KR20080084986A

KR20080084986A - 돌연변이 ｉｉ형 베타-락탐 아실라제

Info

Publication number: KR20080084986A
Application number: KR1020087015507A
Authority: KR
Inventors: 반 더 얀 메츠케 라안; 리차드 커크만; 빌렘 비즐레벨트; 비앙카 질레센
Original assignee: 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
Priority date: 2005-12-28
Filing date: 2006-12-28
Publication date: 2008-09-22
Also published as: CN101351549A; WO2007073947A2; EP1974029A2; EP2851423B1; BRPI0621278A2; HK1128305A1; ES2571865T3; WO2007073947A3; CN101351549B; EP2851423A1

Abstract

본 발명은 II형 베타-락탐 아실라제 활성을 갖는 모델 폴리펩티드의 변이체인 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제를 기술하며, 이때 상기 돌연변이 베타-락탐 아실라제는 베타-락탐 아실라제 활성을 갖는 모델 폴리펩티드와 비교하여 아디필-7-ADCA에 대해 1.5배 이상 개선된 시험관내 베타-락탐 아실라제 활성을 갖는다.

Description

돌연변이 ＩＩ형 베타-락탐 아실라제{MUTANT TYPE II BETA-LACTAM ACYLASES}

본 발명은 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제, 상기 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 미생물, 및 돌연변이 II형 베타 락탐을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 돌연변이 II형 베타 락탐 아실라제를 사용하여 주목되는 탈아실화 베타-락탐 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

베타-락탐 항생물질은 오래된 임상 용도의 역사를 갖는 항생물질 화합물의 가장 중요한 군을 이룬다. 상기 군에서, 두드러지는 것은 페니실린 및 세팔로스포린이다. 페니실린은 페니실리움(Penicillium)(예를 들면, 페니실리움 크리소게넘(P. chrysogenum))과 같은 다양한 섬유상 진균에 의해 천연적으로 생성된다. 세팔로스포린은 아크레모늄(Acremonium)(예를 들면, 아크레모늄 크리소게넘(A. chrysogenum)) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)(예를 들면, 스트렙토마이세스 클라불리게루스(S. clavuligerus))와 같은 다양한 미생물에 의해 천연적으로 생성된다.

전통적인 균주 개량 기술의 결과, 페니실리움 크리소게넘 및 아크레모늄 크리소게넘에서의 항생물질 생산 수준은 과거 수십년에 비해 현저하게 증가되었다. 페니실린 및 세팔로스포린을 유도하는 생합성 경로에 대한 지식이 증가하고 재조합 DNA 기술이 개발됨에 따라, 생산 균주의 개량을 위한 새로운 도구를 이용할 수 있게 되었다.

문헌 [Ingolia and Queener, Med Res Rev, 9:245-264, 1989](생합성 경로 및 효소) 및 [Aharonowitz, Cohen and Martin, Ann Rev Microbiol, 46:461-495, 1992](유전자 클로닝)에서 발견할 수 있는 바와 같이, 베타-락탐 생합성에 수반되는 대부분의 효소들이 동정되었고 그들의 상응하는 유전자가 클로닝되었다.

페니실리움 크리소게넘에서 페니실린 생합성의 처음 두 단계는 3개 아미노산 L-5-아미노-5-카복시펜타노산(L-알팔파-아미노아디프산)(A), L-시스테인(C) 및 L-발린(V)이 트라이펩티드 LLD-ACV로 축합된 후 상기 트라이펩티드가 환화되어 아이소페니실린 N을 생성하는 것이다. 상기 화합물은 전형적인 베타-락탐 구조를 함유한다. 세 번째 단계는 L-5-아미노-5-카복시펜타노산의 친수성 측쇄가 효소 아실트랜스퍼라제(AT)의 작용에 의해 소수성 측쇄로 치환되는 것을 포함한다.

EP-A-0448180 호에서는, AT에 의해 매개된 효소적 교환 반응이 세포성 세포소기관인 미소체(microbody) 내부에서 일어나는 것으로 기술하였다. 데아세톡시세팔로스포린 C 신타제(EC 1.14.20.1 - DAOCS, 본원에서 익스팬다제(expandase)로도 또한 나타냄)를 발현하는 비-전구화 페니실리움 크리소게넘 형질전환체에 의해 충분한 양의 데아세톡시세팔로스포린 C(DAOC)가 생성될 수 있다는 관찰결과는 페니실 리움 크리소게넘 중에, 익스팬다제의 천연 기질인 페니실린 N이 상당량 존재함을 시사한다[Alvi et al., J. Antibiot, 48:338-340, 1995]. 그러나, DAOC의 D-알파-아미노-아디필 측쇄는 용이하게 제거할 수 없다.

세팔로스포린은 페니실린보다 훨씬 더 고가이다. 한가지 이유는 일부 세팔로스포린(예를 들면, 세팔렉신)이 많은 화학적 전환에 의해 페니실린으로부터 제조되기 때문이다. 또 다른 이유는, 지금까지 D-알파-아미노-아디필 측쇄를 갖는 세팔로스포린만이 발효될 수 있었다는 것이다. 이와 관련하여 단연 가장 중요한 출발 물질인 세팔로스포린 C는 어떤 pH에서도 물에 매우 가용성이므로, 복잡하고 고가인 컬럼 기술을 사용하는 길고 비용이 많이 드는 분리 공정을 시사한다. 상기 방식으로 수득된 세팔로스포린 C는 많은 화학적 및 효소적 전환반응에 의해 치료적으로 사용되는 세팔로스포린으로 전환되어야 한다.

중간체 7-아미노-데아세톡시세팔로포란산(7-ADCA)을 제조하기 위해 현재 산업계에서 선호되는 방법은 페니실린 G의 확장 및 유도체화를 유도하는 복잡한 화학적 단계들을 수반한다. 7-ADCA를 생성하기 위해 필수적인 화학적 단계 중 하나는 5-원 페니실린 고리 구조가 6-원 세팔로스포린 고리 구조로 확장되는 것을 포함한다(예를 들면, US 4,003,894 호 참조). 상기 복잡한 화학적 과정은 둘 다 고가이고 환경에 유해하다. 결과적으로, 상기 화학적 과정을, 바람직하게는 발효동안 효소적 촉매반응과 같은 효소 반응으로 대체할 필요성이 크다. 화학적 확장 과정을 생물학적 과정으로 대체하는데 있어 핵심은 세팔로스포린 생합성 경로에서의 중심 효소인 익스팬다제이다. 세균 스트렙토마이세스 클라불리게루스로부터의 익스팬다 제 효소는, 일부 경우에서, 페니실린 고리 확장을 수행하는 것으로 밝혀졌다. 페니실리움 크리소게넘에 도입되는 경우, 상기 효소는 문헌 [Cantwell et al., Proc R Soc Lond B, 248:283-289, 1992]에 기술된 바와 같이, 페니실린 고리 구조를 세팔로스포린 고리 구조로 전환시킬 수 있다. 익스팬다제 효소는 페니실린 N의 5-원 티아졸리딘 고리가 DAOC의 6-원 다이하이드로티아진 고리로 확장되는 것을 촉진하기 때문에, 상기 효소는 화학 과정의 고리 확장 단계를 대체하기 위한 필연적인 후보임은 물론이다. 유감스럽게도, 상기 효소는 세팔로스포린 생합성 경로의 페니실린 N 중간체에 작용하지만, 페니실린 V 또는 페니실린 G와 같이 페니실리움 크리소게넘에 의해 생성되는 바와 같은 용이하게 입수가능한 저렴한 페니실린에는 작용하지 않거나 매우 불충분하게 작용한다. 페니실린 N은 상업적으로 시판하지 않으며, 확장되었을 때조차도 그의 D-알파-아미노-아디필 측쇄는 페니실린 아실라제에 의해 용이하게 제거될 수 없다.

익스팬다제 효소는 특정한 측쇄를 갖는 페니실린을 상응하는 7-ADCA 유도체로 확장시킬 수 있는 것으로 보고되었다. 익스팬다제의 이러한 특징은 WO 93/05158 호, WO 95/04148 호 및 WO 95/04149 호에 개시된 바와 같은 기술에서 개발되었다. 상기 개시내용에서는, 페니실린 G의 7-ADCA로의 통상적인 화학적 시험관내 전환반응이 익스팬다제 유전자로 형질전환된 재조합 페니실리움 크리소게넘 균주에서 특정 6-아미노페니실란산(6-APA) 유도체의 생체내 전환반응으로 대체되었다. 보다 특히, WO 93/05158 호는 공급원료로서 페니실리움 크리소게넘에서의 아실트랜스퍼라제 효소의 기질인 아디필 측쇄(아디필로도 지칭됨)와 함께, 페니실리 움 크리소게넘에서 익스팬다제 효소의 생체내 사용을 교지하고 있다. 이에 의해 아디필-6-APA가 생성되고, 이것은 페니실리움 크리소게넘 균주내에 도입된 익스팬다제 효소에 의해 전환되어 아디필-7-ADCA를 생성하고, 이것은 진균 세포에 의해 주위 매체 중으로 분비된다.

후속 단계에서, 상응하는 7-ADCA 유도체의 측쇄는 화학적으로, 또는 아실라제 효소에 의해 효소적으로 분리되어 7-ADCA 및 상응하는 측쇄를 생성할 수 있다. 다양한 유형의 미생물들이 발효에 의해 수득된 베타-락탐 유도체의 탈아실화에 유용한 아실라제 생성 균주로서 문헌에 제시되었다. 상기 아실라제-생성 미생물의 예는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 클루이베라 시트로필라(Kluyvera citrophila), 프로테우스 레트게리(Proteus rettgeri), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 알칼리제네스 페칼리스(Alcaligenes faecalis), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실러스 스페리쿠스(Bacillus sphaericus) 및 아트로박터 비스코서스(Arthrobacter viscosus) 종의 특정 균주들이다.

문헌에 따르면, 그의 분자 구조 및 기질 특이성을 기준으로 여러 유형의 아실라제가 예상될 수 있다[Vandamme E.J. Penicillin acylases and beta-lactamases, In: "Microbial Enzymes and Bioconversions", E.H. Rose(Ed.), Economic Microbiology, 5, 467-552, 1980, Acad. Press, New York].

I-형 아실라제는 페니실린 V에 특이적이다. 이들 효소는 각각 35 kDa의 분자량을 갖는 4개의 동일한 서브유니트로 이루어진다. 바실러스 스페리쿠스로부터 클로닝된 유전자의 완전한 뉴클레오티드 서열이 보고되었다[Ollson A., Appl. Environm. Microb., 203, 1976].

II-형 아실라제는 모두 공통 분자 구조를 공유한다: 이들 효소는 소 알파-서브유니트(20 내지 25 kDa) 및 거대 베타-서브유니트(60 내지 65 kDa)로 이루어진 헤테로이량체이다. 기질 특이성과 관련하여, II-형 아실라제는 2개의 군으로 더 나뉠 수 있다.

IIA-형 아실라제는 페니실린 G에 매우 특이적이므로, 일반적으로 페니실린 아실라제로 알려져 있다. 일반적으로, 이들은 아마이드기의 질소 원자에 인접한 잔기(이것은 세펨기, 페넴기, 아미노산 등일 수 있다)에 별로 특이적이지 않지만, 기질 특이성은 기질의 아실 잔기에 존재한다. 상기 아실 잔기는 매우 소수성이어야 하며, 바람직하게는 벤질 또는 (단쇄) 알킬이다. IIA-형 아실라제에 의해 가수분해되지 않는 기질의 예는 아실 잔기로서 다이카복실산을 갖는 것들: 석시닐, 글루타릴, 아디필, 및 CefC의 측쇄인 아미노아디필이다. IIA-형 아실라제의 예는 에스케리키아 콜라이, 클루이베라 시트로필라, 프로테우스 레트게리 및 알칼리제네스 페칼리스로부터의 효소들이다.

IIB-형 아실라제는 아실 잔기로서 석시닐, 글루타릴, 아디필 및 α-케토아디필, 및 심지어 CefC를 갖는 세팔로스포린(데스아세톡시-유도체 포함)을 매우 제한된 정도로 가수분해시킬 수 있는 것으로 보고되었다. IIB-형 아실라제의 기는 다시 아미노산 서열 상동성을 기준으로 2개의 군으로 분류될 수 있다. 이들 부분군은 여기에서 SY77-군 및 SE83-군으로 정의되며, 슈도모나스 SY77 및 슈도모나스 SE83-acyII 각각으로부터의 아실라제 다음에 명명된다.

마츠다(Matsuda) 등[J. Bacteriol, 163, 1222, 1985]은 SY77-아실라제를 암호화하는 유전자를 클로닝하고 서열화하였으며, 상기 효소가 글루타릴-7ACA에 대해서는 활성이지만 석시닐-7ACA 및 아디필-7ACA에 대해서는 훨씬 덜 활성임을 입증하였다. SY77-전구체에 대한 3-차원 구조는 알려져 있다[J. Biol. Chem., 277, 2823, 2002].

나중에, 마츠다 등[J. Bacteriol., 169, 5815, 1987 and J. Bacteriol., 169, 5821, 1987]은 SE83-acyII 아실라제를 암호화하는 유전자를 클로닝하고 서열화하였으며, 상기 효소가 글루타릴-7ACA, 아디필-7ACA, 석시닐-7ACA 및 CEFC(세팔로스포린 C)(감소하는 순서로)에 대해 활성임을 입증하였다. SE83에 관련된 모든 연구는 7-ACA의 유도체를 가수분해시키는 효소의 능력, 특히 CEFC를 가수분해시키는 능력에 초점을 맞추었다.

WO 91/16435 호에서는, SY77과 SE83-acyII 사이의 아미노산 상동성이, 아실라제의 알파-서브유니트에 대해 약 25% 및 베타-서브유니트에 대해 28%로 매우 낮음을 밝혔다.

WO 95/12680 호는 SE83-acyII에 대해 약 94% 상동성이고 그의 CEFC-아실라제 활성에 대해 시험한, N176으로 명명된, 브레분디모나스 디미누타(Brevundimonas diminuta)로부터의 또 다른 SE83-군 아실라제를 개시하고 있다. SE83-군의 세 번째 구성원은 브레분디모나스 디미누타 V22로부터의 V22이다. 상기 세가지 아실라제의 아미노산 서열은 문헌 [Aramori et al., Journal of Fermentation and Bioengineering, 72, 232-243, 1991]에 개시되어 있다. 표 I은 SE83-군의 다양한 IIB-형 아실라제의 아미노산 서열의 전장(full-length) 서열 동일성 행렬을 나타낸 것이다.

IIB-형 아실라제	SE83acyii	N176	V22
SE83acyii	100	94	93
N176	94	100	98
V22	93	98	100

현재의 몇 개의 아실라제의 CEFC-아실라제 활성을 증가시키기 위해 여러 가지가 시도되었다: WO 2005/014821 호는 SE83-아실라제의 돌연변이체를 개시하고 있고, EP-A-1553175 호는 N176-아실라제의 돌연변이체를 개시하고 있는데, 이들은 모두 CEFC-아실라제 활성을 개선하기 위한 것이다. 인용된 참조문헌중 어느 것도 아디필-7-ADCA와 같은 주목되는 다른 아실화 베타-락탐 화합물과의 탈아실화 반응의 개선에는 초점을 맞추지 않았다. 그러므로, 아디필-7-ADCA에 대해 개선된 탈아실화 활성을 가지며, 예를 들면, 형질전환된 페니실리움 균주의 발효에 의해 생성된 아디필-7-ADCA로부터 7-ADCA를 생성하기 위한 공정에 유리하게 사용될 수 있는 아실라제가 여전히 절박하게 요구된다.

도 1은 슈도모나스 SE83으로부터의 II형 베타-락탐 아실라제 SE83-acyii(서열번호 1), 브레분디모나스 디미누타 N-176으로부터의 N176(서열번호 2) 및 브레분디모나스 디미누타 V22로부터의 V22(서열번호 3)의 아미노산 서열의 다중 정렬을 나타낸 것이다.

도 2는 pH 8.8 및 30 ℃에서(도 2a), 및 pH 9.5 및 40 ℃에서(도 2b)의 고정화된 아실라제에 의한 아디필-7ADCA의 전환율을 나타낸 것이다. 슈도모나스 SE83 ACYii 야생형 고정화 아실라제(실선) 및 돌연변이체 L161T 고정화 아실라제(점선). 속도(Y-축상의 ml KOH/분)가 전환율(%)(X-축상의 %)의 함수로 플롯팅되어 있다.

첫 번째 태양으로, 본 발명은 II형 베타-락탐 아실라제 활성을 갖는 모델 폴리펩티드의 변이체인 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제를 제공하며, 이때 상기 돌연변이 베타-락탐 아실라제는 베타-락탐 아실라제 활성을 갖는 모델 폴리펩티드와 비교하여 아디필-7-ADCA에 대해 1.5배 이상 개선된 시험관내 베타-락탐 아실라제 활성을 갖는다. 아디필-7-ADCA에 대한 시험관내 베타-락탐 아실라제 활성의 측정은 물질 및 방법 부분에 상세히 기술되어 있다. 보다 바람직하게, 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제의 아디필-7-ADCA에 대한 시험관내 베타-락탐 아실라제 활성은 2배 이상, 보다 바람직하게는 2.5배 이상, 보다 바람직하게는 3배 이상, 보다 바람직하게는 4배 이상, 보다 바람직하게는 5배 이상, 보다 바람직하게는 6배 이상, 보다 바람직하게는 7배 이상, 보다 바람직하게는 8배 이상, 보다 바람직하게는 9배 이상, 보다 바람직하게는 10배 이상, 보다 바람직하게는 11배 이상 개선된다.

본 발명에 있어서, "변형된 또는 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제"란 천연 공급원으로부터는 수득되지 않고, 그에 대한 아미노산 서열이 천연 II형 베타-락탐 아실라제 효소의 완전 아미노산 서열과 상이한, 아실라제 활성을 갖는 임의의 효소를 의미한다.

본 발명은 또한 II형 베타-락탐 아실라제 활성을 갖는 모델 폴리펩티드의 변이체인 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제를 제공하는데, 이때 상기 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제는, 슈도모나스의 SE83-acyII 아실라제의 아미노산 서열(서열번호 1)의 아미노산 위치 번호를 이용하여, 적어도, 161, 270, 296, 442 및 589번 위치로 이루어진 군에서 선택되거나, 또는 10, 29, 274, 280, 314, 514, 645, 694, 706 및 726번 위치로 이루어진 군에서 선택되거나, 또는 10, 29, 161, 270, 274, 280, 296, 314, 442, 514, 589, 645, 694, 706 및 726번 위치로 이루어진 군에서 선택되거나, 또는 10, 29, 270, 274, 280, 442, 514, 589, 645, 694 및 726번 위치로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 위치에서 변형되었다.

보다 바람직하게, 본 발명은 II형 베타-락탐 아실라제 활성을 갖는 모델 폴리펩티드의 변이체인 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제를 제공하는데, 이때 상기 돌연변이 베타-락탐 아실라제는 베타-락탐 아실라제 활성을 갖는 모델 폴리펩티드와 비교하여, 1.5배 이상, 보다 바람직하게는 2배 이상, 보다 바람직하게는 2.5배 이상, 보다 바람직하게는 3배 이상, 보다 바람직하게는 4배 이상, 보다 바람직하게는 5배 이상, 보다 바람직하게는 6배 이상, 보다 바람직하게는 7배 이상, 보다 바람직하게는 8배 이상, 보다 바람직하게는 9배 이상, 보다 바람직하게는 10배 이상, 보다 바람직하게는 11배 이상 개선된, 아디필-7-ADCA에 대한 시험관내 베타-락탐 아실라제 활성을 가지며, 상기 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제는, 슈도모나스의 SE83-acyII 아실라제의 아미노산 서열(서열번호 1)의 아미노산 위치 번호를 이용하여, 적어도, 161, 270, 296, 442 및 589번 위치로 이루어진 군에서 선택되거나, 또는 10, 29, 274, 280, 314, 514, 645, 694, 706 및 726번 위치로 이루어진 군에서 선택되거나, 또는 10, 29, 161, 270, 274, 280, 296, 314, 442, 514, 589, 645, 694, 706 및 726번 위치로 이루어진 군에서 선택되거나, 또는 10, 29, 270, 274, 280, 442, 514, 589, 645, 694 및 726번 위치로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 위치에서 변형되었다.

본 발명은 바람직하게는 II형 베타-락탐 아실라제 활성을 갖는 모델 폴리펩티드의 변이체인 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제를 제공하는데, 이때 상기 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제는, 슈도모나스의 SE83-acyII 아실라제의 아미노산 서열(서열번호 1)의 아미노산 위치 번호를 이용하여, 적어도 10번 위치에서 또는 적어도 29번 위치에서, 적어도 161번 위치에서 또는 적어도 270번 위치에서 또는 적어도 274번 위치에서 또는 적어도 280번 위치에서 또는 적어도 296번 위치에서 또는 적어도 314번 위치에서 또는 적어도 442번 위치에서 또는 적어도 514번 위치에서 또는 적어도 589번 위치에서 또는 적어도 645번 위치에서 또는 적어도 694번 위치에서 또는 적어도 706번 위치에서 또는 적어도 726번 위치에서 변형되었다. 한 태양에서, 본 발명은 161번 또는 296번 위치에서 단일 변형을 갖는 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제를 제공한다.

본 발명은 또한 II형 베타-락탐 아실라제 활성을 갖는 모델 폴리펩티드의 변이체인 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제를 제공하는데, 이때 상기 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제는, 슈도모나스의 SE83-acyII 아실라제의 아미노산 서열(서열번호 1)의 아미노산 위치 번호를 이용하여, 적어도 161+270번 위치의 조합에서, 또는 적어도 161+296번 위치의 조합에서, 또는 적어도 161+442번 위치의 조합에서, 또는 적어도 161+589번 위치의 조합에서, 또는 적어도 270+296번 위치의 조합에서, 또는 적어도 270+442번 위치의 조합에서, 또는 적어도 270+589번 위치의 조합에서, 또는 적어도 296+442번 위치의 조합에서, 또는 적어도 296+589번 위치의 조합에서, 또는 적어도 442+589번 위치의 조합에서, 또는 적어도 161+270+296번 위치의 조합에서, 또는 적어도 161+270+442번 위치의 조합에서, 또는 적어도 161+270+589번 위치의 조합에서, 또는 적어도 161+296+589번 위치의 조합에서, 또는 적어도 296+442+589번 위치의 조합에서, 또는 적어도 161+296+442번 위치의 조합에서, 또는 적어도 161+296+589번 위치의 조합에서, 또는 적어도 296+442+589번 위치의 조합에서, 또는 적어도 161, 270, 296, 442 및 589번으로 이루어진 군에서 선택된 4개 위치의 임의의 조합에서, 또는 적어도 161, 270, 296, 442 및 589번 위치의 조합에서 변형되었으며, 이때 상기 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제는 상기 위치들 이외에 다른 아미노산 위치 및 전술한 바와 같은 그의 모든 가능한 조합에서 변형을 가질 수 있다.

본 발명에서 사용되는 바와 같은 II형 베타-락탐 아실라제 활성을 갖는 모델 폴리펩티드는, 바람직하게는 서열번호 1에 따른 아미노산 서열(즉, 슈도모나스속 SE83의 SE83-acyII 아실라제)을 가지거나 또는 서열번호 2에 따른 아미노산 서열(즉, 슈도모나스속 N176의 N176-아실라제)을 가지거나 또는 서열번호 3에 따른 아미노산 서열(즉, 브레분디모나스 디미누타 V22의 V22 아실라제)을 갖는, II형 베타-락탐 아실라제 활성을 갖는 폴리펩티드; 및 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열번호 1과의 동일성 퍼센트, 또는 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열번호 2와의 동일성 퍼센트, 또는 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열번호 3과의 동일성 퍼센트를 갖는 아미노산 서열을 갖는, II형 베타-락탐 아실라제 활성을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택된다. 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 가지거나 서열번호 2에 따른 아미노산 서열을 가지거나 또는 서열번호 3에 따른 아미노산 서열을 갖는, II형 베타-락탐 아실라제 활성을 갖는 폴리펩티드가 본 발명에서 사용되는 바와 같은 II형 베타-락탐 아실라제 활성을 갖는 모델 펠리펩티드로서 보다 바람직하다. 슈도모나스의 SE83-acyII 아실라제(서열번호 1)가 II형 베타-락탐 아실라제 활성을 갖는 모델 폴리펩티드로서 가장 바람직하다.

본 발명은 바람직하게는 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 갖는 아실라제; 및 서열번호 2에 따른 아미노산 서열을 갖는 아실라제; 및 서열번호 3에 따른 아미노산 서열을 갖는 아실라제; 및 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열번호 1과의 동일성 퍼센트, 또는 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열번호 2와의 동일성 퍼센트, 또는 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열번호 3과의 동일성 퍼센트를 갖는 아미노산 서열을 갖는, II형 베타-락탐 아실라제 활성을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택된 모델 II형 베타-락탐 아실라제의 돌연변이체를 제공하며, 이때 상기 돌연변이체는 적어도 10번 위치에서 또는 적어도 29번 위치에서 또는 적어도 161번 위치에서 또는 적어도 270번 위치에서 또는 적어도 274번 위치에서 또는 적어도 280번 위치에서 또는 적어도 296번 위치에서 또는 적어도 314번 위치에서 또는 적어도 442번 위치에서 또는 적어도 514번 위치에서 또는 적어도 589번 위치에서 또는 적어도 645번 위치에서 또는 적어도 694번 위치에서 또는 적어도 706번 위치에서 또는 적어도 726번 위치에서 변형을 갖는다. 한 태양에서, 본 발명은 슈도모나스의 SE83-acyII 아실라제의 아미노산 서열의 아미노산 위치 번호를 이용하여 161번 또는 296번 위치에서 단일 변형을 갖는 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제를 제공한다.

아미노산 위치에서의 변형은 천연에서 일어나는 20개 L-아미노산의 군에서 선택된, 또 다른 아미노산에 의한 치환을 포함할 수 있다(표 1 참조). 또는, 아미노산 위치에서의 변형은 상기 위치에서의 아미노산의 결실을 포함할 수 있다. 또한, 아미노산 위치에서의 변형은 상기 아미노산의 C-말단 또는 N-말단 측면에서 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함할 수 있다.

아미노산	3-문자 코드	1-문자 코드
알라닌	Ala	A
아르기닌	Arg	R
아스파라긴	Asn	N
아스파트산	Asp	D
시스테인	Cys	C
글루탐산	Glu	E
글루타민	Gln	Q
글라이신	Gly	G
히스티딘	His	H
아이소류신	Ile	I
류신	Leu	L
라이신	Lys	K
메티오닌	Met	M
페닐알라닌	Phe	F
프롤린	Pro	P
세린	Ser	S
트레오닌	Thr	T
트립토판	Trp	W
티로신	Tyr	Y
발린	Val	V

본 발명의 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제, 바람직하게는 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 갖는 아실라제 및 서열번호 2에 따른 아미노산 서열을 갖는 아실라제 및 서열번호 3에 따른 아미노산 서열을 갖는 아실라제로 이루어진 군에서 선택된 모델 II형 베타-락탐 아실라제의 돌연변이체는 하기의 변형 중 하나 이상을 가질 수 있다:

·10번 위치에서, 양으로 하전된 아미노산 잔기, 예를 들면, 라이신 또는 아르기닌, 또는 α-나선 형성에 대해 구조적 선호도를 갖는 소 아미노산 잔기, 예를 들면, 알라닌, 바람직하게는 라이신에 의한 글루타메이트(서열번호 1) 또는 알라닌(서열번호 2 및 서열번호 3)의 치환.

·29번 위치에서, 방향족(유사) 측쇄를 갖는 아미노산, 예를 들면, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 및 히스티딘, 또는 보다 큰 비-하전된 극성 또는 양으로 하전된 측쇄를 갖는 아미노산, 예를 들면, 아스파라긴, 글루타민, 아르기닌 및 라이신, 바람직하게는 아스파라긴 또는 페닐알라닌에 의한 세린의 치환.

·161번 위치에서, 보다 작거나 보다 극성인 아미노산, 예를 들면, 트레오닌, 세린, 글라이신 및 시스테인, 또는 양으로 하전된, 약 pH 9의 아미노산, 예를 들면, 아르기닌 및 라이신, 바람직하게는 세린 또는 트레오닌 또는 글라이신, 가장 바람직하게는 트레오닌에 의한 류신의 치환.

·274번 위치에서, 측쇄의 감마 위치에서 적어도 탄소, 산소 또는 황 원자를 함유하고 히스티딘에 비해 크기가 더 작은 아미노산 잔기, 예를 들면, 류신, 아이소류신, 시스테인, 트레오닌, 세린, 아스파라긴, 발린 및 프롤린, 바람직하게는 류신, 아이소류신, 시스테인 또는 트레오닌에 의한 히스티딘의 치환.

·280번 위치에서, 양 전하를 음 전하로 치환하는 아미노산 잔기, 예를 들면, 아스파트산 및 글루탐산, 또는 비-분지 및 비-하전 극성 측쇄, 예를 들면, 글루타민, 아스파라긴 및 세린, 바람직하게는 글루타민 및 아스파라긴, 가장 바람직하게는 글루타민에 의한 아르기닌의 치환.

·296번 위치에서, 하전되거나 극성인 아미노산, 또는 모델 아실라제에서 히스티딘 잔기의 N-델타 또는 N-엡실론 원자에 대한 존재하는 수소 결합을 대체할 수 있는 아미노산 잔기, 예를 들면, 아스파라긴 및 글루타민, 바람직하게는 글루타민에 의한 히스티딘의 치환.

·314번 위치에서, β-분지를 갖는 보다 작은 아미노산 잔기, 예를 들면, 발린, 또는 중간 크기의 극성 측쇄, 예를 들면, 글루타민, 아스파라긴, 세린 및 트레오닌, 바람직하게는 발린 또는 글루타민에 의한 아이소류신의 치환.

·442번 위치에서, 소수성 측쇄가 없거나 작은 소수성 측쇄를 갖는 아미노산, 예를 들면, 글라이신, 알라닌, 류신, 발린 및 아이소류신, 바람직하게는 글라이신에 의한 글루탐산의 치환.

·514번 위치에서, 추가의 수소 결합에 기여할 수 있는 보다 극성이고/이거나 보다 유연한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 예를 들면, 글루타민, 아스파라긴, 트레오닌, 세린, 시스테인, 아스파트산 및 글루탐산, 바람직하게는 글루타민에 의한 프롤린의 치환.

·589번 위치에서, 특정 환경에서 양전하를 유지할 수 있는 아미노산 잔기, 예를 들면, 히스티딘 및 라이신, 또는 수소 결합을 형성할 수 있는 방향족 측쇄, 예를 들면, 티로신 및 트립토판, 또는 모델 아실라제에서 히스티딘 잔기의 N-델타 또는 N-엡실론 원자에 대한 존재하는 수소 결합을 대체할 수 있는 아미노산 잔기, 예를 들면, 아스파라긴 및 글루타민, 바람직하게는 히스티딘에 의한 아르기닌의 치환.

·645번 위치에서, β-스트랜드 형성에 대해 증가된 선호도를 갖는 소 아미노산 잔기, 예를 들면, 트레오닌, 발린, 세린, 시스테인 및 류신, 바람직하게는 트레오닌에 의한 알라닌의 치환.

·694번 위치에서, 아스파라긴보다 작은 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 예를 들면, 알라닌, 트레오닌, 세린, 시스테인, 발린 및 글라이신, 바람직하게는 트레오닌에 의한 아스파라긴의 치환.

·706번 위치에서, 측쇄를 갖지 않거나 류신보다 작은 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 예를 들면, 글라이신, 알라닌, 발린, 세린, 시스테인, 트레오닌 및 프롤린, 바람직하게는 글라이신에 의한 티로신의 치환.

·726번 위치에서, 보다 큰 소수성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 예를 들면, 아이소류신, 류신 및 메티오닌, 바람직하게는 아이소류신에 의한 발린의 치환.

본 발명의 매우 바람직한 태양은, 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 갖는 아실라제; 및 서열번호 2에 따른 아미노산 서열을 갖는 아실라제; 및 서열번호 3에 따른 아미노산 서열을 갖는 아실라제; 및 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열번호 1과의 동일성 퍼센트, 또는 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열번호 2와의 동일성 퍼센트, 또는 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열번호 3과의 동일성 퍼센트를 갖는 아미노산 서열을 갖는, II형 베타-락탐 아실라제 활성을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택되고, 다음 변형: H296Q, L161G, L161S 또는 L161T 중 하나를 갖는 모델 II형 베타-락탐 아실라제의 돌연변이체이다.

본 발명의 훨씬 더 바람직한 태양은, 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 갖는 아실라제; 및 서열번호 2에 따른 아미노산 서열을 갖는 아실라제; 및 서열번호 3에 따른 아미노산 서열을 갖는 아실라제; 및 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열번호 1과의 동일성 퍼센트, 또는 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열번호 2와의 동일성 퍼센트, 또는 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열번호 3과의 동일성 퍼센트를 갖는 아미노산 서열을 갖는, II형 베타-락탐 아실라제 활성을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택되고, 위치에서의 변형을 갖는 모델 II형 베타-락탐 아실라제의 돌연변이체이다. 다음의 2개 위치의 조합: [161+10], [161+29] 또는 [161+694] 또는 [161+726] 또는 [161+274] 또는 [161+706] 또는 [161+442] 또는 [161+589] 또는 [161+314]; 또는 다음의 3개 위치의 조합: [161+29+274], [161+29+706], [161+29+514], [161+274+589] 또는 [161+274+706]; 또는 다음의 4개 위치의 조합: [161+29+274+726], [161+274+280+314]; 또는 다음의 5개 위치의 조합: [161+29+274+314+694], [161+274+280+514+726]; 또는 다음의 6개 위치의 조합: [161+29+280+314+645+726]에서 변형을 갖는 돌연변이 아실라제가 가장 바람직하다.

본 발명은 바람직하게는, 적어도 위치 L161+M270의 조합에서 또는 적어도 위치 L161+H296의 조합에서 또는 적어도 위치 L161+E442의 조합에서 또는 적어도 위치 L161+R589의 조합에서 또는 적어도 위치 M270+H296의 조합에서 또는 적어도 위치 M270+E442의 조합에서 또는 적어도 위치 M270+R589의 조합에서 또는 적어도 위치 H296+E442의 조합에서 또는 적어도 위치 H296+R589의 조합에서 또는 적어도 위치 E442+R589의 조합에서 또는 적어도 위치 L161+M270+H296의 조합에서 또는 적어도 위치 L161+M270+E442의 조합에서 또는 적어도 위치 L161+M270+R589의 조합에서 또는 적어도 위치 L161+H296+R589의 조합에서 또는 적어도 위치 H296+E442+R589의 조합에서 또는 적어도 위치 L161+H296+E442의 조합에서 또는 적어도 L161, M270, H296, E442 및 R589로 이루어진 군에서 선택된 4개 위치의 임의의 조합에서 또는 적어도 위치 L161, M270, H296, E442 및 R589의 조합에서 변형을 갖는, 슈도모나스의 SE83-acyII 아실라제(서열번호 1)의 돌연변이체를 제공하며, 이때 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제는 상기 위치들 이외에 다른 아미노산 위치 및 전술한 바와 같은 그의 모든 가능한 조합에서 변형을 가질 수 있다. 본 발명의 매우 바람직한 태양은 실시예의 표 2 내지 5에 요약된 슈도모나스 SE83-AcyII 돌연변이체이다.

두 번째 태양으로, 본 발명은 본 발명의 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 또한 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제의 알파-서브유니트를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제의 베타-서브유니트를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. WO 2005/014821 호는 8 및 9 쪽에 SE83-군 아실라제를 암호화하는 유전자가 α-서브유니트, 스페이서 펩티드 및 β-서브유니트로 이 순서로 이루어진 폴리펩티드를 암호화함을 개시하고 있다. 슈도모나스속 SE83으로부터 유도된 아실라제는 숙주 세포에서 전사 및 번역된 후에 크기가 약 84 kDa인 불활성 단일 쇄 폴리펩티드의 형태로 생성된다. 그 다음, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 230 및 231번 위치와 239 및 240번 위치에서 아미노산 사이에 2번의 자가-절단이 일어나, 9개의 아미노산으로 이루어진 스페이서 펩티드가 제거되고 25 kDa의 α-서브유니트와 58 kDa의 β-서브유니트로 분리된다. 하나의 α-서브유니트는 소수성 상호작용을 통해 하나의 β-서브유니트에 결합되어 아실라제 활성을 갖는, 약 83 kDa의 헤테로이량체를 생성한다. 일반적으로 알려져 있는 바와 같이, N-말단 메티오닌을 암호화하는 첫 번째 코돈(ATG)이 원핵생물에서의 단백질 합성시 번역 개시에 필요하다. 메티오닌은 번역후에 제거된다.

본 발명에 따른 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제 또는 알파-서브유니트 또는 베타-서브유니트를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 따른 적절한 아미노산 서열을 암호화하는 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 다양한 아미노산에 대한 코돈 사용방식이 슈도모나스에서의 코돈 사용방식과 다른 암호화 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 코돈 사용방식은, 변형된 II형 베타-락탐 아실라제를 암호화하는 DNA 단편으로 형질전환될 것이거나 형질전환된 특정한 숙주 세포의 코돈 사용방식에 적합화될 수 있다.

세 번째 태양으로, 본 발명은 하기에서 정의하는 바와 같은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 또는 발현 카세트를 제공한다.

네 번째 태양으로, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 발현 벡터 또는 발현 카세트로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 형질전환된 숙주 세포는 본 발명의 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제의 생산에 사용될 수 있다.

본 발명의 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제의 생산을 위한 숙주 세포는 바람직하게는 세포외 또는 세포내로 그의 유효한 단백질 또는 효소 생산에 대해 당해 분야에 공지된 숙주 세포, 예를 들면, 진균, 효모 및 세균과 같은 미생물이다. 바람직한 숙주 세포의 예로는 다음의 종류: 아스퍼질러스(Aspergillus)(예를 들면, 아스퍼질러스 니거(A. niger), 아스퍼질러스 오리재(A. oryzae)), 페니실리움(예를 들면, 페니실리움 에머소니(P. emersonii), 페니실리움 크리소게넘), 사카로마이세스(Saccharomyces)(예를 들면, 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae)), 클루이베로마이세스(예를 들면, 클루이베로마이세스 락티스(K. lactis)), 바실러스(예를 들면, 바실러스 서브틸리스(B. subtilis), 바실러스 리케니포미스(B. licheniformis), 바실러스 아밀로리케파시엔스(B. amyloliquefaciens)), 에스케리키아(이. 콜라이), 스트렙토마이세스(예를 들면, 스트렙토마이세스 클라불리게루스), 슈도모나스가 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.

다섯 번째 태양으로, 본 발명은 본 발명에 따른 형질전환된 숙주 세포를 돌연변이 익스팬다제의 생성을 촉진하는 조건하에서 배양하고, 선택적으로 돌연변이 익스팬다제를 회수하는 것을 포함하는, 본 발명의 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제의 제조 방법을 제공한다.

여섯 번째 태양으로, 본 발명은 본 발명의 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제를 이용하여 주목되는 베타-락탐 화합물의 아실화된 전구체를 탈아실화시키는 단계를 포함하는, 주목되는 탈아실화 베타-락탐 화합물의 제조 방법을 제공한다. 주목되는 탈아실화 베타-락탐 화합물은 천연 페니실린 또는 세팔로스포린의 유도체, 예를 들면, 6-APA, 7-ACA, 7-ADCA, 7-ADAC, 7-아미노-3-카바모일옥시메틸-3-세펨-4-카복실산(예를 들면, WO 2004/106347 호) 등일 수 있다. 바람직하게, 주목되는 탈아실화 베타-락탐 화합물은 7-ADCA 또는 7-ACA이며, 7-ADCA가 가장 바람직하다. 주목되는 베타-락탐 화합물의 아실화된 전구체는 다이카복실산으로 이루어진 군에 속하는 아실을 가질 수 있다. 바람직한 아실 기는 석시닐, 글루타릴, 아디필, 알파-케토아디필 및 아미노아디필이다. 아디필 및 아미노아디필이 보다 바람직하며, 아디필이 매우 바람직하다. 주목되는 베타-락탐 화합물의 바람직한 아실화 전구체는 아디필-7-ADCA, 아디필-7-ACA, 아미노아디필-7-ADCA 및 아미노아디필-7-ACA이고, 아미노아디필-7-ACA는 CEFC로 알려져 있으며, 아디필-7-ADCA가 가장 바람직하다.

주목되는 탈아실화 베타-락탐 화합물을 제조하기 위한 본 발명의 방법은 배치 방식으로 수행할 수 있으며, 여기서는 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제를 주목되는 베타-락탐 화합물의 아실화 전구체를 포함하는 용액에 용해된 상태로 사용한다.

보다 바람직하게, 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제는 고정화된 형태로 사용된다. 그 이점은 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제를 탈아실화 반응 완료후 회수할 수 있으며 추가의 탈아실화 반응에 재사용할 수 있다는 것이다. 이렇게, 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제의 사용에 있어 비용이 상당히 감소될 수 있으므로, 탈아실화 공정의 경제적 매력성이 증가될 수 있다. 탈아실화 반응 및 효소의 고정화를 위한 조건은 선행 기술에서 알려져 있다(예를 들면, 문헌 [Kallenberg, A.I. et al., Adv. Synth. Catal., 347, 905-926, 2005]).

일곱 번째 태양으로, 본 발명은 주목되는 베타-락탐 화합물의 아실화 전구체를 탈아실화시키는 단계를 포함하는, 주목되는 탈아실화 베타-락탐 화합물의 제조 방법에 있어서 본 발명의 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제의 용도에 관한 것이다. 주목되는 탈아실화 베타-락탐 화합물은 천연 페니실린 또는 세팔로스포린의 유도체, 예를 들면, 6-APA, 7-ACA, 7-ADCA, 7-ADAC, 7-아미노-3-카바모일옥시메틸-3-세펨-4-카복실산 등일 수 있다. 바람직하게, 주목되는 탈아실화 베타-락탐 화합물은 7-ADCA 또는 7-ACA이며, 7-ADCA가 가장 바람직하다. 주목되는 베타-락탐 화합물의 아실화 전구체는 다이카복실산으로 이루어진 군에 속하는 아실을 가질 수 있다. 바람직한 아실 기는 석시닐, 글루타릴, 아디필, 알파-케토아디필 및 아미노아디필이다. 아디필 및 아미노아디필이 보다 바람직하며, 아디필이 매우 바람직하다. 주목되는 베타-락탐 화합물의 가장 바람직한 아실화 전구체는 아디필-7-ADCA, 아디필-7-ACA, 아디필-7-아미노-3-카바모일옥시메틸-3-세펨-4-카복실산, 알파-케토아디필-7-ADCA, 알파-케토아디필-7-ACA, 아미노아디필-7-ADCA, 아미노아디필-7-ACA이고, 아미노아디필-7-ACA는 CEFC로 알려져 있다. 주목되는 탈아실화 베타-락탐 화합물을 제조하기 위한 본 발명의 방법은 배치 방식으로 수행할 수 있으며, 여기서는 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제를 주목되는 베타-락탐 화합물의 아실화 전구체를 포함하는 용액에 용해된 상태로 사용한다. 보다 바람직하게, 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제는 고정화된 형태로 사용된다.

물질 및 방법

아실라제의 제조

야생형(wt) 유전자 또는 돌연변이체 유전자를 갖는 플라스미드를 이. 콜라이 탑 10 세포(인비트로겐(Invitrogen))에 형질전환시켰다. 37 ℃ 및 280 rpm에서 50 μg/ml의 제오신을 함유하는 20 ml의 2xTY 배지를 사용하여 100 ml의 플라스크에 세포를 접종하였다. 24 시간후에, 100 ml의 2xTY 배지, 50 μg/ml의 제오신 및 0.05% 아라비노스를 갖는 플라스크에 50 μl의 배양물을 1:1000으로 접종하고, 25 ℃ 및 280 rpm에서 성장시켰다. 배양물을 원심분리하고, -20 ℃에서 냉동시켰다. 무세포 추출물을 제조하기 위해, 펠릿을 추출 완충액(50mM 트리스/HCl, 0.1 mg/ml DNAse1, 2 mg/ml 라이소자임, 10mM DTT(다이티오트레이톨), 5mM MgSO₄)에 재현탁하고 배양하였다. 30 분후에, 추출물을 원심분리하고 아실라제 활성을 갖는 상등액을 활성 측정에 사용하였다.

아실라제 함량은 SDS-PAGE 겔 전기영동, 및 용출제로서 0.1M 포스페이트 완충액(pH 7.0)을 사용하여 TSK 3000SWxl 컬럼상에서 수행한 분석용 HPLC 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 측정하였다. 적용된 크로마토그래피 조건은 유량 1.0 ml/분 및 280 nm에서의 검출이었다. 관찰된 아실라제 피크 면적을 비교하여, 상이한 샘플의 단백질 함량을 비교할 수 있다. 아실라제 단백질 함량은 154350(M^-1·cm^-1)의 몰 흡광 계수를 이용하여 OD280으로부터 계산하였다. HPLC 크로마토그램에서 추가 피크의 경우, 샘플의 E280 값은 추가 피크 부분에 대해 보정하였다.

정제

100 ml 배양물로부터의 세포 펠릿을 1 ml의 20mM 트리스(pH 8)로 재현탁시켰다. 얼음 위에서 10μ의 진폭하에 9 x 10 초의 초음파처리(소니프레프(Soniprep) 150 I-BU03)(15 초간 중단)한 후, 세포 현탁액을 미세원심분리관에서 14000 rpm 및 4 ℃에서 5 분간 원심분리하였다. 상등액을 0.1M HCl로 5.3 내지 5.4의 pH로 만든 후, 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 이어서, 상등액을 NaOH를 사용하여 다시 pH 8로 적정하였다. 약 100 내지 400 μl를 1 ml의 모노큐(MonoQ) 컬럼에 적용하고, 이것을 10% NaCl을 함유하는 20mM 트리스(pH 8)로 평형화시켰다. 완충액 A(20mM 트리스(pH 8)) 및 완충액 B(20mM 트리스(pH 8) + 1M NaCl)를 용출하는 동안 다음과 같이 혼합하였다: 0 내지 1 분 10% B/90% A; 1 내지 5분 20% B/80% A; 5 내지 9 분 40% B/60% A; 9 내지 12분 60% B/40% A; 12 내지 15분 100% B. 아실라제 활성을 함유하는 피크 분획들을 수거하고 겔 여과 컬럼, TSK겔 3000SWxl에 적용하고, 이것을 100mM 인산나트륨 완충액(pH 7)으로 평형화시켰다. 피크 분획을 수거하고 추가 사용을 위해 저장하였다.

시약

WO 9848037 호에 기술된 바와 같이 효소적 합성에 의해 아디프산 및 7-ADCA로부터 아디필-7-ADCA를 제조할 수 있다. 또한, 아디필-7-ADCA는 글루타르산 무수물 대신 아디프산 무수물로부터 출발하여 문헌 [Shibuya et al., Agric. Biol. Chem., 45(7), 1561-1567, 1981]에 기술된 바와 같이 화학적 합성에 의해 제조할 수 있다.

아디필-7-ADCA 기질의 8%(w/v) 저장 용액을 적절한 완충액중에 제조하고 4N NaOH를 사용하여 목적하는 pH로 조정하였다.

100 ml의 시트르산(1 L의 에탄올에 용해시킨 315.5 g의 시트르산 모노하이드레이트)에 200 mg을 용해시켜 컬러 시약 4-(다이메틸아미노)-벤즈알데하이드(p-DMBA)를 새로 제조하였다.

pH 8.0 내지 pH 10.0의 범위에서 활성 측정을 필요에 따라 4N HCl 또는 4N NaOH를 사용하여 목적 pH로 조정한 0.2M CHES 완충액(2-(N-사이클로헥실아미노)에테인 설폰산) 중에서 수행하였다.

아실라제 활성의 측정

180 μl의 적절한 완충액을 상응하는 완충액중의 기질 저장액 200 μl 및 20 μl의 효소 용액과 혼합하고, 바람직한 온도, 통상적으로는 달리 언급하지 않는 한 실온에서 20 분간 배양하였다. 600 μl의 컬러 시약을 가하여 반응을 중단시켰다. 실온에서 10 분후에, 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소를 가하기 전에 분석물에 컬러 용액을 가하여 블랭크 측정을 수행하였다. 아실라제 활성은 분당 흡광도(OD)의 증가(델타 OD/분)로 계산한다. 절대 활성을 계산하기 위해, L당 0.1 내지 1 g의 7-ADCA 범위의 7-ADCA 보정선을 사용하였다.

K _M 측정 및 pH 곡선

K_M 측정은 기술한 바와 같은 분석을 이용하여 수행하였다. 그러나, 아디필-7-ADCA 농도는 0.5 내지 4%(w/v) 아디필-7-ADCA로 변하였다.

실시예 1

SE83 ACYii 돌연변이체의 아실라제 활성

기질로서 아디필-7-ADCA를 사용하여 돌연변이체의 아실라제 활성은 pH 8.5 내지 pH 9.5에서 측정하였다. 결과는 표 2에 나타내었다.

pH 8.5 및 pH 9.5에서, 돌연변이체의 활성은 야생형 아실라제에 비해 훨씬 더 높았다. 또한, pH 9.5에서의 활성을 pH 8.5에서의 활성과 비교할 때, pH 9.5에서의 돌연변이 아실라제의 활성이 야생형에 비해 비교적 더 높은 것이 명백해진다. 돌연변이체의 pH 활성 프로필은 더 높은 pH로 이동되어, 이들 돌연변이체가 상승되는 pH에서 사용하기에 특히 적합하다. 이것은 특별히 중요한데, 그 이유는 가수분해 반응의 완료쪽으로 열역학적 평형이 더 이동됨으로 인해 더 높은 pH에서 전환반응 수율이 증가될 것이기 때문이다.

아디필-7ADCA의 7-ADCA 및 아디프산으로의 전환 과정 동안 후자의 농도가 증가할 것이므로, 생성물 억제는 초기 속도 조건하에서 측정된 돌연변이체의 개선을 감소시킬 수 있다. 그러므로, 야생형 및 돌연변이 아실라제의 활성은 1.5%(w/v) 아디프산의 존재하에서 측정하였다. 표 3은 상기 조건하에서 돌연변이체의 활성이 pH 8.5 및 pH 9.5에서 야생형 아실라제에 비해 훨씬 더 높은 것을 보여준다. 이들 돌연변이체에 대한 pH 활성 프로필은 더 높은 pH로 이동되지 않았다.

기질로서 아디필-7-ADCA를 사용한 야생형 및 돌연변이 아실라제의 아실라제 활성은 1.5%(w/v) 아디프산의 존재하에 pH 8.6, pH 9.1 및 pH 9.5에서 측정하였다. 결과는 표 4에 나타내었다.

표 4는 pH 8.6, pH 9.1 및 pH 9.5에서, 돌연변이체의 활성이 야생형 아실라제에 비해 훨씬 더 높음을 보여준다. pH 9.1에서의 활성 개선율을 pH 8.6에서의 활성 개선율과 비교할 때(활성의 비를 나타낸 컬럼), pH 9.1에서 돌연변이 아실라제의 활성이 야생형에 비해 비교적 더 개선됨이 명백해진다. 돌연변이체의 pH 활성 프로필은 더 높은 pH로 이동되어, 이들 돌연변이체가 상승되는 pH에서 사용하기에 특히 적합하다. pH 9.5에서의 활성을 pH 8.6에서와 비교할 때, 대부분의 돌연변이 아실라제의 활성이 야생형에 비해 pH 8.5에서보다 pH 9.5에서 훨씬 더 개선된다.

실시예 2

기질 친화도는 SE83 ACYii 돌연변이체의 K _M 측정에 의해 나타낸다

표 5는 야생형에 대한 여러 돌연변이체에 대해 측정한 K_M 값을 나타낸 것이다. 미카엘리스 상수(Michaelis constant) K_M은 효소가 그의 최대 속도의 50%에서 작용하는 기질 농도를 나타낸다. K_M 미만의 기질 농도에서 효소는 더 느려지고, K_M보다 높은 기질 농도에서 효소는, 높은 기질 농도에서 효소가 완전히 포화되고 최대 속도로 작용할 때가지 더 빠르게 작용한다. 기질이 소모되는 효소 전환반응 말기에, 충분한 활성을 유지하기 위해서는 낮은 K_M이 중요하다. 돌연변이체에 대한 상대 K_M 값이 1.00 미만인 경우, 이것은, 보다 낮은 기질 농도에서, 예를 들면, 전환반응 말기에, 돌연변이체가 실질적으로 더 높은 활성을 유지하는데 있어 야생형에 비해 이점을 가짐을 의미한다.

실시예 3

고정화된 SE83 ACYii 돌연변이체의 아실라제 활성

고정화는 겔화제로서 젤라틴 및 키토산, 및 가교결합제로서 글루타르산 다이알데하이드를 사용하여 WO 97/04086 호에 기술된 바와 같이 수행하였다. 온도 및 pH가 조절된 100 ml 반응기에서 아디필-7ADCA의 완전 가수분해를 수행하여 고정화된 야생형 아실라제 및 돌연변이 아실라제의 성능을 측정하였다. 실험은 3.2% 아디필-7-ADCA에서 수행하였다. 고정화 효소는 바람직한 조건하에서 120 분 이내에 90% 이상의 전환율이 수득될 수 있도록 하는 방식으로 투여하였다. 전환반응은 pH 8.8 및 30 ℃ 및 pH 9.5 및 40 ℃에서 수행하였다. 동일량(중량으로)의 야생형 및 돌연변이 아실라제를 전환반응에 사용하였다. 반응시에 pH는 1M KOH 용액을 가하여 일정하게 유지시켰다. 고정화 아실라제의 활성은 분당 KOH ml로 나타낸다. 도 2a 및 2b에서, 전환율의 함수로서 분 당 KOH ml로 나타낸 속도를 나타내었다.

평균 6회 시행을 pH 8.8 및 30 ℃에서 행하였다. 처음 30% 전환율의 데이터는 시스템이 완전히 안정화되지 않아 데이터에 큰 변동이 있었기 때문에 포함시키기 않았다. pH 9.5 및 40 ℃에서, 평균 2회 시행을 행하였다. 그러므로, 편차가 더 크다. 그러나, 계산된 기울기는 활성의 우수한 지표를 제공한다. 도 2a 및 2b는 돌연변이 아실라제의 활성이 전체 전환반응동안 상당히 더 높음을 보여준다.

고정화 아실라제의 안정성은 고정화 아실라제의 동일 배치를 가지고 180 분의 20회 후속 전환반응을 측정함으로써 결정하였다. 각 배양의 30 내지 50% 전환율의 속도를 측정하였다. 고정화 아실라제의 잔류 활성은 본원에서 첫 번째 배양의 속도에 대한 20번째 배양의 활성으로 정의한다.

표 6은 결과를 요약한 것이다. 특히 가수분해 반응의 열역학적 평형을 보다 완전한 전환반응으로 이동시키는 조건(고온 및 고 pH)하에서, 돌연변이 아실라제의 안정성이 야생형에 비해 상당히 개선되는 것으로 관찰되었다.

돌연변이 아실라제의 상기 보다 높은 가수분해 활성 및 보다 높은 안정성의 결과로, 돌연변이된 아실라제 효소의 그램(g) 당 생산성이 상당히 증가되었다.

SEQUENCE LISTING <110> DSM IP Assets B.V <120> Mutant Type II Beta-Lactam Acylases <130> 24988WO <160> 3 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 3141 <212> DNA <213> Pseudomonas sp. SE83 <220> <221> CDS <222> (562)..(2886) <400> 1 aagcttgcga tcgcggacgc cgctgccgcc ctgaagaaga ccgcctacaa gggcgagccg 60 gtggtcttcc tgacggtcgc cgggtcgatc tcgcagacgg ccggcgcggt tctggccagc 120 aatatgcgca aggccggctt caccgtggac gagcaggtga tggactgggg cacggtgctc 180 gcacgccggg ccaagaagga cggttggagc gtcttcccgg tctacgccaa cggcatcgac 240 atgatgtcgc cgctgacgca tttctacatc ggcaacaact gcgcgaacta tgccggctgg 300 agctgcgacg ccgtcatcac ccaaaagctc gccgcctatg ccaaggcgcc tgatccggcc 360 acccgcaagc gcatcgcggc cgagatcagg tcgaggccta taaggacacg ccctccgtga 420 tgtggggcca gttcagccgg ccggccggat accgcctgcg cctcaaagac atcgtccagt 480 ccagcttccg atcttctggc agctcacgct cgacgcgtga gctcgtccag atcccgataa 540 gcaacgaggt ccagacagag a atg acg atg gcg gcc aag acc gat cgc gag 591 Met Thr Met Ala Ala Lys Thr Asp Arg Glu 1 5 10 gcc ctg cag gcg gcg ctg ccg ccg ctt tcc ggc agc ctc tcc att ccc 639 Ala Leu Gln Ala Ala Leu Pro Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ser Ile Pro 15 20 25 gga ttg agc gcg ccg gtc cgt gtc cag cgc gat ggc tgg ggc atc ccg 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ggc gat ccg ctc gag gga gca gcg ctc acg ctg 1695 Gly Pro Val Ile Ala Gly Asp Pro Leu Glu Gly Ala Ala Leu Thr Leu 365 370 375 cgc tcg gtc cag ttc gcc gag acc gac ctt tcc ttc gat tgc ctg acg 1743 Arg Ser Val Gln Phe Ala Glu Thr Asp Leu Ser Phe Asp Cys Leu Thr 380 385 390 cgg atg ccg ggc gca tcg acc gtg gcg cag ctt tac gac gcg acg cgc 1791 Arg Met Pro Gly Ala Ser Thr Val Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Thr Arg 395 400 405 410 ggc tgg ggc ctg atc gac cat aat ctc gtc gcc ggg gat gtc gcg ggc 1839 Gly Trp Gly Leu Ile Asp His Asn Leu Val Ala Gly Asp Val Ala Gly 415 420 425 tcg atc ggc cat ctg gtc cgc gcc cgc gtc ccg tcc cgc ccg cgc gag 1887 Ser Ile Gly His Leu Val Arg Ala Arg Val Pro Ser Arg Pro Arg Glu 430 435 440 aac ggc tgg ctg ccg gtg ccg ggc tgg tcc ggc gag cat gaa tgg cgc 1935 Asn Gly Trp Leu Pro Val Pro Gly Trp Ser Gly Glu His Glu Trp Arg 445 450 455 ggc tgg att ccg cac gag gcg atg ccg cgc gtc atc gat ccg ccg ggc 1983 Gly Trp Ile Pro His Glu Ala Met Pro Arg Val Ile Asp Pro Pro Gly 460 465 470 ggc ctc atc gtc acg gcg aac aac cgc gtc gtg gcc gat gat cat ccc 2031 Gly Leu Ile Val Thr Ala Asn Asn Arg Val Val Ala Asp Asp His Pro 475 480 485 490 gat tat ctc tgt acc gat tgc cat ccg ccc tac cgc gcc gaa cgg atc 2079 Asp Tyr Leu Cys Thr Asp Cys His Pro Pro Tyr Arg Ala Glu Arg Ile 495 500 505 atg gag cgc ctg gtc gcc agt ccg gct ttc gcc gtc gac gat gcg gcc 2127 Met Glu Arg Leu Val Ala Ser Pro Ala Phe Ala Val Asp Asp Ala Ala 510 515 520 gcg atc cac gcc gat acg ctg tcc ccc cat gtc ggc ttg ctg cgc gcg 2175 Ala Ile His Ala Asp Thr Leu Ser Pro His Val Gly Leu Leu Arg Ala 525 530 535 agg ctc gaa gcg ctc gga atc cag ggc agt ctc cct gcc gaa gag ttg 2223 Arg Leu Glu Ala Leu Gly Ile Gln Gly Ser Leu Pro Ala Glu Glu Leu 540 545 550 agg cag acc ctc atc gcc tgg gac ggc cgc atg gat gct ggc tcg cag 2271 Arg Gln Thr Leu Ile Ala Trp Asp Gly Arg Met Asp Ala Gly Ser Gln 555 560 565 570 gcg gct tcc gct tat aat gcg ttc cgc agg gcg ctg acg cgg ctg gta 2319 Ala Ala Ser Ala Tyr Asn Ala Phe Arg Arg Ala Leu Thr Arg Leu Val 575 580 585 acg gcc cgc agc ggg ctg gag caa gcg ata gcg cat ccc ttc gcg gcc 2367 Thr Ala Arg Ser Gly Leu Glu Gln Ala Ile Ala His Pro Phe Ala Ala 590 595 600 gtc ccg ccc ggc gtc tcg ccg cag ggg cag gtc tgg tgg gcc gtg ccg 2415 Val Pro Pro Gly Val Ser Pro Gln Gly Gln Val Trp Trp Ala Val Pro 605 610 615 acc ctg ctg cgc aac gac gat gcc ggg atg ctg aaa ggc tgg agc tgg 2463 Thr Leu Leu Arg Asn Asp Asp Ala Gly Met Leu Lys Gly Trp Ser Trp 620 625 630 gac gag gcc ttg tcg gag gcc ctg tcc gtc gcg acg cag aac ctg acc 2511 Asp Glu Ala Leu Ser Glu Ala Leu Ser Val Ala Thr Gln Asn Leu Thr 635 640 645 650 ggg cgc ggc tgg ggc gag gag cat cgg ccg cgt ttc acg cac ccg ctc 2559 Gly Arg Gly Trp Gly Glu Glu His Arg Pro Arg Phe Thr His Pro Leu 655 660 665 tcc gcg cag ttc ccg gcc tgg gcc gcg ctg ctg aac ccg gtt tcg cgc 2607 Ser Ala Gln Phe Pro Ala Trp Ala Ala Leu Leu Asn Pro Val Ser Arg 670 675 680 ccg atc ggc ggc gat ggc gac acc gtg ctg gcg aac ggg ctc gtc cca 2655 Pro Ile Gly Gly Asp Gly Asp Thr Val Leu Ala Asn Gly Leu Val Pro 685 690 695 tcg gcc gga cct gag gcg acc tat ggc gcc ctg tcg cgc tac gtc ttc 2703 Ser Ala Gly Pro Glu Ala Thr Tyr Gly Ala Leu Ser Arg Tyr Val Phe 700 705 710 gat gtc ggc aat tgg gac aat agc cgc tgg gtc gtc ttc cac ggc gcc 2751 Asp Val Gly Asn Trp Asp Asn Ser Arg Trp Val Val Phe His Gly Ala 715 720 725 730 tcg ggg cat ccg gcc agc ccc cac tat gcc gac cag aat gcg cca tgg 2799 Ser Gly His Pro Ala Ser Pro His Tyr Ala Asp Gln Asn Ala Pro Trp 735 740 745 agc gac tgc gcg atg gtg ccg atg ctc tat agc tgg gac agg atc gcc 2847 Ser Asp Cys Ala Met Val Pro Met Leu Tyr Ser Trp Asp Arg Ile Ala 750 755 760 gcg gag gcc gtg acc tcg cag gaa ctc gtc ccg gcc tga ggggcaaggc 2896 Ala Glu Ala Val Thr Ser Gln Glu Leu Val Pro Ala 765 770 tgcggtcagc ctgccgcagc attcttgcgg caggcgcggg tgcgtaagcc cgctgtttcg 2956 ccgccgtcga cggtcaggac ggcgccgttc acatagctcg acgcgtcgga caggagccag 3016 gccgcgagat cggcgacctc gtccggcgtg ccgagccggc ctgccggaat gcgcagctca 3076 agctgctcca gccgcagcgg gtcggccagc accttgtcca tcatccgcgt cgcgatctgc 3136 ccggg 3141 <210> 2 <211> 2847 <212> DNA <213> Brevundimonas diminuta N-176 <220> <221> CDS <222> (483)..(2801) <400> 2 cccggggatc tcgcagacgg ctggcgcggt cctggccagc aatatgcgca aggccggctt 60 cacggtggaa cagcaggtga tggattgggg cacggtgctc gcccgccggg ccaagaagga 120 cggctggagc gttttcccgg tctacgccaa cggcatcgac atgatgtcgc cgctgacgca 180 tttctacatc ggcaacaact gcgtgaacta tgcgggctgg agctgcgacg ccgtcatcac 240 cgaaaagctc gccgcctatg ccaaggcgcc cgatccggct acccgcaaac gcatcgcggc 300 cgaaatccag gtcgaggcct acaaggacac gccctccgtg atgtggggcc agttcagccg 360 gccggcgggc taccgcctgc gcctcaagaa catcgtccag tccagcttcc cgatcttctg 420 gcagctcacg ctcgacgcgt gagcttgccc agattccgac aagcaatgag gtcccgacgc 480 ga atg act atg gcg gcc aac acc gat cgc gcg gtc ttg cag gcg gcg 527 Met Thr Met Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ala Val Leu Gln Ala Ala 1 5 10 15 ctg ccg ccg ctt tcc ggc agc ctc ccc att ccc gga ttg agc gcg tcg 575 Leu Pro Pro Leu Ser Gly Ser Leu Pro Ile Pro Gly Leu Ser Ala Ser 20 25 30 gtc cgc gtc cgg cgc gat gcc tgg ggc atc ccg cat atc aag gcc tcg 623 Val Arg Val Arg Arg Asp Ala Trp Gly Ile Pro His Ile Lys Ala Ser 35 40 45 ggc gag gcc gat gcc tat cgg gcg ctg ggc ttc gtc cat tcg cag gac 671 Gly Glu Ala Asp Ala Tyr Arg Ala Leu Gly Phe Val His Ser Gln Asp 50 55 60 cgt ctt ttc cag atg gag ctg acg cgt cgc aag gcg ctg gga cgc gcg 719 Arg Leu Phe Gln Met Glu Leu Thr Arg Arg Lys Ala Leu Gly Arg Ala 65 70 75 gcc gaa tgg ctg ggc gcc gag gcc gcc gag gcc gat atc ctc gtg cgc 767 Ala Glu Trp Leu Gly Ala Glu Ala Ala Glu Ala Asp Ile Leu Val Arg 80 85 90 95 cgg ctc gga atg gaa aaa gtc tgc cgg cgc gac ttc gag gcc ttg ggc 815 Arg Leu Gly Met Glu Lys Val Cys Arg Arg Asp Phe Glu Ala Leu Gly 100 105 110 gtc gag gcg aag gac atg ctg cgg gct tat gtc gcc ggc gtg aac gca 863 Val Glu Ala Lys Asp Met Leu Arg Ala Tyr Val Ala Gly Val Asn Ala 115 120 125 ttc ctg gct tcc ggt gct ccc ctg cct gtc gaa tac gga ttg ctc gga 911 Phe Leu Ala Ser Gly Ala Pro Leu Pro Val Glu Tyr Gly Leu Leu Gly 130 135 140 gca gag ccg gag ccc tgg gag cct tgg cac agc atc gcg gtg atg cgc 959 Ala Glu Pro Glu Pro Trp Glu Pro Trp His Ser Ile Ala Val Met Arg 145 150 155 cgg ctg ggc ctg ctt atg ggt tcg gtg tgg ttc aag ctc tgg cgg atc 1007 Arg Leu Gly Leu Leu Met Gly Ser Val Trp Phe Lys Leu Trp Arg Ile 160 165 170 175 ctg gcg ctg ccg gtg gtc gga gcc gcc aat gcg ctg aag ctg cgc tat 1055 Leu Ala Leu Pro Val Val Gly Ala Ala Asn Ala Leu Lys Leu Arg Tyr 180 185 190 gac gat ggc ggc cgg gat ttg ctc tgc atc ccg ccg ggc gcc gaa gcc 1103 Asp Asp Gly Gly Arg Asp Leu Leu Cys Ile Pro Pro Gly Ala Glu Ala 195 200 205 gat cgg ctc gag gcg gat ctc gcg acc ctg cgg ccc gcg gtc gat gcg 1151 Asp Arg Leu Glu Ala Asp Leu Ala Thr Leu Arg Pro Ala Val Asp Ala 210 215 220 ctg ctg aag gcg atg ggc ggc gat gcc tcc gat gct gcc ggc ggc ggc 1199 Leu Leu Lys Ala Met Gly Gly Asp Ala Ser Asp Ala Ala Gly Gly Gly 225 230 235 agc aac aac tgg gcg gtc gct ccg ggc cgc acg gcg acc ggc agg ccg 1247 Ser Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro 240 245 250 255 atc ctc gcg ggc gat ccg cat cgc gtc ttc gaa atc ccg ggc atg tat 1295 Ile Leu Ala Gly Asp Pro His Arg Val Phe Glu Ile Pro Gly Met Tyr 260 265 270 gcg cag cat cat ctg gcc tgc gac cgg ttc gac atg atc ggc ctg acc 1343 Ala Gln His His Leu Ala Cys Asp Arg Phe Asp Met Ile Gly Leu Thr 275 280 285 gtg ccg ggc gtg ccg ggc ttc ccg cac ttc gcg cat aac ggc aag gtc 1391 Val Pro Gly Val Pro Gly Phe Pro His Phe Ala His Asn Gly Lys Val 290 295 300 gcc tat tgc gtc acc cat gcc ttc atg gac atc cac gat ctc tat ctc 1439 Ala Tyr Cys Val Thr His Ala Phe Met Asp Ile His Asp Leu Tyr Leu 305 310 315 gag cag ttc gcg ggg gag ggc cgc act gcg cgg ttc ggc aac gat ttc 1487 Glu Gln Phe Ala Gly Glu Gly Arg Thr Ala Arg Phe Gly Asn Asp Phe 320 325 330 335 gag ccc gtc gcc tgg agc cgg gac cgt atc gcg gtc cgg ggt ggc gcc 1535 Glu Pro Val Ala Trp Ser Arg Asp Arg Ile Ala Val Arg Gly Gly Ala 340 345 350 gat cgc gag ttc gat atc gtc gag acg cgc cat ggc ccg gtt atc gcg 1583 Asp Arg Glu Phe Asp Ile Val Glu Thr Arg His Gly Pro Val Ile Ala 355 360 365 ggc gat ccg cgc gat ggc gca gcg ctc acg ctg cgt tcg gtc cag ttc 1631 Gly Asp Pro Arg Asp Gly Ala Ala Leu Thr Leu Arg Ser Val Gln Phe 370 375 380 gcc gag acc gat ctg tcc ttc gac tgc ctg acg cgg atg ccg ggc gca 1679 Ala Glu Thr Asp Leu Ser Phe Asp Cys Leu Thr Arg Met Pro Gly Ala 385 390 395 tcg acc gtg gcc cag ctc tac gac gcg acg cgc ggc tgg ggc ctg atc 1727 Ser Thr Val Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Thr Arg Gly Trp Gly Leu Ile 400 405 410 415 gac cat aac ctc gtc gcc ggg gat gtc gcg ggc tcg atc ggc cat ctg 1775 Asp His Asn Leu Val Ala Gly Asp Val Ala Gly Ser Ile Gly His Leu 420 425 430 gtc cgc gcc cgc gtt ccg tcc cgt ccg cgc gaa aac ggc tgg ctg ccg 1823 Val Arg Ala Arg Val Pro Ser Arg Pro Arg Glu Asn Gly Trp Leu Pro 435 440 445 gtg ccg ggc tgg tcc ggc gag cat gaa tgg cgg ggc tgg att ccg cac 1871 Val Pro Gly Trp Ser Gly Glu His Glu Trp Arg Gly Trp Ile Pro His 450 455 460 gag gcg atg ccg cgc gtg atc gat ccg ccg ggc ggc atc atc gtc acg 1919 Glu Ala Met Pro Arg Val Ile Asp Pro Pro Gly Gly Ile Ile Val Thr 465 470 475 gcg aat aat cgc gtc gtg gcc gat gac cat ccc gat tat ctc tgc acc 1967 Ala Asn Asn Arg Val Val Ala Asp Asp His Pro Asp Tyr Leu Cys Thr 480 485 490 495 gat tgc cat ccg ccc tac cgc gcc gag cgc atc atg aag cgc ctg gtc 2015 Asp Cys His Pro Pro Tyr Arg Ala Glu Arg Ile Met Lys Arg Leu Val 500 505 510 gcc aat ccg gct ttc gcc gtc gac gat gcc gcc gcg atc cat gcc gat 2063 Ala Asn Pro Ala Phe Ala Val Asp Asp Ala Ala Ala Ile His Ala Asp 515 520 525 acg ctg tcg ccc cat gtc ggg ttg ctg cgc cgg agg ctc gag gcg ctt 2111 Thr Leu Ser Pro His Val Gly Leu Leu Arg Arg Arg Leu Glu Ala Leu 530 535 540 gga gcc cgc gac gac tcc gcg gcc gaa ggg ctg agg cag atg ctc gtc 2159 Gly Ala Arg Asp Asp Ser Ala Ala Glu Gly Leu Arg Gln Met Leu Val 545 550 555 gcc tgg gac ggc cgc atg gat gcg gct tcg gag gtc gcg tct gcc tac 2207 Ala Trp Asp Gly Arg Met Asp Ala Ala Ser Glu Val Ala Ser Ala Tyr 560 565 570 575 aat gcg ttc cgc agg gcg ctg acg cgg ctg gtg acg gac cgc agc ggg 2255 Asn Ala Phe Arg Arg Ala Leu Thr Arg Leu Val Thr Asp Arg Ser Gly 580 585 590 ctg gag cag gcg ata tcg cat ccc ttc gcg gct gtc gcg ccg ggc gtc 2303 Leu Glu Gln Ala Ile Ser His Pro Phe Ala Ala Val Ala Pro Gly Val 595 600 605 tca ccg caa ggc cag gtc tgg tgg gcc gtg ccg acc ctg ctg cgc gac 2351 Ser Pro Gln Gly Gln Val Trp Trp Ala Val Pro Thr Leu Leu Arg Asp 610 615 620 gac gat gcc gga atg ctg aag ggc tgg agc tgg gac cag gcc ttg tct 2399 Asp Asp Ala Gly Met Leu Lys Gly Trp Ser Trp Asp Gln Ala Leu Ser 625 630 635 gag gcc ctc tcg gtc gcg tcg cag aac ctg acc ggg cga agc tgg ggc 2447 Glu Ala Leu Ser Val Ala Ser Gln Asn Leu Thr Gly Arg Ser Trp Gly 640 645 650 655 gaa gag cat cgg ccg cgc ttc acg cat ccg ctt gcc acg caa ttc ccg 2495 Glu Glu His Arg Pro Arg Phe Thr His Pro Leu Ala Thr Gln Phe Pro 660 665 670 gcc tgg gcg ggg ctg ctg aat ccg gct tcc cgt ccg atc ggt ggc gat 2543 Ala Trp Ala Gly Leu Leu Asn Pro Ala Ser Arg Pro Ile Gly Gly Asp 675 680 685 ggc gat acc gtg ctg gcg aac ggg ctc gtc ccg tca gcc ggg ccg cag 2591 Gly Asp Thr Val Leu Ala Asn Gly Leu Val Pro Ser Ala Gly Pro Gln 690 695 700 gcg acc tat ggt gcc ctg tcg cgc tac gtc ttc gat gtc ggc aat tgg 2639 Ala Thr Tyr Gly Ala Leu Ser Arg Tyr Val Phe Asp Val Gly Asn Trp 705 710 715 gac aat agc cgc tgg gtc gtc ttc cac ggc gcc tcc ggg cat ccg gcc 2687 Asp Asn Ser Arg Trp Val Val Phe His Gly Ala Ser Gly His Pro Ala 720 725 730 735 agc gcc cat tat gcc gat cag aat gcg ccc tgg agc gac tgt gcg atg 2735 Ser Ala His Tyr Ala Asp Gln Asn Ala Pro Trp Ser Asp Cys Ala Met 740 745 750 gtg ccg atg ctc tat agc tgg gac agg atc gcg gca gag gcc gtg acg 2783 Val Pro Met Leu Tyr Ser Trp Asp Arg Ile Ala Ala Glu Ala Val Thr 755 760 765 tcg cag gaa ctc gtc ccg gcctgagggc cgggcctgtt gtcagcctgc 2831 Ser Gln Glu Leu Val Pro 770 cgcagctctc ttcggc 2847 <210> 3 <211> 2325 <212> DNA <213> Brevundimonas diminuta V22 <220> <221> CDS <222> (1)..(2322) <400> 3 atg act atg gct gcc aac acc gat cgc gcc gtc ttg cag gcg gcg ctg 48 Met Thr Met Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ala Val Leu Gln Ala Ala Leu 1 5 10 15 ccg ccg ctt tcc ggc agc ctc ccc att ccc gga ttg agc gcg tcg gtc 96 Pro Pro Leu Ser Gly Ser Leu Pro Ile Pro Gly Leu Ser Ala Ser Val 20 25 30 cct atc cag cgc gat gcc tgg ggc atc ccg cat atc aag gcc tcc ggc 144 Pro Ile Gln Arg Asp Ala Trp Gly Ile Pro His Ile Lys Ala Ser Gly 35 40 45 gag gcc gat gcc tat cgc gcg ctg ggc ttc gtc cat gcg cag gac cgc 192 Glu Ala Asp Ala Tyr Arg Ala Leu Gly Phe Val His Ala Gln Asp Arg 50 55 60 ctt ttc cag atg gag ctg acg cgt cgc aag gcg ctg gga cgc gcg gcc 240 Leu Phe Gln Met Glu Leu Thr Arg Arg Lys Ala Leu Gly Arg Ala Ala 65 70 75 80 gaa tgg ctg ggt gcc gag gcc gcc gag gcc gat atc ctc gtg cgc cgg 288 Glu Trp Leu Gly Ala Glu Ala Ala Glu Ala Asp Ile Leu Val Arg Arg 85 90 95 ctc ggt atg gaa aaa gtc tgc cga cgc gat ttc gag gcc ctg ggc gcc 336 Leu Gly Met Glu Lys Val Cys Arg Arg Asp Phe Glu Ala Leu Gly Ala 100 105 110 gag gcg aag gac atg ctc cgg gcc tac gtc gcc ggc gtg aac gca ttc 384 Glu Ala Lys Asp Met Leu Arg Ala Tyr Val Ala Gly Val Asn Ala Phe 115 120 125 ctg gct tcc ggt gtt ccc ctg cct gtc gaa tac gga ttg ctc gga gca 432 Leu Ala Ser Gly Val Pro Leu Pro Val Glu Tyr Gly Leu Leu Gly Ala 130 135 140 gag ccg gag ccc tgg gag cct tgg cac agc atc gcg gtg atg cgc cgg 480 Glu Pro Glu Pro Trp Glu Pro Trp His Ser Ile Ala Val Met Arg Arg 145 150 155 160 ctg ggc ctg ctg atg ggt tcg gtc tgg ttc aag ctc tgg cgg atg ctg 528 Leu Gly Leu Leu Met Gly Ser Val Trp Phe Lys Leu Trp Arg Met Leu 165 170 175 gcg ctg ccg gtg gtc gga gcc gcg aat gcg ctg aag ctg cgc tat gac 576 Ala Leu Pro Val Val Gly Ala Ala Asn Ala Leu Lys Leu Arg Tyr Asp 180 185 190 gat ggc ggc cgc gat ttg ctc tgc atc ccg ccg cgc gcc gaa gcg gat 624 Asp Gly Gly Arg Asp Leu Leu Cys Ile Pro Pro Arg Ala Glu Ala Asp 195 200 205 cgg ctc gag gcg gat ctc gcg acc ctg cgg ccc gcg gtc gat gcg ctg 672 Arg Leu Glu Ala Asp Leu Ala Thr Leu Arg Pro Ala Val Asp Ala Leu 210 215 220 ctg aag gcg atg ggc ggg gat gcc tca gat gcc gcc ggt ggc ggc agc 720 Leu Lys Ala Met Gly Gly Asp Ala Ser Asp Ala Ala Gly Gly Gly Ser 225 230 235 240 aac aac tgg gcg gtc gcg ccg ggc cgt acg gcg acc ggc cgg ccg atc 768 Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro Ile 245 250 255 ctc gcg ggc gat ccg cat cgc gtc ttc cag atc ccc ggc atg tat gcc 816 Leu Ala Gly Asp Pro His Arg Val Phe Gln Ile Pro Gly Met Tyr Ala 260 265 270 cag cat cat ctg gcc tgc gat cgc ttc gac atg atc ggc ctg acc gtg 864 Gln His His Leu Ala Cys Asp Arg Phe Asp Met Ile Gly Leu Thr Val 275 280 285 ccg ggc gtg ccg ggt ttt ccg cat ttc gcg cat aac ggc aag gtc gcc 912 Pro Gly Val Pro Gly Phe Pro His Phe Ala His Asn Gly Lys Val Ala 290 295 300 tac tgc gtc acc cat gcc ttc atg gac att cac gat ctc tac ctt gag 960 Tyr Cys Val Thr His Ala Phe Met Asp Ile His Asp Leu Tyr Leu Glu 305 310 315 320 cag ttc gcg gag gag ggc cgc agg gcg cgg ttc ggc aac gat ttc gag 1008 Gln Phe Ala Glu Glu Gly Arg Arg Ala Arg Phe Gly Asn Asp Phe Glu 325 330 335 ccc gcc gcc tgg agc cgg gac cgt atc gcg gtc cgg ggt ggt gcc gac 1056 Pro Ala Ala Trp Ser Arg Asp Arg Ile Ala Val Arg Gly Gly Ala Asp 340 345 350 cgc gaa ttc gat atc atc gag acg cgc cat ggt ccc gtc ata gca ggc 1104 Arg Glu Phe Asp Ile Ile Glu Thr Arg His Gly Pro Val Ile Ala Gly 355 360 365 gat ccg cgc gat ggc gca gcg ctc acg ctg cgc tcg gtc cag ttc gcc 1152 Asp Pro Arg Asp Gly Ala Ala Leu Thr Leu Arg Ser Val Gln Phe Ala 370 375 380 gag acc gat ctg tcc ttc gat tgc ctg acg cgg atg ccg ggc gca tcg 1200 Glu Thr Asp Leu Ser Phe Asp Cys Leu Thr Arg Met Pro Gly Ala Ser 385 390 395 400 acc gtg gcg cag ctc tac gac gcg acg cgc ggc tgg ggc ctg atc gac 1248 Thr Val Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Thr Arg Gly Trp Gly Leu Ile Asp 405 410 415 cat aat ctc gtc gcc ggg gat gtc ggg ggc tcg atc ggc cat ctg gtc 1296 His Asn Leu Val Ala Gly Asp Val Gly Gly Ser Ile Gly His Leu Val 420 425 430 cgc gcc cgt gtc ccg tcc cgc tcg cgc gaa aac ggc tgg ctg ccg gtg 1344 Arg Ala Arg Val Pro Ser Arg Ser Arg Glu Asn Gly Trp Leu Pro Val 435 440 445 ccg ggc tgg tcc ggc gag cat gaa tgg cgg ggt tgg att ccg cac gag 1392 Pro Gly Trp Ser Gly Glu His Glu Trp Arg Gly Trp Ile Pro His Glu 450 455 460 gcg atg ccg cgc gtg atc gat ccg ccg ggc ggc atc atc gtc acg gcg 1440 Ala Met Pro Arg Val Ile Asp Pro Pro Gly Gly Ile Ile Val Thr Ala 465 470 475 480 aat aat cgc gtc gtg gcc gat gac cat ccc gat tat ctc tgc acc gat 1488 Asn Asn Arg Val Val Ala Asp Asp His Pro Asp Tyr Leu Cys Thr Asp 485 490 495 tgc cat ccg ccc tac cgc gcc gag ccc atc atg aag cgc ctg gtc gcc 1536 Cys His Pro Pro Tyr Arg Ala Glu Pro Ile Met Lys Arg Leu Val Ala 500 505 510 aat ccg gct ttc gcc gtc gac gat gcc gcc gcg atc cat gcc gat acg 1584 Asn Pro Ala Phe Ala Val Asp Asp Ala Ala Ala Ile His Ala Asp Thr 515 520 525 ctg tcg ccc cat gtc ggg ttg ctg cgc cgg agg ctc gag gcg ctt gga 1632 Leu Ser Pro His Val Gly Leu Leu Arg Arg Arg Leu Glu Ala Leu Gly 530 535 540 gcc cgc gac gac tcc gcg gcc gaa ggg ctg agg cag atg ctc gtc gcc 1680 Ala Arg Asp Asp Ser Ala Ala Glu Gly Leu Arg Gln Met Leu Val Ala 545 550 555 560 tgg gac ggc cgc atg gat gcg gct tcg gag gtc gcg tct gcc tac aat 1728 Trp Asp Gly Arg Met Asp Ala Ala Ser Glu Val Ala Ser Ala Tyr Asn 565 570 575 gcg ttc cgc agg gcg ctg acg cgg ctg gtg acg gac cgc agc ggg ctg 1776 Ala Phe Arg Arg Ala Leu Thr Arg Leu Val Thr Asp Arg Ser Gly Leu 580 585 590 gag cag gcg ata tcg cat ccc ttc gcg gct gtc gcg ccg ggc gtc tca 1824 Glu Gln Ala Ile Ser His Pro Phe Ala Ala Val Ala Pro Gly Val Ser 595 600 605 ccg caa ggc cag gtc tgg tgg gcc gtg ccg acc ctg ctg cgc gac gac 1872 Pro Gln Gly Gln Val Trp Trp Ala Val Pro Thr Leu Leu Arg Asp Asp 610 615 620 gat gcc gga atg ctg aag ggc tgg agc tgg gac cag gcc ttg tct gag 1920 Asp Ala Gly Met Leu Lys Gly Trp Ser Trp Asp Gln Ala Leu Ser Glu 625 630 635 640 gcc ctc tcg gtc gcg tcg cag aac ctg agc cgg cga agc tgg ggc gaa 1968 Ala Leu Ser Val Ala Ser Gln Asn Leu Ser Arg Arg Ser Trp Gly Glu 645 650 655 gag cat cgg ccg cgc ttc acg cat ccg ctt gcc acg caa ttc ccg gcc 2016 Glu His Arg Pro Arg Phe Thr His Pro Leu Ala Thr Gln Phe Pro Ala 660 665 670 tgg gcg ggg ctg ctg aat ccg gct tcc cgt ccg atc ggc ggc gat ggc 2064 Trp Ala Gly Leu Leu Asn Pro Ala Ser Arg Pro Ile Gly Gly Asp Gly 675 680 685 gac acc gtg ctg gcg aac ggg ctc gtc ccg tca gcc ggg ccg cag gcg 2112 Asp Thr Val Leu Ala Asn Gly Leu Val Pro Ser Ala Gly Pro Gln Ala 690 695 700 acc tat ggc gcc ctg tcg cgc tac gtc ttt gat gtc ggc aat tgg gac 2160 Thr Tyr Gly Ala Leu Ser Arg Tyr Val Phe Asp Val Gly Asn Trp Asp 705 710 715 720 aat agc cgc tgg gtc gtc ttc cac ggc gcc tcc ggg cat ccg gcc agc 2208 Asn Ser Arg Trp Val Val Phe His Gly Ala Ser Gly His Pro Ala Ser 725 730 735 gcc cat tat gcc gat cag aat gcg ccc tgg agc gac tgt gcg atg gtg 2256 Ala His Tyr Ala Asp Gln Asn Ala Pro Trp Ser Asp Cys Ala Met Val 740 745 750 ccg atg ctc tat agc tgg gac agg atc gcg gca gag gcc gtg acg tcg 2304 Pro Met Leu Tyr Ser Trp Asp Arg Ile Ala Ala Glu Ala Val Thr Ser 755 760 765 cag gaa ctc gtc ccg gcc tga 2325 Gln Glu Leu Val Pro Ala 770

Claims

베타-락탐 아실라제 활성을 갖는 모델 폴리펩티드와 비교하여 아디필-7-ADCA에 대해 1.5배 이상 개선된 시험관내 베타-락탐 아실라제 활성을 갖는, II형 베타-락탐 아실라제 활성을 갖는 모델 폴리펩티드의 변이체인 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제.
슈도모나스(Pseudomonas)의 SE83-acyII 아실라제의 아미노산 서열(서열번호 1)의 아미노산 위치 번호를 이용하여, 적어도 10, 29, 161, 270, 274, 280, 296, 314, 442, 514, 589, 645, 694, 706 및 726번 위치로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 위치에서 변형된, II형 베타-락탐 아실라제 활성을 갖는 모델 폴리펩티드의 변이체인 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제.
제 1 항에 있어서,

슈도모나스의 SE83-acyII 아실라제의 아미노산 서열(서열번호 1)의 아미노산 위치 번호를 이용하여, 적어도 10, 29, 161, 270, 274, 280, 296, 314, 442, 514, 589, 645, 694, 706 및 726번 위치로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 위치에서 변형된 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

II형 베타-락탐 아실라제 활성을 갖는 모델 폴리펩티드가 슈도모나스의 SE83-acyII 아실라제(서열번호 1), 브레분디모나스 디미누타(Brevundimonas diminuta)로부터의 N176(서열번호 2) 및 브레분디모나스 디미누타로부터의 V22 아실라제(서열번호 3), 및 70% 이상의 서열번호 1과의 동일성 퍼센트 또는 70% 이상의 서열번호 2와의 동일성 퍼센트 또는 70% 이상의 서열번호 3과의 동일성 퍼센트를 갖는 아미노산 서열을 갖는 II형 베타-락탐 아실라제 활성을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택되는 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제.
제 4 항에 있어서,

모델 폴리펩티드가 슈도모나스의 SE83-acyII 아실라제(서열번호 1)인 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

바람직하게는 10, 29, 270, 274, 280, 296, 314, 442, 514, 589, 645, 694, 706 및 726번으로 이루어진 군에서 선택된 위치에서 하나 이상의 다른 변형과 함께, 161번 위치에서 변형된 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
제 7 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 또는 카세트.
제 7 항의 폴리뉴클레오티드 또는 제 8 항의 벡터 또는 카세트로 형질전환된 숙주 세포.
돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제의 생성을 촉진하는 조건하에서 제 9 항에 따른 숙주 세포를 배양하고, 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는, 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제를 사용하여 주목되는 베타-락탐 화합물의 아실화 전구체를 탈아실화시키는 단계를 포함하는, 주목되는 탈아실화 베타-락탐 화합물의 제조 방법.
제 11 항에 있어서,

주목되는 탈아실화 베타-락탐 화합물이 6-APA, 7-ACA, 7-ADCA, 7-ADAC 또는 7-아미노-3-카바모일옥시메틸-3-세펨-4-카복실산인 방법.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,

주목되는 베타-락탐 화합물의 아실화 전구체의 아실 기가 다이카복실산의 기, 바람직하게는 석시닐, 글루타릴, 아디필, 알파-케토아디필 및 아미노아디필, 보다 바람직하게는 아디필에 속하는 방법.
제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,

돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제가 고정화된 형태로 사용되는 방법.
주목되는 베타-락탐 화합물의 아실화 전구체의 탈아실화를 위한, 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제의 용도.
제 15 항에 있어서,

주목되는 베타-락탐 화합물이 7-ADCA 또는 7-ACA인 용도.
제 15 항 또는 제 16 항에 있어서,

주목되는 베타-락탐 화합물의 아실화 전구체가 다이카복실산의 기, 바람직하게는 석시닐, 글루타릴, 아디필, 알파-케토아디필 및 아미노아디필, 보다 바람직하게는 아디필에 속하는 용도.
제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,

돌연변이 II형 베타-락탐 아실라제가 고정화된 형태로 사용되는 용도.