPstＩ−BamHI断片を単離し
た。
mHIで切断したのち、アガロースゲル（1.0％）電気泳動
（前記、「モレキュラー・クローニング」、第150〜162
頁参照）および電気泳動溶出法（高木康敬「遺伝子操作
マニュアル」第33頁、講談社サイエンティフィク、1982
年、参照）により2.2kbpのPstＩ−BamHI断片を単離し
た。
以上の約90bpのEcoRI−BamHI断片、1.2kbpのEcoRI−P
stＩ断片、2.2kbpのPstＩ−BamHI断片をT4DNAリガーゼ
を用いて連結することにより、プラスミドpGL 69を作製
した。
stＩ断片、2.2kbpのPstＩ−BamHI断片をT4DNAリガーゼ
を用いて連結することにより、プラスミドpGL 69を作製
した。
４）プラスミドpGH 2の作製（第41図参照） 前項のプラスミドpGL 69をPstＩとBamHIで切断したの
ち、アガロースゲル（1.0％）電気泳動（前記、「モレ
キュラー・クローニング」、第150〜162頁参照）および
電気泳動溶出法（高木康敬「遺伝子操作マニュアル」第
33頁、講談社サイエンティフィク、1982年、参照）によ
り、1.3kbpのPstＩ−BamHI断片を単離した。
ち、アガロースゲル（1.0％）電気泳動（前記、「モレ
キュラー・クローニング」、第150〜162頁参照）および
電気泳動溶出法（高木康敬「遺伝子操作マニュアル」第
33頁、講談社サイエンティフィク、1982年、参照）によ
り、1.3kbpのPstＩ−BamHI断片を単離した。
１）項記載のプラスミドpCH 1をHindIIIとBamHIで切
断したのち、アガロースゲル（1.0％）電気泳動（前
記、「モレキュラー・クローニング」、第150〜162頁参
照）および電気泳動溶出法（高木康敬「遺伝子操作マニ
ュアル」第33頁、講談社サイエンティフィク、1982年、
参照）により、1.6kbpのHinIII−BamHI断片を単離し
た。
断したのち、アガロースゲル（1.0％）電気泳動（前
記、「モレキュラー・クローニング」、第150〜162頁参
照）および電気泳動溶出法（高木康敬「遺伝子操作マニ
ュアル」第33頁、講談社サイエンティフィク、1982年、
参照）により、1.6kbpのHinIII−BamHI断片を単離し
た。
ベクタープラスミドpUC 19をPstＩとHindIIIで切断し
たのち、アガロースゲル（1.0％）電気泳動（前記、
「モレキュラー・クローニング」、第150〜162頁参照）
および電気泳動溶出法（高木康敬「遺伝子操作マニュア
ル」第33頁、講談社サイエンティフィク、1982年、参
照）により、2.7kbpのPstＩ−HindIII断片を単離した。
たのち、アガロースゲル（1.0％）電気泳動（前記、
「モレキュラー・クローニング」、第150〜162頁参照）
および電気泳動溶出法（高木康敬「遺伝子操作マニュア
ル」第33頁、講談社サイエンティフィク、1982年、参
照）により、2.7kbpのPstＩ−HindIII断片を単離した。
以上の1.3kbpのPstＩ−BamHI断片、1.6kbpのHindIII
−BamHI断片、2.7kbpのPstＩ−HindIII断片をT4DNAリガ
ーゼを用いて連結することにより、プラスミドpGH2を作
製した。
−BamHI断片、2.7kbpのPstＩ−HindIII断片をT4DNAリガ
ーゼを用いて連結することにより、プラスミドpGH2を作
製した。
５）プラスミドpGH 21の作製 参考例３−３）で作製したpGL 69をBamHIとHindIIIで
切断したのち、アガロースゲル（1.0％）電気泳動（前
記、「モレキュラー・クローニング」、第150〜162頁参
照）および電気泳動溶出法（高木康敬著「遺伝子操作マ
ニュアル」第33頁、講談社サイエンティフィク、1982
年、参照）により、1.3kbpのBamHI−HindIII断片を単離
した。参考例３−１）項記載のプラスミドpCH 1をHindI
IIとBamHIで切断したのち、アガロースゲル（1.0％）電
気泳動（前記、「モレキュラー・クローニング」、第15
0〜162頁参照）および電気泳動溶出法（高木康敬著「遺
伝子操作マニュアル」第33頁、講談社サイエンティフィ
ク、1982年、参照）により、1.6kbpのHindIII−BamHI断
片を単離した。
切断したのち、アガロースゲル（1.0％）電気泳動（前
記、「モレキュラー・クローニング」、第150〜162頁参
照）および電気泳動溶出法（高木康敬著「遺伝子操作マ
ニュアル」第33頁、講談社サイエンティフィク、1982
年、参照）により、1.3kbpのBamHI−HindIII断片を単離
した。参考例３−１）項記載のプラスミドpCH 1をHindI
IIとBamHIで切断したのち、アガロースゲル（1.0％）電
気泳動（前記、「モレキュラー・クローニング」、第15
0〜162頁参照）および電気泳動溶出法（高木康敬著「遺
伝子操作マニュアル」第33頁、講談社サイエンティフィ
ク、1982年、参照）により、1.6kbpのHindIII−BamHI断
片を単離した。
ベクタープラスミドpHSG398（宝酒造製）をHindIIIで
切断したのち、アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）
を作用させた。
切断したのち、アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）
を作用させた。
以上の1.3kbpのBamHI−HindIII断片、1.6kbpのHindII
I−BamHI断片、pHSG398のHindIII断片をT4リガーゼを用
いて連結することによりプラスミドpGH 21（第28図参
照）を作製した。
I−BamHI断片、pHSG398のHindIII断片をT4リガーゼを用
いて連結することによりプラスミドpGH 21（第28図参
照）を作製した。
発明の効果 本発明のセファロスポリン系抗生物質の生合成に関与
する酵素遺伝子群を有するDNA断片は、細菌（例えば、
大腸菌）やカビ（例えば、アクレモニウム クリソゲナ
ム）を宿主として効率的に発現させることができ、これ
らの酵素遺伝子群を含有するDNA断片を用いることによ
って、セファロスポリン系抗生物質の生産性の向上が可
能である。
する酵素遺伝子群を有するDNA断片は、細菌（例えば、
大腸菌）やカビ（例えば、アクレモニウム クリソゲナ
ム）を宿主として効率的に発現させることができ、これ
らの酵素遺伝子群を含有するDNA断片を用いることによ
って、セファロスポリン系抗生物質の生産性の向上が可
能である。
第１図は、実施例４において決定されたDNA断片の塩基
配列を、第２図は、実施例１−３）において調製された
DNAオリゴマー（イソペニシリンＮシンセターゼ遺伝子
検索プローブ）を、第３図は、実施例１−５）において
作製されたプラスミドpIPS 6の制限酵素切断地図を、第
４図は、実施例２−４）において得られたプラスミドpB
I1の制限酵素切断地図を、第５図および６図は、実施例
３−１）において作製されたプラスミドpBI2およびpBI3
の制限酵素切断地図を、第７図、第８図、第９図、第10
図および第11図は、実施例３−２）において作成された
プラスミドpBI4,pBI5,pBI6,pBI7およびpBI8の制限酵素
切断地図を、第12図は、プラスミドpBI1,pBI2,pBI3,pBI
4,pBI5,pBI6,pBI7およびpBI8に含まれるリゾバクター・
ラクタムＡヌスYK−90の染色体DNAの制限酵素切断地図
を第13〜21図は、ORF1〜９のアミノ酸配列を、第22図
は、実施例６において作製されたプラスミドpBR322Eco
の制限酵素切断地図を、第23図は、実施例６において作
製されたプラスミドpBRTAC8の制限酵素切断地図を、第2
4図は、実施例７において作製されたプラスミドpBI110
の制限酵素切断地図を、第25図は、実施例８において作
製されたプラスミドpBI120の制限酵素切断地図を、第26
図は、実施例９において作製されたプラスミドpBI140の
制限酵素切断地図を、第27図は、実施例10において作製
されたプラスミドpBI151の制限酵素切断地図を、第28図
は、参考例３−５）において作製されたプラスミドpGH2
1の制限酵素切断地図を、第29図は、実施例11−１）に
おいて作製されたBglII−Bsp1286アダプターを、第30図
は、実施例11−１）において作製されたプラスミドpGBI
1の制限酵素切断地図を示す。第31図は、実施例11−
２）において作製されたプラスミドpGHBI21の制限酵素
切断地図を、第32図は、実施例12−１）において作製さ
れたプラスミドpCP14の制限酵素切断地図を、第33図
は、実施例13−１）において作製されたプラスミドpCP7
の制限酵素切断地図を、第34図は、参考例１−２）にお
いて調製されたDNAオリゴマー（GLO遺伝子検索プロー
ブ）を、第35図は、参考例１−４）において調製された
DNAオリゴマーを、第36図は、参考例１−５）において
作製されたプラスミドpGLD19の制限酵素切断地図を、第
37図は、参考例２−４）において作製されたプラスミド
pGL13の制限酵素切断地図を、第38図は、参考例３−
１）において作製されたプラスミドpCH1の制限酵素切断
地図を、第39図はプラスミドpGL6の調製法を、第40図
は、参考例３におけるプラスミドpGL69の調製法を、第4
1図は、参考例３におけるプラスミドpGH2の調製法をそ
れぞれ示す。
配列を、第２図は、実施例１−３）において調製された
DNAオリゴマー（イソペニシリンＮシンセターゼ遺伝子
検索プローブ）を、第３図は、実施例１−５）において
作製されたプラスミドpIPS 6の制限酵素切断地図を、第
４図は、実施例２−４）において得られたプラスミドpB
I1の制限酵素切断地図を、第５図および６図は、実施例
３−１）において作製されたプラスミドpBI2およびpBI3
の制限酵素切断地図を、第７図、第８図、第９図、第10
図および第11図は、実施例３−２）において作成された
プラスミドpBI4,pBI5,pBI6,pBI7およびpBI8の制限酵素
切断地図を、第12図は、プラスミドpBI1,pBI2,pBI3,pBI
4,pBI5,pBI6,pBI7およびpBI8に含まれるリゾバクター・
ラクタムＡヌスYK−90の染色体DNAの制限酵素切断地図
を第13〜21図は、ORF1〜９のアミノ酸配列を、第22図
は、実施例６において作製されたプラスミドpBR322Eco
の制限酵素切断地図を、第23図は、実施例６において作
製されたプラスミドpBRTAC8の制限酵素切断地図を、第2
4図は、実施例７において作製されたプラスミドpBI110
の制限酵素切断地図を、第25図は、実施例８において作
製されたプラスミドpBI120の制限酵素切断地図を、第26
図は、実施例９において作製されたプラスミドpBI140の
制限酵素切断地図を、第27図は、実施例10において作製
されたプラスミドpBI151の制限酵素切断地図を、第28図
は、参考例３−５）において作製されたプラスミドpGH2
1の制限酵素切断地図を、第29図は、実施例11−１）に
おいて作製されたBglII−Bsp1286アダプターを、第30図
は、実施例11−１）において作製されたプラスミドpGBI
1の制限酵素切断地図を示す。第31図は、実施例11−
２）において作製されたプラスミドpGHBI21の制限酵素
切断地図を、第32図は、実施例12−１）において作製さ
れたプラスミドpCP14の制限酵素切断地図を、第33図
は、実施例13−１）において作製されたプラスミドpCP7
の制限酵素切断地図を、第34図は、参考例１−２）にお
いて調製されたDNAオリゴマー（GLO遺伝子検索プロー
ブ）を、第35図は、参考例１−４）において調製された
DNAオリゴマーを、第36図は、参考例１−５）において
作製されたプラスミドpGLD19の制限酵素切断地図を、第
37図は、参考例２−４）において作製されたプラスミド
pGL13の制限酵素切断地図を、第38図は、参考例３−
１）において作製されたプラスミドpCH1の制限酵素切断
地図を、第39図はプラスミドpGL6の調製法を、第40図
は、参考例３におけるプラスミドpGL69の調製法を、第4
1図は、参考例３におけるプラスミドpGH2の調製法をそ
れぞれ示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭60−141296（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−224292（ＪＰ，Ａ) Ｎａｔｕｒｅ，1984，Ｖｏｌ．309, Ｎｏ．31，Ｐ．462−464 Ｎａｔｕｒｅ，1985，Ｖｏｌ．318, Ｎｏ．14，Ｐ．191−194 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12P 1/00 - 41/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (5)
- 【請求項１】第１図の第5524〜16690番目の塩基配
列、第16761〜17739番目の塩基配列、第17802〜187
59番目の塩基配列、第18798〜19737番目の塩基配列、
第19802〜21059番目の塩基配列および第21186〜223
41番目の塩基配列を含有することを特徴とするセファロ
スポリン系抗生物質の生合成に関与するσ−（Ｌ−α
−アミノアジピル）−Ｌ−システニル−Ｄ−バリンシン
セターゼ）、イソペニシリンＮシンセターゼ、デア
セトキシセファロスポリンＣシンセターゼ、デアセト
キシセファロスポリンＣハイドロキシラーゼ、イソペ
ニシリンＮエピメラーゼおよびβ−ラクタマーゼの酵
素遺伝子群を有するリゾバクター・ラクタムゲヌス由来
のDNA断片。 - 【請求項２】DNA断片の塩基配列が、第１図に示すもの
である請求項（１）記載のDNA断片。 - 【請求項３】請求項（１）または（２）記載のDNA断片
または、それを構成する酵素遺伝子の発現に必要な大き
さのDNA断片を組み込んだプラスミド。 - 【請求項４】請求項（３）記載のプラスミドで形質転換
した微生物。 - 【請求項５】セファロスポリン系抗生物質を産生する能
力を有する請求項（４）記載の形質転換体を培養し、セ
ファロスポリン系抗生物質を培養液中に蓄積させ、それ
を採取することを特徴とするセファロスポリン系抗生物
質の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003762A JP2928884B2 (ja) | 1989-02-01 | 1990-01-10 | Ｄｎａおよびその用途 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2471089 | 1989-02-01 | ||
| JP1-24710 | 1989-02-01 | ||
| JP2003762A JP2928884B2 (ja) | 1989-02-01 | 1990-01-10 | Ｄｎａおよびその用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02291274A JPH02291274A (ja) | 1990-12-03 |
| JP2928884B2 true JP2928884B2 (ja) | 1999-08-03 |
Family
ID=26337403
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003762A Expired - Fee Related JP2928884B2 (ja) | 1989-02-01 | 1990-01-10 | Ｄｎａおよびその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2928884B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ288721B6 (cs) * | 1991-10-15 | 2001-08-15 | Dsm Gist B. V. | Biologický způsob výroby kyseliny 7-aminodeacetylcefalosporanové |
-
1990
- 1990-01-10 JP JP2003762A patent/JP2928884B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｎａｔｕｒｅ，１９８４，Ｖｏｌ．３０９，Ｎｏ．３１，Ｐ．４６２−４６４ |
| Ｎａｔｕｒｅ，１９８５，Ｖｏｌ．３１８，Ｎｏ．１４，Ｐ．１９１−１９４ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02291274A (ja) | 1990-12-03 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |