JP3072101B2 - ７―ａｄｃａの生化学的新規製造法 - Google Patents
７―ａｄｃａの生化学的新規製造法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】１．発明の属する技術分野 本発明は、市販のセファロスポリン系抗生物質を製造す
るための合成方法の分野に関する。該抗生物質の数は現
在、かなり多く、これらの治療物質は現在、第４世代に
ある。市販のセファロスポリン系抗生物質には種々の多
数の側鎖があり、セファロスポリン系抗生物質の経済的
重要性が大きいことから、種々のセファロスポリン系抗
生物質の合成を容易にする重要中間体のより経済的で効
率的な製造方法の達成に対する重要性が高まっいてる。
るための合成方法の分野に関する。該抗生物質の数は現
在、かなり多く、これらの治療物質は現在、第４世代に
ある。市販のセファロスポリン系抗生物質には種々の多
数の側鎖があり、セファロスポリン系抗生物質の経済的
重要性が大きいことから、種々のセファロスポリン系抗
生物質の合成を容易にする重要中間体のより経済的で効
率的な製造方法の達成に対する重要性が高まっいてる。
【０００２】これらの重要中間体の一つは７−アミノデ
スアセトキシセファロスポラン酸（７−ＡＤＣＡ）であ
り、下記式：
スアセトキシセファロスポラン酸（７−ＡＤＣＡ）であ
り、下記式：
【０００３】
【化１】 で表すことができる。現在、７−ＡＤＣＡはペニシリン
Ｇから製造されるが、ペニシリン環系の５員環からセフ
ァロスポリン系の特徴である６員環へ広げるには４また
は５個の化学工程を必要とする。全合成の場合の常とし
て、この方法には重大な欠点がある。とりわけ、複雑な
多段工程を必要とし、試薬が高価であり、かなりの量の
副成物が生じるため排出液の処理が問題になり、また、
化学処理を施す前にかなり不純な出発物質の精製を要す
ることが挙げられる。従って、環の拡張および側鎖の開
裂を酵素的に行って、現在使用されている化学的方法よ
りも経済的に７−ＡＤＣＡを製造する微生物または醗酵
による方法に関する研究が進行している。
Ｇから製造されるが、ペニシリン環系の５員環からセフ
ァロスポリン系の特徴である６員環へ広げるには４また
は５個の化学工程を必要とする。全合成の場合の常とし
て、この方法には重大な欠点がある。とりわけ、複雑な
多段工程を必要とし、試薬が高価であり、かなりの量の
副成物が生じるため排出液の処理が問題になり、また、
化学処理を施す前にかなり不純な出発物質の精製を要す
ることが挙げられる。従って、環の拡張および側鎖の開
裂を酵素的に行って、現在使用されている化学的方法よ
りも経済的に７−ＡＤＣＡを製造する微生物または醗酵
による方法に関する研究が進行している。
【０００４】従って、本発明は特に、重要なセファロス
ポリン中間体である７−ＡＤＣＡの製造分野に関し、と
りわけ、７−ＡＤＣＡの生化学的製造方法の分野に関す
る。
ポリン中間体である７−ＡＤＣＡの製造分野に関し、と
りわけ、７−ＡＤＣＡの生化学的製造方法の分野に関す
る。
【０００５】今日まで、７−ＡＤＣＡの生化学的取得を
成功させるための研究は大部分が徒労に終わっており、
商業的規模での製造法に関しては特にそうである。例え
ば、直接醗酵により、および／またはペニシリンＧを酵
素処理することにより、７−ＡＤＣＡを得るために必要
な環の拡張を別にして、６−アミノペニシラン酸（６−
ＡＰＡ）を製造することは可能であるが、不幸なこと
に、自身の正常な代謝経路に環の拡張を含むCephalospo
riumまたはStreptomyces属の酵素は、６−ＡＰＡを基質
として受け入れない。公知文献ではＤＡＯＣＳまたはエ
クスパンダーゼ酵素と総称しているこれらの酵素を、こ
こではペニシリン型分子に見られるペナム環構造をセフ
ァロスポリン類に見られるセフ−３−エム環に拡張する
のを触媒する酵素として定義する。以後、これらの酵素
は「エクスパンダーゼ酵素」と称する。
成功させるための研究は大部分が徒労に終わっており、
商業的規模での製造法に関しては特にそうである。例え
ば、直接醗酵により、および／またはペニシリンＧを酵
素処理することにより、７−ＡＤＣＡを得るために必要
な環の拡張を別にして、６−アミノペニシラン酸（６−
ＡＰＡ）を製造することは可能であるが、不幸なこと
に、自身の正常な代謝経路に環の拡張を含むCephalospo
riumまたはStreptomyces属の酵素は、６−ＡＰＡを基質
として受け入れない。公知文献ではＤＡＯＣＳまたはエ
クスパンダーゼ酵素と総称しているこれらの酵素を、こ
こではペニシリン型分子に見られるペナム環構造をセフ
ァロスポリン類に見られるセフ−３−エム環に拡張する
のを触媒する酵素として定義する。以後、これらの酵素
は「エクスパンダーゼ酵素」と称する。
【０００６】エクスパンダーゼ酵素が作用する基質はペ
ニシリンＮであり、これは、環が拡張されるとデアセト
キシセファロスポリンＣ（ＤＡＯＣ）になる。この場
合、７−ＡＤＣＡを得るためには、（Ｄ）−α−アミノ
アジポイル側鎖を開裂するだけでよいが、この側鎖は、
酵素開裂に対して頑強に抵抗して、許容されないほどの
低収量しか得られないことがわかっている。
ニシリンＮであり、これは、環が拡張されるとデアセト
キシセファロスポリンＣ（ＤＡＯＣ）になる。この場
合、７−ＡＤＣＡを得るためには、（Ｄ）−α−アミノ
アジポイル側鎖を開裂するだけでよいが、この側鎖は、
酵素開裂に対して頑強に抵抗して、許容されないほどの
低収量しか得られないことがわかっている。
【０００７】本発明によれば、ペニシリン化合物（アジ
ポイル側鎖を有する）を新規醗酵法により高力価で製造
する効率的な生化学方法を達成することができる。そし
て、該ペニシリン化合物は、ペニシリン化合物を産生す
る同一の微生物をエクスパンダーゼ酵素系をも発現する
よう形質転換すると、それによってｉｎ ｓｉｔｕで産
生されるエクスパンダーゼ酵素系の許容可能な基質であ
る。エクスパンダーゼ酵素は、ペニシリン化合物の環を
拡張してセファロスポリン化合物が高収率で得られるよ
うに作用する。この第二の必須工程で重要なことは、ペ
ニシリン化合物、ここではセファロスポリン化合物の側
鎖が、別の酵素により驚くほど高収率で脱離可能である
ことである。本発明の一部をなすこの独自の生化学方法
は、予期しなかったことに、７−ＡＤＣＡが驚くほど高
収率で製造されるという結果をもたらす。２．従来技術の簡単な説明 Cantwell et al., in Curr Genet (1990) 17:213-221
は、ペニシリンＶの環を拡張した後、得られたデアセト
キシセファロスポリンＶを酵素的に加水分解することに
より７−ＡＤＣＡを製造する生化学方法を提案した。こ
の提案は、S.clavuligerus由来のクローン化したペニシ
リンＮエクスパンダーゼ遺伝子（ｃｅｆＥ）が入手可能
であることに基づいている(Kovacevic et al.,J. Bacte
riol. (1989) 171:754-760およびU.S.5,070,020)。しか
し、そのエクスパンダーゼは、天然基質であるペニシリ
ンＮには作用するものの、ペニシリンＶには作用しない
ので、その提案は、ペニシリンＶの環拡張を行うことが
できるような修飾エクスパンダーゼ遺伝子が得られるよ
うな遺伝子処理を必要とする。必要な修飾は、Cantwell
et al. では達成されておらず、Streptomyces clavuli
gerus由来のｃｅｆＥ遺伝子により Penicillium chryso
genumを形質転換し、ＤＡＯＣＳ（エクスパンダーゼ）
酵素を低レベルで発現することに成功したに過ぎない。
ポイル側鎖を有する）を新規醗酵法により高力価で製造
する効率的な生化学方法を達成することができる。そし
て、該ペニシリン化合物は、ペニシリン化合物を産生す
る同一の微生物をエクスパンダーゼ酵素系をも発現する
よう形質転換すると、それによってｉｎ ｓｉｔｕで産
生されるエクスパンダーゼ酵素系の許容可能な基質であ
る。エクスパンダーゼ酵素は、ペニシリン化合物の環を
拡張してセファロスポリン化合物が高収率で得られるよ
うに作用する。この第二の必須工程で重要なことは、ペ
ニシリン化合物、ここではセファロスポリン化合物の側
鎖が、別の酵素により驚くほど高収率で脱離可能である
ことである。本発明の一部をなすこの独自の生化学方法
は、予期しなかったことに、７−ＡＤＣＡが驚くほど高
収率で製造されるという結果をもたらす。２．従来技術の簡単な説明 Cantwell et al., in Curr Genet (1990) 17:213-221
は、ペニシリンＶの環を拡張した後、得られたデアセト
キシセファロスポリンＶを酵素的に加水分解することに
より７−ＡＤＣＡを製造する生化学方法を提案した。こ
の提案は、S.clavuligerus由来のクローン化したペニシ
リンＮエクスパンダーゼ遺伝子（ｃｅｆＥ）が入手可能
であることに基づいている(Kovacevic et al.,J. Bacte
riol. (1989) 171:754-760およびU.S.5,070,020)。しか
し、そのエクスパンダーゼは、天然基質であるペニシリ
ンＮには作用するものの、ペニシリンＶには作用しない
ので、その提案は、ペニシリンＶの環拡張を行うことが
できるような修飾エクスパンダーゼ遺伝子が得られるよ
うな遺伝子処理を必要とする。必要な修飾は、Cantwell
et al. では達成されておらず、Streptomyces clavuli
gerus由来のｃｅｆＥ遺伝子により Penicillium chryso
genumを形質転換し、ＤＡＯＣＳ（エクスパンダーゼ）
酵素を低レベルで発現することに成功したに過ぎない。
【０００８】エクスパンダーゼ酵素は、その活性および
遺伝子配列の両方に関して十分研究されている。例え
ば、U.S.4,510,246 および4,536,476 （以上、Wolfe）
では、サイクラーゼ、エピメラーゼおよび環拡張酵素
が、Streptomyces clavuligerusを含む、原核生物のβ
−ラクタム産生微生物の無細胞抽出物から別々に単離さ
れて、安定な酵素試薬が得られた。EP-A-0366354には、
S.clavuligerusから単離・精製したエクスパンダーゼ酵
素が記載されており、該酵素は末端残基およびアミノ酸
組成物などで確認され、約３４，６００ダルトンの分子
量を有すると言われている。しかし、これは、U.S.4,53
6,476 では同一酵素であると思われるものの分子量が２
９，０００になっており、対照的である。EP-A-0233715
は、S.clavuligerusから得られるエクスパンダーゼ酵素
の単離およびエンドヌクレアーゼ制限酵素による制限地
図作成、該酵素の宿主での形質転換および発現、ならび
に該酵素を使用したペニシリンＮ基質の環拡張の実例を
開示している。U.S.5,070,020は、S.clavuligerusから
得られるエクスパンダーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列
を開示しており、また、P.chrysogenum菌株を該ＤＮＡ
配列を含む発現ベクターにより形質転換してエクスパン
ダーゼ酵素を発現させることを記載している。この酵素
はペニシリンＮ以外の基質の拡張にも有用とされている
が、そのような拡張の実例はない。
遺伝子配列の両方に関して十分研究されている。例え
ば、U.S.4,510,246 および4,536,476 （以上、Wolfe）
では、サイクラーゼ、エピメラーゼおよび環拡張酵素
が、Streptomyces clavuligerusを含む、原核生物のβ
−ラクタム産生微生物の無細胞抽出物から別々に単離さ
れて、安定な酵素試薬が得られた。EP-A-0366354には、
S.clavuligerusから単離・精製したエクスパンダーゼ酵
素が記載されており、該酵素は末端残基およびアミノ酸
組成物などで確認され、約３４，６００ダルトンの分子
量を有すると言われている。しかし、これは、U.S.4,53
6,476 では同一酵素であると思われるものの分子量が２
９，０００になっており、対照的である。EP-A-0233715
は、S.clavuligerusから得られるエクスパンダーゼ酵素
の単離およびエンドヌクレアーゼ制限酵素による制限地
図作成、該酵素の宿主での形質転換および発現、ならび
に該酵素を使用したペニシリンＮ基質の環拡張の実例を
開示している。U.S.5,070,020は、S.clavuligerusから
得られるエクスパンダーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列
を開示しており、また、P.chrysogenum菌株を該ＤＮＡ
配列を含む発現ベクターにより形質転換してエクスパン
ダーゼ酵素を発現させることを記載している。この酵素
はペニシリンＮ以外の基質の拡張にも有用とされている
が、そのような拡張の実例はない。
【０００９】上述した研究は、原核生物S.clavuligerus
から得られるエクスパンダーゼ酵素に集中している。こ
の同一の酵素または少なくとも見かけ上同じ環拡張活性
を有する酵素は、真核生物Cephalosporium acremonium
（Acremonium chrysogenumとも言う。）の菌株によって
も発現される。しかし、そのような菌株でのエクスパン
ダーゼ活性は二機能性遺伝子（ｃｅｆＥＦ）によって発
現され、その遺伝子は、その本来の機能がエクスパンダ
ーゼ酵素のデスアセトキシセファロスポラン酸（ＤＡＯ
Ｃ）産物をデアセチルセファロスポリンＣ（ＤＡＣ）に
変換することであるＤＡＣＳ（ヒドロキシラーゼ）活性
も発現する。その結果、単一であるが二機能性のエクス
パンダーゼ／ヒドロキシラーゼ酵素が得られる。これら
２個の遺伝子産物の活性を分離する試みがなされている
が、まだ誰も成功していない。例えば、EP-A-0281391
は、C.acremonium ATCC11550から得られるＤＡＯＣＳ／
ＤＡＣＳ遺伝子の単離およびＤＮＡ配列の同定をその酵
素の対応するアミノ酸配列とともに開示している。Peni
cilliumは形質転換され、その酵素を発現するが、ペニ
シリンＧおよびＶを対応するセファロスポリンに変換す
るという試みは少しも例示されていない。さらに、ＤＡ
ＯＣＳをコードする遺伝子情報をＤＡＣＳから分離して
それらを別々に発現することは、遺伝子工学技術により
容易に行うことができるという示唆にもかかわらず、そ
のような分離の実例は全く記載されていない。
から得られるエクスパンダーゼ酵素に集中している。こ
の同一の酵素または少なくとも見かけ上同じ環拡張活性
を有する酵素は、真核生物Cephalosporium acremonium
（Acremonium chrysogenumとも言う。）の菌株によって
も発現される。しかし、そのような菌株でのエクスパン
ダーゼ活性は二機能性遺伝子（ｃｅｆＥＦ）によって発
現され、その遺伝子は、その本来の機能がエクスパンダ
ーゼ酵素のデスアセトキシセファロスポラン酸（ＤＡＯ
Ｃ）産物をデアセチルセファロスポリンＣ（ＤＡＣ）に
変換することであるＤＡＣＳ（ヒドロキシラーゼ）活性
も発現する。その結果、単一であるが二機能性のエクス
パンダーゼ／ヒドロキシラーゼ酵素が得られる。これら
２個の遺伝子産物の活性を分離する試みがなされている
が、まだ誰も成功していない。例えば、EP-A-0281391
は、C.acremonium ATCC11550から得られるＤＡＯＣＳ／
ＤＡＣＳ遺伝子の単離およびＤＮＡ配列の同定をその酵
素の対応するアミノ酸配列とともに開示している。Peni
cilliumは形質転換され、その酵素を発現するが、ペニ
シリンＧおよびＶを対応するセファロスポリンに変換す
るという試みは少しも例示されていない。さらに、ＤＡ
ＯＣＳをコードする遺伝子情報をＤＡＣＳから分離して
それらを別々に発現することは、遺伝子工学技術により
容易に行うことができるという示唆にもかかわらず、そ
のような分離の実例は全く記載されていない。
【００１０】C.acremoniumのＤＡＯＣＳ／ＤＡＣＳ（エ
クスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ）酵素も、その活性
および特徴ならびに遺伝子配列に関して十分に研究され
ている。例えば、U.S.4,178,210 、U.S.4,248,966 およ
びU.S.4,307,192 （以上、Demain）では、エピマー化し
て環を拡張することによりセファロスポリン抗生物質を
生じるC.acremoniumの無細胞抽出物によりペニシリン型
の種々の出発物質を処理している。U.S.4,753,881 （Wu
-Kuang Yeh）は、C.acremonium酵素の等電点、分子量、
アミノ酸残基、ヒドロキシラーゼ活性とエクスパンダー
ゼ活性との比およびペプチド断片に関して記載してい
る。
クスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼ）酵素も、その活性
および特徴ならびに遺伝子配列に関して十分に研究され
ている。例えば、U.S.4,178,210 、U.S.4,248,966 およ
びU.S.4,307,192 （以上、Demain）では、エピマー化し
て環を拡張することによりセファロスポリン抗生物質を
生じるC.acremoniumの無細胞抽出物によりペニシリン型
の種々の出発物質を処理している。U.S.4,753,881 （Wu
-Kuang Yeh）は、C.acremonium酵素の等電点、分子量、
アミノ酸残基、ヒドロキシラーゼ活性とエクスパンダー
ゼ活性との比およびペプチド断片に関して記載してい
る。
【００１１】上述した公知文献は、P.chrysogenum菌株
を、エクスパンダーゼ酵素を発現する遺伝子により形質
転換してその酵素を発現させるという点のみで、本発明
に関連している。そこでは、発現した酵素を使用して、
ペニシリンＧおよびＶではなく、ペニシリンＮの環拡張
を行っているだけである。その場合ですら、ペニシリン
Ｎの７位には、本発明方法のように酵素的に開裂して７
−ＡＤＣＡにすることができない側鎖がある。本発明
は、アジポイル側鎖がP.chrysogenum菌株により効率的
に付加され、ｉｎ ｓｉｔｕ発現したエクスパンダーゼ
酵素がその化合物を環拡張の基質として効率的に使用し
てアジポイル７−ＡＤＣＡにし、次いで、そのアジポイ
ル側鎖が別の酵素により効率的に脱離されて７−ＡＤＣ
Ａになるという驚くべき発見によるものである。本発明
個々の断片自体は公知文献に見出すことができるとして
も、それらを結合すると本発明方法のように予期しない
結果が得られるということは示唆されていない。
を、エクスパンダーゼ酵素を発現する遺伝子により形質
転換してその酵素を発現させるという点のみで、本発明
に関連している。そこでは、発現した酵素を使用して、
ペニシリンＧおよびＶではなく、ペニシリンＮの環拡張
を行っているだけである。その場合ですら、ペニシリン
Ｎの７位には、本発明方法のように酵素的に開裂して７
−ＡＤＣＡにすることができない側鎖がある。本発明
は、アジポイル側鎖がP.chrysogenum菌株により効率的
に付加され、ｉｎ ｓｉｔｕ発現したエクスパンダーゼ
酵素がその化合物を環拡張の基質として効率的に使用し
てアジポイル７−ＡＤＣＡにし、次いで、そのアジポイ
ル側鎖が別の酵素により効率的に脱離されて７−ＡＤＣ
Ａになるという驚くべき発見によるものである。本発明
個々の断片自体は公知文献に見出すことができるとして
も、それらを結合すると本発明方法のように予期しない
結果が得られるということは示唆されていない。
【００１２】例えば、６−アジポイルペニシラン酸は文
献により公知である（Ballio, A. et al., Nature (196
0) 185, 97-99 参照）。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの６−アジ
ポイルペニシラン酸の酵素的拡張も文献により公知であ
る（Baldwin et al., Tetrahedron (1987) 43, 3009-30
14およびEP-A-0268343参照）。そして、アジポイル側鎖
の酵素的開裂も文献により公知である（Matsuda et a
l., J. Bact. (1987) 169, 5815-5820）。
献により公知である（Ballio, A. et al., Nature (196
0) 185, 97-99 参照）。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの６−アジ
ポイルペニシラン酸の酵素的拡張も文献により公知であ
る（Baldwin et al., Tetrahedron (1987) 43, 3009-30
14およびEP-A-0268343参照）。そして、アジポイル側鎖
の酵素的開裂も文献により公知である（Matsuda et a
l., J. Bact. (1987) 169, 5815-5820）。
【００１３】アジポイル側鎖は次の構造：ＣＯＯＨ−
（ＣＨ２）４−ＣＯ−を有するが、密接に関連した構造
の側鎖として、構造：ＣＯＯＨ−（ＣＨ２）３−ＣＯ−
を有するグルタリル側鎖がある。グルタリル側鎖の酵素
的開裂は文献により公知である（例えば、Shibuya et a
l., Agric. Biol. Chem. (1981) 45, 1561-1567 、Mats
uda and Komatsu, J. Bact. (1985) 163, 1222- 1228、
Matsuda et al., J. Bact. (1987) 169, 5815-5820、特
開昭53-086084 （萬有製薬）および特開昭52-128293
（萬有製薬）参照）。
（ＣＨ２）４−ＣＯ−を有するが、密接に関連した構造
の側鎖として、構造：ＣＯＯＨ−（ＣＨ２）３−ＣＯ−
を有するグルタリル側鎖がある。グルタリル側鎖の酵素
的開裂は文献により公知である（例えば、Shibuya et a
l., Agric. Biol. Chem. (1981) 45, 1561-1567 、Mats
uda and Komatsu, J. Bact. (1985) 163, 1222- 1228、
Matsuda et al., J. Bact. (1987) 169, 5815-5820、特
開昭53-086084 （萬有製薬）および特開昭52-128293
（萬有製薬）参照）。
【００１４】また、EP-A-0453048は、Pseudomonas SY-7
7-1 によって産生されるグルタリルアシラーゼのアジポ
イル開裂活性を改善する方法を記載している。α−サブ
ユニット内に位置する種々のアミノ酸を置換することに
より、（アジポイル−セリンからの）アジポイル開裂速
度が３〜５倍高くなった。なお、EP-A-0453048は見かけ
上、アジポイル側鎖に対する活性が改善されたアシラー
ゼを実証しているが、アジポイル−セファロスポリンを
主に生じさせる方法（化学的方法または本明細書に記載
した方法と類似の生化学的方法のいずれによっても）に
ついては何も記載していない。
7-1 によって産生されるグルタリルアシラーゼのアジポ
イル開裂活性を改善する方法を記載している。α−サブ
ユニット内に位置する種々のアミノ酸を置換することに
より、（アジポイル−セリンからの）アジポイル開裂速
度が３〜５倍高くなった。なお、EP-A-0453048は見かけ
上、アジポイル側鎖に対する活性が改善されたアシラー
ゼを実証しているが、アジポイル−セファロスポリンを
主に生じさせる方法（化学的方法または本明細書に記載
した方法と類似の生化学的方法のいずれによっても）に
ついては何も記載していない。
【００１５】（Ｄ）−α−アミノアジポイル側鎖が存在
する場合、最初にアミノ基を酵素的に除いて、その側鎖
を（Ｄ）−アミノ酸オキシダーゼにより短くしてグルタ
リル（ＧＬ−７）側鎖とし、これを別の酵素（グルタリ
ルアシラーゼ）によりグルタリル側鎖を脱離することは
文献により公知である。そのような二段開裂は、U.S.3,
960,662 （Matsuda ）、EP-A-0275901、特開昭61-21805
7 （1988-Komatsu, 旭化成工業）、WO90/12110（1990-
Wong, Biopure Corp. ）およびIsogai et al.,Bio/Tech
nology(1991) 9,188-191に開示されている。係属の出願との関連 エクスパンダーゼ酵素の活性を、本明細書に記載した７
−ＡＤＣＡを得るための生化学方法と同様の方法により
P.chrysogenum形質転換細胞で発現させ７−ＡＣＡを得
るためのバイオ方法を開示した出願中の米国特許出願０
７／９５３，４９２、１９９２年１０月６日出願（特開
平４−３１９１９４号）と関連する。しかし、この７−
ＡＣＡバイオ方法では、別個の最終産物を得るための全
く異なる組換え代謝経路を達成するために、別の酵素活
性を発現するには別の形質転換が必要であるが、本明細
書は、それに関しては何も示唆していない。
する場合、最初にアミノ基を酵素的に除いて、その側鎖
を（Ｄ）−アミノ酸オキシダーゼにより短くしてグルタ
リル（ＧＬ−７）側鎖とし、これを別の酵素（グルタリ
ルアシラーゼ）によりグルタリル側鎖を脱離することは
文献により公知である。そのような二段開裂は、U.S.3,
960,662 （Matsuda ）、EP-A-0275901、特開昭61-21805
7 （1988-Komatsu, 旭化成工業）、WO90/12110（1990-
Wong, Biopure Corp. ）およびIsogai et al.,Bio/Tech
nology(1991) 9,188-191に開示されている。係属の出願との関連 エクスパンダーゼ酵素の活性を、本明細書に記載した７
−ＡＤＣＡを得るための生化学方法と同様の方法により
P.chrysogenum形質転換細胞で発現させ７−ＡＣＡを得
るためのバイオ方法を開示した出願中の米国特許出願０
７／９５３，４９２、１９９２年１０月６日出願（特開
平４−３１９１９４号）と関連する。しかし、この７−
ＡＣＡバイオ方法では、別個の最終産物を得るための全
く異なる組換え代謝経路を達成するために、別の酵素活
性を発現するには別の形質転換が必要であるが、本明細
書は、それに関しては何も示唆していない。
【００１６】本発明方法および上述した公知文献の開示
をより十分に理解するのを助けるために、以下に、ペニ
シリンＧおよびセファロスポリンＣに導く代謝経路の種
々の段階、中間物質および関与する形質転換を行う酵素
を示す。
をより十分に理解するのを助けるために、以下に、ペニ
シリンＧおよびセファロスポリンＣに導く代謝経路の種
々の段階、中間物質および関与する形質転換を行う酵素
を示す。
【００１７】
【化２】
【００１８】
【化３】
【００１９】
【化４】
【００２０】
【化５】
【００２１】
【化６】
【００２２】
【化７】 発明の要旨 本発明は、７−アミノデスアセトキシセファロスポラン
酸（７−ＡＤＣＡ）を製造するための新規生化学方法に
関している。本発明の方法は、下記工程： １）イソペニシリンＮを産生するPenicillium chrysoge
num菌株を、それが生育できる培養培地中で維持し、該
培養培地にアジピン酸または該Penicillium chrysogenu
m菌株によって同化・利用され得る１種以上のその塩お
よびエステルを含むアジペート原料を添加してアジポイ
ル−６−アミノペニシラン酸（アジポイル−６−ＡＰ
Ａ）を製造する工程であって、該Penicillium chrysoge
num菌株は、アジポイル−６−ＡＰＡを基質とすること
ができるエクスパンダーゼ酵素の活性をコードするＤＮ
Ａによって形質転換されており、その酵素の発現に伴
い、該菌株によって産生されたアジポイル−６−ＡＰＡ
がｉｎ ｓｉｔｕで環拡張されてアジポイル−７−ＡＤ
ＣＡを生じる工程；および ２）該アジポイル−７−ＡＤＣＡをアジポイルアシラー
ゼと接触させることによりアジポイル側鎖を脱離して７
−ＡＤＣＡを生成し、次いで該物質を単離する工程を含
む。
酸（７−ＡＤＣＡ）を製造するための新規生化学方法に
関している。本発明の方法は、下記工程： １）イソペニシリンＮを産生するPenicillium chrysoge
num菌株を、それが生育できる培養培地中で維持し、該
培養培地にアジピン酸または該Penicillium chrysogenu
m菌株によって同化・利用され得る１種以上のその塩お
よびエステルを含むアジペート原料を添加してアジポイ
ル−６−アミノペニシラン酸（アジポイル−６−ＡＰ
Ａ）を製造する工程であって、該Penicillium chrysoge
num菌株は、アジポイル−６−ＡＰＡを基質とすること
ができるエクスパンダーゼ酵素の活性をコードするＤＮ
Ａによって形質転換されており、その酵素の発現に伴
い、該菌株によって産生されたアジポイル−６−ＡＰＡ
がｉｎ ｓｉｔｕで環拡張されてアジポイル−７−ＡＤ
ＣＡを生じる工程；および ２）該アジポイル−７−ＡＤＣＡをアジポイルアシラー
ゼと接触させることによりアジポイル側鎖を脱離して７
−ＡＤＣＡを生成し、次いで該物質を単離する工程を含
む。
【００２３】本明細書で使用する下記用語の意味を表示
する。
する。
【００２４】「アジポイル−６−ＡＰＡ」は、〔２Ｓ−
（２α、５α、６β）〕−３，３−ジメチル−７−オキ
ソ−６−〔（ヘキサン−１，６−ジオイル）アミノ〕−
４−チア−１−アザビシクロ−〔３．２．０〕ヘプタン
−２−カルボン酸を意味し、「アジポイル−７−ＡＤＣ
Ａ」は、７−〔（ヘキサン−１，６−ジオイル）アミ
ノ〕−３−メチル−８−オキソ−５−チア−１−アザビ
シクロ−〔４．２．０〕オクト−２−エン−２−カルボ
ン酸を意味する。
（２α、５α、６β）〕−３，３−ジメチル−７−オキ
ソ−６−〔（ヘキサン−１，６−ジオイル）アミノ〕−
４−チア−１−アザビシクロ−〔３．２．０〕ヘプタン
−２−カルボン酸を意味し、「アジポイル−７−ＡＤＣ
Ａ」は、７−〔（ヘキサン−１，６−ジオイル）アミ
ノ〕−３−メチル−８−オキソ−５−チア−１−アザビ
シクロ−〔４．２．０〕オクト−２−エン−２−カルボ
ン酸を意味する。
【００２５】特に、本発明は、上記で詳述した７−アミ
ノデアセトキシセファロスポラン酸（７−ＡＤＣＡ）を
製造するための新規生化学的方法において、アジペート
源がアジピン酸二ナトリウムであり、エクスパンダーゼ
酵素の活性をコードするＤＮＡがStreptomyces clavuli
gerus ATCC27064に由来し、アジポイルアシラーゼがPse
udomonas属に由来する方法に関する。
ノデアセトキシセファロスポラン酸（７−ＡＤＣＡ）を
製造するための新規生化学的方法において、アジペート
源がアジピン酸二ナトリウムであり、エクスパンダーゼ
酵素の活性をコードするＤＮＡがStreptomyces clavuli
gerus ATCC27064に由来し、アジポイルアシラーゼがPse
udomonas属に由来する方法に関する。
【００２６】さらに、本発明は、Streptomyces clavuli
gerus ATCC27064に由来するエクスパンダーゼ酵素の活
性をコードするＤＮＡおよびエクスパンダーゼ活性をコ
ードするＤＮＡの発現を促進するプロモータを含む、後
述するプラスミドｐＰｅｎＦＴＳＯから成る組換えＤＮ
Ａ発現ベクターに関する。
gerus ATCC27064に由来するエクスパンダーゼ酵素の活
性をコードするＤＮＡおよびエクスパンダーゼ活性をコ
ードするＤＮＡの発現を促進するプロモータを含む、後
述するプラスミドｐＰｅｎＦＴＳＯから成る組換えＤＮ
Ａ発現ベクターに関する。
【００２７】本発明はさらに、Streptomyces clavulige
rus ATCC27064に由来するエクスパンダーゼ酵素の活性
をコードするＤＮＡおよびエクスパンダーゼ活性をコー
ドするＤＮＡの発現を促進するプロモータ（Penicilliu
m chrysogenum IPNS遺伝子のプロモータなど）を含む組
換えＤＮＡ発現ベクターで形質転換されたPenicillium
chrysogenum宿主細胞に関する。特に、本発明は、後述
するプラスミドｐＰｅｎＦＴＳＯから成る組換えＤＮＡ
発現ベクターで形質転換されたPenicillium chrysogenu
m宿主細胞に関する。
rus ATCC27064に由来するエクスパンダーゼ酵素の活性
をコードするＤＮＡおよびエクスパンダーゼ活性をコー
ドするＤＮＡの発現を促進するプロモータ（Penicilliu
m chrysogenum IPNS遺伝子のプロモータなど）を含む組
換えＤＮＡ発現ベクターで形質転換されたPenicillium
chrysogenum宿主細胞に関する。特に、本発明は、後述
するプラスミドｐＰｅｎＦＴＳＯから成る組換えＤＮＡ
発現ベクターで形質転換されたPenicillium chrysogenu
m宿主細胞に関する。
【００２８】さらに、本発明は、遺伝子の発現に適した
条件下で組換えPenicillium chrysogenum宿主細胞を培
養する工程を含み、該組換え宿主細胞がStreptomyces c
lavuligerus ATCC27064に由来するエクスパンダーゼ酵
素の活性をコードするＤＮＡおよびエクスパンダーゼ活
性をコードするＤＮＡの発現を促進するプロモータ（Pe
nicillium chrysogenum IPNS遺伝子のプロモータなど）
を含む組換えＤＮＡ発現ベクターから成る方法に関す
る。特に、本発明は、遺伝子の発現に適した条件下で組
換えPenicillium chrysogenum 宿主細胞を培養する方法
であって、該組換え宿主細胞が後述するプラスミドｐＰ
ｅｎＦＴＳＯなどの組換えＤＮＡ発現ベクターから成る
方法に関する。発明の詳細な説明 本発明の第一は、下記構造式：
条件下で組換えPenicillium chrysogenum宿主細胞を培
養する工程を含み、該組換え宿主細胞がStreptomyces c
lavuligerus ATCC27064に由来するエクスパンダーゼ酵
素の活性をコードするＤＮＡおよびエクスパンダーゼ活
性をコードするＤＮＡの発現を促進するプロモータ（Pe
nicillium chrysogenum IPNS遺伝子のプロモータなど）
を含む組換えＤＮＡ発現ベクターから成る方法に関す
る。特に、本発明は、遺伝子の発現に適した条件下で組
換えPenicillium chrysogenum 宿主細胞を培養する方法
であって、該組換え宿主細胞が後述するプラスミドｐＰ
ｅｎＦＴＳＯなどの組換えＤＮＡ発現ベクターから成る
方法に関する。発明の詳細な説明 本発明の第一は、下記構造式：
【００２９】
【化８】 で表される、市販の合成セファロスポリンの重要な製造
中間体である７−アミノデスアセトキシセファロスポラ
ン酸（７−ＡＤＣＡ）を製造するための新規生化学的方
法である。７−ＡＤＣＡの特徴は、セファロスポリン核
の他に、７−アミノ基および３−メチル基である。７−
アミノ基は多数の誘導側鎖に変換することができ、従っ
て、市販の種々のセファロスポリンを合成するためのベ
ースとなる。３−メチル基は、セファレキシンの場合の
ようにいつもではないが通常は、市販のセファロスポリ
ンを合成するためにいくつかの他の側鎖に変換されるこ
ととなる。
中間体である７−アミノデスアセトキシセファロスポラ
ン酸（７−ＡＤＣＡ）を製造するための新規生化学的方
法である。７−ＡＤＣＡの特徴は、セファロスポリン核
の他に、７−アミノ基および３−メチル基である。７−
アミノ基は多数の誘導側鎖に変換することができ、従っ
て、市販の種々のセファロスポリンを合成するためのベ
ースとなる。３−メチル基は、セファレキシンの場合の
ようにいつもではないが通常は、市販のセファロスポリ
ンを合成するためにいくつかの他の側鎖に変換されるこ
ととなる。
【００３０】本発明方法の７−ＡＤＣＡ物質は、下記構
造式：
造式：
【００３１】
【化９】 で表される別の重要なセファロスポリン中間体であるセ
ファロスポリンＣと対比させることができる。この中間
体の場合、３−アセチルオキシメチル側鎖は市販のセフ
ァロスポリンに対して許容されるかもしれないが、７−
（Ｄ）−α−アミノアジポイル側鎖は、合成によるこれ
以上の誘導には適しないので、許容可能な７−アミノ基
を得るために開裂しなければならない。不幸なことに、
７−（Ｄ）−α−アミノアジポイル側鎖は、化学的また
は生化学的ないずれの手段によっても、いつも脱離が困
難である。定義 本明細書、特に好ましい態様の説明の章で使用する下記
の用語の意味を表示する。 ７−ＡＤＣＡ ７−アミノデスアセトキシセファロスポラン酸 ６−ＡＰＡ ６−アミノペニシラン酸 ＤＡＯＣ デスアセトキシセファロスポラン酸 ＤＡＯＣＳ DAOCシンセターゼ ＤＡＣ デアセチルセファロスポリンＣ ＤＡＣＳ DAC シンセターゼ ＩＰＮＳ イソペニシリンＮシンセターゼ Ｔｒｉｓ トリス〔ヒドロキシメチル〕アミノメタン ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸 ＤＥＰＣ ジエチルピロカーボネート ＴＥ Tris／EDTA緩衝液 ＳＳＣ 塩（塩化ナトリウム）、クエン酸ナトリウム緩衝液 ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム ＰＥＧ ポリエチレングリコールPenicillium chrysogenum 培養 本発明方法の第一工程は、イソペニシリンＮを産生する
Penicillium chrysogenum菌株を、それが生育できる培
養培地中で維持し、該培養培地にアジピン酸またはその
塩およびエステルを含むアジペート源を添加する工程を
含む。アジペート源は、P.chrysogenumを接種した後、
その培養培地に添加することができるが、接種を行うと
きにすでに培養培地に存在しているのが好ましい。アジ
ピン酸またはその塩およびエステルは、該P.chrysogenu
m菌株によって同化・利用されてアジポイル−６−ＡＰ
Ａを生成することができるものである。ここで、P.chry
sogenumはエクスパンダーゼ酵素の活性をコードするＤ
ＮＡによって形質転換されており、その酵素の発現の
際、該アジポイル−６−ＡＰＡがｉｎ ｓｉｔｕで環拡
張されてアジポイル−７−ＡＤＣＡを生じる。
ファロスポリンＣと対比させることができる。この中間
体の場合、３−アセチルオキシメチル側鎖は市販のセフ
ァロスポリンに対して許容されるかもしれないが、７−
（Ｄ）−α−アミノアジポイル側鎖は、合成によるこれ
以上の誘導には適しないので、許容可能な７−アミノ基
を得るために開裂しなければならない。不幸なことに、
７−（Ｄ）−α−アミノアジポイル側鎖は、化学的また
は生化学的ないずれの手段によっても、いつも脱離が困
難である。定義 本明細書、特に好ましい態様の説明の章で使用する下記
の用語の意味を表示する。 ７−ＡＤＣＡ ７−アミノデスアセトキシセファロスポラン酸 ６−ＡＰＡ ６−アミノペニシラン酸 ＤＡＯＣ デスアセトキシセファロスポラン酸 ＤＡＯＣＳ DAOCシンセターゼ ＤＡＣ デアセチルセファロスポリンＣ ＤＡＣＳ DAC シンセターゼ ＩＰＮＳ イソペニシリンＮシンセターゼ Ｔｒｉｓ トリス〔ヒドロキシメチル〕アミノメタン ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸 ＤＥＰＣ ジエチルピロカーボネート ＴＥ Tris／EDTA緩衝液 ＳＳＣ 塩（塩化ナトリウム）、クエン酸ナトリウム緩衝液 ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム ＰＥＧ ポリエチレングリコールPenicillium chrysogenum 培養 本発明方法の第一工程は、イソペニシリンＮを産生する
Penicillium chrysogenum菌株を、それが生育できる培
養培地中で維持し、該培養培地にアジピン酸またはその
塩およびエステルを含むアジペート源を添加する工程を
含む。アジペート源は、P.chrysogenumを接種した後、
その培養培地に添加することができるが、接種を行うと
きにすでに培養培地に存在しているのが好ましい。アジ
ピン酸またはその塩およびエステルは、該P.chrysogenu
m菌株によって同化・利用されてアジポイル−６−ＡＰ
Ａを生成することができるものである。ここで、P.chry
sogenumはエクスパンダーゼ酵素の活性をコードするＤ
ＮＡによって形質転換されており、その酵素の発現の
際、該アジポイル−６−ＡＰＡがｉｎ ｓｉｔｕで環拡
張されてアジポイル−７−ＡＤＣＡを生じる。
【００３２】ペニシリウム属のchrysogenum種以外の種
もイソペニシリンＮを産生する。しかし、歴史上、イソ
ペニシリンＮの産生量が最も高い菌株は全て、周知の菌
株改良技術によりchrysogenum種から発育させている。
このため本発明は、事実上、Penicillium chrysogenum
菌株に限定したが、他の種にも適応できることは明らか
である。Penicillium chrysogenumの寄託菌株または該
菌株の他の公的に入手可能な源は、いずれも本発明方法
を行うための適する出発点である。
もイソペニシリンＮを産生する。しかし、歴史上、イソ
ペニシリンＮの産生量が最も高い菌株は全て、周知の菌
株改良技術によりchrysogenum種から発育させている。
このため本発明は、事実上、Penicillium chrysogenum
菌株に限定したが、他の種にも適応できることは明らか
である。Penicillium chrysogenumの寄託菌株または該
菌株の他の公的に入手可能な源は、いずれも本発明方法
を行うための適する出発点である。
【００３３】イソペニシリンＮを産生するPenicillium
chrysogenum菌株の生育を維持することができる培養培
地は、当業者が容易に慣れ親しむ型のものである。例え
ば、培養は水中下通気醗酵法により行い、使用培地は多
数の使用可能な適する培地から選択される。典型的な培
地は、ショ糖、グルコースおよび澱粉などの炭素源；大
豆の粉末および粕、綿実油、ピーナツ油ならびに種々の
アミノ酸、それらの混合物およびペプトンなどの窒素源
を利用する。産生条件は、収量および単離し易さに重点
が置かれ、従って、そのような状況に好ましい培地は、
炭素源を糖蜜にして、窒素源を大豆粉末およびアミノ酸
にすることができる。
chrysogenum菌株の生育を維持することができる培養培
地は、当業者が容易に慣れ親しむ型のものである。例え
ば、培養は水中下通気醗酵法により行い、使用培地は多
数の使用可能な適する培地から選択される。典型的な培
地は、ショ糖、グルコースおよび澱粉などの炭素源；大
豆の粉末および粕、綿実油、ピーナツ油ならびに種々の
アミノ酸、それらの混合物およびペプトンなどの窒素源
を利用する。産生条件は、収量および単離し易さに重点
が置かれ、従って、そのような状況に好ましい培地は、
炭素源を糖蜜にして、窒素源を大豆粉末およびアミノ酸
にすることができる。
【００３４】通常は栄養無機塩を培養培地に添加し、そ
のような塩としては、次のイオン成分：ナトリウム、カ
リウム、アンモニウム、カルシウム、リン酸塩、硫酸
塩、塩化物、臭化物、硝酸塩、炭酸塩、第二鉄、第一
鉄、マグネシウム、マンガンなどを供給できる塩が挙げ
られる。微量元素も、通常は、Penicillium chrysogenu
mの生育、発育および代謝のために必須であり、他の培
養培地成分にもともと成分としてすでに与えられていな
いならば、培養培地に直接添加することができる。
のような塩としては、次のイオン成分：ナトリウム、カ
リウム、アンモニウム、カルシウム、リン酸塩、硫酸
塩、塩化物、臭化物、硝酸塩、炭酸塩、第二鉄、第一
鉄、マグネシウム、マンガンなどを供給できる塩が挙げ
られる。微量元素も、通常は、Penicillium chrysogenu
mの生育、発育および代謝のために必須であり、他の培
養培地成分にもともと成分としてすでに与えられていな
いならば、培養培地に直接添加することができる。
【００３５】Penicillium chrysogenum菌株は、ごく少
量の７−ＡＤＣＡの生産を所望する場合は、１ｌ容振と
うフラスコなどの容積の小さい装置中で培養することが
できる。しかし、もっと大量のアジポイル−７−ＡＤＣ
Ａを所望する場合は、水面下通気醗酵条件下で大規模な
醗酵槽を使用する。
量の７−ＡＤＣＡの生産を所望する場合は、１ｌ容振と
うフラスコなどの容積の小さい装置中で培養することが
できる。しかし、もっと大量のアジポイル−７−ＡＤＣ
Ａを所望する場合は、水面下通気醗酵条件下で大規模な
醗酵槽を使用する。
【００３６】アジポイル−７−ＡＤＣＡを大規模に製造
する場合は、Penicillium chrysogenum菌株の胞子を傾
斜寒天培地に保持する。傾斜培地の胞子を使用して、小
さい体積の栄養培地に接種する。その栄養培地をインキ
ュベートして、その微生物の培養を大量かつ新鮮で活発
に増殖するように行う。次いで、この栄養培地を大規模
醗酵培地の接種物として使用する。場合によっては、醗
酵培地の接種物としてさらに別の栄養培地を含めるのが
好ましいかもしれない。そのような第二の栄養培地は、
通常、醗酵培地の体積が第一栄養培地よりもかなり大き
い場合に使用する。このように、微生物の胞子が最初に
体積の小さい栄養培地で培養されて体積の大きい栄養培
地用の接種物となる。次いで、体積の大きい栄養培地か
ら十分な濃度の微生物が得られたら、大規模醗酵槽での
急速な醗酵が開始される。栄養培地は、醗酵培地と同じ
組成物を有するか、小規模での微生物の生長および発育
を高めるための他の成分を含むことができる。
する場合は、Penicillium chrysogenum菌株の胞子を傾
斜寒天培地に保持する。傾斜培地の胞子を使用して、小
さい体積の栄養培地に接種する。その栄養培地をインキ
ュベートして、その微生物の培養を大量かつ新鮮で活発
に増殖するように行う。次いで、この栄養培地を大規模
醗酵培地の接種物として使用する。場合によっては、醗
酵培地の接種物としてさらに別の栄養培地を含めるのが
好ましいかもしれない。そのような第二の栄養培地は、
通常、醗酵培地の体積が第一栄養培地よりもかなり大き
い場合に使用する。このように、微生物の胞子が最初に
体積の小さい栄養培地で培養されて体積の大きい栄養培
地用の接種物となる。次いで、体積の大きい栄養培地か
ら十分な濃度の微生物が得られたら、大規模醗酵槽での
急速な醗酵が開始される。栄養培地は、醗酵培地と同じ
組成物を有するか、小規模での微生物の生長および発育
を高めるための他の成分を含むことができる。
【００３７】本発明方法で使用するPenicillium chryso
genum菌株は約２０〜３０℃の温度で最も効率的に培養
されるが、最適な収率は、温度が約２２〜２８℃、好ま
しくは約２５℃のときに得られる。
genum菌株は約２０〜３０℃の温度で最も効率的に培養
されるが、最適な収率は、温度が約２２〜２８℃、好ま
しくは約２５℃のときに得られる。
【００３８】アジポイル−７−ＡＤＣＡは、Penicilliu
m chrysogenum菌株を大規模槽中で、約１０〜３０日
間、好ましくは１５〜２５日間、培養すると生産が最大
になる。しかし、２５０ｍｌ容の振とうフラスコなどの
小規模装置で培養すると、微生物の生長はより急速にな
り、アジポイル−７−ＡＤＣＡがより短時間、例えば４
〜１５日、しばしば５〜７日間で生産される。
m chrysogenum菌株を大規模槽中で、約１０〜３０日
間、好ましくは１５〜２５日間、培養すると生産が最大
になる。しかし、２５０ｍｌ容の振とうフラスコなどの
小規模装置で培養すると、微生物の生長はより急速にな
り、アジポイル−７−ＡＤＣＡがより短時間、例えば４
〜１５日、しばしば５〜７日間で生産される。
【００３９】大規模醗酵槽の最終ｐＨが８．０以上に達
すると、アジポイル−７−ＡＤＣＡの収率に悪影響を及
ぼす可能性がある。そのような状況では、醗酵の間中、
培養培地のｐＨを監視するのが好ましい。アジポイル−
７−ＡＤＣＡの生産が最大になる前にｐＨがそのような
レベルに達すると考えられる場合は、適切な酸または緩
衝剤を醗酵培地に添加することによりｐＨを下方に調整
すると好都合であると考えられる。
すると、アジポイル−７−ＡＤＣＡの収率に悪影響を及
ぼす可能性がある。そのような状況では、醗酵の間中、
培養培地のｐＨを監視するのが好ましい。アジポイル−
７−ＡＤＣＡの生産が最大になる前にｐＨがそのような
レベルに達すると考えられる場合は、適切な酸または緩
衝剤を醗酵培地に添加することによりｐＨを下方に調整
すると好都合であると考えられる。
【００４０】アジポイル−７−ＡＤＣＡを生産した後、
醗酵培養液のサンプルをクロマトグラフィーによりテス
トすることができる。
醗酵培養液のサンプルをクロマトグラフィーによりテス
トすることができる。
【００４１】ほとんどの水面下通気醗酵と同じように、
培養培地に滅菌空気を通すことにより、Penicillium ch
rysogenum菌株の生長がより効率的に行われ、アジポイ
ル−７−ＡＤＣＡの生産が高まる。培養培地に通す空気
の体積は通常、単位体積の培養培地につき、１分間に少
なくとも約０．２体積である。しかし、空気の通過速度
を高めると、アジポイル−７−ＡＤＣＡの生産に対して
有益な影響が得られることが多い。
培養培地に滅菌空気を通すことにより、Penicillium ch
rysogenum菌株の生長がより効率的に行われ、アジポイ
ル−７−ＡＤＣＡの生産が高まる。培養培地に通す空気
の体積は通常、単位体積の培養培地につき、１分間に少
なくとも約０．２体積である。しかし、空気の通過速度
を高めると、アジポイル−７−ＡＤＣＡの生産に対して
有益な影響が得られることが多い。
【００４２】Penicillium chrysogenum菌株は、典型的
には、アジポイル−７−ＡＤＣＡの他に多くの副成物お
よび代謝物を生産する。これらのいくつかは酸に対して
感受性であるため、アジポイル−７−ＡＤＣＡを醗酵培
地から回収する際、醗酵培養液全体を短時間、酸性ｐＨ
で処理することにより、副成した不純物の一部を分解す
るのが望ましい。アジポイル−７−ＡＤＣＡ醗酵産物
は、こうして処理した醗酵培養液を濾過して回収し、所
望により、イオン交換樹脂でのクロマトグラフィーによ
り醗酵培地の他の成分から分離し、さらに、必要であれ
ば、続くアジポイル側鎖の酵素的開裂工程の前にクロマ
トグラフィーにより精製することができる。また、その
ようなイオン交換クロマトグラフィーによる分離は、側
鎖の開裂を行った後に行うこともできる。分離上の問題
がある主要な副成物の一つはアジポイル−６−ＡＰＡで
あり、この副成物は、化学的または酵素的に分解して分
離をより容易にすることができる。最初に、濾過した醗
酵培養液を、ｎ−ブタノールまたは酢酸アミルなどの水
と混和しない有機溶媒で最初に抽出するなどの予備精製
にかけて不純物を除去する。次いで、抽出した培養液
は、さらに、活性炭でのクロマトグラフィーによる予備
的方法で精製することができる。アジペート源の添加 上述のように好ましくは、Penicillium chrysogenumに
対する醗酵培養を行うとき、接種の前にアジペート源を
醗酵培養液の他の成分に添加する。所望により、接種
後、例えば接種の１、２および／または３日後にアジペ
ート源を添加してもよい。アジペート源は、アジピン酸
または培養されているPenicillium chrysogenum菌株に
より同化・利用されてアジポイル−６−ＡＰＡを生産す
ることができるアジピン酸の１種以上の塩もしくはエス
テルとして定義される。アジピン酸、塩およびエステル
は単独または組み合わせて使用することができる。二ナ
トリウム塩が好ましいが、カリウム塩およびナトリウム
との混合塩も適する。メチルエステルは使用できるが、
エチルエステルは水に不溶である。アジピン酸塩または
エステルは、Penicillium chrysogenum菌株により同化
・利用されてアジポイル−６−ＡＰＡを生産することが
できるものでなければならない。例えば、アジピン酸自
体は水に不溶であるにもかかわらず、同化可能な塩が適
正なｐＨ条件下で生成されるために適する。適するエクスパンダーゼ酵素 上述したように培養され、アジペート源が与えられてア
ジポイル−６−ＡＰＡを生産するPenicillium chrysoge
num菌株はまた、エクスパンダーゼ酵素の活性をコード
するＤＮＡによって形質転換されており、その発現の
際、該アジポイル−６−ＡＰＡはｉｎ ｓｉｔｕで環拡
張されてアジポイル−７−ＡＤＣＡになる。
には、アジポイル−７−ＡＤＣＡの他に多くの副成物お
よび代謝物を生産する。これらのいくつかは酸に対して
感受性であるため、アジポイル−７−ＡＤＣＡを醗酵培
地から回収する際、醗酵培養液全体を短時間、酸性ｐＨ
で処理することにより、副成した不純物の一部を分解す
るのが望ましい。アジポイル−７−ＡＤＣＡ醗酵産物
は、こうして処理した醗酵培養液を濾過して回収し、所
望により、イオン交換樹脂でのクロマトグラフィーによ
り醗酵培地の他の成分から分離し、さらに、必要であれ
ば、続くアジポイル側鎖の酵素的開裂工程の前にクロマ
トグラフィーにより精製することができる。また、その
ようなイオン交換クロマトグラフィーによる分離は、側
鎖の開裂を行った後に行うこともできる。分離上の問題
がある主要な副成物の一つはアジポイル−６−ＡＰＡで
あり、この副成物は、化学的または酵素的に分解して分
離をより容易にすることができる。最初に、濾過した醗
酵培養液を、ｎ−ブタノールまたは酢酸アミルなどの水
と混和しない有機溶媒で最初に抽出するなどの予備精製
にかけて不純物を除去する。次いで、抽出した培養液
は、さらに、活性炭でのクロマトグラフィーによる予備
的方法で精製することができる。アジペート源の添加 上述のように好ましくは、Penicillium chrysogenumに
対する醗酵培養を行うとき、接種の前にアジペート源を
醗酵培養液の他の成分に添加する。所望により、接種
後、例えば接種の１、２および／または３日後にアジペ
ート源を添加してもよい。アジペート源は、アジピン酸
または培養されているPenicillium chrysogenum菌株に
より同化・利用されてアジポイル−６−ＡＰＡを生産す
ることができるアジピン酸の１種以上の塩もしくはエス
テルとして定義される。アジピン酸、塩およびエステル
は単独または組み合わせて使用することができる。二ナ
トリウム塩が好ましいが、カリウム塩およびナトリウム
との混合塩も適する。メチルエステルは使用できるが、
エチルエステルは水に不溶である。アジピン酸塩または
エステルは、Penicillium chrysogenum菌株により同化
・利用されてアジポイル−６−ＡＰＡを生産することが
できるものでなければならない。例えば、アジピン酸自
体は水に不溶であるにもかかわらず、同化可能な塩が適
正なｐＨ条件下で生成されるために適する。適するエクスパンダーゼ酵素 上述したように培養され、アジペート源が与えられてア
ジポイル−６−ＡＰＡを生産するPenicillium chrysoge
num菌株はまた、エクスパンダーゼ酵素の活性をコード
するＤＮＡによって形質転換されており、その発現の
際、該アジポイル−６−ＡＰＡはｉｎ ｓｉｔｕで環拡
張されてアジポイル−７−ＡＤＣＡになる。
【００４３】アジポイル−６−ＡＰＡは、アジペート源
を添加して培養したPenicillium chrysogenumにより細
胞内で生産される。また、その細胞内、すなわちｉｎ
ｓｉｔｕ条件では、形質転換されたPenicillium chryso
genum がエクスパンダーゼ酵素の活性をコードするＤＮ
Ａを発現し、その際、その酵素が基質としてのアジポイ
ル−６−ＡＰＡに作用して環を拡張させ、アジポイル−
７−ＡＤＣＡを生成させる。
を添加して培養したPenicillium chrysogenumにより細
胞内で生産される。また、その細胞内、すなわちｉｎ
ｓｉｔｕ条件では、形質転換されたPenicillium chryso
genum がエクスパンダーゼ酵素の活性をコードするＤＮ
Ａを発現し、その際、その酵素が基質としてのアジポイ
ル−６−ＡＰＡに作用して環を拡張させ、アジポイル−
７−ＡＤＣＡを生成させる。
【００４４】本発明の新規生化学的方法は、エクスパン
ダーゼ酵素の活性をコードするＤＮＡによる上述した型
の Penicillium chrysogenum菌株の形質転換をその範囲
内に含み、その酵素の発現の際、アジポイル−６−ＡＰ
Ａがｉｎ ｓｉｔｕで環拡張されてアジポイル−７−Ａ
ＤＣＡを生じる。すなわち、Penicillium chrysogenu m
を形質転換するＤＮＡは、従来技術において理解されて
いるエクスパンダーゼ酵素の活性、すなわちイソペニシ
リンＮを環拡張してＤＡＯＣにする能力だけでなく、ア
ジポイル−６−ＡＰＡを環拡張してアジポイル−７−Ａ
ＤＣＡにする能力も有する酵素を発現しなければならな
い。しかし、側鎖の類似性からして、どのエクスパンダ
ーゼ酵素も本発明の新規生化学的方法において使用可能
であると考えられる。
ダーゼ酵素の活性をコードするＤＮＡによる上述した型
の Penicillium chrysogenum菌株の形質転換をその範囲
内に含み、その酵素の発現の際、アジポイル−６−ＡＰ
Ａがｉｎ ｓｉｔｕで環拡張されてアジポイル−７−Ａ
ＤＣＡを生じる。すなわち、Penicillium chrysogenu m
を形質転換するＤＮＡは、従来技術において理解されて
いるエクスパンダーゼ酵素の活性、すなわちイソペニシ
リンＮを環拡張してＤＡＯＣにする能力だけでなく、ア
ジポイル−６−ＡＰＡを環拡張してアジポイル−７−Ａ
ＤＣＡにする能力も有する酵素を発現しなければならな
い。しかし、側鎖の類似性からして、どのエクスパンダ
ーゼ酵素も本発明の新規生化学的方法において使用可能
であると考えられる。
【００４５】従来技術の章ですでに述べたように、Stre
ptomyces clavuligerus ATCC27064由来のエクスパンダ
ーゼ酵素は、その全塩基配列が分析されているととも
に、エンドヌクレアーゼ制限酵素による地図作製により
特徴付けられている。しかし、同一酵素であると思われ
るS.clavuligerus NRRL3585 由来のものは、分子量が異
なると報告されているに止まり、塩基配列は分析されて
いない。
ptomyces clavuligerus ATCC27064由来のエクスパンダ
ーゼ酵素は、その全塩基配列が分析されているととも
に、エンドヌクレアーゼ制限酵素による地図作製により
特徴付けられている。しかし、同一酵素であると思われ
るS.clavuligerus NRRL3585 由来のものは、分子量が異
なると報告されているに止まり、塩基配列は分析されて
いない。
【００４６】従来技術においてすでに同定されたこれら
のエクスパンダーゼ酵素は、本発明の新規生化学的方法
において有用である。まだ同定されていないS.clavulig
erusの異なる菌株または別の属の微生物に由来する他の
エクスパンダーゼ酵素でさえも、本発明の新規生化学的
方法を行うのに適すると考えられる。有用な微生物の新
しい菌株および属を同定し、エクスパンダーゼ酵素とさ
れるものを単離し、それらが本発明方法での使用に適し
ていることを検証するための方法は簡単であり、当業者
には周知である。有用な微生物の候補となる新しい菌株
および属の無細胞抽出物のスクリーニングは、該抽出物
を、第一鉄（Ｆｅ2+）イオン、アスコルビン酸塩、α−
ケトグルタル酸塩およびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）
などの公知のＤＡＯＣＳ補助因子の存在下でアジポイル
−６−ＡＰＡに添加するという、信頼でき再現性のある
方法で行うことができる。アジポイル−６−ＡＰＡ基質
は、下記に詳細に記載する方法と同様にしてアジペート
源を未形質転換Penicillium chrysogenumに供給するこ
とにより十分な量で製造することができる。所望のエク
スパンダーゼ酵素は、アジポイル−７−ＡＤＣＡが生成
するならば存在し、その有無はクロマトグラフィーによ
り検出することができる。
のエクスパンダーゼ酵素は、本発明の新規生化学的方法
において有用である。まだ同定されていないS.clavulig
erusの異なる菌株または別の属の微生物に由来する他の
エクスパンダーゼ酵素でさえも、本発明の新規生化学的
方法を行うのに適すると考えられる。有用な微生物の新
しい菌株および属を同定し、エクスパンダーゼ酵素とさ
れるものを単離し、それらが本発明方法での使用に適し
ていることを検証するための方法は簡単であり、当業者
には周知である。有用な微生物の候補となる新しい菌株
および属の無細胞抽出物のスクリーニングは、該抽出物
を、第一鉄（Ｆｅ2+）イオン、アスコルビン酸塩、α−
ケトグルタル酸塩およびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）
などの公知のＤＡＯＣＳ補助因子の存在下でアジポイル
−６−ＡＰＡに添加するという、信頼でき再現性のある
方法で行うことができる。アジポイル−６−ＡＰＡ基質
は、下記に詳細に記載する方法と同様にしてアジペート
源を未形質転換Penicillium chrysogenumに供給するこ
とにより十分な量で製造することができる。所望のエク
スパンダーゼ酵素は、アジポイル−７−ＡＤＣＡが生成
するならば存在し、その有無はクロマトグラフィーによ
り検出することができる。
【００４７】また、公知の組換え技術を使用すると、S.
clavuligerusおよびC.acremoniumのエクスパンダーゼ配
列に基づいてＤＮＡプローブを作り、本発明方法での使
用に適するエクスパンダーゼを生産しそうな候補微生物
のＤＮＡ部分をスクリーニングすることができる。エクスパンダーゼ酵素の可能源 すでに述べたように、エクスパンダーゼ酵素は、ペナム
環構造（ペニシリン型分子に見られる）を拡張してセフ
−３−エム環（セファロスポリンに見られる）にするの
を触媒する酵素である。従って、セフェム環を含む代謝
産物を生産するどの有機体もエクスパンダーゼをコード
するＤＮＡの可能源である。そのような有機体の例を下
記に挙げるが、このリストは例示に過ぎず、全てを網羅
していると考えるべきではない。 真菌：Cephalosporium acremonium Cephalosporium sp.Emericellopsis Paecilomyces Scopulariopsis Diheterospora Spiroidium Anoxiopsis 放線菌：Streptomyces clavuligerus S.lipmanii S.wadayamensis S.todorominensis S.filipinensis cephamycini S.heteromorphus S.panayensis S.griseus S.cattleya Nocardia lactamdurans 他の細菌：Flavobacterium sp.Alcaligenes denitrificans Mycoplana bullata Providencia rettgeri Lysobacter lactamgenus 上記で挙げた生体のエクスパンダーゼは、さらに研究す
るための単なる候補に過ぎず、それらが全て本発明の新
規方法に適するとは限らない。例えば、C.acremoniumに
由来する酵素などのエクスパンダーゼ活性およびヒドロ
キシラーゼ活性の両方を有する酵素を使用すると、ヒド
ロキシル化アジポイル−７−ＡＤＣＡ、すなわちアジポ
イル側鎖のついたＤＡＣが製造される可能性がある。エクスパンダーゼ活性をコードするＤＮＡ断片の単離 所望のエクスパンダーゼ酵素の存在が上記方法により検
出されると、エクスパンダーゼ酵素活性をコードするＤ
ＮＡの単離法も簡単で、当業者には周知である。エクス
パンダーゼ酵素をコードする遺伝子の公知配列および部
分配列に基づくＤＮＡプローブは、所望の酵素をコード
する単離すべきＤＮＡとハイブリッド形成するように構
成される。そのようなプローブの構成は、エクスパンダ
ーゼ酵素をコードするアミノ酸およびヌクレオチド塩基
配列ならびに関与する特定の微生物の優先コドンに関す
る知見に基づく。Streptomyces clavuligerus ATCC2706
4のゲノムＤＮＡに適用されるこの種の典型的方法の詳
細な説明を以下でさらに述べる。
clavuligerusおよびC.acremoniumのエクスパンダーゼ配
列に基づいてＤＮＡプローブを作り、本発明方法での使
用に適するエクスパンダーゼを生産しそうな候補微生物
のＤＮＡ部分をスクリーニングすることができる。エクスパンダーゼ酵素の可能源 すでに述べたように、エクスパンダーゼ酵素は、ペナム
環構造（ペニシリン型分子に見られる）を拡張してセフ
−３−エム環（セファロスポリンに見られる）にするの
を触媒する酵素である。従って、セフェム環を含む代謝
産物を生産するどの有機体もエクスパンダーゼをコード
するＤＮＡの可能源である。そのような有機体の例を下
記に挙げるが、このリストは例示に過ぎず、全てを網羅
していると考えるべきではない。 真菌：Cephalosporium acremonium Cephalosporium sp.Emericellopsis Paecilomyces Scopulariopsis Diheterospora Spiroidium Anoxiopsis 放線菌：Streptomyces clavuligerus S.lipmanii S.wadayamensis S.todorominensis S.filipinensis cephamycini S.heteromorphus S.panayensis S.griseus S.cattleya Nocardia lactamdurans 他の細菌：Flavobacterium sp.Alcaligenes denitrificans Mycoplana bullata Providencia rettgeri Lysobacter lactamgenus 上記で挙げた生体のエクスパンダーゼは、さらに研究す
るための単なる候補に過ぎず、それらが全て本発明の新
規方法に適するとは限らない。例えば、C.acremoniumに
由来する酵素などのエクスパンダーゼ活性およびヒドロ
キシラーゼ活性の両方を有する酵素を使用すると、ヒド
ロキシル化アジポイル−７−ＡＤＣＡ、すなわちアジポ
イル側鎖のついたＤＡＣが製造される可能性がある。エクスパンダーゼ活性をコードするＤＮＡ断片の単離 所望のエクスパンダーゼ酵素の存在が上記方法により検
出されると、エクスパンダーゼ酵素活性をコードするＤ
ＮＡの単離法も簡単で、当業者には周知である。エクス
パンダーゼ酵素をコードする遺伝子の公知配列および部
分配列に基づくＤＮＡプローブは、所望の酵素をコード
する単離すべきＤＮＡとハイブリッド形成するように構
成される。そのようなプローブの構成は、エクスパンダ
ーゼ酵素をコードするアミノ酸およびヌクレオチド塩基
配列ならびに関与する特定の微生物の優先コドンに関す
る知見に基づく。Streptomyces clavuligerus ATCC2706
4のゲノムＤＮＡに適用されるこの種の典型的方法の詳
細な説明を以下でさらに述べる。
【００４８】エクスパンダーゼ酵素活性をコードするＤ
ＮＡの単離は、組換えＤＮＡ技術でよく知られた制限お
よび連結方法により行われる。適正な制限断片を得て単
離するには、関与する微生物のゲノムのエンドヌクレア
ーゼによる制限酵素地図を知ることが必要である。S.cl
avuligerusおよびC.acremoniumの制限酵素地図はすでに
入手可能である。すなわち、前者の場合は、制限酵素Ｂ
ａｍＨＩおよびＳａｌＩを使用すると、電気泳動によ
り、所望の１．８および２．２ｋｂの断片が得られる。Penicillium chrysogenum 菌株の形質転換 エクスパンダーゼ活性をコードするＤＮＡ断片が得られ
たら、それらを、プロモータ、翻訳活性化配列、耐性マ
ーカー、調節配列、コスミドフォーマー、ならびに形質
転換を可能にし、または促進し、遺伝子産物の発現を行
い、形質転換細胞の単離を容易にする他のＤＮＡ塩基配
列とともに、プラスミドまたは他の発現ベクターに挿入
（連結）することができる。こうして構成した発現ベク
ターを使用すると、Penicillium chrysogenum菌株の形
質転換およびエクスパンダーゼ酵素の活性の細胞内発現
が達成される。形質転換および発現を達成するために使
用される技術は文献により公知であり、そのような典型
的な方法の詳細な説明を以下でさらに述べる。
ＮＡの単離は、組換えＤＮＡ技術でよく知られた制限お
よび連結方法により行われる。適正な制限断片を得て単
離するには、関与する微生物のゲノムのエンドヌクレア
ーゼによる制限酵素地図を知ることが必要である。S.cl
avuligerusおよびC.acremoniumの制限酵素地図はすでに
入手可能である。すなわち、前者の場合は、制限酵素Ｂ
ａｍＨＩおよびＳａｌＩを使用すると、電気泳動によ
り、所望の１．８および２．２ｋｂの断片が得られる。Penicillium chrysogenum 菌株の形質転換 エクスパンダーゼ活性をコードするＤＮＡ断片が得られ
たら、それらを、プロモータ、翻訳活性化配列、耐性マ
ーカー、調節配列、コスミドフォーマー、ならびに形質
転換を可能にし、または促進し、遺伝子産物の発現を行
い、形質転換細胞の単離を容易にする他のＤＮＡ塩基配
列とともに、プラスミドまたは他の発現ベクターに挿入
（連結）することができる。こうして構成した発現ベク
ターを使用すると、Penicillium chrysogenum菌株の形
質転換およびエクスパンダーゼ酵素の活性の細胞内発現
が達成される。形質転換および発現を達成するために使
用される技術は文献により公知であり、そのような典型
的な方法の詳細な説明を以下でさらに述べる。
【００４９】上記で既に詳述したように、形質転換され
たPenicillium chrysogenum菌株は、エクスパンダーゼ
酵素の活性を細胞内で発現し、ｉｎ ｓｉｔｕでアジポ
イル−６−ＡＰＡ基質に作用して環を拡張し、アジポイ
ル−７−ＡＤＣＡにする。新規な形質転換細胞 エクスパンダーゼ遺伝子の活性を発現する特定のPenici
llium chrysogenum形質転換細胞は、本発明の好ましい
態様であり、Cantwell et al. (1990) CurrentGenetic,
17, 213-221 にあるような従来の構成と比べて新規で
ある。いずれの構築でも、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘
発を使用してプロモータをエクスパンダーゼ遺伝子に連
結する。Cantwellの構築では、エクスパンダーゼ遺伝子
のＡＴＧにＮｄｅＩ部位を導入し、それを、ＸｂａＩ／
ＮｄｅＩリンカーによりＩＰＮＳプロモータの３′−末
端にあるＸｂａＩ部位に連結する。本発明の構築では、
エクスパンダーゼ遺伝子のＡＴＧにＮｃｏＩ部位を作
り、ＩＰＮＳリンカーの３’−末端にあるＮｃｏＩ部位
に連結する。この結果、これらの構築におけるプロモー
タ−遺伝子連結部の周りの塩基配列は次のようになる。
たPenicillium chrysogenum菌株は、エクスパンダーゼ
酵素の活性を細胞内で発現し、ｉｎ ｓｉｔｕでアジポ
イル−６−ＡＰＡ基質に作用して環を拡張し、アジポイ
ル−７−ＡＤＣＡにする。新規な形質転換細胞 エクスパンダーゼ遺伝子の活性を発現する特定のPenici
llium chrysogenum形質転換細胞は、本発明の好ましい
態様であり、Cantwell et al. (1990) CurrentGenetic,
17, 213-221 にあるような従来の構成と比べて新規で
ある。いずれの構築でも、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘
発を使用してプロモータをエクスパンダーゼ遺伝子に連
結する。Cantwellの構築では、エクスパンダーゼ遺伝子
のＡＴＧにＮｄｅＩ部位を導入し、それを、ＸｂａＩ／
ＮｄｅＩリンカーによりＩＰＮＳプロモータの３′−末
端にあるＸｂａＩ部位に連結する。本発明の構築では、
エクスパンダーゼ遺伝子のＡＴＧにＮｃｏＩ部位を作
り、ＩＰＮＳリンカーの３’−末端にあるＮｃｏＩ部位
に連結する。この結果、これらの構築におけるプロモー
タ−遺伝子連結部の周りの塩基配列は次のようになる。
【００５０】 Xba1 NcoI IPNS プロモータ 5' TCTAGACACC ATGG 3' 配列番号:1Strep エクスパンダーゼ 5' GTGAGAGTTG ATGGAC 3' 配列番号:2 Cantwell 5' TCTAGACACT ATGGAC 3' 配列番号:3 本発明 5' TCTAGACACC ATGGAC 3' 配列番号:4 Cantwell構築では、ＣがＴで置き換わっているが、本発
明の構築では、Ｃは保持されている。すなわち、ＡＴＧ
開始コドンのすぐ隣のＩＰＮＳプロモータの配列は、天
然に存在するＩＰＮＳ遺伝子に見られるものと正確に一
致する。この従来のプロモータは、ただ１個のヌクレオ
チド塩基が異なるだけだが、翻訳効率が低下し、その結
果エクスパンダーゼ遺伝子の発現レベルを下げる可能性
がある。
明の構築では、Ｃは保持されている。すなわち、ＡＴＧ
開始コドンのすぐ隣のＩＰＮＳプロモータの配列は、天
然に存在するＩＰＮＳ遺伝子に見られるものと正確に一
致する。この従来のプロモータは、ただ１個のヌクレオ
チド塩基が異なるだけだが、翻訳効率が低下し、その結
果エクスパンダーゼ遺伝子の発現レベルを下げる可能性
がある。
【００５１】他の違いは、構築に含まれるプロモータま
たは遺伝子の領域である。Cantwell構築には、ＩＰＮＳ
プロモータの５′ＢａｍＨＩからＸｂａＩ３′までの領
域を含むが、本発明のベクターはそのプロモータの５′
ＮｃｏＩからＮｃｏＩ３′までの領域を含む〔Diez, et
al., (1990), J. Biol. Chem. 265, 16358-16365 〕。
この結果、Cantwell構築のＩＰＮＳプロモータには５′
末端に約２５０塩基対が付加される。しかし、この領域
はＩＰＮＳ遺伝子の上流にあるＡＣＶシンセターゼ遺伝
子の読み取り枠にある。
たは遺伝子の領域である。Cantwell構築には、ＩＰＮＳ
プロモータの５′ＢａｍＨＩからＸｂａＩ３′までの領
域を含むが、本発明のベクターはそのプロモータの５′
ＮｃｏＩからＮｃｏＩ３′までの領域を含む〔Diez, et
al., (1990), J. Biol. Chem. 265, 16358-16365 〕。
この結果、Cantwell構築のＩＰＮＳプロモータには５′
末端に約２５０塩基対が付加される。しかし、この領域
はＩＰＮＳ遺伝子の上流にあるＡＣＶシンセターゼ遺伝
子の読み取り枠にある。
【００５２】また、Cantwell構築は、Streptomyces遺伝
子を、ＡＴＧからその遺伝子の３′側のＢａｍＨＩ部位
まで含むが、本発明のベクターは、ＡＴＧからその遺伝
子の３′側のＳａｌＩ部位まで含む〔Kovacevic et a
l., (1989), J. Bacteriol., 171, 754-760〕。この結
果、Cantwell構築の３′末端には約１０００ ｂｐｓの
塩基配列が付加される。本発明の構築はさらに、エクス
パンダーゼ遺伝子の上流域を、ＡＴＧの５′側のＢａｍ
ＨＩ部位まで含むが、エクスパンダーゼ遺伝子の読み取
り枠とは ＩＰＮＳプロモータにより分離されている。
子を、ＡＴＧからその遺伝子の３′側のＢａｍＨＩ部位
まで含むが、本発明のベクターは、ＡＴＧからその遺伝
子の３′側のＳａｌＩ部位まで含む〔Kovacevic et a
l., (1989), J. Bacteriol., 171, 754-760〕。この結
果、Cantwell構築の３′末端には約１０００ ｂｐｓの
塩基配列が付加される。本発明の構築はさらに、エクス
パンダーゼ遺伝子の上流域を、ＡＴＧの５′側のＢａｍ
ＨＩ部位まで含むが、エクスパンダーゼ遺伝子の読み取
り枠とは ＩＰＮＳプロモータにより分離されている。
【００５３】本発明の構築が公知文献に記載されたもの
とさらに異なる点は、使用する選択的マーカーに関す
る。Penicillium IPNSプロモータの使用：本発明の構築
におけるphleomycin遺伝子融合は、多重複製の組み込み
または高レベルの発現を可能にし、従ってエクスパンダ
ーゼ遺伝子を高レベルで発現する形質転換細胞を高い割
合で産生する可能性がある位置での組み込みを選択する
ようになる。
とさらに異なる点は、使用する選択的マーカーに関す
る。Penicillium IPNSプロモータの使用：本発明の構築
におけるphleomycin遺伝子融合は、多重複製の組み込み
または高レベルの発現を可能にし、従ってエクスパンダ
ーゼ遺伝子を高レベルで発現する形質転換細胞を高い割
合で産生する可能性がある位置での組み込みを選択する
ようになる。
【００５４】上述した型の新規形質転換細胞は、ＰＣ１
００と命名したPenicillium chrysogenumである。その
菌学上の特性としては、典型的には、広範囲に広がる緑
青色〜緑色で、滑らかなベルベット様で黄色の粒のつい
たコロニーを生じ、寒天中に黄色が逆拡散し、分生子頭
の分枝は全体に滑らかで、分生子は長さが３〜４ｍｍの
楕円形〜球形であることが挙げられる。P.chrysogenum
に対する許容可能な培養条件は、１ｌの蒸留水中にラク
トース一水和物１．５％（ｗ／ｖ）、コーン浸出液０．
５％（ｖ／ｖ）、ペプトン０．５％（ｗ／ｖ）、ＮａＣ
ｌ０．４％（ｗ／ｖ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．０５
％（ｗ／ｖ）、ＫＨ２ＰＯ４０．０６％（ｗ／ｖ）、Ｆ
ｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ０．０００５％（ｗ／ｖ）、ＣｕＳ
Ｏ４・５Ｈ２Ｏ０．０００２％（ｗ／ｖ）、寒天３．０
％（ｗ／ｖ）を含む固形培地を使用し、ｐＨ４．８であ
る。すぐ上に記載し、ＰＣ１００と命名したP.chrysoge
numは、American Type Culture Collection（ATCC）（1
2301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852）に
ATCC74182の受託番号（寄託日：1992年8月21日に受理さ
れ、生存は1992年8月27日に確認）で寄託されている。アジポイル側鎖の開裂 本発明の新規生化学的方法の次の工程は、アジポイル−
７−ＡＤＣＡからアジポイル側鎖を開裂することであ
り、この工程では、前の工程の産物をアジポイルアシラ
ーゼ酵素系で処理する必要がある。上記ですでに述べた
ように、本発明の重要な成果の一つは、アジポイル−７
−ＡＤＣＡの製造に導く全工程を単一の醗酵培養で行う
ことができることである。これにより、その方法の工程
ごとに中間物質を単離し、部分的に精製する必要がない
点で有効性が非常に改善される。しかし、この最終工程
にアジポイルアシラーゼ酵素系は存在しない、すなわ
ち、最初の醗酵培養においてｉｎ ｓｉｔｕで生成され
ていない。
００と命名したPenicillium chrysogenumである。その
菌学上の特性としては、典型的には、広範囲に広がる緑
青色〜緑色で、滑らかなベルベット様で黄色の粒のつい
たコロニーを生じ、寒天中に黄色が逆拡散し、分生子頭
の分枝は全体に滑らかで、分生子は長さが３〜４ｍｍの
楕円形〜球形であることが挙げられる。P.chrysogenum
に対する許容可能な培養条件は、１ｌの蒸留水中にラク
トース一水和物１．５％（ｗ／ｖ）、コーン浸出液０．
５％（ｖ／ｖ）、ペプトン０．５％（ｗ／ｖ）、ＮａＣ
ｌ０．４％（ｗ／ｖ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．０５
％（ｗ／ｖ）、ＫＨ２ＰＯ４０．０６％（ｗ／ｖ）、Ｆ
ｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ０．０００５％（ｗ／ｖ）、ＣｕＳ
Ｏ４・５Ｈ２Ｏ０．０００２％（ｗ／ｖ）、寒天３．０
％（ｗ／ｖ）を含む固形培地を使用し、ｐＨ４．８であ
る。すぐ上に記載し、ＰＣ１００と命名したP.chrysoge
numは、American Type Culture Collection（ATCC）（1
2301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852）に
ATCC74182の受託番号（寄託日：1992年8月21日に受理さ
れ、生存は1992年8月27日に確認）で寄託されている。アジポイル側鎖の開裂 本発明の新規生化学的方法の次の工程は、アジポイル−
７−ＡＤＣＡからアジポイル側鎖を開裂することであ
り、この工程では、前の工程の産物をアジポイルアシラ
ーゼ酵素系で処理する必要がある。上記ですでに述べた
ように、本発明の重要な成果の一つは、アジポイル−７
−ＡＤＣＡの製造に導く全工程を単一の醗酵培養で行う
ことができることである。これにより、その方法の工程
ごとに中間物質を単離し、部分的に精製する必要がない
点で有効性が非常に改善される。しかし、この最終工程
にアジポイルアシラーゼ酵素系は存在しない、すなわ
ち、最初の醗酵培養においてｉｎ ｓｉｔｕで生成され
ていない。
【００５５】本発明の新規生化学的方法をバッチ式で行
う場合は、最初の工程の産物を単離し、部分的に精製す
る必要がある。このための予備的操作については上記で
すでに記載した。
う場合は、最初の工程の産物を単離し、部分的に精製す
る必要がある。このための予備的操作については上記で
すでに記載した。
【００５６】にもかかわらず、本発明の方法は、アジポ
イル−７−ＡＤＣＡが７−ＡＤＣＡに酵素的に変換でき
るようにアジポイルアシラーゼをアジポイル−７−ＡＤ
ＣＡに効果的に接触させる方法であればどの方法でも行
うことができる。これは、「接触」の最も広い意味での
定義である。原料として粗アジポイル−７−ＡＤＣＡの
無細胞培養液を使用し、それを、粗アジポイルアシラー
ゼ培養液によりバッチ式で処理することが可能である。
この方法は、最初の反応物の実質的な精製を必要としな
いので、ある程度の有効性が得られる。もちろん、改良
は可能である。例えば、反応物は、互いに接触させる前
に所望する程度に精製してもよい。また、バッチ法では
なく連続的方法でその工程を行うこともできる。反応物
自体の接触は、処理技術の向上に応じ、種々の方法で改
良することができる。すなわち、固定化酵素を、例えば
アジポイルアシラーゼを含むカラムの形で使用し、アジ
ポイル−７−ＡＤＣＡをそのカラムに通す。また、固定
化酵素を懸濁物としてアジポイル−７−ＡＤＣＡに添加
してもよい。そのような固定化酵素系は、酵素の回収が
容易で、何度でも再使用できるという利点を有する。そ
のような処理技術の他の例は、膜反応器に関するもので
ある。反応物を接触させる好ましい方法は、固定化酵素
カラムによる方法である。開裂工程に有用なアジポイルアシラーゼ酵素 アジポイル側鎖に対して既知特異性を有する酵素は多数
存在する。市販のRAEVCorp.製アジポイルアシラーゼを
使用して得られる結果は、下記の実施例でさらに詳述す
る。文献には、セファロスポリン型分子からアジポイル
側鎖を脱離する他の７種類の酵素が報告されている。こ
れら７種類の酵素のうち６個はPseudomonas種に由来
し、７番目はBacillus種に由来する。各々のPseudomona
s酵素はいくつかの類似性があるが、全７種は、物理的
／生物学的特性がある程度異なる。それらの特性のいく
つかを下記にまとめる。
イル−７−ＡＤＣＡが７−ＡＤＣＡに酵素的に変換でき
るようにアジポイルアシラーゼをアジポイル−７−ＡＤ
ＣＡに効果的に接触させる方法であればどの方法でも行
うことができる。これは、「接触」の最も広い意味での
定義である。原料として粗アジポイル−７−ＡＤＣＡの
無細胞培養液を使用し、それを、粗アジポイルアシラー
ゼ培養液によりバッチ式で処理することが可能である。
この方法は、最初の反応物の実質的な精製を必要としな
いので、ある程度の有効性が得られる。もちろん、改良
は可能である。例えば、反応物は、互いに接触させる前
に所望する程度に精製してもよい。また、バッチ法では
なく連続的方法でその工程を行うこともできる。反応物
自体の接触は、処理技術の向上に応じ、種々の方法で改
良することができる。すなわち、固定化酵素を、例えば
アジポイルアシラーゼを含むカラムの形で使用し、アジ
ポイル−７−ＡＤＣＡをそのカラムに通す。また、固定
化酵素を懸濁物としてアジポイル−７−ＡＤＣＡに添加
してもよい。そのような固定化酵素系は、酵素の回収が
容易で、何度でも再使用できるという利点を有する。そ
のような処理技術の他の例は、膜反応器に関するもので
ある。反応物を接触させる好ましい方法は、固定化酵素
カラムによる方法である。開裂工程に有用なアジポイルアシラーゼ酵素 アジポイル側鎖に対して既知特異性を有する酵素は多数
存在する。市販のRAEVCorp.製アジポイルアシラーゼを
使用して得られる結果は、下記の実施例でさらに詳述す
る。文献には、セファロスポリン型分子からアジポイル
側鎖を脱離する他の７種類の酵素が報告されている。こ
れら７種類の酵素のうち６個はPseudomonas種に由来
し、７番目はBacillus種に由来する。各々のPseudomona
s酵素はいくつかの類似性があるが、全７種は、物理的
／生物学的特性がある程度異なる。それらの特性のいく
つかを下記にまとめる。
【００５７】
【表１】 上記アジポイルアシラーゼ酵素は全て、本発明の新規性
化学的方法に有用である。本発明方法に有用な他のアジ
ポイルアシラーゼを、候補の酵素を、作用すべき実際の
基質であるアジポイル−７−ＡＤＣＡに対してテストす
ることにより容易に発見できるかもしれない。よさそう
な結果が得られたら、信頼できて再現性のある方法によ
り、候補の酵素が本発明方法に実際に有用であることを
測定する。基質は、Szewczuk and Wellman-Bednawska i
n Clin. Chim. Acta (1978) 84,19-26により報告された
方法を改良して無水アジピン酸と７−ＡＤＣＡとの反応
から直接調製できる。無水アジピン酸は、J. Macromol.
Sci. Chem. (1990) A27,397-412に記載されたAlbertso
n and Lundmarkの方法に従って調製できる。７−ＡＤＣ
Ａは、いくつかの市販のもの（例えば、E. R. Squibb &
Sons, Ltd., NJおよび Interchem Corp., NJ）を利用
する。
化学的方法に有用である。本発明方法に有用な他のアジ
ポイルアシラーゼを、候補の酵素を、作用すべき実際の
基質であるアジポイル−７−ＡＤＣＡに対してテストす
ることにより容易に発見できるかもしれない。よさそう
な結果が得られたら、信頼できて再現性のある方法によ
り、候補の酵素が本発明方法に実際に有用であることを
測定する。基質は、Szewczuk and Wellman-Bednawska i
n Clin. Chim. Acta (1978) 84,19-26により報告された
方法を改良して無水アジピン酸と７−ＡＤＣＡとの反応
から直接調製できる。無水アジピン酸は、J. Macromol.
Sci. Chem. (1990) A27,397-412に記載されたAlbertso
n and Lundmarkの方法に従って調製できる。７−ＡＤＣ
Ａは、いくつかの市販のもの（例えば、E. R. Squibb &
Sons, Ltd., NJおよび Interchem Corp., NJ）を利用
する。
【００５８】高速比色法を使用して候補の酵素を粗選別
する場合は、アジポイル−７−ＡＤＣＡ基質の代わりに
アジポイル−ＰＡＢＡ（パラ−アミノ安息香酸）または
アジポイル−ＰＮＡ（パラ−ニトロアニリン）などの呈
色基質を使用してもよい。側鎖の開裂により発色種が生
じ、その種の有無および濃度が比色計により容易に測定
される。これらおよび他の適する比色法に関するさらに
詳細な情報は、Marelli, L. P. (1968), J. Pharm. Sc
i., 57:2172-2173; Szasz, G. (1969), Clin. Chem. 1
5:124-136; Szewczuk, A. et al.,(1980) Anal. Bioche
m. 103:166-169;およびReyes, F. et al.,(1989) J. Ph
arma. Pharmacol. 41:136-137を参照。
する場合は、アジポイル−７−ＡＤＣＡ基質の代わりに
アジポイル−ＰＡＢＡ（パラ−アミノ安息香酸）または
アジポイル−ＰＮＡ（パラ−ニトロアニリン）などの呈
色基質を使用してもよい。側鎖の開裂により発色種が生
じ、その種の有無および濃度が比色計により容易に測定
される。これらおよび他の適する比色法に関するさらに
詳細な情報は、Marelli, L. P. (1968), J. Pharm. Sc
i., 57:2172-2173; Szasz, G. (1969), Clin. Chem. 1
5:124-136; Szewczuk, A. et al.,(1980) Anal. Bioche
m. 103:166-169;およびReyes, F. et al.,(1989) J. Ph
arma. Pharmacol. 41:136-137を参照。
【００５９】ａｃｙIIの大きいサブユニットを持つＲＡ
ＥＶ酵素のＮ−末端アミノ酸配列を、上記表に記載した
ＧＫ１６と比較した。比較結果を下記に示す（括弧内
は、決定的なものではないことを示す。）。 RAEV 配列番号:5 S N (S)(G) A V A P G K T A N G N A L (L) L Q N (P) GK16 配列番号:6 S N S W A V A P G K T A N G N A L L L Q N P acyII 配列番号:7 S N N W A V A P G R T A T G R P I L A G D P 示した配列から、これら３個のペプチドは全て、明らか
に関連している。しかし、上記で示した配列と同様のＮ
−末端配列を有する蛋白は、Arthrobacter菌株により産
生されるペニシリンＧアシラーゼの場合のように、必ず
しもアジポイルアシラーゼ活性を有するとは限らない。
他方、上記Ｎ−末端配列との相同性が小さくとも本発明
方法に有用なアジポイルアシラーゼがある。例えば、上
記の表で述べた Asahi酵素ａｃｙＩおよび Fujisawa B.
laterosporus J1 アシラーゼは一応のアジポイル−７−
ＡＣＡアシラーゼ活性を示すが、上記に記載した他の酵
素との配列の相同関係はない。従って、新規生化学的方
法の第二工程に有用なアジポイルアシラーゼに関する本
発明の範囲は、候補の酵素がアジポイル−７−ＡＤＣＡ
からアジポイル側鎖を開裂することができるかどうかで
決定され、それは、上記で詳述したように容易かつ確実
に決定することができる。
ＥＶ酵素のＮ−末端アミノ酸配列を、上記表に記載した
ＧＫ１６と比較した。比較結果を下記に示す（括弧内
は、決定的なものではないことを示す。）。 RAEV 配列番号:5 S N (S)(G) A V A P G K T A N G N A L (L) L Q N (P) GK16 配列番号:6 S N S W A V A P G K T A N G N A L L L Q N P acyII 配列番号:7 S N N W A V A P G R T A T G R P I L A G D P 示した配列から、これら３個のペプチドは全て、明らか
に関連している。しかし、上記で示した配列と同様のＮ
−末端配列を有する蛋白は、Arthrobacter菌株により産
生されるペニシリンＧアシラーゼの場合のように、必ず
しもアジポイルアシラーゼ活性を有するとは限らない。
他方、上記Ｎ−末端配列との相同性が小さくとも本発明
方法に有用なアジポイルアシラーゼがある。例えば、上
記の表で述べた Asahi酵素ａｃｙＩおよび Fujisawa B.
laterosporus J1 アシラーゼは一応のアジポイル−７−
ＡＣＡアシラーゼ活性を示すが、上記に記載した他の酵
素との配列の相同関係はない。従って、新規生化学的方
法の第二工程に有用なアジポイルアシラーゼに関する本
発明の範囲は、候補の酵素がアジポイル−７−ＡＤＣＡ
からアジポイル側鎖を開裂することができるかどうかで
決定され、それは、上記で詳述したように容易かつ確実
に決定することができる。
【００６０】他の方法により適するアジポイルアシラー
ゼを見出すことは可能である。例えば、EPA-A-0453048
は、Pseudomonas SY-77-1により生産されるグルタリル
アシラーゼのアジポイル開裂活性の改善方法を記載して
いる。α−サブユニット内の特定位置の種々のアミノ酸
を置き換えることにより、（アジポイル−セリンから
の）アジポイル開裂速度が３〜５倍高まるのが認められ
た。そのような改善された酵素も本発明での使用に適す
る。なお、EP-A-0453048は、確かにアジポイル側鎖に対
する活性が改善されたアシラーゼを例示しているが、ア
ジポイル−セファロスポリンをまず生成させる（化学的
または本明細書に記載した方法と類似した生化学的方法
による）方法は全く記載していない。好ましい態様の記載 以下に本発明の好ましい態様について詳細に記載する
が、これらは説明のためのものに過ぎず、本発明はこれ
らの態様によって限定されるものではない。
ゼを見出すことは可能である。例えば、EPA-A-0453048
は、Pseudomonas SY-77-1により生産されるグルタリル
アシラーゼのアジポイル開裂活性の改善方法を記載して
いる。α−サブユニット内の特定位置の種々のアミノ酸
を置き換えることにより、（アジポイル−セリンから
の）アジポイル開裂速度が３〜５倍高まるのが認められ
た。そのような改善された酵素も本発明での使用に適す
る。なお、EP-A-0453048は、確かにアジポイル側鎖に対
する活性が改善されたアシラーゼを例示しているが、ア
ジポイル−セファロスポリンをまず生成させる（化学的
または本明細書に記載した方法と類似した生化学的方法
による）方法は全く記載していない。好ましい態様の記載 以下に本発明の好ましい態様について詳細に記載する
が、これらは説明のためのものに過ぎず、本発明はこれ
らの態様によって限定されるものではない。
【００６１】
【実施例】実施例１ Penicillium chrysogenum 培養条件 これらの方法で使用するPenicillium chrysogenumは、
１ｌの蒸留水中にラクトース一水和物１．５％（ｗ／
ｖ）、コーン浸出液０．５％（ｖ／ｖ）、ペプトン０．
５％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ０．４％（ｗ／ｖ）、ＭｇＳ
Ｏ４・７Ｈ２Ｏ０．０５％（ｗ／ｖ）、ＫＨ２ＰＯ
４０．０６％（ｗ／ｖ）、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ０．０
００５％（ｗ／ｖ）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ０．０００
２％（ｗ／ｖ）、寒天３．０％（ｗ／ｖ）を含むＬＣＳ
Ｂ培地（ｐＨ４．８）を含む平板上に保持した。２５
℃、相対湿度６５％で１２日間後、単集落を取り出し、
ガラスビーズを含むねじ栓付き試験管中の蒸留水２ｍｌ
に添加した。増殖培養物をかきまぜて解離した後、その
懸濁物を使用してライスフラスコに接種した。ライスフ
ラスコは、３〜４倍体積の蒸留水で７分間洗浄し、３０
秒ごとに混合した後、米の水の吸収が約２５％になるま
で排水した、天然長粒種のUncle Ben 転換米を２５ｇ／
２５０ｍｌフラスコで含んでいた。２５℃、湿度６５％
で１２日間後、５０ｍｌの滅菌水で胞子をその米から洗
い流した。その胞子懸濁物を使用して液体培地に接種
し、また、４℃で貯蔵するために培養液の親液性を付与
した。胞子を同体積の５％スキムミルクに添加し、滅菌
アンプル中に凍結乾燥した。
１ｌの蒸留水中にラクトース一水和物１．５％（ｗ／
ｖ）、コーン浸出液０．５％（ｖ／ｖ）、ペプトン０．
５％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ０．４％（ｗ／ｖ）、ＭｇＳ
Ｏ４・７Ｈ２Ｏ０．０５％（ｗ／ｖ）、ＫＨ２ＰＯ
４０．０６％（ｗ／ｖ）、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ０．０
００５％（ｗ／ｖ）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ０．０００
２％（ｗ／ｖ）、寒天３．０％（ｗ／ｖ）を含むＬＣＳ
Ｂ培地（ｐＨ４．８）を含む平板上に保持した。２５
℃、相対湿度６５％で１２日間後、単集落を取り出し、
ガラスビーズを含むねじ栓付き試験管中の蒸留水２ｍｌ
に添加した。増殖培養物をかきまぜて解離した後、その
懸濁物を使用してライスフラスコに接種した。ライスフ
ラスコは、３〜４倍体積の蒸留水で７分間洗浄し、３０
秒ごとに混合した後、米の水の吸収が約２５％になるま
で排水した、天然長粒種のUncle Ben 転換米を２５ｇ／
２５０ｍｌフラスコで含んでいた。２５℃、湿度６５％
で１２日間後、５０ｍｌの滅菌水で胞子をその米から洗
い流した。その胞子懸濁物を使用して液体培地に接種
し、また、４℃で貯蔵するために培養液の親液性を付与
した。胞子を同体積の５％スキムミルクに添加し、滅菌
アンプル中に凍結乾燥した。
【００６２】ペニシリンの生産またはＲＮＡもしくはＤ
ＮＡ源としての菌糸体の生産のために、菌株を振とうフ
ラスコ中で２段階醗酵した。接種段階は、１ｌの蒸留水
にグルコース３．０％（ｗ／ｖ）、pharmamedia １．０
％（ｗ／ｖ）、コーン浸出液３．０％（ｖ／ｖ）、硫酸
アンモニウム０．２％（ｗ／ｖ）、ＣａＣｏ３０．５％
（ｗ／ｖ）、無水リン酸一カリウム０．０５％（ｗ／
ｖ）、ラクトース１．０％（ｗ／ｖ）、一次乾燥酵母
１．０％（ｗ／ｖ）を含む培地５０ｍｌ／５００ｍｌフ
ラスコに１×１０８胞子を添加することにより開始し
た。インキュベーションは、直径７０ｍｍの円を描いて
回転する（２２０ｒｐｍ）盤上、２５℃、相対湿度６５
％で行った。４８時間インキュベーションした後、生産
段階を、１ｌの蒸留水にＫＨ２ＰＯ４０．０５％（ｗ／
ｖ）、Ｋ２ＳＯ４０．５％（ｗ／ｖ）、（ＮＨ４）２Ｓ
Ｏ４１．０％（ｗ／ｖ）、ラクトース１２．０％（ｗ／
ｖ）、pharmamedia ２．７５％（ｗ／ｖ）、ＣａＣＯ３
（沈降）１．０％（ｗ／ｖ）、ラード油１．０％（ｖ／
ｖ）の組成物を含む培地（ｐＨ６．６）３５ｍｌ／５０
０ｍｌフラスコに生長能力のある種子２ｍｌを移すこと
により開始した。オートクレーブ後、しかし接種の前
に、滅菌した２５％アジピン酸ナトリウム（ｐＨ６．
６）を添加して最終のアジピン酸ナトリウム濃度を２．
５％にした。次いで、接種後、前段階と同じ条件下で５
〜７日間インキュベーションを続けた。
ＮＡ源としての菌糸体の生産のために、菌株を振とうフ
ラスコ中で２段階醗酵した。接種段階は、１ｌの蒸留水
にグルコース３．０％（ｗ／ｖ）、pharmamedia １．０
％（ｗ／ｖ）、コーン浸出液３．０％（ｖ／ｖ）、硫酸
アンモニウム０．２％（ｗ／ｖ）、ＣａＣｏ３０．５％
（ｗ／ｖ）、無水リン酸一カリウム０．０５％（ｗ／
ｖ）、ラクトース１．０％（ｗ／ｖ）、一次乾燥酵母
１．０％（ｗ／ｖ）を含む培地５０ｍｌ／５００ｍｌフ
ラスコに１×１０８胞子を添加することにより開始し
た。インキュベーションは、直径７０ｍｍの円を描いて
回転する（２２０ｒｐｍ）盤上、２５℃、相対湿度６５
％で行った。４８時間インキュベーションした後、生産
段階を、１ｌの蒸留水にＫＨ２ＰＯ４０．０５％（ｗ／
ｖ）、Ｋ２ＳＯ４０．５％（ｗ／ｖ）、（ＮＨ４）２Ｓ
Ｏ４１．０％（ｗ／ｖ）、ラクトース１２．０％（ｗ／
ｖ）、pharmamedia ２．７５％（ｗ／ｖ）、ＣａＣＯ３
（沈降）１．０％（ｗ／ｖ）、ラード油１．０％（ｖ／
ｖ）の組成物を含む培地（ｐＨ６．６）３５ｍｌ／５０
０ｍｌフラスコに生長能力のある種子２ｍｌを移すこと
により開始した。オートクレーブ後、しかし接種の前
に、滅菌した２５％アジピン酸ナトリウム（ｐＨ６．
６）を添加して最終のアジピン酸ナトリウム濃度を２．
５％にした。次いで、接種後、前段階と同じ条件下で５
〜７日間インキュベーションを続けた。
【００６３】形質転換のため、またはＤＮＡ源としてプ
ロトプラストを生成させるために菌糸体が必要な場合
は、その菌株を、１ｌの蒸留水に５０ｍｌの２０Ｘ Clu
tterbuck塩（１２０ｇのＮａＮＯ３、１０．４ｇのＫＣ
ｌ、１０．４ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３０．４ｇの
ＫＨ２ＰＯ４）、２．０ｍｌのVogel微量元素（０．３
Ｍのクエン酸、０．２ＭのＺｎＳＯ４、２５ｍＭのＦｅ
（ＮＨ４）２（ＳＯ４） ２・６Ｈ２Ｏ、１０ｍＭのＣｕ
ＳＯ４、３ｍＭのＭｎＳＯ４、８ｍＭのホウ酸、２ｍＭ
のＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ）、５ｇのトリプトン、５
ｇの酵母抽出物、１０ｇのグルコースを含む完全媒体
（ＣＭ）５０ｍｌ／２５０ｍｌフラスコ中で生長させ
た。インキュベーションは、２２０ｒｐｍの回転盤上、
２５℃で行った。実施例２ Penicillium ゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡの単離 上記したように調製した、４８時間培養して生長させた
植物菌糸体を寒冷紗により濾取し、液体窒素中で凍結
し、一夜凍結乾燥した。乾燥した菌糸体を乳鉢・すりこ
ぎで砂とともにすりつぶし、１００ｍＭのＬｉＣｌ、５
０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．
０）、４％ＳＤＳの２５ｍｌに再懸濁した。その懸濁物
を６０℃の湯浴中で５０〜５５℃に加熱した後、その混
合物を、最初に１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）飽和フェノー
ル、次いでＴｒｉｓ飽和フェノール：クロロホルム
（１：１，ｖ／ｖ）、次いでクロロホルムで抽出した。
同量の６Ｍ冷ＬｉＣｌを添加し、次いでその混合物を−
２０℃で２〜３時間保持すると、ＲＮＡが水相から析出
した。４℃、１２０００×ｇで２０分間遠心分離した
後、上澄みを６６％（ｖ／ｖ）エタノール溶液にして、
−２０℃で１５分間冷却すると、ＤＮＡが析出した。上
述したように遠心分離した後、ＤＮＡペレットを７０％
エタノールで洗浄し、脱水してＴＥ緩衝液（１０ｍＭの
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ）に
再懸濁した。ＤＮＡ濃度を、アガロースゲル電気泳動に
おいて臭化エチジウムにより染色して、既知ＤＮＡ基準
と比較することにより推定した。
ロトプラストを生成させるために菌糸体が必要な場合
は、その菌株を、１ｌの蒸留水に５０ｍｌの２０Ｘ Clu
tterbuck塩（１２０ｇのＮａＮＯ３、１０．４ｇのＫＣ
ｌ、１０．４ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３０．４ｇの
ＫＨ２ＰＯ４）、２．０ｍｌのVogel微量元素（０．３
Ｍのクエン酸、０．２ＭのＺｎＳＯ４、２５ｍＭのＦｅ
（ＮＨ４）２（ＳＯ４） ２・６Ｈ２Ｏ、１０ｍＭのＣｕ
ＳＯ４、３ｍＭのＭｎＳＯ４、８ｍＭのホウ酸、２ｍＭ
のＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ）、５ｇのトリプトン、５
ｇの酵母抽出物、１０ｇのグルコースを含む完全媒体
（ＣＭ）５０ｍｌ／２５０ｍｌフラスコ中で生長させ
た。インキュベーションは、２２０ｒｐｍの回転盤上、
２５℃で行った。実施例２ Penicillium ゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡの単離 上記したように調製した、４８時間培養して生長させた
植物菌糸体を寒冷紗により濾取し、液体窒素中で凍結
し、一夜凍結乾燥した。乾燥した菌糸体を乳鉢・すりこ
ぎで砂とともにすりつぶし、１００ｍＭのＬｉＣｌ、５
０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．
０）、４％ＳＤＳの２５ｍｌに再懸濁した。その懸濁物
を６０℃の湯浴中で５０〜５５℃に加熱した後、その混
合物を、最初に１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）飽和フェノー
ル、次いでＴｒｉｓ飽和フェノール：クロロホルム
（１：１，ｖ／ｖ）、次いでクロロホルムで抽出した。
同量の６Ｍ冷ＬｉＣｌを添加し、次いでその混合物を−
２０℃で２〜３時間保持すると、ＲＮＡが水相から析出
した。４℃、１２０００×ｇで２０分間遠心分離した
後、上澄みを６６％（ｖ／ｖ）エタノール溶液にして、
−２０℃で１５分間冷却すると、ＤＮＡが析出した。上
述したように遠心分離した後、ＤＮＡペレットを７０％
エタノールで洗浄し、脱水してＴＥ緩衝液（１０ｍＭの
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ）に
再懸濁した。ＤＮＡ濃度を、アガロースゲル電気泳動に
おいて臭化エチジウムにより染色して、既知ＤＮＡ基準
と比較することにより推定した。
【００６４】上記実施例１で記載したPenicillium chry
sogenumの培養を、２５℃、２２０ｒｐｍの回転盤上に
載せた３５ｍｌの醗酵培地中（醗酵条件は前述した通
り）で９６時間生長させた。菌糸体を、真空下、Whatma
n #1フィルターにより濾取し、約５０ｍｌの水で洗浄し
た。直ちに菌糸体をそのフィルターからこすり取り、５
ｍｌの「破壊緩衝液」（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，
ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴ
Ａ，ｐＨ８．０、５％のＳＤＳ）に再懸濁し、液体窒素
で凍結し、凍結乾燥した。一夜凍結乾燥した後、０．１
％のＤＥＰＣを含む５ｍｌの水および５ｍｌの１Ｍ Ｔ
ｒｉｓ（ｐＨ８）飽和フェノール：クロロホルム：イソ
アミルアルコール（５０：５０：１）を添加し、その混
合物を振とうしながら３７℃で２０分間溶かした。混合
物を４℃、１２０００×ｇで１０分間遠心分離し、水相
を分離して、最初に１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）飽和フェ
ノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（５０：
５０：１）、２番目に１Ｍのトリス（ｐＨ８）飽和フェ
ノール、３番目にクロロホルムで再抽出した。同量の６
ＭＬｉＣｌを最終的に得られた水相と混合し、その溶液
を−２０℃で最低４時間放置した。全ＲＮＡを４℃、１
２０００×ｇで２０分間ペレット化し、そのペレットを
０．３ｍｌのＴＥ緩衝液＋０．０３ｍｌの３Ｍ酢酸ナト
リウムに溶解し、２．５倍体積のエタノールを添加して
ＲＮＡを両析出させた。最終的に得られたペレットを
０．１ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解し、ＲＮＡ濃度を、分光
光度計による２６０ｎｍでの吸光度により測定した。実施例３ Streptomyces clavuligerus 培養条件 以下の操作で使用するStreptomyces clavuligerus菌株
は、ATCC27064 であった。その菌株を、１ｌの蒸留水に
酵母エキス４ｇ、麦芽エキス１０ｇ、グルコース４ｇ、
寒天２０ｇを含む（ｐＨ７．２）平板上で維持した。３
０℃で５日間生長させた後、２ｍｌの滅菌水をその平板
に添加し、培養増殖したものを寒天表面からこすり採っ
た。得られた懸濁物を、ガラスビーズを含む滅菌ねじ栓
つき管に移した。培養増殖したものを、かきまぜて解離
させた後、その懸濁物を液体培地の接種に使用した。ま
た、その懸濁物は、最終体積が１５％になるまでグリセ
ロールを添加して、−７０℃での永久保存培地に使用し
た。
sogenumの培養を、２５℃、２２０ｒｐｍの回転盤上に
載せた３５ｍｌの醗酵培地中（醗酵条件は前述した通
り）で９６時間生長させた。菌糸体を、真空下、Whatma
n #1フィルターにより濾取し、約５０ｍｌの水で洗浄し
た。直ちに菌糸体をそのフィルターからこすり取り、５
ｍｌの「破壊緩衝液」（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，
ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴ
Ａ，ｐＨ８．０、５％のＳＤＳ）に再懸濁し、液体窒素
で凍結し、凍結乾燥した。一夜凍結乾燥した後、０．１
％のＤＥＰＣを含む５ｍｌの水および５ｍｌの１Ｍ Ｔ
ｒｉｓ（ｐＨ８）飽和フェノール：クロロホルム：イソ
アミルアルコール（５０：５０：１）を添加し、その混
合物を振とうしながら３７℃で２０分間溶かした。混合
物を４℃、１２０００×ｇで１０分間遠心分離し、水相
を分離して、最初に１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）飽和フェ
ノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（５０：
５０：１）、２番目に１Ｍのトリス（ｐＨ８）飽和フェ
ノール、３番目にクロロホルムで再抽出した。同量の６
ＭＬｉＣｌを最終的に得られた水相と混合し、その溶液
を−２０℃で最低４時間放置した。全ＲＮＡを４℃、１
２０００×ｇで２０分間ペレット化し、そのペレットを
０．３ｍｌのＴＥ緩衝液＋０．０３ｍｌの３Ｍ酢酸ナト
リウムに溶解し、２．５倍体積のエタノールを添加して
ＲＮＡを両析出させた。最終的に得られたペレットを
０．１ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解し、ＲＮＡ濃度を、分光
光度計による２６０ｎｍでの吸光度により測定した。実施例３ Streptomyces clavuligerus 培養条件 以下の操作で使用するStreptomyces clavuligerus菌株
は、ATCC27064 であった。その菌株を、１ｌの蒸留水に
酵母エキス４ｇ、麦芽エキス１０ｇ、グルコース４ｇ、
寒天２０ｇを含む（ｐＨ７．２）平板上で維持した。３
０℃で５日間生長させた後、２ｍｌの滅菌水をその平板
に添加し、培養増殖したものを寒天表面からこすり採っ
た。得られた懸濁物を、ガラスビーズを含む滅菌ねじ栓
つき管に移した。培養増殖したものを、かきまぜて解離
させた後、その懸濁物を液体培地の接種に使用した。ま
た、その懸濁物は、最終体積が１５％になるまでグリセ
ロールを添加して、−７０℃での永久保存培地に使用し
た。
【００６５】形質転換のため、またはＤＮＡ源としてプ
ロトプラストを生成させるために菌糸体が必要な場合
は、その菌株を、１ｌの蒸留水に酵母エキス３ｇ、ペプ
トン５ｇ、麦芽エキス３ｇ、グルコース１０ｇ、ショ糖
３４０ｇ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ１．０２ｇ、グリシン
５ｇ、寒天１８ｇを含むＹＥＭＥ培地２００ｍｌ／１ｌ
フラスコ中で生長させた。インキュベーションは、２２
０ｒｐｍの回転盤上、２８℃で行った。実施例４ StreptomycesゲノムＤＮＡの単離 上述したように調製した培地で４８時間培養して生長さ
せた植物菌糸体を、２２１００×ｇで１０分間遠心分離
することにより集めた。その細胞を１０ｍｌのＴＥ緩衝
液に再懸濁し、１０ｍｇのリゾチームを添加して、その
混合物を３０℃で１５分間インキュベートした。次い
で、１ｍｌの２０％ＳＤＳを添加し、次いですぐに１０
ｍｌのＴＥ（ｐＨ８）飽和フェノールおよび１．５ｍｌ
の５Ｍ−ＮａＣｌを添加して、その混合物を２０分間静
かに上下動させた。１２０００×ｇで１０分間、相分離
を行った後、水相を取り出して新しい管に移した。同量
のクロロホルムを添加し、その混合物を１０分間静かに
上下動させた。再び１２０００×ｇで１０分間遠心分離
することにより相分離を行い、水相を取り出して新しい
管に移した。２倍体積のイソプロパノールを注意しなが
ら添加し、析出したＤＮＡを取り、最少量のＴＥ緩衝液
に再溶解した。ＲＮＡアーゼＡを添加して最終濃度を２
０ｍｇ／ｍｌとし、その溶液を５０℃で１時間インキュ
ベートした。次いで、１００ｍＭのＮａＣｌおよび０．
４％のＳＤＳとともにプロテアーゼＫを添加して最終濃
度を１００ｍｇ／ｍｌとし、その混合物を３７℃で１時
間インキュベートした。その溶液を同量のＴＥ（ｐＨ
８）飽和フェノールで再び抽出し、さらにクロロホルム
で抽出した。最後の抽出により得られたＤＮＡを２倍体
積のイソプロパノールを添加した後に取り、その濃度を
分光光度計による２６０ｎｍでの吸光度により測定し
た。実施例５ 遺伝子ライブラリーの構築およびStreptomyces clavuli
gerusエクスパンダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の単離 前記操作により得たStreptomyces clavuligerusゲノム
ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化し
た。消化されたＤＮＡを０．８％アガロースゲル上で電
気泳動にかけ、１．８〜２．２ｋｂの大きさの断片を溶
離し、予めＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化してあるｐ
ＵＣ１８ＤＮＡに連結した。連結混合物を希釈し、電気
穿孔法（Gene Pulser, Bio-Rad, Richmond, CA）により
コンピテントＪＭ１０９細胞に取り込んで形質転換し
た。コンピテント細胞の作製および電気穿孔法の条件は
ともに、製造者の指示に従った。形質転換混合物を１０
０ｍｇ／ｍｌのアンピシリンおよび７５ｍｌの２％Ｘ−
Ｇａｌを含むＬＢ平板上で平板培養した。３７℃で一夜
インキュベートした後、組換えコロニーを、プラスミド
ベクターβ−ガラクトシダーゼ遺伝子活性の不活化によ
り無色になることから同定した。無色のコロニーを選ん
で、１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含む新しいＬＢ
平板に移した。３７℃で一夜生長させた後、コロニーを
ニトロセルロースに移し、複製連鎖反応により作製し
た、公開された Streptomyces clavuligerusエクスパン
ダーゼ遺伝子配列の５２〜９１８の塩基〔Kovacevic et
al., (1989)J. Bacteriol. 171:754-760；およびU.S.
5,070,020〕に対応するプローブとハイブリッド形成さ
せた。複製連鎖反応産物の標識を、（３２Ｐ）ｄＣＴＰ
およびオリゴ標識キットを使用し、製造者（Pharmacia,
Piscateway, New Jersey ）の指示に従ってランダムプ
ライマー伸長法により行った。ハイブリッド形成反応
は、１０６ＣＰＭの放射性同位体で標識したプローブ、
３０％のホルムアミド、５ＸＳＳＣ（０．１５ＭのＮａ
Ｃｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７）、
０．１％のＳＤＳ，５×Denhardt（５ｇのフィコール、
５ｇのポリビニルピロリドンおよび５ｇのＢＳＡ（５０
０ｍｌの５０Ｘストック用））および１００ｍｇ／ｍｌ
の牛胸腺ＤＮＡの存在下、３７℃で一夜行った。いくつ
かの形質転換細胞がプローブと強くハイブリッドを形成
した。うち１個のコロニーについて、制限酵素分析によ
りエクスパンダーゼ遺伝子を有するベクターを含むこと
が確認され、このプラスミドをｐＦＴＳＯ−１と命名し
た。実施例６ プラスミドＤＮＡの単離 プラスミドを含むE.coli培養液を５００ｍｌのＬＢ培養
液（２０ｇ／ｌのＬＢ培養液ベース）（Gibco, Paisle
y, Scotland）中で、１５ｍｇ／ｍｌのテトラサイクリ
ンとともに、３７℃、２２０ｒｐｍの回転盤上で１２〜
１６時間生長させた。４℃、４０００×ｇで１０分間遠
心分離することにより細胞をペレット状にした。その細
胞ペレットを１８ｍｌのグルコース緩衝液（５０ｍＭの
グルコース、２５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１０
ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁し、４０ｍｇ／ｍｌのリゾチ
ーム（Sigma, St. Louis, MO）／グルコース緩衝液を２
ｍｌ添加して混合し、その混合物を室温で１５分間イン
キュベートした。新しく調製した０．２ＮのＮａＯＨお
よび１％のＳＤＳの溶液を４０ｍｌ添加し、その混合物
を静かに攪拌して氷上に１０分間置いた。次いで、５Ｍ
の酢酸カリウム（ｐＨ４．８）３０ｍｌを添加して十分
混合し、得られた混合物を氷上にさらに１０分間置い
た。細胞片を、４℃、４０００×ｇで１０分間遠心分離
することによりペレット化し、得られた上澄みを寒冷紗
フィルターにより濾過した。プラスミドＤＮＡを析出さ
せるためにイソプロパノール（０．６倍体積）を透明な
上澄みに添加し、室温で２０分間インキュベートしてい
る間に析出物が生成した。プラスミドＤＮＡのペレット
化を４℃、４０００×ｇで２０分間行い、次いで、７０
％エタノールで洗浄して軽く乾燥した。そのペレットを
９ｍｌのＴＥ緩衝液に再懸濁した後、１０ｇのＣｓＣｌ
および１０ｍｇ／ｍｌの臭化エチジウム溶液０．３８７
ｍｌを添加した。この溶液を３１３，１００×ｇで２４
時間遠心分離した。塩化セシウム勾配において得られた
プラスミドのバンドを紫外線により可視化して単離した
後、臭化エチジウムを抽出用の飽和ブタノール水溶液に
より除去した。次いで、プラスミドの作製に使用したＣ
ｓＣｌをＴＥ緩衝液に対する透析により除去し、最後に
ＤＮＡをＰＥＧ（ＭＷ８０００）を使用して濃縮した。
ＤＮＡの濃度は分光光度計による２６０ｎｍでの吸光度
により測定した。実施例７ Penicillium 形質転換ベクターｐＰｅｎＦＴＳＯの構築 Penicillium 形質転換ベクターは、優性選択マーカーと
してのフレオマイシン耐性遺伝子を入れて構築した。こ
れは、まず、フレオマイシン耐性遺伝子（Streptoallot
eichus hindustanus由来のフレオマイシン結合蛋白遺伝
子）を含み、酵母シトクロムＣ１ターミネータに結合し
た６６０ｂｐ断片を、ＢａｍＨＩ／ＢｇｌIIで消化した
プラスミドｐＵＴ７１３（CAYLA, Toulouse Cedex, Fra
nce ）からアガロースゲル上で電気泳動して溶離するこ
とにより単離して行った。単離した断片はベクターｐＳ
ＥＬＥＣＴ*１（Promega Corporation）のＢａｍＨＩ部
位に連結し、遺伝子の方向は制限酵素分析により決定し
た。次に、λ付着末端部位を含む５５０ｂｐのＰｓｔＩ
断片を挿入して、適切な大きさの挿入配列を含む場合は
そのベクターを使用してコスミドが形成できるようにし
た。次いで、Penicillium chrysogenumイソペニシリン
Ｎシンセターゼ（ＩＰＮＳ）遺伝子のプロモータ領域を
含む１．５ｋｂのＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ断片を、Ｎｃｏ
Ｉ／ＢａｍＨＩで消化したＩＰＮＳ遺伝子を含むゲノム
クローンから（アガロースゲル上で電気泳動して溶離す
ることにより）単離した。単離したＩＰＮＳ−プロモー
タ断片をＢａｍＨＩ／ＮｃｏＩで消化したベクターに連
結した。ＮｃｏＩ部位は、フレオマイシン耐性遺伝子の
ＡＴＧ開始コドンにある。このベクターをｐＵＴＺ−２
と命名する。
ロトプラストを生成させるために菌糸体が必要な場合
は、その菌株を、１ｌの蒸留水に酵母エキス３ｇ、ペプ
トン５ｇ、麦芽エキス３ｇ、グルコース１０ｇ、ショ糖
３４０ｇ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ１．０２ｇ、グリシン
５ｇ、寒天１８ｇを含むＹＥＭＥ培地２００ｍｌ／１ｌ
フラスコ中で生長させた。インキュベーションは、２２
０ｒｐｍの回転盤上、２８℃で行った。実施例４ StreptomycesゲノムＤＮＡの単離 上述したように調製した培地で４８時間培養して生長さ
せた植物菌糸体を、２２１００×ｇで１０分間遠心分離
することにより集めた。その細胞を１０ｍｌのＴＥ緩衝
液に再懸濁し、１０ｍｇのリゾチームを添加して、その
混合物を３０℃で１５分間インキュベートした。次い
で、１ｍｌの２０％ＳＤＳを添加し、次いですぐに１０
ｍｌのＴＥ（ｐＨ８）飽和フェノールおよび１．５ｍｌ
の５Ｍ−ＮａＣｌを添加して、その混合物を２０分間静
かに上下動させた。１２０００×ｇで１０分間、相分離
を行った後、水相を取り出して新しい管に移した。同量
のクロロホルムを添加し、その混合物を１０分間静かに
上下動させた。再び１２０００×ｇで１０分間遠心分離
することにより相分離を行い、水相を取り出して新しい
管に移した。２倍体積のイソプロパノールを注意しなが
ら添加し、析出したＤＮＡを取り、最少量のＴＥ緩衝液
に再溶解した。ＲＮＡアーゼＡを添加して最終濃度を２
０ｍｇ／ｍｌとし、その溶液を５０℃で１時間インキュ
ベートした。次いで、１００ｍＭのＮａＣｌおよび０．
４％のＳＤＳとともにプロテアーゼＫを添加して最終濃
度を１００ｍｇ／ｍｌとし、その混合物を３７℃で１時
間インキュベートした。その溶液を同量のＴＥ（ｐＨ
８）飽和フェノールで再び抽出し、さらにクロロホルム
で抽出した。最後の抽出により得られたＤＮＡを２倍体
積のイソプロパノールを添加した後に取り、その濃度を
分光光度計による２６０ｎｍでの吸光度により測定し
た。実施例５ 遺伝子ライブラリーの構築およびStreptomyces clavuli
gerusエクスパンダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の単離 前記操作により得たStreptomyces clavuligerusゲノム
ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化し
た。消化されたＤＮＡを０．８％アガロースゲル上で電
気泳動にかけ、１．８〜２．２ｋｂの大きさの断片を溶
離し、予めＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化してあるｐ
ＵＣ１８ＤＮＡに連結した。連結混合物を希釈し、電気
穿孔法（Gene Pulser, Bio-Rad, Richmond, CA）により
コンピテントＪＭ１０９細胞に取り込んで形質転換し
た。コンピテント細胞の作製および電気穿孔法の条件は
ともに、製造者の指示に従った。形質転換混合物を１０
０ｍｇ／ｍｌのアンピシリンおよび７５ｍｌの２％Ｘ−
Ｇａｌを含むＬＢ平板上で平板培養した。３７℃で一夜
インキュベートした後、組換えコロニーを、プラスミド
ベクターβ−ガラクトシダーゼ遺伝子活性の不活化によ
り無色になることから同定した。無色のコロニーを選ん
で、１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含む新しいＬＢ
平板に移した。３７℃で一夜生長させた後、コロニーを
ニトロセルロースに移し、複製連鎖反応により作製し
た、公開された Streptomyces clavuligerusエクスパン
ダーゼ遺伝子配列の５２〜９１８の塩基〔Kovacevic et
al., (1989)J. Bacteriol. 171:754-760；およびU.S.
5,070,020〕に対応するプローブとハイブリッド形成さ
せた。複製連鎖反応産物の標識を、（３２Ｐ）ｄＣＴＰ
およびオリゴ標識キットを使用し、製造者（Pharmacia,
Piscateway, New Jersey ）の指示に従ってランダムプ
ライマー伸長法により行った。ハイブリッド形成反応
は、１０６ＣＰＭの放射性同位体で標識したプローブ、
３０％のホルムアミド、５ＸＳＳＣ（０．１５ＭのＮａ
Ｃｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７）、
０．１％のＳＤＳ，５×Denhardt（５ｇのフィコール、
５ｇのポリビニルピロリドンおよび５ｇのＢＳＡ（５０
０ｍｌの５０Ｘストック用））および１００ｍｇ／ｍｌ
の牛胸腺ＤＮＡの存在下、３７℃で一夜行った。いくつ
かの形質転換細胞がプローブと強くハイブリッドを形成
した。うち１個のコロニーについて、制限酵素分析によ
りエクスパンダーゼ遺伝子を有するベクターを含むこと
が確認され、このプラスミドをｐＦＴＳＯ−１と命名し
た。実施例６ プラスミドＤＮＡの単離 プラスミドを含むE.coli培養液を５００ｍｌのＬＢ培養
液（２０ｇ／ｌのＬＢ培養液ベース）（Gibco, Paisle
y, Scotland）中で、１５ｍｇ／ｍｌのテトラサイクリ
ンとともに、３７℃、２２０ｒｐｍの回転盤上で１２〜
１６時間生長させた。４℃、４０００×ｇで１０分間遠
心分離することにより細胞をペレット状にした。その細
胞ペレットを１８ｍｌのグルコース緩衝液（５０ｍＭの
グルコース、２５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１０
ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁し、４０ｍｇ／ｍｌのリゾチ
ーム（Sigma, St. Louis, MO）／グルコース緩衝液を２
ｍｌ添加して混合し、その混合物を室温で１５分間イン
キュベートした。新しく調製した０．２ＮのＮａＯＨお
よび１％のＳＤＳの溶液を４０ｍｌ添加し、その混合物
を静かに攪拌して氷上に１０分間置いた。次いで、５Ｍ
の酢酸カリウム（ｐＨ４．８）３０ｍｌを添加して十分
混合し、得られた混合物を氷上にさらに１０分間置い
た。細胞片を、４℃、４０００×ｇで１０分間遠心分離
することによりペレット化し、得られた上澄みを寒冷紗
フィルターにより濾過した。プラスミドＤＮＡを析出さ
せるためにイソプロパノール（０．６倍体積）を透明な
上澄みに添加し、室温で２０分間インキュベートしてい
る間に析出物が生成した。プラスミドＤＮＡのペレット
化を４℃、４０００×ｇで２０分間行い、次いで、７０
％エタノールで洗浄して軽く乾燥した。そのペレットを
９ｍｌのＴＥ緩衝液に再懸濁した後、１０ｇのＣｓＣｌ
および１０ｍｇ／ｍｌの臭化エチジウム溶液０．３８７
ｍｌを添加した。この溶液を３１３，１００×ｇで２４
時間遠心分離した。塩化セシウム勾配において得られた
プラスミドのバンドを紫外線により可視化して単離した
後、臭化エチジウムを抽出用の飽和ブタノール水溶液に
より除去した。次いで、プラスミドの作製に使用したＣ
ｓＣｌをＴＥ緩衝液に対する透析により除去し、最後に
ＤＮＡをＰＥＧ（ＭＷ８０００）を使用して濃縮した。
ＤＮＡの濃度は分光光度計による２６０ｎｍでの吸光度
により測定した。実施例７ Penicillium 形質転換ベクターｐＰｅｎＦＴＳＯの構築 Penicillium 形質転換ベクターは、優性選択マーカーと
してのフレオマイシン耐性遺伝子を入れて構築した。こ
れは、まず、フレオマイシン耐性遺伝子（Streptoallot
eichus hindustanus由来のフレオマイシン結合蛋白遺伝
子）を含み、酵母シトクロムＣ１ターミネータに結合し
た６６０ｂｐ断片を、ＢａｍＨＩ／ＢｇｌIIで消化した
プラスミドｐＵＴ７１３（CAYLA, Toulouse Cedex, Fra
nce ）からアガロースゲル上で電気泳動して溶離するこ
とにより単離して行った。単離した断片はベクターｐＳ
ＥＬＥＣＴ*１（Promega Corporation）のＢａｍＨＩ部
位に連結し、遺伝子の方向は制限酵素分析により決定し
た。次に、λ付着末端部位を含む５５０ｂｐのＰｓｔＩ
断片を挿入して、適切な大きさの挿入配列を含む場合は
そのベクターを使用してコスミドが形成できるようにし
た。次いで、Penicillium chrysogenumイソペニシリン
Ｎシンセターゼ（ＩＰＮＳ）遺伝子のプロモータ領域を
含む１．５ｋｂのＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ断片を、Ｎｃｏ
Ｉ／ＢａｍＨＩで消化したＩＰＮＳ遺伝子を含むゲノム
クローンから（アガロースゲル上で電気泳動して溶離す
ることにより）単離した。単離したＩＰＮＳ−プロモー
タ断片をＢａｍＨＩ／ＮｃｏＩで消化したベクターに連
結した。ＮｃｏＩ部位は、フレオマイシン耐性遺伝子の
ＡＴＧ開始コドンにある。このベクターをｐＵＴＺ−２
と命名する。
【００６６】Streptomyces clavuligerusエクスパンダ
ーゼ遺伝子を含む１．６４５ｋｂ断片をＢａｍＨＩおよ
びＳａｌＩで消化したｐＦＴＳＯ−１（前述のベクタ
ー）から、０．８％アガロースゲル上で電気泳動して溶
離することにより精製した。単離した断片は、やはりＢ
ａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化したベクターｐＳＥＬＥ
ＣＴ（Promega Corporation）に連結した。このベクタ
ーは、ｐＦＴＳＯ−８と命名した。新規ＮｃｏＩ部位
を、 Altered Sites* in vitro突然変異誘発系（Promeg
a Corporation ）を使用したｐＦＴＳＯ−８の部位特異
的突然変異誘発によりエクスパンダーゼ遺伝子のＡＴＧ
開始コドンに作った。突然変異誘発は、製造者の指示に
従って行った。オリゴヌクレオチドは、Streptomycesエ
クスパンダーゼ遺伝子の公開された塩基配列（Kovacevi
c et al., (1990) Journal of Bacteriology, 171, p.3
952-3958）由来のＡＴＧ開始コドンにあるＤＮＡ領域の
コード配列と相補的であるように構築した。オリゴヌク
レオチドの合成は、シアノエチルホスホラミディト化学
（Pharmacia Gene Assembler instrumentation）により
行い、オリゴ塩基配列は次の通りであった。 配列番号:8 5' CGAGAGGATCAGTGAGAGTCCATGGACACGACGG 3' 突然変異誘発は、制限酵素分析により確認した。次に、
Penicillium chrysogenumイソペニシリンＮシンセター
ゼ遺伝子のプロモータ領域を含む１．２ｋｂのＮｃｏＩ
断片を、ＩＰＮＳ遺伝子を含むＮｃｏＩで消化したゲノ
ムクローンから（アガロースゲル上で電気泳動して溶離
することにより）単離した。ＩＰＮＳ−プロモータ領域
は、エクスパンダーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドンに突然
変異誘発により作ったｐＦＴＳＯ−８ベクターの新規Ｎ
ｃｏＩ部位に連結した。プロモータのエクスパンダーゼ
遺伝子に対する方向は、制限酵素分析により確認した。
次いで、ＩＰＮＳ−プロモータ：エクスパンダーゼ遺伝
子カセットをＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ断片として、上述し
たPenicillium形質転換ベクターｐＵＴＺ−２のＢａｍ
ＨＩ／ＳａｌＩ切断部位に移した。最終的な構成物をｐ
ＰｅｎＦＴＳＯと命名した。実施例８ Penicillium β−チューブリンプロモータのクローン化 Penicillium β−チューブリン遺伝子を、ハイブリッド
形成プローブとしてAspergillus niger β−チューブリ
ン遺伝子を使用して、Penicillium λゲノムライブラリ
ーからクローン化した。このクローンの配列決定および
Aspergillus nigerのβ−チューブリン遺伝子の既知ア
ミノ酸配列との比較により、ＡＴＧ開始コドンで始まる
９１％の相同率の領域があることが確認された。機能性
プロモータを含む配列が、開始コドンと１．４ｋｂ上流
のＢａｍＨＩ部位との間で単離された。Penicillium β−チューブリンプロモータを有する形質
転換ベクターの構築 Penicillium β−チューブリンプロモータを含む２．０
ｋｂのＸｂａＩ／Ｈｉｎｄ III断片を、やはりＸｂａＩ
／ＨｉｎｄIII で消化したベクターｐＳＥＬＥＣＴ(Pro
mega Corporation）に連結した。新規ＮｃｏＩ部位を、
Altered Sites ＊in vitro突然変異誘発系（Promega Co
rporation ）を使用した部位特異的突然変異誘発により
ＡＴＧ開始コドンに作った。突然変異誘発は、製造者の
指示に従って行った。オリゴヌクレオチドはＡＴＧ開始
部位領域に対して相補的に構築したが、ＮｃｏＩ部位を
作るための変更をいくつか挿入し、突然変異誘発のため
に使用した。オリゴヌクレオチド合成は、シアノエチル
ホスホラミディト化学（Pharmacia Gene Assembler ins
trumentation）により行い、オリゴ塩基配列は次の通り
であった。 配列番号:9 5' ATCTCTTTTCTAATACCTTCACCATGGGTGAGATTGTACGTGATCCC
3' 突然変異誘発は、制限酵素分析により確認した。
次に、Penicillium β−チューブリンプロモータを含む
１．４ｋｂのＢａｍＨＩ／ＮｃｏＩ断片を、ＢａｍＨＩ
／ＮｃｏＩで消化したベクターｐＦＴＳＯ−８（前記実
施例７に記載したベクター）においてStreptomycesエク
スパンダーゼ遺伝子のＡＴＧに作ったＮｃｏＩ部位に連
結した。このベクターをｂｔＦＴＳＯ−８と命名した。
β−チューブリンプロモータを含む１．４ｋｂのＢａｍ
ＨＩ／ＮｃｏＩ断片はまた、ＢａｍＨＩ／ＮｃｏＩで消
化したベクターｐＵＴＺ−２（前記実施例７に記載した
ベクター）にも連結した。この連結により、フレオマイ
シン耐性遺伝子のすぐ前にβ−チューブリンプロモータ
が位置した。このベクターはｐＣＩ−６と命名した。次
に、β−チューブリンプロモータエクスパンダーゼ遺伝
子カセットを含む、ベクターｂｔＦＴＳＯ−８由来の
２．４ｋｂのＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄ III断片をＢａｍＨ
Ｉ／Ｈｉｎｄ IIIで消化したベクターｐＣＩ−６に連結
して、最終的なPenicilliu形質転換ベクターを得た。こ
のベクターにおいて、Streptomycesエクスパンダーゼ遺
伝子およびフレオマイシン耐性マーカーをβ−チューブ
リンプロモータから発現させた。このベクターをｐＴＳ
−２と命名した。実施例９ Penicillium（ＧＡＰ）プロモータのクローン化 Penicillium グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロ
ゲナーゼ（ＧＡＰ）遺伝子を、Aspergillus niger由来
のＧＡＰ遺伝子をハイブリッド形成プローブとして使用
することにより、Penicillium λゲノムライブラリーか
らクローン化した。陽性の可能性がある４個のクローン
について、 Cephalosporium ＧＡＰ遺伝子（Kimura, H.
et al., (1991), J. Ferm. and Bioeng., 71, 145-15
0）の５′領域のプライマーから生じたＰＣＲ産物によ
りさらに探索した。複製連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマ
ーに使用したオリゴヌクレオチドは、シアノエチルホス
ホラミディト化学（Pharmacia Gene Assembler instrum
entation）により合成し、オリゴ配列は次の通りであ
る。 配列番号:10 5' CGCGGATCCCGGCATCAACGGCTTCGGTCGTAT 3' 配列番号:11 5' CGCGGATCCGGGCACGCGCATGGACATGCCAGTG 3' ４個の陽性と目されたクローンの１個が、ＰＣＲ産物と
クロスハイブリッド形成した。このゲノムクローンのＢ
ａｍＨＩ断片（４ｋｂ）を、配列決定目的でＢａｍＨＩ
で消化したベクターｐＳＥＬＥＣＴ（Promega Corporat
ion）に連結した。このベクターをｐＴＳ−０と命名し
た。この断片を配列決定すると、セファロスポリンＧＡ
Ｐ遺伝子の既知配列との比較によりＡＴＧ開始コドンが
確認された。Penicillium（ＧＡＰ）プロモータを有する形質転換ベ
クターの構築 Penicillium ＧＡＰプロモータにStreptomycesエクスパ
ンダーゼ遺伝子を入れるために、ベクターｐＴＳ−０を
使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ部位特異的突然変異誘発によ
り新規ＮｃｏＩ部位をPenicillium ＧＡＰ遺伝子のＡＴ
Ｇに作った。突然変異誘発は、製造者の指示に従って行
った。オリゴヌクレオチドは、ＧＡＰ遺伝子のＡＴＧ開
始コドンのＤＮＡ領域をコードする配列に相補的である
ように構築したが、ＮｃｏＩ部位を作るために塩基を変
えて挿入した。オリゴヌクレオチドの合成はシアノエチ
ルホスホラミディト化学（Pharmacia Gene Assemblerin
strumentation）により行い、オリゴ配列は次の通りで
ある。配列番号:12 5' CAGTAAACGCAACCATGGTTGTCCAG 3' 突然変異誘発は、制限酵素分析により確認した。次に、
ＧＡＰプロモータを含むｐＴＳ−０のＮｃｏＩ／Ｂａｍ
ＨＩ断片（１．９ｋｂ）をＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩで消化
したベクターｐＦＴＳＯ−８（上記実施例７に記載のベ
クター）に連結し、Streptomycesエクスパンダーゼ遺伝
子とともにＧＡＰプロモータの位置付けた。このベクタ
ーをｐＴＳ−０−１と命名した。次に、ＧＡＰプロモー
タ：エクスパンダーゼカセットを含むｐＴＳ−０−１の
ＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄ III断片（３．０ｋｂ）をＢａｍ
ＨＩ／Ｈｉｎｄ IIIで消化したベクターｐＣＩ−６（上
記実施例８に記載のベクター）に連結して、ＧＡＰプロ
モータからStreptomycesエクスパンダーゼ遺伝子が発現
する最終的なPenicillium 形質転換ベクターｐＳＤ−１
を得た。実施例１０ Penicillium chrysogenum の形質転換 上記Penicillium chrysogenum 菌株由来のプロトプラス
トを、２５℃、２２０ｒｐｍの回転盤上で６７時間、５
０ｍｌのＣＭ培養液に１×１０７個の胞子を接種するこ
とにより生成させた。菌糸体を寒冷紗上に濾取し、５０
０ｍｌ容フラスコに移し、１００ｍｇのNovozyme 234(N
ovo BioLabs, Bagsvaerd,Denmark）を含む２５ｍｌのＫ
ＭＰ（０．７ＭのＫＣｌ、０．８Ｍのマンニトール、
０．０２ＭのＫＰＯ４、ｐＨ６．３）に再懸濁し、３０
℃、１００ｒｐｍでインキュベートした。スフェロプラ
ストを寒冷紗／グラスウールフィルターでの濾過により
分離し、３５０×ｇで１０分間遠心分離することにより
ペレット化した。次いで、スフェロプラストを１０ｍｌ
のＫＭＰ緩衝液で３回洗浄し、ＫＭＰＣ（５０ｍＭのＣ
ａＣｌ２を有するＫＭＰ）に再懸濁して５×１０７細胞
／ｍｌの濃度にし、室温で２０分間放置した。Penicill
ium の形質転換のために、２００ｍｌのスフェロプラス
ト懸濁物を、５０ｍｌのＰＰＣ（４０％ＰＥＧ，ＭＷ３
５００、２０ｍＭのＫＰＯ４，ｐＨ６．３、５％ＣａＣ
ｌ２は使用直前に添加した）とともにＤＮＡ（５ｍｇ／
ｍｌヘパリンを含む５ｍｇのベクターＤＮＡ／６．２ｍ
ｌのＫＭＰＣ）に添加し、形質転換混合物を氷上で３０
分間インキュベートした。新しく調製したＰＰＣ１ｍｌ
を添加し、その混合物を５０ｍｌの溶融した（５０℃）
再生寒天（ＣＭ＋１．３Ｍのマンニトールおよび３％寒
天）に移した。次いで、形質転換混合物を５枚のペトリ
皿に分配した。２５℃で２４時間再生した後、プレート
に、１００ｍｇ／５０ｍｌＯＬ（１％ペプトン／１％寒
天）のフレオマイシンを含むＯＬを上塗りした。上塗り
の量は再生寒天の量に等しい。プレートは、２５℃で７
〜１４日間インキュベートし、形質転換コロニーの発生
を観察した。実施例１１ アジポイル−６−ＡＰＡおよびアジポイル−７−ＡＤＣ
Ａ醗酵生成物のＨＰＬＣ分析 高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用し
て、使用した未形質転換P.chrysogenum菌株でのアジポ
イル−６−ＡＰＡの生産および使用した形質転換P.chry
sogenum菌株でのアジポイル−７−ＡＤＣＡの生産の分
析を行った。その分析は、６２５溶媒供給システム、２
２０ｎｍおよび２５４ｎｍにセットした４９０Ｅ可変波
長検出器、８２５Maximaデータシステムおよび固定相と
しての Novo-C-18カラムを有するWatersシステムで行っ
た。移動相（流量は１ｍｌ／分）は、２％メタノール／
９８％の０．０１０Ｍ−ＫＨ２ＰＯ４によるイソクラテ
ィク溶離を５分間、２→４０％直線勾配のメタノール／
０．０１０Ｍ−ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０を１５分間と
した。アジポイル−６−ＡＰＡの定量は、２２０ｎｍで
の標準ペニシリンＮの基準線を使用して求め、アジポイ
ル−７−ＡＤＣＡの定量は２５４ｎｍでの標準デアセト
キシセファロスポリンの基準線を使用して求めた。
ーゼ遺伝子を含む１．６４５ｋｂ断片をＢａｍＨＩおよ
びＳａｌＩで消化したｐＦＴＳＯ−１（前述のベクタ
ー）から、０．８％アガロースゲル上で電気泳動して溶
離することにより精製した。単離した断片は、やはりＢ
ａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化したベクターｐＳＥＬＥ
ＣＴ（Promega Corporation）に連結した。このベクタ
ーは、ｐＦＴＳＯ−８と命名した。新規ＮｃｏＩ部位
を、 Altered Sites* in vitro突然変異誘発系（Promeg
a Corporation ）を使用したｐＦＴＳＯ−８の部位特異
的突然変異誘発によりエクスパンダーゼ遺伝子のＡＴＧ
開始コドンに作った。突然変異誘発は、製造者の指示に
従って行った。オリゴヌクレオチドは、Streptomycesエ
クスパンダーゼ遺伝子の公開された塩基配列（Kovacevi
c et al., (1990) Journal of Bacteriology, 171, p.3
952-3958）由来のＡＴＧ開始コドンにあるＤＮＡ領域の
コード配列と相補的であるように構築した。オリゴヌク
レオチドの合成は、シアノエチルホスホラミディト化学
（Pharmacia Gene Assembler instrumentation）により
行い、オリゴ塩基配列は次の通りであった。 配列番号:8 5' CGAGAGGATCAGTGAGAGTCCATGGACACGACGG 3' 突然変異誘発は、制限酵素分析により確認した。次に、
Penicillium chrysogenumイソペニシリンＮシンセター
ゼ遺伝子のプロモータ領域を含む１．２ｋｂのＮｃｏＩ
断片を、ＩＰＮＳ遺伝子を含むＮｃｏＩで消化したゲノ
ムクローンから（アガロースゲル上で電気泳動して溶離
することにより）単離した。ＩＰＮＳ−プロモータ領域
は、エクスパンダーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドンに突然
変異誘発により作ったｐＦＴＳＯ−８ベクターの新規Ｎ
ｃｏＩ部位に連結した。プロモータのエクスパンダーゼ
遺伝子に対する方向は、制限酵素分析により確認した。
次いで、ＩＰＮＳ−プロモータ：エクスパンダーゼ遺伝
子カセットをＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ断片として、上述し
たPenicillium形質転換ベクターｐＵＴＺ−２のＢａｍ
ＨＩ／ＳａｌＩ切断部位に移した。最終的な構成物をｐ
ＰｅｎＦＴＳＯと命名した。実施例８ Penicillium β−チューブリンプロモータのクローン化 Penicillium β−チューブリン遺伝子を、ハイブリッド
形成プローブとしてAspergillus niger β−チューブリ
ン遺伝子を使用して、Penicillium λゲノムライブラリ
ーからクローン化した。このクローンの配列決定および
Aspergillus nigerのβ−チューブリン遺伝子の既知ア
ミノ酸配列との比較により、ＡＴＧ開始コドンで始まる
９１％の相同率の領域があることが確認された。機能性
プロモータを含む配列が、開始コドンと１．４ｋｂ上流
のＢａｍＨＩ部位との間で単離された。Penicillium β−チューブリンプロモータを有する形質
転換ベクターの構築 Penicillium β−チューブリンプロモータを含む２．０
ｋｂのＸｂａＩ／Ｈｉｎｄ III断片を、やはりＸｂａＩ
／ＨｉｎｄIII で消化したベクターｐＳＥＬＥＣＴ(Pro
mega Corporation）に連結した。新規ＮｃｏＩ部位を、
Altered Sites ＊in vitro突然変異誘発系（Promega Co
rporation ）を使用した部位特異的突然変異誘発により
ＡＴＧ開始コドンに作った。突然変異誘発は、製造者の
指示に従って行った。オリゴヌクレオチドはＡＴＧ開始
部位領域に対して相補的に構築したが、ＮｃｏＩ部位を
作るための変更をいくつか挿入し、突然変異誘発のため
に使用した。オリゴヌクレオチド合成は、シアノエチル
ホスホラミディト化学（Pharmacia Gene Assembler ins
trumentation）により行い、オリゴ塩基配列は次の通り
であった。 配列番号:9 5' ATCTCTTTTCTAATACCTTCACCATGGGTGAGATTGTACGTGATCCC
3' 突然変異誘発は、制限酵素分析により確認した。
次に、Penicillium β−チューブリンプロモータを含む
１．４ｋｂのＢａｍＨＩ／ＮｃｏＩ断片を、ＢａｍＨＩ
／ＮｃｏＩで消化したベクターｐＦＴＳＯ−８（前記実
施例７に記載したベクター）においてStreptomycesエク
スパンダーゼ遺伝子のＡＴＧに作ったＮｃｏＩ部位に連
結した。このベクターをｂｔＦＴＳＯ−８と命名した。
β−チューブリンプロモータを含む１．４ｋｂのＢａｍ
ＨＩ／ＮｃｏＩ断片はまた、ＢａｍＨＩ／ＮｃｏＩで消
化したベクターｐＵＴＺ−２（前記実施例７に記載した
ベクター）にも連結した。この連結により、フレオマイ
シン耐性遺伝子のすぐ前にβ−チューブリンプロモータ
が位置した。このベクターはｐＣＩ−６と命名した。次
に、β−チューブリンプロモータエクスパンダーゼ遺伝
子カセットを含む、ベクターｂｔＦＴＳＯ−８由来の
２．４ｋｂのＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄ III断片をＢａｍＨ
Ｉ／Ｈｉｎｄ IIIで消化したベクターｐＣＩ−６に連結
して、最終的なPenicilliu形質転換ベクターを得た。こ
のベクターにおいて、Streptomycesエクスパンダーゼ遺
伝子およびフレオマイシン耐性マーカーをβ−チューブ
リンプロモータから発現させた。このベクターをｐＴＳ
−２と命名した。実施例９ Penicillium（ＧＡＰ）プロモータのクローン化 Penicillium グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロ
ゲナーゼ（ＧＡＰ）遺伝子を、Aspergillus niger由来
のＧＡＰ遺伝子をハイブリッド形成プローブとして使用
することにより、Penicillium λゲノムライブラリーか
らクローン化した。陽性の可能性がある４個のクローン
について、 Cephalosporium ＧＡＰ遺伝子（Kimura, H.
et al., (1991), J. Ferm. and Bioeng., 71, 145-15
0）の５′領域のプライマーから生じたＰＣＲ産物によ
りさらに探索した。複製連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマ
ーに使用したオリゴヌクレオチドは、シアノエチルホス
ホラミディト化学（Pharmacia Gene Assembler instrum
entation）により合成し、オリゴ配列は次の通りであ
る。 配列番号:10 5' CGCGGATCCCGGCATCAACGGCTTCGGTCGTAT 3' 配列番号:11 5' CGCGGATCCGGGCACGCGCATGGACATGCCAGTG 3' ４個の陽性と目されたクローンの１個が、ＰＣＲ産物と
クロスハイブリッド形成した。このゲノムクローンのＢ
ａｍＨＩ断片（４ｋｂ）を、配列決定目的でＢａｍＨＩ
で消化したベクターｐＳＥＬＥＣＴ（Promega Corporat
ion）に連結した。このベクターをｐＴＳ−０と命名し
た。この断片を配列決定すると、セファロスポリンＧＡ
Ｐ遺伝子の既知配列との比較によりＡＴＧ開始コドンが
確認された。Penicillium（ＧＡＰ）プロモータを有する形質転換ベ
クターの構築 Penicillium ＧＡＰプロモータにStreptomycesエクスパ
ンダーゼ遺伝子を入れるために、ベクターｐＴＳ−０を
使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ部位特異的突然変異誘発によ
り新規ＮｃｏＩ部位をPenicillium ＧＡＰ遺伝子のＡＴ
Ｇに作った。突然変異誘発は、製造者の指示に従って行
った。オリゴヌクレオチドは、ＧＡＰ遺伝子のＡＴＧ開
始コドンのＤＮＡ領域をコードする配列に相補的である
ように構築したが、ＮｃｏＩ部位を作るために塩基を変
えて挿入した。オリゴヌクレオチドの合成はシアノエチ
ルホスホラミディト化学（Pharmacia Gene Assemblerin
strumentation）により行い、オリゴ配列は次の通りで
ある。配列番号:12 5' CAGTAAACGCAACCATGGTTGTCCAG 3' 突然変異誘発は、制限酵素分析により確認した。次に、
ＧＡＰプロモータを含むｐＴＳ−０のＮｃｏＩ／Ｂａｍ
ＨＩ断片（１．９ｋｂ）をＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩで消化
したベクターｐＦＴＳＯ−８（上記実施例７に記載のベ
クター）に連結し、Streptomycesエクスパンダーゼ遺伝
子とともにＧＡＰプロモータの位置付けた。このベクタ
ーをｐＴＳ−０−１と命名した。次に、ＧＡＰプロモー
タ：エクスパンダーゼカセットを含むｐＴＳ−０−１の
ＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄ III断片（３．０ｋｂ）をＢａｍ
ＨＩ／Ｈｉｎｄ IIIで消化したベクターｐＣＩ−６（上
記実施例８に記載のベクター）に連結して、ＧＡＰプロ
モータからStreptomycesエクスパンダーゼ遺伝子が発現
する最終的なPenicillium 形質転換ベクターｐＳＤ−１
を得た。実施例１０ Penicillium chrysogenum の形質転換 上記Penicillium chrysogenum 菌株由来のプロトプラス
トを、２５℃、２２０ｒｐｍの回転盤上で６７時間、５
０ｍｌのＣＭ培養液に１×１０７個の胞子を接種するこ
とにより生成させた。菌糸体を寒冷紗上に濾取し、５０
０ｍｌ容フラスコに移し、１００ｍｇのNovozyme 234(N
ovo BioLabs, Bagsvaerd,Denmark）を含む２５ｍｌのＫ
ＭＰ（０．７ＭのＫＣｌ、０．８Ｍのマンニトール、
０．０２ＭのＫＰＯ４、ｐＨ６．３）に再懸濁し、３０
℃、１００ｒｐｍでインキュベートした。スフェロプラ
ストを寒冷紗／グラスウールフィルターでの濾過により
分離し、３５０×ｇで１０分間遠心分離することにより
ペレット化した。次いで、スフェロプラストを１０ｍｌ
のＫＭＰ緩衝液で３回洗浄し、ＫＭＰＣ（５０ｍＭのＣ
ａＣｌ２を有するＫＭＰ）に再懸濁して５×１０７細胞
／ｍｌの濃度にし、室温で２０分間放置した。Penicill
ium の形質転換のために、２００ｍｌのスフェロプラス
ト懸濁物を、５０ｍｌのＰＰＣ（４０％ＰＥＧ，ＭＷ３
５００、２０ｍＭのＫＰＯ４，ｐＨ６．３、５％ＣａＣ
ｌ２は使用直前に添加した）とともにＤＮＡ（５ｍｇ／
ｍｌヘパリンを含む５ｍｇのベクターＤＮＡ／６．２ｍ
ｌのＫＭＰＣ）に添加し、形質転換混合物を氷上で３０
分間インキュベートした。新しく調製したＰＰＣ１ｍｌ
を添加し、その混合物を５０ｍｌの溶融した（５０℃）
再生寒天（ＣＭ＋１．３Ｍのマンニトールおよび３％寒
天）に移した。次いで、形質転換混合物を５枚のペトリ
皿に分配した。２５℃で２４時間再生した後、プレート
に、１００ｍｇ／５０ｍｌＯＬ（１％ペプトン／１％寒
天）のフレオマイシンを含むＯＬを上塗りした。上塗り
の量は再生寒天の量に等しい。プレートは、２５℃で７
〜１４日間インキュベートし、形質転換コロニーの発生
を観察した。実施例１１ アジポイル−６−ＡＰＡおよびアジポイル−７−ＡＤＣ
Ａ醗酵生成物のＨＰＬＣ分析 高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用し
て、使用した未形質転換P.chrysogenum菌株でのアジポ
イル−６−ＡＰＡの生産および使用した形質転換P.chry
sogenum菌株でのアジポイル−７−ＡＤＣＡの生産の分
析を行った。その分析は、６２５溶媒供給システム、２
２０ｎｍおよび２５４ｎｍにセットした４９０Ｅ可変波
長検出器、８２５Maximaデータシステムおよび固定相と
しての Novo-C-18カラムを有するWatersシステムで行っ
た。移動相（流量は１ｍｌ／分）は、２％メタノール／
９８％の０．０１０Ｍ−ＫＨ２ＰＯ４によるイソクラテ
ィク溶離を５分間、２→４０％直線勾配のメタノール／
０．０１０Ｍ−ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０を１５分間と
した。アジポイル−６−ＡＰＡの定量は、２２０ｎｍで
の標準ペニシリンＮの基準線を使用して求め、アジポイ
ル−７−ＡＤＣＡの定量は２５４ｎｍでの標準デアセト
キシセファロスポリンの基準線を使用して求めた。
【００６７】アジポイル−６−ＡＰＡおよびアジポイル
−７−ＡＤＣＡのペニシリナーゼ処理に対する感受性の
分析を、濾液に１単位／ｍｌのペニシリナーゼＩまたは
ペニシリナーゼIII を添加し、室温で１０〜３０分間イ
ンキュベートすることにより行った。これらのサンプル
を、上記と同じＨＰＬＣ条件下で分析した。
−７−ＡＤＣＡのペニシリナーゼ処理に対する感受性の
分析を、濾液に１単位／ｍｌのペニシリナーゼＩまたは
ペニシリナーゼIII を添加し、室温で１０〜３０分間イ
ンキュベートすることにより行った。これらのサンプル
を、上記と同じＨＰＬＣ条件下で分析した。
【００６８】アジポイル−６−ＡＰＡおよびアジポイル
−７−ＡＤＣＡ物質のＵＶスペクトル分析を５１０溶媒
供給システム、９９０フォトダイオードアレイ検出器、
９９０データシステムおよび固定相としての Novo-C-18
カラムを有するWatersシステムを使用して行った。使用
した移動相は上記と同じ条件であった。
−７−ＡＤＣＡ物質のＵＶスペクトル分析を５１０溶媒
供給システム、９９０フォトダイオードアレイ検出器、
９９０データシステムおよび固定相としての Novo-C-18
カラムを有するWatersシステムを使用して行った。使用
した移動相は上記と同じ条件であった。
【００６９】全醗酵培養液からのアジポイル−７−ＡＤ
ＣＡ物質の大規模な単離を、５１０溶媒供給システム、
９９０フォトダイオードアレイ検出器、９９０データシ
ステムおよび固定相としてのmBondapak C18 予備カラム
を使用したWatersシステムを使用して行った。移動相
（流量は５ｍｌ／分）は、０．０１０Ｍ−ＫＨ２Ｐ
Ｏ４、ｐＨ７．０によるイソクラティク溶離が３５分間
であった。アジポイル−７−ＡＤＣＡ物質の保持時間に
対応する吸収ピークをフラクションコレクターにより集
めた。実施例１２ 生理活性分析 寒天拡散バイオアッセイを使用して、ＨＰＬＣにより単
離したアジポイル−６−ＡＰＡおよびアジポイル−７−
ＡＤＣＡ醗酵物質の抗生活性を測定した。２０ｍｌの単
離物質を、ＬＢ寒天平板培地（Bacillus subtilus ATCC
33677またはE.coli超感受性菌株（Prof. Arnold L. Dem
ain, MITからの提供）を接種した３％寒天（Gibco, Pai
sley, Scotland）を有する２０ｇ／ｌのＬＢ培養液ベー
ス）の５ｍｍディスクに広げた。Bacillus subtilusを
アジポイル−６−ＡＰＡ物質を分析するための指示菌株
として使用し、E.coli超感受性菌株をアジポイル−７−
ＡＤＣＡ物質を分析するための指示菌株として使用し
た。３７℃で１５時間インキュベートした後のディスク
周辺の生育阻害のハロ形成は、その物質が生理活性を有
することを示した。この実験におけるコントロールは、
デアセトキシセファロスポリンＣ、セファロスポリン
Ｃ、ペニシリンＶおよびβ−ラクタム構造確認のための
コントロールとしてのペニシリナーゼを含んだ、または
含まない寒天であった。実施例１３ ＲＡＥＶ酵素分析 全醗酵培養液から精製したアジポイル−７−ＡＤＣＡ物
質を、ＲＡＥＶ酵素（RAEV Corp.から市販されたもの）
の比活性を測定するための基質として使用した。０．１
６ＭのＫＨ２ＰＯ４に１０ｍＭの基質、１ｍｇのＲＡＥ
Ｖ酵素、５％のグリセロールを含む全体積５０ｍｌの反
応混合物を３７℃でインキュベートした。０、１、３、
５、１０、２０および３０分後に５ｍｌずつ取り、３５
ｍｌの０．０１０Ｍ−ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ３．５で希釈
して−７０℃に冷凍した後、前記条件下でのＨＰＬＣ分
析を行った。
ＣＡ物質の大規模な単離を、５１０溶媒供給システム、
９９０フォトダイオードアレイ検出器、９９０データシ
ステムおよび固定相としてのmBondapak C18 予備カラム
を使用したWatersシステムを使用して行った。移動相
（流量は５ｍｌ／分）は、０．０１０Ｍ−ＫＨ２Ｐ
Ｏ４、ｐＨ７．０によるイソクラティク溶離が３５分間
であった。アジポイル−７−ＡＤＣＡ物質の保持時間に
対応する吸収ピークをフラクションコレクターにより集
めた。実施例１２ 生理活性分析 寒天拡散バイオアッセイを使用して、ＨＰＬＣにより単
離したアジポイル−６−ＡＰＡおよびアジポイル−７−
ＡＤＣＡ醗酵物質の抗生活性を測定した。２０ｍｌの単
離物質を、ＬＢ寒天平板培地（Bacillus subtilus ATCC
33677またはE.coli超感受性菌株（Prof. Arnold L. Dem
ain, MITからの提供）を接種した３％寒天（Gibco, Pai
sley, Scotland）を有する２０ｇ／ｌのＬＢ培養液ベー
ス）の５ｍｍディスクに広げた。Bacillus subtilusを
アジポイル−６−ＡＰＡ物質を分析するための指示菌株
として使用し、E.coli超感受性菌株をアジポイル−７−
ＡＤＣＡ物質を分析するための指示菌株として使用し
た。３７℃で１５時間インキュベートした後のディスク
周辺の生育阻害のハロ形成は、その物質が生理活性を有
することを示した。この実験におけるコントロールは、
デアセトキシセファロスポリンＣ、セファロスポリン
Ｃ、ペニシリンＶおよびβ−ラクタム構造確認のための
コントロールとしてのペニシリナーゼを含んだ、または
含まない寒天であった。実施例１３ ＲＡＥＶ酵素分析 全醗酵培養液から精製したアジポイル−７−ＡＤＣＡ物
質を、ＲＡＥＶ酵素（RAEV Corp.から市販されたもの）
の比活性を測定するための基質として使用した。０．１
６ＭのＫＨ２ＰＯ４に１０ｍＭの基質、１ｍｇのＲＡＥ
Ｖ酵素、５％のグリセロールを含む全体積５０ｍｌの反
応混合物を３７℃でインキュベートした。０、１、３、
５、１０、２０および３０分後に５ｍｌずつ取り、３５
ｍｌの０．０１０Ｍ−ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ３．５で希釈
して−７０℃に冷凍した後、前記条件下でのＨＰＬＣ分
析を行った。
【００７０】比色用のアジポイル−ｐ−アミノ安息香酸
基質に対するＲＡＥＶ酵素の活性を、０．０６５ＭのＫ
Ｈ２ＰＯ４、ｐＨ７．０に５ｍＭの基質、８．２５ｍｇ
のＲＡＥＶ酵素、１０％のグリセロールを入れて全体積
５０ｍｌとし、これを使用して３７℃で３０分間分析し
た。反応は、９６ウェルのマイクロタイターディッシュ
で行った。１／１００に希釈した１ＭのＮａＮＯ２／
０．２５Ｍ酢酸を５０ｍｌ添加して反応を停止し、その
反応物を室温で３分間放置した。１０ｍｇ／ｍｌの４−
アミノ−５−ヒドロキシ−２，７−ナフタレン−ジスル
ホン酸一ナトリウム塩水和物／水を０．５ＭのＮａＨＣ
Ｏ３で１／１００に希釈し、その１００ｍｌを添加し
て、ＥＬ３１２ Bio-Kinetics Plate Reader（BioTek I
nstruments）により５１５ｎｍですぐに発色をモニター
した。実施例１４ ＲＡＥＶ酵素反応物質のＨＰＬＣ分析 アジポイル−７−ＡＤＣＡ基質を使用したＲＡＥＶ酵素
（RAEV Corp.から市販されたもの）分析を全てＨＰＬＣ
でモニターしたが、これは、６２５溶媒供給システム、
２０３ｎｍおよび２５４ｎｍにセットした４９０Ｅ可変
波長検出器、８２５Maximaデータシステムおよび固定相
としてのNovo-C18カラムを有するWatersシステムを使用
して行った。移動相（流量は１ｍｌ／分）は、２％メタ
ノール／９８％の０．０１０Ｍ−ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ
３．５によるイソクラティク溶離を５分間、２→４０％
直線勾配のメタノール／０．０１０Ｍ−ＫＨ２ＰＯ４、
ｐＨ３．５を１５分間とした。反応物質の保持時間をモ
ニターするために標準７−ＡＤＣＡを使用した。反応物
質の定量は、２５４ｎｍでの標準７−ＡＤＣＡの基準線
を使用して求めた。実施例１５ アジポイル−７−ＡＤＣＡ醗酵物質の１３Ｃ−ＮＭＲ分
析 １３ Ｃ−ＮＭＲ（広幅プロトンデカップル）スペクトル
を、フーリエ変換方式のＩＢＭ−ＡＦ−３５０分光器に
より７５．４ＭＨｚ（７．１Ｔ）で求めた。サンプル
は、０．５ｍｌのＤ２Ｏ（９９．８％Ｄ、Aldrich）ま
たは０．５ｍｌのＤＭＳＯ−ｄ６（９９．０％Ｄ、Aldr
ich ）における醗酵培養液から得た５０ｍｇのアジポイ
ル−７−ＡＤＣＡ物質から成り、３５０゜Ｋで５ｍｍの
管に入れた。ＮＭＲデータにより、その物質がアジポイ
ル−７−ＡＤＣＡであることが確認された。実施例１６ 別のアジポイルアシラーゼ酵素の評価 ＲＡＥＶ酵素を使用した研究の他に、アジポイル−７−
ＡＤＣＡ（および他のアジポイル化合物）からのアジポ
イル側鎖の脱離を、種々の微生物源から得た酵素により
例証した。最初の研究では、Pseudomonas sp. 菌株SE-8
3 およびSE-495（日本国微工研に各々、FERM BP-817お
よびFERM BP-818の受託番号で寄託されている。）なら
びにPseudomonas 菌株SY-77-1 （the Northern Regiona
l ResearchLaboratory にNNRLB-8070の受託番号で寄託
されている。）を、２．０％（ｗ／ｖ）のHyCase SF 、
０．５％（ｗ／ｖ）のグルタミン酸一ナトリウム、０．
５％（ｗ／ｖ）の酵母エキス、０．２％（ｗ／ｖ）のコ
ーンスティープ粉末、０．５％（ｗ／ｖ）の綿実油およ
び０．１％（ｗ／ｖ）のグルタル酸を含む培地で７２時
間生長させた。細胞を遠心分離により集め、５０ｍＭの
リン酸塩緩衝液、ｐＨ８．０で洗浄した後、緩衝液に再
懸濁し、少量のクロロホルムを添加することにより外膜
を透過性にした。次いで、細胞懸濁物の一部をアジポイ
ル−ｐ−ニトロアニリン（ａｄ−ＰＮＡ）と混合し、３
０℃で２〜１８時間インキュベートした。インキュベー
ション後、その混合物を１０％（ｖ／ｖ）の酢酸を添加
することにより酸性にした。遊離したｐ−ニトロアニリ
ンを次いで、γ−グルタミル−トランスフェラーゼ（Si
gma製品番号545-A ）の分析用の試薬（キット型、 Sigm
aChemical Company 製）を使用してジアゾ化合物に変換
した後、比色法により検出した。３種類の菌株の相対的
活性は、各々、SE-495、SE-83 およびSY-77-1 に対して
１００％、８５．５％および４８％であった。上記ＲＡ
ＥＶ酵素に対して記載したものと同様の方法を使用し
て、SE-83 およびSE-495酵素のアジポイル−７−ＡＤＣ
Ａに対する活性も示された。 SY-77-1のアジポイル−７
−ＡＤＣＡに対するデアシル化活性は、この菌株がβ−
ラクタマーゼを生成するため、示すことができなかっ
た。
基質に対するＲＡＥＶ酵素の活性を、０．０６５ＭのＫ
Ｈ２ＰＯ４、ｐＨ７．０に５ｍＭの基質、８．２５ｍｇ
のＲＡＥＶ酵素、１０％のグリセロールを入れて全体積
５０ｍｌとし、これを使用して３７℃で３０分間分析し
た。反応は、９６ウェルのマイクロタイターディッシュ
で行った。１／１００に希釈した１ＭのＮａＮＯ２／
０．２５Ｍ酢酸を５０ｍｌ添加して反応を停止し、その
反応物を室温で３分間放置した。１０ｍｇ／ｍｌの４−
アミノ−５−ヒドロキシ−２，７−ナフタレン−ジスル
ホン酸一ナトリウム塩水和物／水を０．５ＭのＮａＨＣ
Ｏ３で１／１００に希釈し、その１００ｍｌを添加し
て、ＥＬ３１２ Bio-Kinetics Plate Reader（BioTek I
nstruments）により５１５ｎｍですぐに発色をモニター
した。実施例１４ ＲＡＥＶ酵素反応物質のＨＰＬＣ分析 アジポイル−７−ＡＤＣＡ基質を使用したＲＡＥＶ酵素
（RAEV Corp.から市販されたもの）分析を全てＨＰＬＣ
でモニターしたが、これは、６２５溶媒供給システム、
２０３ｎｍおよび２５４ｎｍにセットした４９０Ｅ可変
波長検出器、８２５Maximaデータシステムおよび固定相
としてのNovo-C18カラムを有するWatersシステムを使用
して行った。移動相（流量は１ｍｌ／分）は、２％メタ
ノール／９８％の０．０１０Ｍ−ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ
３．５によるイソクラティク溶離を５分間、２→４０％
直線勾配のメタノール／０．０１０Ｍ−ＫＨ２ＰＯ４、
ｐＨ３．５を１５分間とした。反応物質の保持時間をモ
ニターするために標準７−ＡＤＣＡを使用した。反応物
質の定量は、２５４ｎｍでの標準７−ＡＤＣＡの基準線
を使用して求めた。実施例１５ アジポイル−７−ＡＤＣＡ醗酵物質の１３Ｃ−ＮＭＲ分
析 １３ Ｃ−ＮＭＲ（広幅プロトンデカップル）スペクトル
を、フーリエ変換方式のＩＢＭ−ＡＦ−３５０分光器に
より７５．４ＭＨｚ（７．１Ｔ）で求めた。サンプル
は、０．５ｍｌのＤ２Ｏ（９９．８％Ｄ、Aldrich）ま
たは０．５ｍｌのＤＭＳＯ−ｄ６（９９．０％Ｄ、Aldr
ich ）における醗酵培養液から得た５０ｍｇのアジポイ
ル−７−ＡＤＣＡ物質から成り、３５０゜Ｋで５ｍｍの
管に入れた。ＮＭＲデータにより、その物質がアジポイ
ル−７−ＡＤＣＡであることが確認された。実施例１６ 別のアジポイルアシラーゼ酵素の評価 ＲＡＥＶ酵素を使用した研究の他に、アジポイル−７−
ＡＤＣＡ（および他のアジポイル化合物）からのアジポ
イル側鎖の脱離を、種々の微生物源から得た酵素により
例証した。最初の研究では、Pseudomonas sp. 菌株SE-8
3 およびSE-495（日本国微工研に各々、FERM BP-817お
よびFERM BP-818の受託番号で寄託されている。）なら
びにPseudomonas 菌株SY-77-1 （the Northern Regiona
l ResearchLaboratory にNNRLB-8070の受託番号で寄託
されている。）を、２．０％（ｗ／ｖ）のHyCase SF 、
０．５％（ｗ／ｖ）のグルタミン酸一ナトリウム、０．
５％（ｗ／ｖ）の酵母エキス、０．２％（ｗ／ｖ）のコ
ーンスティープ粉末、０．５％（ｗ／ｖ）の綿実油およ
び０．１％（ｗ／ｖ）のグルタル酸を含む培地で７２時
間生長させた。細胞を遠心分離により集め、５０ｍＭの
リン酸塩緩衝液、ｐＨ８．０で洗浄した後、緩衝液に再
懸濁し、少量のクロロホルムを添加することにより外膜
を透過性にした。次いで、細胞懸濁物の一部をアジポイ
ル−ｐ−ニトロアニリン（ａｄ−ＰＮＡ）と混合し、３
０℃で２〜１８時間インキュベートした。インキュベー
ション後、その混合物を１０％（ｖ／ｖ）の酢酸を添加
することにより酸性にした。遊離したｐ−ニトロアニリ
ンを次いで、γ−グルタミル−トランスフェラーゼ（Si
gma製品番号545-A ）の分析用の試薬（キット型、 Sigm
aChemical Company 製）を使用してジアゾ化合物に変換
した後、比色法により検出した。３種類の菌株の相対的
活性は、各々、SE-495、SE-83 およびSY-77-1 に対して
１００％、８５．５％および４８％であった。上記ＲＡ
ＥＶ酵素に対して記載したものと同様の方法を使用し
て、SE-83 およびSE-495酵素のアジポイル−７−ＡＤＣ
Ａに対する活性も示された。 SY-77-1のアジポイル−７
−ＡＤＣＡに対するデアシル化活性は、この菌株がβ−
ラクタマーゼを生成するため、示すことができなかっ
た。
【００７１】同様にして、２種類の真菌性菌株（Altern
aria sp.MA-133、ATCC No.20492およびAspergillus sp.
MA-13、ATCC No.20491 ；U.S.4,141,790 （明治製菓）
参照）およびU.S.3,239,394 （Merck & Co., Inc. ）に
セファロスポリンＣアシラーゼ生産源として記載されて
いる３種類の別の細菌性菌株（Brevibacterium、ATCCN
o.14,649；Achromobacterium、ATCC No.14,648；および
Flavobacterium、ATCCNo.14,650）についても、アジポ
イル−アシラーゼ産生が示された。 〔配列表〕 配列番号：１ 配列の長さ：14 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列
aria sp.MA-133、ATCC No.20492およびAspergillus sp.
MA-13、ATCC No.20491 ；U.S.4,141,790 （明治製菓）
参照）およびU.S.3,239,394 （Merck & Co., Inc. ）に
セファロスポリンＣアシラーゼ生産源として記載されて
いる３種類の別の細菌性菌株（Brevibacterium、ATCCN
o.14,649；Achromobacterium、ATCC No.14,648；および
Flavobacterium、ATCCNo.14,650）についても、アジポ
イル−アシラーゼ産生が示された。 〔配列表〕 配列番号：１ 配列の長さ：14 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列
【００７２】
【化１０】 配列番号：２ 配列の長さ：16 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列
【００７３】
【化１１】 配列番号：３ 配列の長さ：16 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列
【００７４】
【化１２】 配列番号：４ 配列の長さ：16 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列
【００７５】
【化１３】 配列番号：５ 配列の長さ：22 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列
【００７６】
【化１４】 配列番号：６ 配列の長さ：22 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列
【００７７】
【化１５】 配列番号：７ 配列の長さ：22 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列
【００７８】
【化１６】 配列番号：８ 配列の長さ：34 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列
【００７９】
【化１７】 配列番号：９ 配列の長さ：47 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列
【００８０】
【化１８】 配列番号：10 配列の長さ：33 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列
【００８１】
【化１９】 配列番号：11 配列の長さ：34 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列
【００８２】
【化２０】 配列番号：12 配列の長さ：26 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列
【００８３】
【化２１】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 フイリス・シー・マクエイダ アメリカ合衆国、ワシントン・98072、 ウツデインビル、ノース・イースト、ワ ンハンドレツドセブンテイサード・アベ ニユー・15611 (72)発明者 ジヨン・エイ・ランボセツク アメリカ合衆国、ワシントン・98115、 シアトル、ノース・イースト、セブンテ イーンズ・アベニユー・7701 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 C12P 35/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (7)
- 【請求項１】 アジポイル−７−アミノ−デスアセトキ
シ−セファロスポラン酸をアジポイルアシラーゼにより
脱アシル化する工程を含む７−アミノ−デスアセトキシ
−セファロスポラン酸の製造方法。 - 【請求項２】 アジポイル−７−アミノ−デスアセトキ
シ−セファロスポラン酸が、下記菌株によってアジポイ
ル−６−アミノペニシラン酸を産生するために利用され
得るアジピン酸の塩及びエステルの一つもしくはそれ以
上を含むアジペート源が添加された培地中にアジポイル
−６−アミノペニシラン酸を産生する能力を有するペニ
シリュウム（Penicillium）属の菌株を培養してアジポ
イル−６−アミノペニシラン酸を生成せしめる工程、お
よびアジポイル−６−アミノペニシラン酸を環拡張して
アジポイル−７−アミノデスアセトキシセファロスポラ
ン酸を生成する反応を触媒するエキスパンダーゼにより
アジポイル−６−アミノペニシラン酸をその場で（in s
itu）処理する工程により製造される請求項１に記載の
方法。 - 【請求項３】 ペニシリュウム属の菌株がエキスパンダ
ーゼをコードするＤＮＡを有する組換えＤＮＡ発現ベク
ターにより形質転換された宿主菌株である請求項２に記
載の方法。 - 【請求項４】 アジポイル−７−アミノ−デスアセトキ
シ−セファロスポラン酸を、アジポイル−７−アミノ−
デスアセトキシ−セファロスポラン酸が発酵ブロスから
イオン交換クロマトグラフィにより分離される前または
分離された後に、アジポイルアシラーゼにより脱アシル
化する請求項２に記載の方法。 - 【請求項５】 アジポイルアシラーゼがシュードモナス
（Pseudomonas）の種由来である請求項１ないし４のい
ずれか一項に記載の方法。 - 【請求項６】 ７−アミノデスアセトキシセファロスポ
ラン酸産物がフェニル酢酸を実質的に含まない請求項１
ないし５のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項７】 ７−アミノデスアセトキシセファロスポ
ラン酸産物がフェノキシ酢酸を実質的に含まない請求項
１ないし５のいずれか一項に記載の方法。
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|---|---|---|---|
| US75787991A | 1991-09-11 | 1991-09-11 | |
| US757879 | 1991-09-11 | ||
| US07/933,469 US5318896A (en) | 1991-09-11 | 1992-08-28 | Recombinant expandase bioprocess for preparing 7-aminodesacetoxy cephalosporanic acid (7-ADCA) |
| US933469 | 1992-08-28 |
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|---|---|
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| JP3072101B2 true JP3072101B2 (ja) | 2000-07-31 |
Family
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Family Applications (2)
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|---|---|---|---|
| JP5505516A Expired - Fee Related JP3027847B2 (ja) | 1991-09-11 | 1992-09-11 | ７−ａｄｃａの生化学的新規製造法 |
| JP11239731A Expired - Fee Related JP3072101B2 (ja) | 1991-09-11 | 1999-08-26 | ７―ａｄｃａの生化学的新規製造法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5505516A Expired - Fee Related JP3027847B2 (ja) | 1991-09-11 | 1992-09-11 | ７−ａｄｃａの生化学的新規製造法 |
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| SK280569B6 (sk) * | 1991-10-15 | 2000-03-13 | Gist-Brocades B.V. | Biologický spôsob výroby kyseliny7-aminodeacetylce |
| ES2194873T3 (es) * | 1993-07-30 | 2003-12-01 | Dsm Ip Assets Bv | Procedimiento para la produccion eficaz de 7-adca a traves de 3-(carboxietil)propionil-7-adca. |
| HU219259B (en) * | 1993-07-30 | 2001-03-28 | Gist Brocades Bv | Process for the efficient production of 7-adca via 2-(carboxyethylthio)acetyl-7-adca and 3-(carboxymethylthio)propionyl-7-adca, recombinant dna vectrors and transformed host cells |
| US5731165A (en) * | 1995-06-02 | 1998-03-24 | Gist-Brocades, B.V. | Process for the production of 7-ADCA via expandase activity on penicillin G |
| WO1997020053A2 (en) * | 1995-11-27 | 1997-06-05 | Gist-Brocades B.V. | Improved process for the production of semi-synthetic cephalosporins via expandase activity on penicillin g |
| WO1997038107A1 (en) * | 1996-04-04 | 1997-10-16 | Gist-Brocades B.V. | An enzyme with high adipoyl-coenzyme a synthetase activity and uses thereof |
| US6320069B1 (en) | 1996-07-02 | 2001-11-20 | Toray Industries, Inc. | Production of optically active ketone |
| EP0914463A2 (en) | 1996-07-16 | 1999-05-12 | Gist-Brocades B.V. | NOVEL PROCESS FOR THE PREPARATION OF CEPHALOSPORINS USING $i(ACREMONIUM CHRYSOGENUM) |
| PL335227A1 (en) * | 1997-02-20 | 2000-04-10 | Dsm Nv | Industrial-scale production of valuable compounds by fermentation in a chemically defined medium |
| JP2000512860A (ja) * | 1997-04-22 | 2000-10-03 | ギスト ブロカデス ベスローテン フェンノートシャップ | β―ラクタム抗生物質を調製する方法 |
| BR9804854A (pt) * | 1997-04-22 | 1999-09-08 | Gist Brocades Bv | Processo para a produção fermentativa de cefalosporinas desaciladas |
| CN1224468A (zh) * | 1997-04-22 | 1999-07-28 | 吉斯特-布罗卡迪斯有限公司 | 去酰基化头孢菌素的发酵生产的方法 |
| CN1137271C (zh) | 1997-04-22 | 2004-02-04 | 吉斯特-布罗卡迪斯有限公司 | 头孢菌素发酵生产的改进方法 |
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| EP1047785A1 (en) * | 1997-12-24 | 2000-11-02 | Isis Innovation Limited | Modified deacetoxycephalosporin c synthase (daocs) and x-ray structure |
| AU3419399A (en) * | 1998-03-27 | 1999-10-18 | Dsm N.V. | Novel process for the fermentative production of cephalosporin |
| US6383773B2 (en) | 1998-04-23 | 2002-05-07 | Massachusetts Institute Of Technology | Penicillin conversion |
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