CN101351549B - 突变体Ⅱ型β-内酰胺酰化酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及突变体II型β-内酰胺酰化酶，其是具有II型β-内酰胺酰化酶活性的模型多肽的变体，其中，突变体β-内酰胺酰化酶较之具有β-内酰胺酰化酶活性的模型多肽而言，针对己二酰-7-ADCA的体外β-内酰胺酰化酶活性提高了至少1.5倍。

Description

突变体Ⅱ型β-内酰胺酰化酶
本发明涉及突变体II型β-内酰胺酰化酶(acylase)、编码所述酶的多肽以及经所述多肽转化的微生物和生产所述突变体II型β-内酰胺的方法。本发明还涉及使用本发明的突变体II型β-内酰胺酰化酶来生产感兴趣的脱酰基化β-内酰胺化合物的工艺。
β-内酰胺抗生素构成了抗生物化合物的最重要的组，其临床应用已有很长的历史。在该组中，突出的有青霉素和头孢菌素。青霉素是多种有丝真菌，例如，Penicillium(例如P.chrysogenum)天然生产的。头孢菌素是多种微生物，例如Acremonium(例如，A.chrysogenum)和Streptomyces(例如，Streptomyces clavuligerus)天然生产的。
作为经典菌株改进技术的结果，过去数十年来，P.chrysogenum和A.chrysogenum中的抗生素生产水平也显著增加。随着对产生青霉素和头孢菌素的生物合成途径的了解逐渐增加以及重组DNA技术的出现，已经可以用新的工具来改进生产菌株。
β-内酰胺生物合成中涉及的很多酶已被鉴定出来，它们对应的基因也已被克隆，如Ingolia and Queener，Med Res Rev(1989)9：245-264(生物合成途径和酶)以及Aharonowitz，Cohen，and Martin，Ann Rev Microbiol(1992)46：461-495(基因克隆)所述。
P.chrysogenum中对青霉素进行生物合成的前两个步骤是三个氨基酸L-5-氨基-5-羧基戊酸(L-αα-氨基己二酸)(A)、L-半胱氨酸(C)和L-缬氨酸(V)缩合为三肽LLD-ACV，接着是该三肽环化为异青霉素N的形式。该化合物含有典型的β-内酰胺结构。第三个步骤涉及通过酰基转移酶(AT)的作用用疏水侧链代替L-5-氨基-5-羧基戊酸的亲水侧链。
在EP-A-0448180中描述，AT介导的酶促交换反应在细胞内的细胞器——微体中发生。可通过表达脱乙酰氧头孢菌素C合酶(EC 1.14.20.1-DAOCS，在本文中还被称为扩环酶(expandase))的非前驱(non-precursed)P.chrysogenum转化子形成相当大量的脱乙酰氧头孢菌素C(DAOC)，这一现象暗示了显著量的青霉素N——扩环酶天然底物在P.chrysogenum中的存在(Alvi et al.，J Antibiot(1995)48：338-340)。但是，DAOC的D-α-氨基-己二酰基侧链不能被容易地去除。
头孢菌素比青霉素贵得多。一个原因在于，一些头孢菌素(例如头孢氨苄(cephalexin))是通过多次化学转化从青霉素制得的。另一原因在于，目前仅具有D-α-氨基-己二酰基侧链的头孢菌素才能被发酵。在这方面最重要的起始材料——头孢菌素C在任何pH下都易溶于水，因此，这暗示要使用麻烦且昂贵的柱技术来进行长且浪费的分离工艺。还必须经过多次化学和酶促转化，将以这种方式获得的头孢菌素C转化为治疗用的头孢菌素。
目前工业界偏好用来制备7-氨基-脱乙酰氧头孢烷酸(7-ADCA)的方法涉及复杂的化学步骤，对青霉素G进行扩环和衍生化。生产7-ADCA的一个必要的化学步骤涉及将5元青霉素环结构扩环为6元头孢菌素环结构(见，例如US 4,003,894)。该复杂的化学加工既昂贵又对环境有害。因此，人们很想用酶促反应(例如酶促催化，优选地，在发酵期间进行的)来代替此类化学过程。通过生物学过程来代替化学扩环过程的关键是头孢菌素生物合成途径中的中枢酶——扩环酶。来自细菌Streptomycesclavuligerus(S.clavuligerus)的扩环酶被发现能在一些情况下进行青霉素环扩展。当将其引入P.chrysogenum时，其能将青霉素环结构转化为头孢菌素环结构，如Cantwell et al.，Proc R Soc Lond B(1992)248：283-289所述。鉴于扩环酶能催化青霉素N的5元噻唑烷环扩环为DAOC的6元二氢噻嗪环，因此从逻辑上讲该酶当然将是代替化学工艺中环扩展步骤的候选者。但不幸的是，该酶作用于头孢菌素生物合成途径的青霉素N中间产物，而在通过P.chrysogenum生产的容易获得的便宜的青霉素(例如青霉素V或青霉素G)上却没有作用或者非常低效。青霉素N并不能商业获得，甚至当其被扩环时，其D-α-氨基-己二酰基侧链都不能被青霉素酰化酶容易地除去。
已有报道，扩环酶能将具有特定侧链的青霉素扩环为对应的7-ADCA衍生物。扩环酶的这一特征被用于WO93/05158、WO95/04148和WO95/04149公开的技术中。在这些公开文本中，通过在经扩环酶基因转化过的重组Penicillium chrysogenum菌株中对某些6-氨基青霉烷酸(6-APA)衍生物进行体内转化，来代替将青霉素G体外转化为7-ADCA的传统化学转化。更具体地，WO93/05158教导了扩环酶在P.chrysogenum中的体内使用，这与作为储备的己二酰基侧链(也被称为己二酰基)组合，所述侧链是P.chrysogenum中酰基转移酶的底物。这导致了己二酰-6-APA的形成，己二酰-6-APA被引入P.chrysogenum菌株的扩环酶转化，产生了己二酰-7-ADCA，其被真菌细胞排进周围培养基。
在随后的步骤中，可通过化学方法或通过酰化酶酶促切掉对应的7-ADCA衍生物的侧链，由此产生7-ADCA和对应的侧链。文献中已提到多种类型的微生物可用作为酰化酶产生菌株，用于对通过发酵获得的β-内酰胺衍生物脱酰基化。此类生产酰化酶的微生物的例子是Escherichia coli、Kluyvera citrophila、Proteus rettgeri、Pseudomonas sp.、Alcaligenesfaecalis、Bacillus megaterium、Bacillus sphaericus和Arthrobacter viscosus种的某些菌株。
根据文献，基于其分子结构和底物特异性而言，可以考虑若干种类型的酰化酶(Vandamme E.J.Penicillin acylases and beta-lactamases″In：″Microbial Enzymes and Bioconversions″E.H.Rose(Ed.)，EconomicMicrobiology 5(1980)467-552，Acad.Press，New York)。
I型酰化酶是对青霉素V特异性的。这些酶由四个相同的亚基构成，每个亚基具有35kDa的分子量。来自Bacillus sphaericus的克隆基因的完整核苷酸序列已被报道(Ollson A.Appl.Environm.Microb.(1976)，203)。
II型酰化酶都共享下述共有的分子结构：这些酶是小α-亚基(20-25kDa)和大β-亚基(60-65kDa)构成的异二聚体。在底物特异性方面，II型酰化酶可被进一步分为两组。
IIA型酰化酶对青霉素G非常特异，因此通常被称为青霉素酰化酶。通常，它们对邻近酰胺基氮原子的基元(这可能是头孢霉素核(cephem)基团、青霉烯(penem)基团、氨基酸等)并不太特异，但是对底物的酰基基元有底物特异性。该酰基基元必须非常疏水，其优选是苯甲基或(短)烷基。不被IIA型酰化酶水解的底物的例子是具有二羧酸作为酰基基元的那些：琥珀酰基、戊二酰基、己二酰基和氨基己二酰基，CefC的侧链。IIA型酰化酶的例子是来自Escherichia coli、Kluyvera citrophila、Proteus rettgeri和Alcaligenes faecalis的酶。
已有报道，IIB型酰化酶能将具有琥珀酰基、戊二酰基、己二酰基和α-酮己二酰基作为酰基基元的头孢菌素(包括脱乙酰氧衍生物)以及甚至CefC水解至非常有限的程度。还可基于氨基酸序列同源性，将该IIB型酰化酶的组再分为两组。这些亚组在本文中被定义为SY77组和SE83组，它们是因为分别来自Pseudomonas SY77和Pseudomonas SE83-acyII的酰化酶得名的。
Matsuda et al(J.Bacteriol(1985)，163，1222已经对编码SY77-酰化酶的基因进行克隆及测序，其表明，该酶对戊二酰-7-ACA具有活性，但是对琥珀酰-7-ACA和己二酰-7-ACA的活性要少得多。SY77-前体的三维结构是已知的(J.Biol.Chem.(2002)，277，2823)。
此后，Matsuda et al.(J.Bacteriol(1987)，169，5815和J.Bacteriol.(1987)，169，5821)对编码SE83-acyII酰化酶的基因进行了克隆和测序，其表明，该酶对戊二酰-7-ACA、己二酰-7-ACA、琥珀酰-7-ACA和CEFC(头孢菌素C)具有活性(降序排列)。与SE83相关的所有研究都集中于酶水解70ACA衍生物的能力，特别是水解CEFC的能力。
在WO91/16435中已显示，SY77和SE83-acyII之间的氨基酸同源性非常低：酰化酶的α-亚基大约25％，β-亚基大约28％。
WO9512680公开了来自Brevundimonas diminuta的另一种SE83组的酰化酶，其被命名为N176，其与SE83-acyII大约94％同源，并且针对其CEFC-酰化酶活性进行了测试。SE83组的第三个成员是来自Brevundimonas diminuta V22的V22。这三种酰化酶的氨基酸序列由Aramori et al在Journal of Fermentation and Bioengineering 72，232-243(1991)中公开。表1显示了SE83组的多种IIB型酰化酶氨基酸序列的全长序列同一性矩阵。
表1
  Type-IIB酰化酶  SE83acyii   N176   V22
  SE83acyii  100   94   93
  N176  94   100   98
  V22  93   98   100
已经有若干种尝试，企图增加数种现有酰化酶的CEFC-酰化酶活性：WO2005014821公开了SE83-酰化酶的突变体，EP-A-1553175公开了N176-酰化酶的突变体，所有突变体都是为了提高CEFC-酰化酶活性。提到的参考文献都没有关注对感兴趣的其它酰化β-内酰胺化合物(例如己二酰-7-ADCA)的脱酰基化反应的改进。因此，人们仍迫切需要下述酰化酶，其具有针对己二酰-7-ADCA的提高的脱酰基化活性，并且可有利地用于从己二酰-7ADCA(例如，通过对经转化的Penicillium菌株发酵生产的)来生产7-ADCA的工艺。
图1：对β-内酰胺酰化酶——来自Pseudomonas SE83的II型SE83-acyii(SEQ ID No.1)、来自Brevundimonas diminuta N-176的N176(SEQID No.2)和来自Brevundimonas diminuta V22的V22(SEQ ID No.3)的氨基酸序列进行的多比对。
图2：在pH＝8.8和30℃(图2a)下以及pH＝9.5和40℃(图2b)下，通过固定的酰化酶对己二酰-7-ADCA的转化。Peudomonas SE83ACYii野生型的固定的酰化酶(实线)和突变体L161T固定的酰化酶(虚线)。速率(ml KOH/分钟，Y轴上)被作为百分比转化率(％，X轴上)的函数作图。
在第一个方面，本发明提供了下述突变体II型β-内酰胺酰化酶，其是具有II型β-内酰胺酰化酶活性的模型多肽的变体，其中，突变体β-内酰胺酰化酶较之具有β-内酰胺酰化酶活性的模型多肽而言，针对己二酰-7-ADCA的体外β-内酰胺酰化酶活性提高了至少1.5倍。在材料和方法章节对针对己二酰-7-ADCA的体外β-内酰胺酰化酶活性的测定进行了详细描述。更优选地，突变体II型β-内酰胺酰化酶的针对己二酰-7-ADCA的体外β-内酰胺酰化酶活性提高了至少2倍，更优选地，至少2.5倍，更优选地，至少3倍，更优选地，至少4倍，更优选地，至少5倍，更优选地，至少6倍，更优选地，至少7倍，更优选地，至少8倍，更优选地，至少9倍，更优选地，至少10倍，更优选地，至少11倍。
在本发明的上下文中，“改变的或突变体II型β-内酰胺酰化酶”指具有酰化酶活性的、并非从天然来源获得的并且其氨基酸序列与天然II型β-内酰胺酰化酶的完整氨基酸序列有所不同的任何酶。
本发明还提供了下述突变体II型β-内酰胺酰化酶，其是具有II型β-内酰胺酰化酶活性的模型多肽的变体，其中，所述突变体II型β-内酰胺酰化酶至少在选自第161、270、296、442和589位构成的组或第10、29、274、280、314、514、645、694、706和726位构成的组或第10、29、161、270、274、280、296、314、442、514、589、645、694、706和726位构成的组或第10、29、270、274、280、442、514、589、645、694和726构成的组的氨基酸位置上经过修饰，其中采用了Pseudomonas的SE83-acyII酰化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸位置编号。
更优选地，本发明还提供了下述突变体II型β-内酰胺酰化酶，其是具有II型β-内酰胺酰化酶活性的模型多肽的变体，其中，突变体β-内酰胺酰化酶较之具有β-内酰胺酰化酶活性的模型多肽而言，针对己二酰-7-ADCA的体外β-内酰胺酰化酶活性提高了至少1.5倍，更优选地，至少2倍，更优选地，至少2.5倍，更优选地，至少3倍，更优选地，至少4倍，更优选地，至少5倍，更优选地，至少6倍，更优选地，至少7倍，更优选地，至少8倍，更优选地，至少9倍，更优选地，至少10倍，更优选地，至少11倍，并且，其中，所述突变体II型β-内酰胺酰化酶至少在选自第161、270、296、442和589位构成的组或第10、29、274、280、314、514、645、694、706和726位构成的组或第10、29、161、270、274、280、296、314、442、514、589、645、694、706和726位构成的组或第10、29、270、274、280、442、514、589、645、694和726构成的组的氨基酸位置上经过修饰，其中采用了Pseudomonas的SE83-acyII酰化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸位置编号。
本发明优选提供了下述突变体II型β-内酰胺酰化酶，其是具有II型β-内酰胺酰化酶活性的模型多肽的变体，其中，所述突变体II型β-内酰胺酰化酶至少在第10位或至少在第29位，至少在第161位或至少在第270位或至少在第274位或至少在第280位或至少在第296位或至少在第314位或至少在第442位或至少在第514位或至少在第589位或至少在第645位或至少在第694位或至少在第706位或至少在第726位经过修饰，其中采用了Pseudomonas的SE83-acyII酰化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸位置编号。在本发明的一种实施方式中，提供了在第161位或第296位具有单种修饰的突变体II型β-内酰胺酰化酶。
本发明还提供了下述突变体II型β-内酰胺酰化酶，其是具有II型β-内酰胺酰化酶活性的模型多肽的变体，其中，所述突变体II型β-内酰胺酰化酶至少在位置161+270的组合或至少在位置161+296的组合或至少在位置161+442的组合或至少在位置161+589的组合或至少在位置270+296的组合或至少在位置270+442的组合或至少在位置270+589的组合或至少在位置296+442的组合或至少在位置296+589的组合或至少在位置442+589的组合或至少在位置161+270+296的组合或至少在位置161+270+442的组合或至少在位置161+270+589的组合或至少在位置161+296+589的组合或至少在位置296+442+589的组合或至少在位置161+296+442的组合或至少在位置161+296+589的组合或至少在位置296+442+589的组合或至少在选自161、270、296、442和589构成的组的4个位置的任何组合或至少在位置161、270、296、442和589的组合处经过修饰，并且，其中，所述突变体II型β-内酰胺酰化酶可能在除了这些位置或前述所有可能的其组合处之外的其它氨基酸位置具有修饰，其中采用了Pseudomonas的SE83-acyII酰化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸位置编号。
本文中使用的具有II型β-内酰胺酰化酶活性的模型多肽选自由下列多肽构成的组：具有II型β-内酰胺酰化酶活性且优选具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列(即，Pseudomonas的种SE83的SE83-acyII酰化酶)或具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列(即，Pseudomonas的种N176的N176酰化酶)或具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列(即，Brevundimonas diminuta V22的V22酰化酶)的多肽和具有与SEQ ID NO：1有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的百分比同一性的氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO：2有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的百分比同一性的氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO：3有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的百分比同一性的氨基酸序列的且具有II型β-内酰胺酰化酶活性的多肽。作为用于本发明的具有II型β-内酰胺酰化酶活性的模型多肽而言，更优选的是具有II型β-内酰胺酰化酶活性，并且具有SEQID NO：1的氨基酸序列或具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或具有SEQ IDNO：3的氨基酸序列的多肽。作为具有II型β-内酰胺酰化酶活性的模型多肽而言，最优选的是Pseudomonas的SE83-acyII酰化酶(SEQ ID NO：1)。
本发明优选提供了选自下述组的模型II型β-内酰胺酰化酶的突变体，所述组由具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酰化酶和具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的酰化酶和具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的酰化酶，以及具有与SEQ ID NO：1有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的百分比同一性的氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO：2有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的百分比同一性的氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO：3有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的百分比同一性的氨基酸序列且具有II型β-内酰胺酰化酶活性的多肽构成，并且，所述突变体具有至少在第10位或至少在第29位，至少在第161位或至少在第270位或至少在第274位或至少在第280位或至少在第296位或至少在第314位或至少在第442位或至少在第514位或至少在第589位或至少在第645位或至少在第694位或至少在第706位或至少在第726位上的修饰。在一种实施方式中，本发明提供了下述突变体II型β-内酰胺酰化酶，其在第161位或第296位具有单种修饰，其中采用了Pseudomonas的SE83-acyII酰化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸位置编号。
在氨基酸位置上的修饰可包含另外的氨基酸(选自天然存在的20种L-氨基酸的组，见表1)的取代。或者，氨基酸位置上的修饰可包含所述位置上氨基酸的缺失。此外，氨基酸位置上的修饰可包含对所述氨基酸C-末端侧或N-末端侧一个或多个氨基酸的取代。
表1
  氨基酸   三字母编码   单字母编码
  丙氨酸   Ala   A
  精氨酸   Arg   R
  天冬酰胺   Asn   N
  天冬氨酸   Asp   D
  半胱氨酸   Cys   C
  谷氨酸   Glu   E
  谷氨酰胺   Gln   Q
  甘氨酸   Gly   G
  组氨酸   His   H
  异亮氨酸   Ile   I
  亮氨酸   Leu   L
  赖氨酸   Lys   K
  甲硫氨酸   Met   M
  苯丙氨酸   Phe   F
  脯氨酸   Pro   P
  丝氨酸   Ser   S
  苏氨酸   Thr   T
  色氨酸   Trp   W
  酪氨酸   Tyr   Y
  缬氨酸   Val   V
本发明的突变体II型β-内酰胺酰化酶，优选地，选自具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酰化酶和具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的酰化酶和具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的酰化酶的模型II型β-内酰胺酰化酶的突变体可能携带一种或多种下述修饰：
◆第10位上的谷氨酸(SEQ ID NO：1)或丙氨酸(SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3)被带正电荷的氨基酸残基(例如赖氨酸或精氨酸)或具有α-螺旋形成的构象偏好的小氨基酸残基(例如丙氨酸)取代，优选被赖氨酸取代；
◆第29位上的丝氨酸被具有芳香族(样)侧链的氨基酸(例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸)或具有更大的不带电荷的极性侧链或带正电荷的侧链的氨基酸(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸和赖氨酸)取代，优选被天冬酰胺或苯丙氨酸取代；
◆第161位上的亮氨酸被更小且更具极性的氨基酸(例如苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸和半胱氨酸)或在pH＝9左右带正电荷的氨基酸(例如精氨酸和赖氨酸)取代，优选被丝氨酸或苏氨酸或甘氨酸取代，最优选被苏氨酸取代；
◆第274位上的组氨酸被至少在侧链γ位含有碳、氧或硫原子并且尺寸比组氨酸要小的氨基酸残基(例如亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、缬氨酸和脯氨酸)取代，优选被亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸或苏氨酸取代；
◆第280位上的精氨酸被由负电荷取代了正电荷的氨基酸残基(例如天冬氨酸和谷氨酸)或被具有不分支且不带电荷的极性侧链的氨基酸残基(例如谷氨酰胺、天冬酰胺和丝氨酸)取代，优选被谷氨酰胺和天冬酰胺取代，最优选被谷氨酰胺取代；
◆第296位上的组氨酸被带电荷的或极性的氨基酸或能代替模型酰化酶中已有的键合到组氨酸残基的N-δ或N-ε原子上的氢键的氨基酸残基取代，例如，被天冬酰胺和谷氨酰胺取代，优选被谷氨酰胺取代；
◆第314位上的异亮氨酸被具有β-分支的更小的氨基酸残基(例如缬氨酸)或具有中等大小的极性侧链的氨基酸残基(例如谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸和苏氨酸)取代，优选被缬氨酸或谷氨酰胺取代；
◆第442位上的谷氨酸被没有疏水侧链或具有小疏水侧链的氨基酸残基(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)取代，优选被甘氨酸取代；
◆第514位上的脯氨酸被具有更具极性和/或更具柔性的侧链(能带来额外的氢键)的氨基酸残基(例如谷氨酰胺、天冬酰胺、苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和谷氨酸)取代，优选被谷氨酰胺取代；
◆第589位上的精氨酸被在某些环境下能保持正电荷的氨基酸残基(例如组氨酸和赖氨酸)或被具有能形成氢键的芳香族侧链的氨基酸残基(例如酪氨酸和色氨酸)或被能代替模型酰化酶中已有的键合到组氨酸残基的N-δ或N-ε原子上的氢键的氨基酸残基(例如天冬酰胺和谷氨酰胺)取代，优选被组氨酸取代；
◆第645位上的丙氨酸被具有对β-链形成的增加的偏好的小氨基酸残基(例如苏氨酸、缬氨酸、丝氨酸、半胱氨酸和亮氨酸)取代，优选被苏氨酸取代；
◆第694位上的天冬酰胺被具有小于天冬酰胺的侧链的氨基酸残基(例如丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、缬氨酸和甘氨酸)取代，优选被苏氨酸取代；
◆第706位上的酪氨酸被没有侧链或具有比亮氨酸小的侧链的氨基酸残基(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸和脯氨酸)取代，优选被甘氨酸取代；
◆第726位上的缬氨酸被具有更大疏水侧链的氨基酸残基(例如异亮氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸)取代，优选被异亮氨酸取代。
本发明的高度优选的实施方式是选自下述组的模型II型β-内酰胺酰化酶的突变体，所述组由具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酰化酶和具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的酰化酶和具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的酰化酶，以及具有与SEQ ID NO：1有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的百分比同一性的氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO：2有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的百分比同一性的氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO：3有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的百分比同一性的氨基酸序列且具有II型β-内酰胺酰化酶活性的多肽构成，并且，所述突变体携带下述修饰中之一：H296Q、L161G、L161S或L161T。
本发明的更加高度优选的实施方式是选自下述组的模型II型β-内酰胺酰化酶的突变体，所述组由具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酰化酶和具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的酰化酶和具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的酰化酶，以及具有与SEQ ID NO：1有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的百分比同一性的氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO：2有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的百分比同一性的氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO：3有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的百分比同一性的氨基酸序列且具有II型β-内酰胺酰化酶活性的多肽构成，并且，所述突变体携带位置上突变。最优选的是下述突变体酰化酶，其在下述2个位置的组合处具有修饰：[161+10]、[161+29]或[161+694]或[161+726]或[161+274]或[161+706]或[161+442]或[161+589]或[161+314]，或在下述3个位置的组合处：[161+29+274]、[161+29+706]、[161+29+514]、[161+274+589]或[161+274+706]，或在下述4个位置的组合处：[161+29+274+726]、[161+274+280+314]，或在下述5个位置的组合处：[161+29+274+314+694]、[161+274+280+514+726]，或在下述6个位置的组合处具有修饰：[161+29+280+314+645+726]。
本发明优选提供了Pseudomonas的SE83-acyII酰化酶(SEQ ID NO：1)的突变体，其具有至少在位置L161+M270的组合上或至少在位置L161+H296的组合上或至少在位置L161+E442的组合上或至少在位置L161+R589的组合上或至少在位置M270+H296的组合上或至少在位置M270+E442的组合上或至少在位置M270+R589的组合上或至少在位置H296+E442的组合上或至少在位置H296+R589的组合上或至少在位置E442+R589的组合上或至少在位置L161+M270+H296的组合上或至少在位置L161+M270+E442的组合上或至少在位置L161+M270+R589的组合上或至少在位置L161+H296+R589的组合上或至少在位置H296+E442+R589的组合上或至少在位置L161+H296+E442的组合上或至少在位置L161+H296+R589的组合上或至少在位置H296+E442+R589的组合上或至少在选自L161、M270、H296、E442和R589构成的组的4个位置的任何组合上或至少在位置L161、M270、H296、E442和R589的组合上的修饰，并且，其中，所述突变体II型β-内酰胺酰化酶可能在除了这些位置或前述所有可能的其组合处之外的其它氨基酸位置上具有修饰。本发明的高度优选的实施方式是实施例中表2-5的Pseudomonas SE83-AcyII突变体。
在第二个方面，本发明提供了编码本发明的突变体II型β-内酰胺酰化酶的多核苷酸。本发明还提供了编码所述突变体II型β-内酰胺酰化酶的α-亚基的多核苷酸以及编码所述突变体II型β-内酰胺酰化酶的β-亚基的多核苷酸。WO2005/014821在第8页和第9页公开：编码SE83-组的酰化酶的基因编码由α-亚基、间隔肽和β-亚基(按该顺序)构成的多肽。在宿主细胞中经历转录和翻译之后，源自Pseudomonas sp.SE83的酰化酶以大小为大约84kDa的非活性单链多肽的形式产生。之后，SEQ ID NO：1的氨基酸序列中第230和第231位以及第239和第240位上的氨基酸之间发生两次自消化，这导致除去了由9个氨基酸构成的间隔肽，并将其分离为25kDa的α-亚基和58kDa的β-亚基。一个α-亚基和一个β-亚基通过疏水相互作用结合，形成大约83kDa的具有酰化酶活性的异二聚体。如技术人员所公知的，编码N-末端甲硫氨酸的第一个密码子(ATG)是在原核生物中进行蛋白合成期间翻译起始所必需的。甲硫氨酸在翻译后被去除。
根据本发明的编码突变体II型β-内酰胺酰化酶或α-亚基或β-亚基的多核苷酸可以是编码根据本发明的合适的氨基酸序列的任何多核苷酸。或者，本发明的多核苷酸可包含这样的编码序列，其中，针对多种氨基酸的密码子使用源自Pseudomonas中的密码子使用。例如，可对密码子使用加以改变，使其适合将或已用编码改变的II型β-内酰胺酰化酶的DNA片段转化的特定宿主细胞的密码子使用。
在第三个方面，本发明提供了包含前文定义的本发明多核苷酸的表达载体或表达盒。
在第四个方面，本发明提供了经转化的宿主细胞，其是用本发明的多核苷酸或本发明的表达载体或表达盒转化过的。经转化的宿主细胞可用于生产本发明的突变体II型β-内酰胺酰化酶。
用于生产本发明的突变体II型β-内酰胺酰化酶的宿主细胞优选是本领域已知能细胞外或细胞内高效生产蛋白或酶的那些宿主细胞，例如，微生物，例如真菌、酵母和细菌。优选的宿主细胞的例子包括但不限于下述属：Aspergillus(例如A.niger、A.oryzea)、Penicillium(例如P.emersonii、P.chrysogenum)、Saccharomyces(例如S.cerevisiae)、Kluyveromyces(例如K.lactis)、Bacillus(例如B.subtilis、B.licheniformis、B.amyloliquefaciens)、Escherichia(E.coli)、Streptomyces(例如S.clavuligerus)、Pseudomonas。
在第五个方面，本发明提供了生产本发明的突变体II型β-内酰胺酰化酶的工艺，所述工艺包括在有益于生产突变体扩环酶的条件下培养经转化的宿主细胞，以及可选地，回收所述突变体扩环酶。
在第六个方面，本发明提供了生产感兴趣的脱酰基化β-内酰胺化合物的工艺，所述工艺包括使用本发明的突变体II型β-内酰胺酰化酶对感兴趣的β-内酰胺化合物的酰化前体进行脱酰基化的步骤。感兴趣的脱酰基化β-内酰胺化合物可以是天然存在的青霉素或头孢菌素的衍生物，例如，6-APA、7-ACA、7-ADCA、7-ADAC、7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢霉素核-4-羧酸(例如WO2004/106347)等。优选地，感兴趣的脱酰基化β-内酰胺化合物是7-ADCA或7-ACA，最优选是7-ADCA。感兴趣的β-内酰胺化合物的酰化前体可具有属于二羧酸构成的组的酰基。优选的酰基是琥珀酰基、戊二酰基、己二酰基、α-酮己二酰基和氨基己二酰基。更优选的是己二酰基和氨基己二酰基，高度优选的是己二酰基。优选的感兴趣的β-内酰胺化合物的酰化前体是己二酰-7-ADCA、己二酰-7-ACA、氨基己二酰-7-ADCA和氨基己二酰-7-ACA，后者作为CEFC已知；最优选的是己二酰-7-ADCA。
本发明用于生产感兴趣的脱酰基化β-内酰胺化合物的工艺可以以分批模式进行，其中，突变体II型β-内酰胺酰化酶在包含感兴趣的β-内酰胺化合物的酰化前体的溶液中以溶解状态使用。
更优选地，突变体II型β-内酰胺酰化酶作为被固定的形式使用。其好处在于，完成脱酰基化反应后可回收突变体II型β-内酰胺酰化酶，并将其重新用于进一步的脱酰基化反应。以这种方式，使用突变体II型β-内酰胺酰化酶的成本可显著降低，由此增加脱酰基化的经济吸引力。用于脱酰基化反应的条件以及对酶的固定是现有技术已知的(例如，Kallenberg，A.I.etal.Adv.Synth.Catal.(2005)，347，905-926)。
在第七个方面，本发明涉及本发明的突变体II型β-内酰胺酰化酶用于生产感兴趣的脱酰基化β-内酰胺化合物的工艺中的用途，所述工艺包括对感兴趣的β-内酰胺化合物的酰化前体进行脱酰基化的步骤。感兴趣的脱酰基化β-内酰胺化合物可以是天然存在的青霉素或头孢菌素的衍生物，例如，6-APA、7-ACA、7-ADCA、7-ADAC、7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢霉素核-4-羧酸等。优选地，感兴趣的脱酰基化β-内酰胺化合物是7-ADCA或7-ACA，最优选是7-ADCA。感兴趣的β-内酰胺化合物的酰化前体可具有属于二羧酸构成的组的酰基。优选的酰基是琥珀酰基、戊二酰基、己二酰基、α-酮己二酰基和氨基己二酰基。更优选的是己二酰基和氨基己二酰基，高度优选的是己二酰基。最优选的感兴趣的β-内酰胺化合物的酰化前体是己二酰-7-ADCA、己二酰-7-ACA、己二酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢霉素核-4-羧酸、α-酮己二酰-7-ADCA、α-酮己二酰-7-ACA、氨基己二酰-7-ADCA和氨基己二酰-7-ACA，后者作为CEFC已知。本发明用于生产感兴趣的脱酰基化β-内酰胺化合物的工艺可以以分批模式进行，其中，突变体II型β-内酰胺酰化酶在包含感兴趣的β-内酰胺化合物的酰化前体的溶液中以溶解状态使用。更优选地，突变体II型β-内酰胺酰化酶以被固定的形式使用。
材料和方法
制备酰化酶
将具有wt基因或突变体基因的质粒转入E.coli Top 10细胞(Invitrogen)。使用20ml 2xTY培养基(含有50μg/ml Zeocine)，在37℃和280rpm下，在100ml瓶中接种细胞。24小时后，以1∶1000向具有100ml 2xTY培养基、50μg/ml Zeocine和0.05％阿拉伯糖的瓶中接种50μl培养物，在25℃和280rpm下培养。对培养物进行离心，冷冻于-20℃。为制备不含细胞的提取物，将沉淀团重新悬浮于提取缓冲液(50mM Tris/HCL、0.1mg/ml DNAsel、2mg/ml Lysozyme、10mM DTT(二硫苏糖醇)、5mM MgSO4)中，并进行孵育。30分钟后，对提取物进行离心，含有酰化酶活性的上清液被用于进行活性测量。
使用SDS-PAGE凝胶电泳和分析性HPLC尺寸排除色谱(在TSK3000SWx1柱上，用0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.0)作为洗脱剂来进行)来测定酰化酶含量。应用的色谱条件：流速1.0ml/分钟，在280nm处检测。通过比较观察到的酰化酶的峰的面积，可对不同样品的蛋白含量进行比较。使用154350(M-1.cm-1)的摩尔消光系数，从OD280来计算酰化酶蛋白含量。HPLC色谱有其它峰的情况下，针对其它峰的作用对样品的E280值加以校正。
纯化
将来自100ml培养物的细胞沉淀团重新悬浮于1ml 20mM Tris pH 8中。在冰上以10μ的振幅进行9×10秒的超声波处理(Soniprep 150I-BU03)后，在微离心管中于14000rpm和4℃下对细胞悬浮液进行5分钟的离心。用0.1M HCl将上清液调节为pH 5.3-5.4之后，对其进行离心，以除去沉淀。随后，用NaOH将上清液滴定回pH＝8。大约100-400μl被加到1ml MonoQ柱(用含有10％NaCl的20mM Tris pH8平衡过)上。洗脱期间按照下文所述来混合缓冲液A(20mM Tris pH8)和缓冲液B(20mM Tris pH8+1M NaCl)：0-1分钟，10％B/90％A；1-5分钟，20％B/80％A；5-9分钟，40％B/60％A；9-12分钟，60％B/40％A；12-15分钟，100％B。收集含有酰化酶活性的峰级分，加到凝胶过滤柱TSKGel3000SWx1上，该柱已用100mM磷酸钠缓冲液pH 7平衡过。收集峰级分，储藏起来以备后用。
试剂
可按照WO9848037所述，通过酶促合成，从己二酸和7-ADCA来制备己二酰-7-ADCA。此外，可按照Shibuya et al.在Agric.Biol.Chem.，1981，45(7)，1561-1567中所述，但从己二酸酐开始(代替戊二酸酐)，通过化学合成来制备己二酰-7-ADCA。
在合适的缓冲液中制备己二酰-7-ADCA底物的8％(w/v)贮液，用4N NaOH将其调节至想要的pH。
通过将200mg 4-(二甲基氨基)-苯甲醛(p-DMBA)溶解于100ml柠檬酸(溶解于1升乙醇中的315.5g柠檬酸单水合物)中，来新鲜制备颜料试剂。
在0.2M CHES缓冲液(2-(N-环己基氨基)乙磺酸)中，于pH 8.0至pH 10.0的范围内进行活性测量，如果需要的话，用4N HCl或4N NaOH将所述缓冲液调节至想要的pH。
测量酰化酶活性
将180μl合适的缓冲液与200μl处于相应缓冲液中的底物贮液和20μl酶溶液混合，在想要的温度下孵育20分钟，如无特别指明的话，通常是在室温下孵育。加入600μl颜料试剂来停止反应。室温下10分钟后，在415nm处测量吸光度。通过在加入酶之前就向检验体系中加入颜料溶液来进行空白测量。酰化酶活性被计算为每分钟光密度(OD)的增加(δOD/分钟)。为计算绝对活性，使用每升0.1至1g 7-ADCA范围内的7-ADCA校正线。
KM测定和pH曲线。
按照所述的检验来进行KM测定。但是，己二酰-7-ADCA浓度在0.5至4％(w/v)己二酰-7-ADCA之间变化。
实施例
实施例1 SE83 ACYii突变体的酰化酶活性
用己二酰-7-ADCA作为底物，在pH＝8.5和pH＝9.5时测量突变体的酰化酶活性。结果示于表2中。
表2：野生型和突变体酰化酶对己二酰-7-ADCA的相对活性，将pH＝8.5时野生型的活性设定为1。括号中是pH＝9.5时相对于野生型活性的活性。在室温下进行检验。在存在4％(w/w)己二酰-7-ADCA时测量起始速率。
Figure S2006800501155D00181
在pH＝8.5以及pH＝9.5时，突变体的活性较之野生型酰化酶显著更高。此外，当将pH＝9.5时的活性与pH＝8.5时的活性相比时，明显可见，突变体酰化酶在pH 9.5的活性较之野生型相对更高。突变体的pH活性曲线向更高的pH迁移，这使得这些突变体特别适合在升高的pH下使用。这点特别重要，因为转化产率将在更高的pH下增加，这是由于热力学平衡更进一步朝向完成水解反应的方向。
鉴于在己二酰-7-ADCA向7-ADCA和己二酸转化的过程中，后者的浓度将增加，因此，产物抑制可能会降低在初始速率条件下测量到的突变体的提高效果。因此，在存在1.5％(w/v)的己二酸时，测量野生型和突变体酰化酶的活性。表3显示，在这些条件下，在pH＝8.5以及pH＝9.5时，突变体的活性较之野生型也显著更高。这些突变体的pH活性曲线没有迁移到更高的pH。
使用己二酰-7-ADCA作为底物，在pH＝8.6、pH＝9.1和pH＝9.5时，存在1.5％(w/v)的己二酸时，测定野生型和突变体酰化酶的酰化酶活性。结果如表4所示。
表4显示，在pH＝8.6、pH＝9.1和pH＝9.5时，突变体的活性较之野生型酰化酶显著更高。当将pH＝9.1时的活性提高与pH＝8.6时的活性提高相比时，明显可见，突变体酰化酶在pH 9.1的活性较之野生型提高更显著。突变体的pH活性曲线向更高的pH迁移，这使得这些突变体特别适合在升高的pH下使用。当将pH＝9.5与pH＝8.6相比时，大多数突变体酰化酶的活性相对野生型而言在pH＝9.5时仍比pH＝8.5时提高更多。
表3：野生型和突变体酰化酶对己二酰-7-ADCA的相对活性，将pH＝8.5时野生型的活性设定为1。括号中是pH＝9.5时相对于野生型活性的活性。在室温下进行检验。在存在4％(w/w)己二酰-7-ADCA时测量起始底物浓度。在存在1.5％(w/v)己二酸时测量起始活性。
Figure S2006800501155D00191
表4：野生型和突变体酰化酶对己二酰-7-ADCA的相对活性，将pH＝8.6时野生型的活性设定为1。括号中是分别在pH＝9.1和pH＝9.5时相对于野生型活性的活性。在室温下进行检验。在存在2％(w/w)己二酰-7-ADCA时测量起始底物浓度。在存在1.5％(w/v)己二酸时测量起始活性。
Figure S2006800501155D00201
实施例2 通过对SE83 ACYii突变体的K M 测量指示底物亲和性
表5显示了针对多种突变体测得的相对于野生型的KM值。Michaelis常数KM代表当酶以其最大速度的50％运作时的底物浓度。在低于KM的底物浓度下，酶会更慢，而在高于KM的底物浓度下，酶会运作得更快，直到在高底物浓度下酶完全饱和并且以最大速度运作。在酶促转化的终点(此时底物耗尽)，低KM是关键的，以保持相当的活性。在突变体的相对KM值＜1.00时，这表示在更低的底物浓度(例如在转化终点)时，突变体相对野生型而言在保持相对较高的活性方面具有优势。
表5：以相对KM值表示的相对底物亲和性。使用前文所述的检验来进行KM测定。己二酰-7-ADCA的浓度在0.5至4％己二酰-7-ADCA之间变化。
Figure S2006800501155D00221
实施例3 被固定的SE83 ACYii突变体的酰化酶活性
按照WO97/04086所述，使用明胶和壳多糖作为胶凝剂，戊二醛作为交联剂，来进行固定。通过在温度和pH受控的100ml反应器中进行对己二酰-7-ADCA的完全水解，来测量被固定的野生型酰化酶和突变体酰化酶的表现。以3.2％己二酰-7-ADCA进行实验。以使得能在想要的条件下在120分钟内获得至少90％的转化的方式，来提供被固定的酶。在pH＝8.8和30℃以及pH＝9.5和40℃下进行转化。用同样的量(重量)的野生型和突变体酰化酶来进行转化。反应期间，通过加入1M KOH溶液使pH保持恒定。被固定的酰化酶的活性被表示为每分钟的KOH ml数。在图2a和图2b中，显示了作为转化率函数的速率(其被表示为每分钟的ml KOH)。
在pH＝8.8和30℃时取六次的平均。转化的最初30％的数据不包括在内，因为系统还没有完全稳定，使得数据大为发散。在pH＝9.5和40℃时取两次的平均。因此，变动更大。但是，计算出的斜率给出了对活性的良好指示。图2a和图2b显示，整个转化期间，突变体酰化酶的活性都显著更高。
通过用同一批被固定的酰化酶，测量随后20次180分钟的转化率，来测定被固定的酰化酶的稳定性。测量每次孵育中转化的30至50％之间的速率。被固定的酰化酶的残余活性在本文中被定义为相对于第一次孵育而言在第20次孵育时的活性。
表6概括了结果。观察到，特别是在能使水解反应的动力学平衡迁移为更完全的转化的条件下(高温和高pH下)，经突变酰化酶的稳定性较之野生型显著提高。
作为经突变的酰化酶的这种更高的水解活性和更高的稳定性的结果，每克经突变的酰化酶的生产能力也相当大地增加。
表6：在指出的条件下进行20次转化后的残余活性。
Figure S2006800501155D00231
Figure IYZ000004253186700011
Figure IYZ000004253186700021
Figure IYZ000004253186700041
Figure IYZ000004253186700051
Figure IYZ000004253186700061
Figure IYZ000004253186700071
Figure IYZ000004253186700091
Figure IYZ000004253186700101
Figure IYZ000004253186700111
Figure IYZ000004253186700121

Claims (13)

1.突变体II型β-内酰胺酰化酶，其是具有II型β-内酰胺酰化酶活性的模型多肽的变体，其中，
所述突变体β-内酰胺酰化酶较之具有β-内酰胺酰化酶活性的所述模型多肽而言，针对己二酰-7-ADCA的体外β-内酰胺酰化酶活性提高了至少1.5倍，以及，
其中，所述突变体II型β-内酰胺酰化酶通过用选自L161T、L161S+E442G、L161S+H589R、L161G、L161G+E10K、L161S、L161T、L161T+S29N、L161T+S29N+H274L、L161T+H274L、L161T+I314V、L161T+V726I、L161T+Y706G、L161T+Y706G+S29N、L161T+S29N+P514Q、L161T+S29N+H274L+I314Q+N694T、L161T+S29N+R280Q+I314V+A645T+V726I、L161T+S29F+H274L+V726I、L161T+H274I+R280Q+I314V、L161T+H274L+R589H、L161T+H274C+Y760G或L161S+H274T+R280Q+R514Q+V726I的突变来修饰SEQ ID NO：1而获得，其中采用了SEQ ID NO：1所示的Pseudomonas的SE83-acyII酰化酶的氨基酸序列的氨基酸位置编号，以及
其中，所述模型多肽是SEQ ID NO：1所示的Pseudomonas的SE83-acyII酰化酶。
2.编码权利要求1所述的突变体II型β-内酰胺酰化酶的多核苷酸。
3.包含权利要求2所述的多核苷酸的表达载体或表达盒。
4.经权利要求2所述的多核苷酸或权利要求3所述的表达载体或表达盒转化的宿主细胞。
5.生产权利要求1所述的突变体II型β-内酰胺酰化酶的工艺，所述工艺包括在有益于生产突变体II型β-内酰胺酰化酶的条件下培养如权利要求4所述的宿主细胞的步骤，以及可选地，回收所述多肽的步骤。
6.生产脱酰基化β-内酰胺化合物的工艺，所述工艺包括使用权利要求1所述的突变体II型β-内酰胺酰化酶对β-内酰胺化合物的酰化前体进行脱酰基化的步骤。
7.如权利要求6所述的工艺，其中，所述脱酰基化β-内酰胺化合物是6-APA、7-ACA、7-ADCA、7-ADAC或7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢霉素核-4-羧酸。
8.如权利要求6或7所述的工艺，其中，所述β-内酰胺化合物的酰化前体具有以二羧酸为酰基基元的酰基。
9.如权利要求6或7所述的工艺，其中，所述突变体II型β-内酰胺酰化酶以被固定的形式使用。
10.如权利要求1所述的突变体II型β-内酰胺酰化酶用于对β-内酰胺化合物的酰化前体进行脱酰基化的用途。
11.如权利要求10所述的用途，其中所述β-内酰胺化合物是7-ADCA或7-ACA。
12.如权利要求10或11所述的用途，其中，所述β-内酰胺化合物的酰化前体具有以二羧酸为酰基基元的酰基。
13.权利要求10或11所述的用途，其中，所述突变体II型β-内酰胺酰化酶以被固定的形式使用。
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