KR100530299B1 - 변이 세팔로스포린 ｃ 아실라제 및 이를 이용한 7-ａｃａ 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 슈도모나스 속 SE83 (Pseudomonas sp. SE83) 균주 유래의 세팔로스포린 C 아실라제 (cephalosporin C acylase; CPC 아실라제)로부터 단백질 공학 기술에 의해 제조된 변이 CPC 아실라제 및 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유한 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체, 변이 세팔로스포린 C 아실라제의 제조방법 및 상기 형질전환체의 배양물 또는 그 처리물을 이용한 세팔로스포린 화합물의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 변이 CPC 아실라제는 CPC 기질에 대한 반응성이 매우 우수하여 CPC로부터 7-ACA를 직접 제조하는 1단계 효소반응법에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

변이 세팔로스포린 Ｃ 아실라제 및 이를 이용한 7-ＡＣＡ 제조방법{CEPHALOSPORIN C ACYLASE MUTANT AND METHOD FOR PREPARING 7-ACA USING SAME}

본 발명은 슈도모나스 속 SE83 균주 유래의 야생형 세팔로스포린 C 아실라제로부터 단백질 공학 기술에 의해 제조된 변이 세팔로스포린 C 아실라제 및 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유한 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체, 변이 세팔로스포린 C 아실라제의 제조방법 및 상기 형질전환체의 배양물 또는 그 처리물을 이용한 세팔로스포린 화합물의 제조방법에 관한 것이다.

세팔로스포린 C (Cephalosporin C, 이하 "CPC"라고 약칭함)는 베타-락탐 (β-lactam)계 항생물질로서 사상균 곰팡이인 아크레모니움 크리소제눔 (Acremonium chrysogenum)과 같은 일부 미생물에 의해서 생산되며, 그람음성 세균에 대해 세포벽 합성저해를 통해 항생활성을 나타내지만, 그 정도가 매우 미약하기 때문에 주로 반합성 세팔로스포린계 항생제 (semi-synthetic cephalosporin antibiotics)의 원료물질을 제조하는데 이용되고 있다. 특히, CPC로부터 아미노아디포일 곁가지 (D-α-aminoadipoyl side chain)가 제거된 7-아미노세팔로스포란산 (7-aminocephalosporanic acid, 이하 "7-ACA"라고 약칭함)이 전세계 항생제 시장의 40% 이상을 점유하는 대부분의 반합성 세팔로스포린계 항생제의 원료물질로 사용되고 있다.

CPC로부터 7-ACA를 제조하기 위한 종래의 공법으로서는 화학공법과 효소공법이 있다. 7-ACA의 전통적인 제조방법은 미생물 발효로 생산된 CPC로부터 화학적으로 합성하는 방법이었다. 화학적 합성공법에 의한 7-ACA 생산공정은 영국의 글락소 (Glaxo)사 등에 의해 실리 (silly)기를 아민 (amine)기와 카르복실 (carboxyl)기 모두에 보호기로 사용하여 CPC로부터 7-ACA를 합성하는 공법이 개발된 이후로 전세계적으로 7-ACA의 주요한 생산방법으로 사용되고 있다. 그러나, 이와 같은 화학적 합성방법은 90% 수준의 높은 수율을 나타내는 등의 장점이 있기는 하나, 반응조건이 복잡하고 비경제적이라는 단점이 있다. 뿐만 아니라, 다량의 유독 화학물질과 유기용매들을 사용하므로 환경 처리비용 증가 등의 문제점들을 초래하고 있다. 따라서, 이에 대한 대안으로서 근래에 환경친화적인 공법인 효소를 이용한 7-ACA 제조방법으로 대체되고 있는 추세이다.

현재 상업적으로 사용되고 있는 효소공법은 제1단계로 D-아미노산 산화효소 (D-amino acid oxidase, 이하 "DAO"라고 약칭함)의 효소반응에 의해 CPC를 글루타릴-7-아미노세팔로스포린산 (Glutaryl-7-aminocephalosporanic acid, 이하 "GL-7-ACA"라고 약칭함)으로 전환시키고, 제2단계로 GL-7-ACA 아실라제 효소반응에 의해 GL-7-ACA를 7-ACA로 전환시키는 2단계 효소반응법이다 (도 1 참조). 그러나, 이 방법은 CPC로부터의 7-ACA 수율이 화학합성법보다 낮은데, 이의 주된 이유는 DAO를 사용하는 첫 번째 반응시에 발생하는 과산화수소가 DAO의 기질이나 반응산물을 공격하여 부산물의 생성이 많아지고, 그로 인해 GL-7-ACA의 수율이 떨어지기 때문이다. 따라서, CPC의 7번 위치의 아미노기 결합을 절단하여 아미노아디포일 곁가지를 제거함으로써 CPC로부터 직접 7-ACA를 제조할 수 있는 세팔로스포린 C 아실라제 (cephalosporin C acylase, 이하 "CPC 아실라제"라고 약칭함)를 사용하여 CPC를 바로 7-ACA로 전환시킬 수 있는 1단계 효소반응법이 개발된다면 종래의 화학합성법이나 2단계 효소반응법에 비하여 확실한 경쟁우위를 가질 수 있을 것으로 기대된다.

한편, 2단계 효소반응법에 사용되고 있는 GL-7-ACA 아실라제는 CPC에 대한 활성을 전혀 나타내지 않는 효소와 미약하기는 하지만 CPC에 대한 활성을 나타내는 효소의 2종류로 구분할 수 있다. 이 중에서 GL-7-ACA에 대한 비활성에 비해서는 매우 미약하기는 하지만 CPC에 대한 활성을 가지고 있는 GL-7-ACA 아실라제를 CPC 아실라제 (또는 CPC 아미다제, CPC 아미도하이드롤라제 등)로 혼용하고 있다. 이와 같은 CPC 아실라제는 슈도모나스 속 SE83 균주 (Matsuda 등, J. Bacteriol. 169: 5815-5820, 1987), 슈도모나스 속 N176 균주 (Aramori 등, J. Ferment. Bioeng. 72: 232-243, 1991), 슈도모나스 속 V22 균주 (Aramori 등, J. Ferment. Bioeng. 72: 232-243, 1991), 슈도모나스 속 130 균주 (Yang 등, Chin. J. Biotech. 7: 99-107, 1991), 슈도모나스 베시큘라리스 B965 균주 (미국특허 제6,297,032호), 바실러스 메가테리움 균주 (미국특허 제5,104,800호), 에어로모나스 속 ACY95 균주 (Ambedkar 등, Process Biochem. 32: 305-307, 1997), 아스로박터 비스코스 ATCC 53594 균주 (미국특허 제4,981,789호) 등에서 발견되고 있다. 상기 CPC 아실라제 생산 균주로부터 현재까지 몇 종류의 CPC 아실라제 유전자가 클로닝되어 그 염기서열이 밝혀졌다; 일본 아사히 화학공업사의 슈도모나스 속 SE83 균주 유래 acyⅡ 유전자 (Matsuda 등, J. Bacteriol., 169: 5821-5826, 1987), 일본 후지사와 제약사의 슈도모나스 속 N176 균주 유래 CPC 아실라제 유전자 (미국특허 제5,192,678호), 일본 후지사와 제약사의 슈도모나스 속 V22 균주 유래 CPC 아실라제 유전자 (Aramori 등, J. Ferment. Bioeng. 72: 232-243, 1991), 영국 글락소사의 슈도모나스 베시큘라리스 B965 균주 유래 CPC 아미도하이드롤라제 유전자 (미국특허 제6,297,032호), 미국 머크사의 바실러스 메가테리움 유래 CPC 아미다제 유전자 (미국특허 제5,229,274호), 중국 샹하이 생화학 연구소의 슈도모나스 속 130 균주 유래 CPC 아실라제 유전자 (Li 등, Eur. J. Biochem. 262: 713-719, 1999). 그러나, 이들 CPC 아실라제들은 CPC 7번 위치의 아미노기 결합에 대한 가수분해 활성이 너무 낮아서 7-ACA 제조를 위한 1단계 효소공법에 적용하기에는 어려운 실정이다.

따라서, 이들 CPC 아실라제의 CPC 기질에 대한 반응성을 증가시키기 위해서 단백질 공학 기술을 적용한 효소활성 개량연구가 진행되어 왔는데, 특히 일본 후지사와 제약사에서는 슈도모나스 속 N176 균주 유래의 CPC 아실라제 유전자를 돌연변이시켜 CPC 아실라제의 CPC에 대한 비활성을 약 2.5배 증가시켰다 (미국특허 제5,804,429; 미국특허 제5,336,613호; 일본특허공보 제1995-222587호; 일본특허공보 제1996-098686호; 일본특허공보 제1996-205864호). 그러나, 이와 같은 변이 CPC 아실라제의 경우에도 여전히 낮은 CPC에 대한 비활성과 반응산물인 7-ACA에 의한 효소활성 저해현상 때문에 CPC를 7-ACA로 전환하는 효율이 매우 낮아서 아직까지 CPC에서 7-ACA를 직접 생산하는 1단계 효소공법에 적용하기 어려운 실정이다.

7-ACA 제조를 위한 1단계 효소공법에 적용할 CPC 아실라제를 개발하기 위하여, 효소개량에 필요한 정보를 얻기 위한 목적으로 GL-7-ACA 아실라제의 3차 구조를 밝히기 위한 연구가 최근에 진행되었다. 이는 GL-7-ACA 아실라제의 활성부위 구조를 밝히고 그 정보를 바탕으로 부위특이 돌연변이 (site-directed mutagenesis)를 수행함으로써 CPC에 대한 반응성을 증진시키고자 함이었다. 이러한 연구의 일환으로 최근에 본 발명자들에 의해서 세계 최초로 GL-7-ACA 아실라제의 3차 구조가 규명된 바 있는데, 본 발명자들은 슈도모나스 속 KAC-1 균주 유래의 GL-7-ACA 아실라제 (Kim 등, Biotech. Lett. 23: 1067-1071, 2001; 이하 "CAD"라고 약칭함)에 대해서 아포효소의 3차 구조 (Kim 등, Structure 8: 1059-1068, 2000) 및 CAD에 GL-7-ACA 기질이 결합된 효소-기질 복합체의 3차 구조 (Kim 등, Chem. Biol. 8: 1253-1264, 2001; Kim 등, J. Biol. Chem. 276: 48376-48381, 2001)를 규명하였다. 효소-기질 복합체의 2.6Å 분해능으로 결정된 3차 구조는 기질인 GL-7-ACA 중의 글루타릭산 (glutarate) 곁가지가 활성부위의 움푹 패인 결합부위에 결합되어 있는 모습을 보여주고 있다 (도 2 참조). 즉, 기질 친화도를 결정하는 인자는 기질의 곁가지라는 것을 미루어 짐작할 수 있다. CAD의 기질 결합양식을 살펴보면, CAD는 GL-7-ACA 기질의 아세톡시기, 육각환, 사각 베타-락탐환으로 이루어진 베타-락탐 코어 부위는 활성부위 아미노산들과의 결합에 크게 기여하지 않고, 오히려 GL-7-ACA 기질의 곁가지인 글루타릭산 부위가 주위 활성부위 아미노산과 잘 짜여진 6개의 수소결합 네트워크를 이루어 CAD의 GL-7-ACA 기질에 대한 친화도를 크게 결정하고 있음을 알 수 있다 (도 3 참조). 결국, CAD의 기질 결합부위에 GL-7-ACA 기질의 글루타릭산 곁가지가 정확한 방향으로 배치됨으로써 CAD 베타 사슬의 첫 번째 잔기인 세린에 의해서 촉매작용이 일어나게 된다. 이와 같이 효소-기질 결합체의 3차 구조 분석을 통하여 CAD의 활성부위 아미노산들과 GL-7-ACA 기질과의 결합양식을 밝혀내었다.

이러한 CAD의 구조연구 결과는 GL-7-ACA 기질뿐만 아니라 CPC 기질에 대한 기질 친화도를 이해하는데 큰 도움을 줄 수 있을 것으로 기대되었다. 그런데, CAD의 기질인 GL-7-ACA에 비해 기질 친화도가 매우 낮은 CPC 기질간의 화학구조상의 차이점을 살펴보면, 베타-락탐 코어의 구조는 동일한 반면 곁가지 부위에서 약간의 차이점을 보인다 (도 3 참조). 즉, GL-7-ACA의 경우에는 곁가지가 글루타릭산으로 구성되어 있는 반면에 CPC의 경우에는 D-α-아미노아디픽산 (D-α-aminoadipic acid)으로 이루어져 있다. 따라서, CAD와 GL-7-ACA 기질과의 복합체 구조를 바탕으로 CAD와 CPC 기질과의 결합체 구조를 모델링한 결과, GL-7-ACA 기질의 글루타릭산 곁가지와 결합에 관여하는 CAD의 핵심 잔기들이 CPC의 D-α-아미노아디픽산 곁가지 말단 부위의 카르복실기 및 D-형태 아미노기와 충돌하는 것을 볼 수 있다 (도 4 참조). 이러한 "CAD 효소-CPC 기질" 복합체의 모델링 결과를 바탕으로 CAD의 기질 결합부위 내에서 CPC의 곁가지, 즉 GL-7-ACA 곁가지에 비해 추가적으로 존재하는 탄소 골격과 D-아미노기를 수용할 수 있는 공간을 확보할 수 있다면 GL-7-ACA 아실라제의 CPC 기질에 대한 활성을 증가시킬 수 있을 것으로 기대되었다. 그런데, CAD의 3차 구조는 페니실린 G 아실라제 (Penicillin G acylase, 이하 "PGA"라고 약칭함)의 3차 구조와 매우 유사하다 (Duggleby 등, Nature 373: 264-268, 1995). PGA의 경우에도 페니실린 G 기질의 베타-락탐 코어는 기질결합에 크게 기여를 하지 않고 기질의 곁가지가 기질결합에 큰 영향을 미친다. 또한, PGA와 CAD의 활성부위가 거의 유사하여 기질결합 및 반응양식이 유사할 뿐만 아니라 활성부위 주변은 매우 견고한 구조를 가지고 있다. 이러한 사실들로부터 다른 슈도모나스 속 균주 유래의 GL-7-ACA 아실라제의 경우에도 CAD의 기질결합 및 반응양식과 매우 유사할 것으로 유추되었다. 실제, 독일 아벤티스사에서는 슈도모나스 속 균주 유래의 GL-7-ACA 아실라제의 구조분석을 통하여 GL-7-ACA 아실라제의 활성부위 구조가 PGA 또는 CAD의 활성부위 구조와 매우 유사함을 밝혀냈으며, 이를 토대로 슈도모나스 속 GL-7-ACA 아실라제의 CPC에 대한 반응성을 높이기 위한 목적으로 부위특이 돌연변이를 수행할 잔기들을 제시하기도 하였다 (Fritz-Wolf 등, Protein Sci. 11: 92-103, 2002). 따라서, CAD의 "효소-기질" 결합체에 대한 구조정보는 CPC에 대한 기질 친화도가 낮은 여러 슈도모나스 속 균주 유래 GL-7-ACA 아실라제에 대해서 활성부위를 변이시켜 CPC에 대한 활성이 증가된 CPC 아실라제를 개발하는데 중요한 핵심 정보를 제공하게 될 것으로 기대된다.

이에, 본 발명자들은 7-ACA 제조를 위한 1단계 효소공법에 적용이 가능한 CPC 아실라제를 개발하기 위해서 예의 연구 노력한 결과, 슈도모나스 속 SE83 균주 유래의 야생형 CPC 아실라제로부터 단백질 공학 기술에 의해 CPC에 대한 반응성이 증대된 변이 CPC 아실라제를 제조하였고, 유전자 재조합 기술을 이용하여 상기 변이 CPC 아실라제 유전자를 포함하는 발현벡터 및 이를 함유한 형질전환체를 제조한 후, 상기 형질전환체의 배양물로부터 정제된 변이 CPC 아실라제를 이용한 효소반응을 통해 반응액 내의 CPC 기질이 7-ACA로 90% 이상 전환되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 CPC 기질에 대한 반응성이 매우 우수하여 CPC 기질을 7-ACA로 효율적으로 전환시킬 수 있는 변이 CPC 아실라제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 변이 CPC 아실라제를 암호화하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 CPC 아실라제를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 숙주세포를 적합한 배양조건 하에서 배양시키고 상기 배양액으로부터 변이 CPC 아실라제를 회수하는 단계를 포함하는, 변이 CPC 아실라제의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 변이 CPC 아실라제를 이용한 7-ACA의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 슈도모나스 속 SE83 균주 유래의 야생형 CPC 아실라제로부터 제조되고 CPC 기질에 대한 반응성이 증대된 변이 CPC 아실라제의 아미노산 서열 및 이와 기능적으로 동등한 유도체 서열을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 변이 CPC 아실라제를 암호화하는 유전자 서열 및 이와 기능적으로 동등한 유도체 서열을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 유전자 서열을 포함하는 재조합 발현벡터 및 상기 유전자 서열 또는 발현벡터에 의해 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환된 숙주세포를 이용한 변이 CPC 아실라제의 제조방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 변이 CPC 아실라제 또는 변이 CPC 아실라제를 유효성분으로 함유하는 조성물 및 이를 고정화 등의 방법으로 가공한 처리물을 이용한 CPC로부터 7-ACA 또는 그의 염의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 있어서 "CPC 기질에 대한 반응성의 증가"란, CPC 기질에 대한 비활성 (specific activity)의 증가 또는/및 반응산물에 의한 효소활성 저해 (end-product inhibition) 현상의 감소를 의미한다.

본 발명에 있어서 "이와 기능적으로 동등한 유도체"란, 본 발명에 의한 변이 CPC 아실라제의 기능적인 특성을 갖는 CPC 아실라제 유도체를 의미한다. 즉, 변이 CPC 아실라제의 기능적인 유도체는 본 발명에 의한 CPC 아실라제의 일반적인 특성을 갖는 것으로, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 첨가된 천연, 합성 또는 재조합에 의한 폴리펩티드나 폴리펩티드 단편, 돌연변이체 등의 변이형을 모두 포괄한다.

본 발명에 있어서 "변이 CPC 아실라제 처리물"이란, 변이 CPC 아실라제를 유리 상태가 아닌 고정화시킨 상태로 사용하는 것으로 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 통상적으로 사용가능한 담체를 공유결합, 이온결합, 소수성결합, 물리적 흡착, 마이크로인캡슐레이션 (microencapsulation) 등에 의해 변이 CPC 아실라제에 결합시킨 것이다. 또한, 상기 처리물은 변이 CPC 아실라제를 따로 정제할 필요가 없이 변이 CPC 아실라제를 함유한 미생물 세포를 그대로 고정화하는 전세포 고정화 (whole cell immobilization) 방법에 의해서도 제조될 수 있다.

본 발명에 있어서 "GL-7-ACA 아실라제"란, 가장 포괄적인 의미로 GL-7-ACA를 7-ACA로 전환시키는 효소를 의미하고, "CPC 아실라제"란 GL-7-ACA 아실라제 중에서 CPC 기질에 대한 활성을 가지고 있는 효소로 CPC의 7번 위치의 아미노기 결합을 절단하여 아미노아디포일 곁가지를 제거함으로써 CPC로부터 직접 7-ACA를 제조할 수 있는 효소를 의미하며, "CAD"란 슈도모나스 속 (Pseudomonas sp.) KAC-1 유래 GL-7-ACA 아실라제를 의미한다.

본 발명은 슈도모나스 속 SE83 균주 유래의 야생형 CPC 아실라제로부터 제조되고 CPC 기질에 대한 반응성이 증대된 변이 CPC 아실라제의 아미노산 서열 및 이와 기능적으로 동등한 유도체 서열; 및 상기 변이 CPC 아실라제를 암호화하는 유전자 서열 및 이와 기능적으로 동등한 유도체 서열을 제공한다.

본 발명에서는 CPC 아실라제 개발을 위한 기본 유전자로서 일본 아사히 화학공업사에 의해 밝혀진 슈도모나스 속 SE83 균주 유래 CPC 아실라제 유전자 ("acyⅡ 유전자")를 사용하였다 (Matsuda 등, J. Bacteriol. 169: 5821-5826, 1987; GenBank M18278). 본 발명에서는 CPC 아실라제 유전자의 공지된 염기서열을 바탕으로 DNA 합성기를 사용하여 acyⅡ 유전자를 합성한 후에 새로이 합성된 acyⅡ 유전자를 변이 CPC 아실라제 개발을 위한 기본 유전자로 사용하였다. 그러나, acyⅡ 유전자를 합성할 때 공지된 염기서열과 동일하게 합성하지 않고 대장균에서의 단백질 합성효율을 증대시키기 위하여 아미노산 서열은 공지된 서열과 동일하지만 각 아미노산을 암호화하는 코돈을 대장균에서 합성이 잘되는 단백질들에서 자주 사용되는 코돈 위주로 염기서열을 합성하였다. 예를 들면, 문헌상의 페닐알라닌에 대한 코돈은 TTC로만 이루어져 있고, 아르기닌에 대한 코돈은 CGC와 CGG 코돈이 주로 사용되고 있는데 반해, 본 발명에 따른 합성 유전자에서는 페닐알라닌에 대한 코돈이 TTT 코돈으로만 이루어져 있고, 아르기닌에 대한 코돈 역시 CGT 코돈으로만 이루어져 있다. 이와 같은 방법으로 합성된 acyⅡ 유전자의 염기서열은 서열번호: 1로 기재되는 2,325개의 염기로 구성되어 있으며, 이는 서열번호: 2로 기재되는 774개의 아미노산을 암호화한다. 본 발명에 따른 합성 유전자로부터 번역되는 서열번호: 2의 아미노산 서열은 문헌에 공지된 CPC 아실라제의 아미노산 서열과 동일하지만 서열번호: 1로 기재되는 합성 유전자의 염기서열은 약 18%가 문헌상의 염기서열과 다르게 구성되어 있다.

대부분의 GL-7-ACA 아실라제 (또는 CPC 아실라제) 유전자로부터 번역되는 아미노산 서열은 알파-서브유닛 (α-subunit), 스페이서 펩티드 (spacer peptide) 및 베타-서브유닛 (β-subunit)의 순으로 구성되어 있다. 본 발명에서 기본 유전자로 사용한 슈도모나스 속 SE83 균주 유래의 야생형 CPC 아실라제는 대장균 등의 숙주세포 내에서 전사 및 번역과정을 거쳐서 약 84 kDa 크기의 불활성 단일사슬로 이루어진 폴리펩티드가 생성되고, 그 후 서열번호: 2의 아미노산 서열의 230번째 아미노산과 231번째 아미노산 사이, 그리고 239번째 아미노산과 240번째 아미노산 사이에서 각각 자체적인 절단이 일어나 9개의 아미노산으로 구성된 스페이서 펩티드가 떨어져 나가고, 약 25 kDa 크기의 알파-서브유닛과 약 58 kDa 크기의 베타-서브유닛이 분리되는 것으로 유추된다. 그 후에 알파-서브유닛과 베타-서브유닛 각각 1개가 소수성 결합 등에 의하여 결합된 83 kDa 크기의 이량체 형태로 생성되어 비로소 아실라제 활성을 갖게 된다. 그런데, 원핵생물 내에서 유전자 산물의 합성시 번역개시에 필요한 개시코돈인 메티오닌은 번역 후에 제거되는 것이 일반적이므로 결국 본 발명의 변이에 사용된 활성형의 야생 CPC 아실라제는 229개의 아미노산으로 구성된 알파-서브유닛 (서열번호: 4)과 535개의 아미노산으로 구성된 베타-서브유닛 (서열번호: 5)으로 이루어져 있다.

GL-7-ACA 아실라제 (또는 CPC 아실라제)는 숙주세포 내에서 해당 유전자의 전사 및 번역 후에 적절한 자체절단이 일어나지 않으면 불활성의 폴리펩티드가 만들어지게 된다. 따라서, 숙주세포 내에서의 자체절단 효율이 활성 단백질을 얻는데 중요한 인자로 작용한다. 그런데, 숙주세포 내에서의 아실라제 과잉 생산, 스페이서 펩티드 또는 성숙 단백질 (mature protein) 내의 특정 아미노산의 돌연변이 등 여러 경우에 적절한 자체절단 효율이 낮아져 불활성 단백질이 다량 생성된다 (Li 등, Eur. J. Biochem. 262: 713-719, 1999; Kim 등, J. Biol. Chem. 276: 48376-48381, 2001). 따라서, CPC 아실라제의 특정 특성을 개량하고자 할 때 반응특성을 증진시킬 수 있는 특정 아미노산의 돌연변이가 자체절단 효율에 영향을 미치는 경우는 반응특성 증진에 관여하는 아미노산을 선발하기가 어려워진다. 즉, 숙주세포 내에서 CPC 아실라제 유전자의 전사 및 번역 후에 생성된 불활성 폴리펩티드의 자체절단 효율의 변화는 활성형 CPC 아실라제의 생산성 변화로 연결되기 때문에 활성형의 변이 CPC 아실라제를 정제하여 그 반응특성을 확인하지 않고서는 특정 반응특성이 개선된 변이 CPC 아실라제를 선발하는 것이 어려워진다. 따라서, 이러한 문제점을 극복하기 위해서, 본 발명에서는 서열번호: 1의 염기서열을 기본으로 하여 번역 단계에서 알파-서브유닛과 베타-서브유닛이 개별적으로 생성되어 자체적인 절단과정을 생략할 수 있는 서열번호: 3의 염기서열을 갖는 CPC 아실라제 유전자를 고안하였다. 서열번호: 3의 염기서열을 갖는 CPC 아실라제 유전자는 CPC 아실라제 유전자 acyⅡ로부터 암호화되는 서열번호: 2의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 암호화하지만, 스페이서 펩티드를 암호화하는 염기서열 (서열번호: 2의 아미노산 서열 중 231~239번째 부위)이 다른 염기서열로 대체되어 있다. 즉, 알파-서브유닛의 마지막 아미노산을 암호화하는 글리신 코돈 뒤에 번역 종결코돈을 삽입하고 이어서 제한효소 인식부위를 포함한 임의의 염기서열, -AGGA-로 대표되는 리보좀 결합부위를 암호화하는 염기서열, 또 다른 임의의 염기서열, 번역 개시코돈인 메티오닌 코돈의 순서로 연결된 염기서열을 베타-서브유닛의 첫 번째 아미노산을 암호화하는 세린 코돈 앞에 배열함으로써 알파-서브유닛과 베타-서브유닛을 암호화하는 염기서열이 개별적으로 구조유전자를 구성하게 하여 아실라제 유전자를 하나의 오페론 형태로 제조한 것이다. 이와 같이 제조된, 서열번호: 3으로 기재되는 염기서열을 가지며, 알파-서브유닛과 베타-서브유닛이 개별적으로 생성되는 CPC 아실라제 유전자를 sem으로 명명하였다. 따라서, 본 발명에 따른 CPC 아실라제 유전자 sem을 적절한 발현벡터에 삽입한 후 숙주세포 내로 도입하면 알파-서브유닛과 베타-서브유닛이 개별적으로 생성된 후 숙주세포 내에서 이들의 자연적 접촉을 통해 알파-서브유닛과 베타-서브유닛이 결합된 활성형의 이량체 아실라제가 생성될 것으로 기대된다. 실제로, 서열번호: 1의 CPC 아실라제 유전자 DNA (acyⅡ)와 서열번호: 3의 CPC 아실라제 유전자 DNA (sem)를 포함하는 재조합 플라스미드를 각각 제조하고 이를 함유한 재조합 대장균 내에서 생성된 CPC 아실라제를 각각 순수하게 정제하여 아실라제 활성 및 반응특성을 조사한 결과, sem 유래 CPC 아실라제의 분자량, 비활성, 기질 특이성, 최적 반응온도, 최적 반응 pH 등의 특성이 acyⅡ 유래 CPC 아실라제의 특성과 동일하였다. 따라서, 알파-서브유닛과 베타-서브유닛을 개별적으로 생성하도록 하는 것은 불활성 폴리펩티드의 자체절단 효율의 변수를 제거하여 특정 아미노산의 돌연변이로 인한 반응특성의 변화를 용이하게 확인할 수 있는 장점이 있다. 이에, 본 발명에서는 서열번호: 3의 DNA를 변이 CPC 아실라제 개발을 위한 기본 DNA로 사용한다.

본 발명에 사용된 슈도모나스 속 SE83 균주 유래 CPC 아실라제 (AcyⅡ, 서열번호: 2)의 아미노산 서열의 문헌상의 번호 표기방법은 알파-서브유닛 N-말단의 메티오닌 잔기를 1번으로 시작하여 베타-서브유닛 C-말단 알라닌 잔기까지 일련 번호를 붙여서 표기하고 있다. 그러나, 숙주세포 내에서 알파-서브유닛 N-말단의 메티오닌 잔기와 스페이서 펩티드는 아실라제 유전자의 전사·번역 후에 제거되어 실제 성숙 단백질의 아미노산 서열에서는 존재하지 않는 잔기들이다. 즉, 활성형 아실라제의 아미노산 서열은 알파-서브유닛과 베타-서브유닛의 아미노산 서열로 이루어져 있다. 따라서, 본 발명에서는 실제 활성형의 성숙 아실라제에 존재하는 알파-서브유닛과 베타-서브유닛의 아미노산 서열 각각에 대해서 일련 번호를 붙여서 표기한다. 이때, CPC 아실라제 아미노산 서열 중의 특정 잔기에 대한 명명법은 이 분야에서 통상적으로 사용하고 있는 명명법을 다음과 같이 편의적으로 채용한다. 즉, 서열번호: 4의 아미노산 서열에서 알파-서브유닛의 첫 번째 잔기인 쓰레오닌은 Thr1α로 명명된다. 또한, 서열번호: 5의 베타-서브유닛의 첫 번째 잔기인 세린은 Ser1β로 명명된다. 따라서, Thr1α와 Ser1β은 서열번호: 2의 아미노산 서열에서 각각 2번째 잔기인 쓰레오닌과 240번째 잔기인 세린을 의미함은 명백하다.

한편, 본 발명에서 CPC 아실라제 아미노산 서열 중 특정 변이 잔기에 대한 명명법 또한 이 분야에서 통상적으로 사용하고 있는 명명법을 다음과 같이 편의적으로 채용한다. 즉, 알파-서브유닛의 169번째 잔기인 페닐알라닌이 티로신으로 치환된 변이 잔기는 F169αY로 표기하였다. 또 다른 예로서 I176βV는 베타-서브유닛의 176번째 잔기인 이소루이신이 발린으로 치환된 것을 의미함은 명백하다.

본 발명의 변이 CPC 아실라제는 상기에서 합성된 서열번호: 3의 CPC 아실라제 sem 유전자를 기본 DNA로 사용하여 통상의 점 돌연변이 (point mutation) 및 유전자 조작 기술을 통해 하기와 같이 제조한다 (도 5 참조).

먼저, 상기 변이 CPC 아실라제의 CPC 기질에 대한 비활성을 증대시키기 위한 방안으로 "CAD 효소-CPC 기질" 결합체의 3차 구조 모델링 및 컴퓨터 프로그램 상에서의 가상 돌연변이 (virtual mutagenesis) 결과를 바탕으로 AcyⅡ 아미노산 서열 중에서 변이 잔기를 도출한다. 이로부터 변화된 코돈에 대응하는 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제조하고, 상기 프라이머를 사용한 중합효소 연쇄반응 (PCR)에 의하여 부위특이 돌연변이를 유발한다. 돌연변이가 유발된 변이 유전자로 형질전환된 형질전환체를 제조하고, 상기 형질전환체가 생산하는 변이 CPC 아실라제의 활성을 측정하여 CPC 기질에 대한 반응성이 증대된 변이 CPC 아실라제를 선발한다. 이로부터 선발된 변이 CPC 아실라제를 암호화하는 변이 CPC 아실라제 유전자의 염기서열을 결정함으로써 본 발명의 변이 CPC 아실라제 유전자를 제조한다. 그 결과, 서열번호: 4 및 서열번호: 5로 기재되는 AcyⅡ 아미노산 서열 중 Phe169α, Met31β, Phe58β, His70β, Ile176β 잔기의 돌연변이가 CPC 아실라제의 CPC 기질에 대한 비활성 증가에 기여하는 것으로 확인되었다.

또한, 변이 CPC 아실라제의 CPC 기질에 대한 반응성을 부가적으로 증대시키기 위하여, 상기 변이 CPC 아실라제 유전자 DNA를 주형으로 에러 유발성 중합효소 연쇄반응 (error-prone PCR)을 수행하여 무작위 위치에서 점 돌연변이를 유발한다. 돌연변이가 유발된 변이 유전자들을 숙주세포에 도입하여 돌연변이 라이브러리를 제조하고, 상기 돌연변이 라이브러리로부터 CPC 기질에 대한 반응성이 증대된 변이 CPC 아실라제 함유 숙주세포를 스크리닝한다. 스크리닝된 숙주세포가 생산하는 변이 CPC 아실라제의 활성을 측정하여 CPC 반응성이 증대된 변이 CPC 아실라제를 선별하고, 상기 변이 CPC 아실라제를 암호화하는 변이 CPC 아실라제 유전자의 염기서열을 결정함으로써 본 발명의 변이 CPC 아실라제 유전자를 제조한다. 그 결과, 서열번호: 4 및 서열번호: 5로 기재되는 AcyⅡ 아미노산 서열 중 Val121α, Gly139α, Ile75β 및 Ser471β 잔기의 돌연변이가 CPC 아실라제가 CPC 기질을 7-ACA로 전환시키는 효율을 증대시키는 것으로 확인되었다.

따라서, 본 발명의 변이 CPC 아실라제는 서열번호: 4 및 서열번호: 5의 AcyⅡ 아미노산 서열에서 Val121α, Gly139α, Phe169α, Met31β, Phe58β, His70β, Ile75β, Ile176β 및 Ser471β 잔기 중 적어도 1개 이상이 다른 아미노산으로 치환되거나 이와 기능적으로 동등한 유도체의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다.

CPC 기질에 대한 반응성의 증가를 위한 상기 잔기에서 다른 아미노산으로의 치환은 글리신 (glycine), 알라닌 (alanine), 발린 (valine), 루이신 (leucine), 세린 (serine), 쓰레오닌 (threonine), 시스테인 (cystein), 이소루이신 (isoleucine), 메티오닌 (methionine), 프롤린 (proline), 페닐알라닌 (phenyalanine), 티로신 (tyrosine), 트립토판 (tryptophan), 아스파르탐산 (aspartic acid), 글루탐산 (glutamic acid), 아스파라긴 (asparagine), 글루타민 (glutamine), 히스티딘 (histidine), 리신 (lysine) 또는 아르기닌 (arginine) 잔기로의 치환을 포함한다. 보다 바람직하게, Val121α 잔기는 알라닌 잔기, Gly139α 잔기는 세린 잔기, Phe169α 잔기는 티로신 잔기, Met31β 잔기는 루이신 잔기, Phe58β 잔기는 아스파라긴 또는 메티오닌, 알라닌, 루이신, 발린, 시스테인 잔기, Ile75β 잔기는 쓰레오닌 잔기, His70β 잔기는 세린 또는 루이신 잔기, Ile176β 잔기는 발린 잔기, Ser471β 잔기는 시스테인 잔기로의 치환이 더욱 선호된다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는, Val121α 잔기가 알라닌으로, Gly139α 잔기가 세린으로, Phe58β 잔기가 아스파라긴으로, Ile75β 잔기가 쓰레오닌으로, Ile176β 잔기가 발린으로, Ser471β 잔기가 시스테인으로 치환된 6중 돌연변이를 갖는 변이 CPC 아실라제 S12 유전자를 제조한다. 상기 S12 유전자는 CPC 기질에 대한 비활성을 증가시키면서 반응산물에 의한 효소활성 저해를 효율적으로 감소시킨다. S12 유전자는 서열번호: 6으로 기재되는 염기서열을 가지며, S12 유전자의 발현에 의해서 생성되는 활성형의 6중 변이 CPC 아실라제는 서열번호: 7로 기재되는 알파-서브유닛과 서열번호: 8로 기재되는 베타-서브유닛을 암호화한다.

본 발명은 또한 상기 변이 CPC 아실라제와 기능적으로 동등한 CPC 아실라제 유도체를 포함한다. 즉, 변이 CPC 아실라제의 기능적인 유도체는 본 발명에 의한 CPC 아실라제의 일반적인 특성을 갖는 것으로, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 첨가된 천연, 합성 또는 재조합에 의한 폴리펩티드나 폴리펩티드 단편, 돌연변이체 등의 변이형을 모두 포괄한다.

또한, 본 발명은 상기 CPC 기질에 대한 반응성이 증가된 변이 CPC 아실라제를 암호화하는 유전자 또는 이의 기능적인 유도체를 포함한다. 바람직하게는, 서열번호: 6으로 기재되는 염기서열을 갖는 변이 CPC 아실라제를 암호화하는 유전자 또는 이의 기능적 유도체를 포함한다.

본 발명에서 기능적인 유도체란 변이 CPC 아실라제의 알파-서브유닛 및/또는 베타-서브유닛을 암호화하는 핵산의 기능적인 특성을 갖는 핵산 및 이의 유도체를 의미하는 것으로, 본 발명에 의한 변이 CPC 아실라제를 암호화하는 유전자의 기능적으로 동등한 유도체는 본 발명에 의한 특징을 갖는 변이 CPC 아실라제의 알파-서브유닛 및/또는 베타-서브유닛을 암호화한다. 따라서, 본 발명에 따른 변이 CPC 아실라제의 알파-서브유닛과 베타-서브유닛이 특정 스페이서 펩티드로 연결된 것을 암호화하는 핵산뿐만 아니라 변이 CPC 아실라제의 알파-서브유닛과 베타-서브유닛이 개별적인 구조유전자로 구성된 유전자 또한 본 발명의 권리범위에 포함된다. 아울러, 본 발명의 변이 CPC 아실라제의 알파-서브유닛만을 암호화하는 유전자와 변이 CPC 아실라제의 베타-서브유닛만을 암호화하는 유전자 또한 본 발명에 포함된다.

본 발명에 의한 변이 CPC 아실라제를 암호화하는 유전자의 유도체는 예컨대, 부위특이적 돌연변이법, 에러 유발성 중합효소 연쇄반응, 포화 돌연변이법 (saturation mutagenesis) 뿐만 아니라, 당해 분야에서 공지된 화학적 돌연변이 유발 기술과 돌연변이 재조합 기술 등에 의해 생성된 돌연변이체 모두를 포함한다.

본 발명에 의해 해석되는 핵산분자는 본 발명 핵산서열에 유전암호의 축퇴성 (codon degeneracy)에 기인한 서열을 갖는 핵산분자들뿐만 아니라, 상기 개시한 방법에 의해 제조된 변이 CPC 아실라제 유전자 염기서열 또는 아미노산 서열로부터 귀납적으로 유추가능한 서열을 갖는 분자들도 포함한다.

본 발명은 상기한 유전자의 염기서열 뿐만 아니라, 이러한 염기서열을 갖는 DNA가 삽입된 재조합 발현벡터도 포함한다. 당업자들은 DNA 절편을 벡터 내로 삽입하는 당업계에 알려진 임의의 방법에 따라 적절한 전사/해독 조절서열 및 변이 CPC 아실라제 효소 암호화 핵산서열을 이용하여 변이 CPC 아실라제를 암호화하는 발현벡터를 제조할 수 있다. 상기 재조합 발현벡터는 선택된 숙주 내에서 작용하는 한 어떠한 벡터도 적용가능한데, 예컨대 당업계에 공지된 통상적인 발현벡터인 플라스미드 (plasmid), 파지 벡터 (phage vector) 또는 숙주세포 염색체 상에서의 발현을 위한 인테그레이션 벡터 (integration vector) 등이 이용될 수 있다. 발현벡터를 구축하는 방법은 그 자체가 공지되어 있고, 예컨대 샘브룩 등의 문헌 (Sambrook 등, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)에 개시되어 있다.

상기와 같이 제조된 재조합 발현벡터는 숙주세포를 형질전환시킬 수 있다. 재조합 DNA의 적당한 발현세포로는 대장균과 바실러스 속 등의 세균, 방선균, 효모, 곰팡이, 동물세포, 곤충세포, 또는 식물세포 등이 이용될 수 있다. 예컨대, 상기한 DNA 핵산 또는 발현벡터에 의해 형질전환된 숙주세포는 대장균 (E. coli), 바실러스 속 (Bacillus sp.) 세균, 스트렙토미세스 속 (Streptomyces sp.) 방선균, 사카로미세스 속 (Saccharomyces sp.), 후미콜라 속 (Humicola sp.), 피치아 속 (Pichia sp.)과 같은 효모, 아스퍼질러스 속 (Aspergillus sp.)이나 트리코데르마 속 (Trichoderma sp.)과 같은 곰팡이, 세팔로스포리움 속 (Cephalosporium sp.)이나 아크레모니움 속 (Acremonium sp.)과 같은 CPC 생산 균주 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는, 서열번호: 6으로 기재되는 6중 변이 CPC 아실라제 유전자 S12를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 대장균 형질전환체 Escherichia coli BL21(DE3)/pET-S12를 2003년 7월 30일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다 (기탁번호: KCT 10503BP).

본 발명의 변이 CPC 아실라제 암호화 유전자 또는 이와 동등한 기능의 서열을 갖는 유전자가 삽입된 재조합 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 적당한 배지와 조건에서 배양하여 변이 CPC 아실라제를 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 변이 CPC 아실라제의 알파-서브유닛 암호화 유전자 또는 이와 동등한 기능의 서열을 갖는 유전자가 삽입된 재조합 발현벡터로 형질전환된 숙주세포와 본 발명의 변이 CPC 아실라제의 베타-서브유닛 암호화 유전자 또는 이와 동등한 기능의 서열을 갖는 유전자가 삽입된 재조합 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 각각 적당한 배지와 조건에서 배양하여 각각의 변이 CPC 아실라제 서브유닛 단백질을 제조한 후 시험관 내에서 (in vitro) 두 서브유닛 단백질을 혼합하여 변이 CPC 아실라제를 제조할 수도 있다.

상기와 같이 제조된 본 발명의 변이 CPC 아실라제를 목적산물 제조를 위해서 그대로 사용하거나 또는 정제하여 사용하는 것이 가능하다. 변이 CPC 아실라제 효소의 분리정제는 기존에 밝혀진 CPC 아실라제의 성질을 이용하여 다양한 크로마토그래피 방법에 의한 단백질 분리방법을 그대로 사용하거나 실험 목적에 맞게 약간 변형하여 사용 가능하다. 또한, 히스티딘 펩티드와 니켈 컬럼 성분과의 결합력 또는 섬유소 결합부위 (cellulose binding domain, CBD), 섬유소와의 결합력 등과 같은 특정 결합력 성질을 이용한 친화성 크로마토그래피 (affinity chromatography) 방법에 의해 변이 CPC 아실라제를 정제하는 것도 가능하다.

또한, 본 발명의 변이 CPC 아실라제를 유리 상태가 아닌 고정화시킨 상태로 사용하는 것이 가능하다. 변이 CPC 아실라제의 고정화는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 제조가 가능한데, 담체로서는 섬유소, 전분, 덱스트란, 아가로즈 (agarose) 등의 천연 폴리머; 폴리아크릴아마이드 (polyacrylamide), 폴리아크릴레이트 (polyacrylate), 폴리메타크릴레이트 (polymethacylate), 유퍼짓 C (Eupergit C) 등의 합성 폴리머; 또는 실리카 (silica), 벤토나이트 (bentonite), 금속과 같은 미네랄 등이 사용 가능하다. 또한, 이들 담체에 공유결합, 이온결합, 소수성결합, 물리적 흡착, 마이크로인캡슐레이션 (microencapsulation) 등에 의해 변이 CPC 아실라제를 결합시키는 것이 가능하다. 아울러, 이들 담체-효소 결합체가 글루타르알데히드 (glutaraldehyde), 시아노겐 브로마이드 (cyanogen bromide) 등의 작용에 의해 공유결합을 형성함으로써 변이 CPC 아실라제를 고정화시키는 것도 가능하다. 또한, 더욱 바람직한 방법으로는 변이 CPC 아실라제를 따로 정제할 필요가 없이 변이 CPC 아실라제를 함유한 미생물 세포를 그대로 고정화하여 사용하는 것도 가능하다. 이와 같은 전세포 고정화 (whole cell immobilization)시 미생물에 함유된 변이 CPC 아실라제의 반응성을 높이기 위하여 세포에 구멍을 내거나 표면발현 등의 기술을 적용할 수도 있다.

본 발명은 또한 상기 변이 CPC 아실라제를 이용하여 하기 화학식 1의 CPC 기질 화합물 또는 그의 염로부터 하기 화학식 2의 7-ACA 화합물 또는 그의 염을 제조하는 방법을 제공한다.

하기 화학식 중, R은 아세톡시 (-OCOCH₃), 하이드록시 (-OH), 수소 (-H)이다. 바람직하게는 하기 화학식의 R은 아세톡시 (-OCOCH₃)이고, 하기 화학식의 바람직한 화합물의 염 형태는 알칼리 금속 염 (예: 나트륨염, 칼륨염, 리튬염 등)이다.

당업자는 상기 제조방법에 의해 제조된 변이 CPC 아실라제 생산균주의 배양물 또는 변이 CPC 아실라제 함유 조성물의 형태로, 또는 분리된 효소를 유리 상태 또는 고정화시킨 상태로 상기 CPC 기질 화합물 (Ⅰ)과 접촉하여 상기 7-ACA 화합물 (Ⅱ)를 제조할 수 있다. 본 발명의 변이 CPC 아실라제와 상기 CPC 기질 화합물 (Ⅰ)과의 접촉은 바람직하게는 수용액 (물 또는 완충용액) 상에서 이루어진다. 바람직한 CPC 기질 화합물 (Ⅰ)의 농도는 1∼500 mM 범위 내에서, 바람직한 본 발명의 변이 CPC 아실라제의 첨가량은 0.1∼100 U/㎖ 범위 내에서, 바람직한 반응혼합액의 pH는 pH 7∼10 범위 내에서, 바람직한 반응시간은 0.1∼24시간 범위 내에서, 바람직한 반응온도는 4∼40℃ 범위 내에서 선택되어질 수 있다. 이와 같은 효소반응을 통해서 생성된 7-ACA 화합물 (Ⅱ)는 통상의 방법에 의해 반응액으로부터 분리, 정제될 수 있다.

또한, 생체 내 (in vivo)에서 본 발명의 변이 CPC 아실라제와 상기 CPC 기질 화합물 (Ⅰ)의 접촉을 통해 상기 7-ACA 화합물 (Ⅱ)를 제조할 수 있다. 상기 CPC 기질 화합물 (Ⅰ)의 생합성 능력을 가지고 있는 아크레모니움 크리소제놈 같은 균주에 본 발명의 변이 CPC 아실라제 암호화 유전자 또는 이와 동등한 기능의 서열을 갖는 유도체가 삽입된 재조합 발현벡터를 도입하고, 상기 형질전환체를 적당한 배지와 조건에서 배양하게 되면 형질전환체 내에서 생합성된 CPC 기질 화합물 (Ⅰ)과 본 발명의 변이 CPC 아실라제의 자연스러운 접촉을 통하여 7-ACA 화합물 (Ⅱ)가 제조될 수 있다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용효과를 실시예를 통하여 보다 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적일 뿐 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> CPC 기질에 대한 반응성이 증대된 변이 CPC 아실라제의 제조

<1-1> 구조정보에 근거한 변이 CPC 아실라제의 제조

<1-1-1> 구조정보에 근거한 AcyⅡ 변이 잔기의 도출

최근에 CAD 효소와 GL-7-ACA 기질이 결합된 복합체의 3차 구조가 결정되었다 (Kim 등, Chem. Biol. 8: 1253-1264, 2001; Kim 등, J. Biol. Chem. 276: 48376-48381, 2001). 도 3에 나타난 바와 같이, CAD의 기질 결합부위에 존재하는 Arg57β, Tyr33β, Tyr149α 및 Arg155α는 기질인 GL-7-ACA와 직접적으로 수소결합을 형성하며, Phe177β, Leu24β 및 Val70β와 같은 잔기들은 소수성 상호작용에 의해 기질과 결합한다. 그리고, Gln50β는 기질과 직접적으로 수소결합이나 소수성 상호작용을 하지는 않지만 Arg57β 및 Tyr149α 잔기와 수소결합을 형성함으로써 이들 두 잔기가 촉매작용을 위한 적절한 위치로 자리잡을 수 있도록 도와주는 역할을 한다. 그런데, CAD 효소와 GL-7-ACA 기질의 결합에 있어서, GL-7-ACA 기질의 아세톡시기, 육각환, 사각 베타-락탐환으로 이루어진 베타-락탐 코어 부위는 활성부위 잔기들과의 결합에 크게 기여하지 않고, 오히려 GL-7-ACA 기질의 곁가지인 글루타릭산 부위가 Arg57β, Tyr33β, Tyr149α 및 Phe177β 등의 잔기와 정교하게 결합함으로써 기질 결합에 가장 큰 영향을 미치는 것으로 확인되었다 (도 2 및 도 3). 또한, Leu24β, Val70β 등은 기질이 적절한 위치로 자리잡을 수 있도록 하여 활성잔기인 Ser1β에 의한 촉매작용을 도와주는 역할을 하는 것으로 추정된다.

한편, CAD와 GL-7-ACA 기질 결합체의 3차 구조에 CPC 기질 구조를 중첩하여 CAD 효소와 CPC 기질이 결합된 복합체의 3차 구조를 모델링한 결과, 도 4에서 보는 바와 같이 GL-7-ACA 기질의 글루타릭산 곁가지와의 결합에 관여하는 CAD의 Arg57β, Tyr33β, Phe177β 및 Tyr149α와 같은 핵심 잔기들과 CPC의 D-α-아미노아디픽산 곁가지 말단부위의 카르복실기와 D-형태 아미노기가 충돌하는 것을 볼 수 있다. 이러한 "CAD 효소-CPC 기질" 복합체의 모델링 결과를 바탕으로 CAD의 기질 결합부위 내에서 CPC의 곁가지 (즉, GL-7-ACA 곁가지에 비해 추가적으로 존재하는 탄소 골격과 D-아미노기)를 수용할 수 있는 공간을 확보할 수 있다면 GL-7-ACA 아실라제의 CPC 기질에 대한 활성을 증가시킬 수 있을 것으로 기대되었다.

그런데, CAD와 페니실린 G 아실라제, 슈도모나스 속 균주 유래의 GL-7-ACA 아실라제 등의 구조비교를 통해서 슈도모나스 속 유래 GL-7-ACA 아실라제들의 기질 결합 및 반응양식이 매우 유사할 것으로 추정되었다 (Kim 등, Chem. Biol. 8: 1253-1264, 2001; Fritz-Wolf 등, Protein Sci. 11: 92-103, 2002). 게다가 CAD는 CPC 기질에 대한 활성이 전혀 측정되지 않는 반면, 슈도모나스 속 SE83 균주 유래의 GL-7-ACA 아실라제 (AcyⅡ)는 GL-7-ACA 기질 대비 약 5% 수준의 CPC 기질에 대한 아실라제 활성을 나타내는 것으로 보고되었다 (Matsuda 등, J. Bacteriol. 169: 5815-5820, 1987). 따라서, CPC 기질에 대한 활성이 측정되지 않는 CAD를 기본으로 하여 CPC 아실라제를 개발하는 것 보다 일정 수준의 CPC 기질에 대한 활성을 가지고 있는 AcyⅡ를 기본으로 하여 CPC 아실라제를 개발하는 것이 보다 유리할 것으로 기대되었다. 이에, 본 발명의 변이 CPC 아실라제 개발을 위한 기본 유전자로서 슈도모나스 속 SE83 균주 유래의 CPC 아실라제 유전자 (acyⅡ)를 사용하였다.

본 발명에서는 CAD 효소-CPC 기질 결합체의 3차 구조와 가상 돌연변이 정보를 바탕으로 AcyⅡ의 활성부위 잔기들을 도출한 후에 CPC 기질결합에 방해가 되는 AcyⅡ 잔기들에 대한 부위특이 돌연변이를 수행함으로써 야생형 AcyⅡ 보다 CPC 기질에 대한 비활성이 현저히 증대된 변이 CPC 아실라제를 제조하고자 하였다. 하기 표 1에 본 발명에서 부위특이 돌연변이를 수행한 CAD의 활성부위 잔기에 해당하는 AcyⅡ의 잔기를 표시하였다.

CAD 잔기		AcyⅡ 잔기
Tyr33β	→	Met31β
Phe58β	→	Phe58β
Val70β	→	His70β
Phe177β	→	Ile176β
Tyr149α	→	Phe169α

CAD 효소-CPC 기질 결합체의 3차 구조 모델링 결과에서 CPC 기질 곁가지의 결합에 가장 방해가 될 것으로 추정되는 CAD의 Phe58β, Tyr33β, Phe177β 및 Tyr149α 잔기에 해당하는 AcyⅡ의 Phe58β, Met31β, Ile176β 및 Phe169α 잔기에 대하여 부위특이 돌연변이를 수행하였고, 또한 활성잔기 Ser1β의 촉매작용을 도와주는 CAD의 Val70β에 해당하는 AcyⅡ의 His70β 잔기에 대하여 부위특이 돌연변이를 수행하였다 (도 5).

<1-1-2> pBCPC 플라스미드 및 pBSEM 플라스미드의 제조

pBCPC 플라스미드는 서열번호: 1의 acyⅡ 구조유전자 DNA 단편이 pBC KS(+) 벡터 (Stratagene사, USA)의 XhoI과 XbaI 제한효소 인식부위에 삽입되어 제조된 것이다. 우선, 슈도모나스 속 SE83 균주 유래의 CPC 아실라제 유전자 (acyⅡ)의 DNA 염기서열 및 그로부터 번역되는 단백질의 아미노산 서열 정보 (GenBank 등재번호 M18278)에 근거하여 DNA 합성기를 사용하여 아미노산 서열은 문헌상의 서열과 동일하지만 각 아미노산을 암호화하는 코돈을 대장균에서 합성이 잘되는 단백질들에서 자주 사용되는 코돈 위주로 염기서열을 변형함으로써 서열번호: 1의 acyⅡ 구조유전자를 합성하였다.

상기 구조유전자에 제한효소 인식부위 및 리보좀 결합부위 등을 도입하기 위하여 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행하였다. PCR 반응액의 조성은 10 ng의 합성 acyⅡ DNA, 각 50 pmol의 CPC-F 프라이머 (서열번호: 13)와 CPC-R 프라이머 (서열번호: 14), Taq 완충용액 (5 mM KCl, 5 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1.5 mM MgCl₂), 0.2 mM dNTP 혼합액, 2.5 단위 ExTaq 중합효소 (Takara사, Japan)로 구성되어 있고, 최종 부피는 100 ㎕로 조정하였다. 또한, PCR은 펠티어 열 순환기 (Peltier Thermal Cycler PTC-200; MJ Research사, USA)를 사용하였으며, 반응조건은 반응 혼합액을 95℃에서 5분 동안 전-변성 (pre-denaturation)시켰고 변성 (denaturation)을 95℃에서 1분, 어닐링 (annealing)을 58℃에서 30초 및 중합 (polymerization)을 72℃에서 90초 동안 수행하는 반응을 25회 반복한 후 72℃에서 10분 동안 후-중합 (post-polymerization)시켰다. 상기 PCR을 통해 얻은 약 2.5 kb 크기의 PCR 산물을 제한효소 XhoI과 XbaI으로 절단한 후 정제 키트 (QIAEX Ⅱ Gel Extraction Kit; Qiagen사, Germany)로 정제하여 이를 삽입 DNA로 사용하였다. 또한, pBC KS(+) 벡터 DNA를 제한효소 XhoI과 XbaI으로 절단하고 CIP로 탈인산화시킨 DNA 단편을 벡터 DNA로 사용하였다. 상기의 삽입 DNA와 벡터 DNA를 T4 DNA 리가아제 (Roche사, Germany)를 이용하여 16℃에서 12∼16시간 동안 접합 (ligation)시킨 후 상기 접합액을 이용하여 전기천공법 (electrophoration)에 의한 E. coli XL-1 blue 균주의 형질전환을 수행하였다. 상기 균주를 25 ㎍/㎖ 농도의 클로르암페니콜 항생제를 함유한 LB 한천배지에 도말하여 30℃에서 하룻밤 정치배양함으로써 형질전환체들을 선별하였다. 이 형질전환체로부터 플라스미드를 분리하여 삽입 DNA의 염기서열을 결정함으로써 서열번호: 1의 염기서열을 갖는 acyⅡ 구조유전자를 포함하는 pBCPC 플라스미드를 제조하였다.

pBSEM 플라스미드는 서열번호: 3의 염기서열을 갖는 sem 구조유전자 단편이 pBC KS(+) 벡터의 XhoI과 XbaI 제한효소 인식부위에 삽입된 것으로 다음과 같이 제조되었다. pBCPC 플라스미드를 주형으로 하고 M13-R 프라이머 (서열번호: 11)와 αORF-R 프라이머 (서열번호: 15)를 사용한 PCR을 수행하여 0.8 kb 크기의 PCR 산물을 회수하였고, pBCPC 플라스미드를 주형으로 하고 βORF-F 프라이머 (서열번호: 16)와 HindⅢ-R 프라이머 (서열번호: 18)를 사용한 PCR을 수행하여 약 0.96 kb 크기의 PCR 산물을 회수하였고, pBCPC 플라스미드를 주형으로 하고 HindⅢ-F 프라이머 (서열번호: 17)와 M13-F 프라이머 (서열번호: 12)를 사용한 PCR을 수행하여 0.75 kb 크기의 PCR 산물을 회수하였다. 상기 0.8 kb의 PCR 산물, 0.96 kb의 PCR 산물과 0.75 kb의 PCR 산물을 혼합한 후 프라이머를 첨가하지 않고 상기와 동일하게 PCR을 수행하여 세 PCR 산물이 하나로 연결된 약 2.5 kb 크기의 PCR 산물을 회수하였다. 그 후에 2.5 kb 크기의 PCR 산물을 주형으로 하고 T3 프라이머 (서열번호: 9)와 T7 프라이머 (서열번호: 10)를 사용한 PCR을 수행하여 약 2.5 kb 크기의 sem 유전자 단편을 증폭하였다. 상기 PCR을 통해 얻은 2.5 kb의 PCR 산물을 제한효소 XhoI과 XbaI으로 절단한 후 정제 키트 (QIAEX Ⅱ Gel Extraction Kit)로 정제하여 삽입 DNA로 사용하였다. 또한, pBC KS(+) 벡터 DNA를 제한효소 XhoI과 XbaI으로 절단하고 CIP로 탈인산화시킨 DNA 단편을 벡터 DNA로 사용하였다. 상기의 삽입 DNA와 벡터 DNA를 T4 DNA 리가아제를 이용하여 16℃에서 16시간 동안 접합시킨 후 상기 접합액을 이용하여 전기천공법에 의한 E. coli XL-1 blue 균주의 형질전환을 수행하였다. 상기 균주를 25 ㎍/㎖ 농도의 클로르암페니콜 항생제를 함유한 LB 한천배지에 도말하여 30℃에서 하룻밤 정치배양함으로써 형질전환체들을 선별하였다. 상기 형질전환체로부터 플라스미드를 분리하여 삽입 DNA의 염기서열을 결정함으로써 서열번호: 3의 염기서열을 갖는 sem 구조유전자를 포함하는 pBSEM 플라스미드를 제조하였다.

pBCPC 플라스미드 함유 재조합 대장균과 pBSEM 플라스미드 함유 재조합 대장균에 의한 CPC 아실라제의 생산성을 측정하기 위해서 CPC 아실라제 조효소액을 하기와 같이 제조하였다. 상기 대장균 형질전환체 각각을 25 ㎍/㎖ 클로르암페니콜이 함유된 3 ㎖의 LB 배지 (1% Bacto-tryptone, 0.5% Yeast Extract, 0.5% NaCl)에 접종한 후 30℃, 200 rpm 조건으로 16시간 동안 진탕배양하였다. 그 후에 배양액 50 ㎕를 25 ㎍/㎖ 클로르암페니콜이 함유된 50 ㎖의 새로운 LB 배지에 접종한 후 25℃, 200 rpm 조건으로 48시간 동안 진탕배양하였다. 이 플라스크 배양액을 원심분리 (4℃, 8,000 rpm, 10분)하여 균체를 회수한 후 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0) 완충용액으로 2회 세척하였다. 이 균체를 5 ㎖의 동일 완충용액에 현탁한 후 4℃에서 초음파 분쇄기로 10분 동안 파쇄하고 4℃, 15,000 rpm 조건으로 20분 동안 원심분리하여 상등액을 취함으로써 변이 CPC 아실라제 조효소액을 제조하였다.

본 발명에서 CPC 기질에 대한 변이효소의 활성은 Park 등의 방법 (Park 등, Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 23: 559-564, 1995)을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. CPC 기질 (순도 74.2%; CJ(주), 한국)을 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0) 완충용액에 20 ㎎/㎖ 농도로 녹인 후 1 N NaOH로 pH를 8.0으로 조절하여 기질용액을 제조하였다. 이 CPC 기질용액 20 ㎕에 효소액 20 ㎕를 첨가하여 37℃에서 5분간 반응시킨 후 50 mM NaOH-20% 빙아세트산 (glacial acetic acid; 1:2) 용액을 200 ㎕ 첨가하여 반응을 정지시켰다. 그 후에 원심분리를 수행하여 회수한 상등액 200 ㎕에 메탄올에 용해시킨 0.5% (w/v) PDAB (p-dimethylaminobenzaldehyde; Sigma, 미국) 40 ㎕를 첨가하여 10분간 반응시킨 후, 415 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하고 표준물질의 정량곡선과 비교하여 정량하였다. 이때, 1 단위 (unit)는 분당 CPC로부터 1 μmole의 7-ACA를 생성할 수 있는 효소의 양으로 정의하였다. 한편, CPC 기질에 대한 비활성은 효소액 중의 단백질 양을 브래드포드의 방법 (Bradford, M., Anal. Biochem. 72: 248-254, 1976)에 따라 측정한 후에 1 ㎎ 단백질에 해당하는 활성 단위로 표시하였다. 그리고 CPC 기질에 대한 반응성은 반응액 중에 동일 양의 단백질을 첨가하여 일정 시간 동안 반응한 후에 생성된 7-ACA 양을 측정하여 상대적인 값으로 표시하였다. 반응산물에 의한 활성저해정도는 반응액 중에 동일 활성단위에 해당하는 단백질을 첨가하여 일정 시간 동안 반응한 후에 생성된 7-ACA 양을 측정하여 상대적인 값으로 표시하였다.

상기의 방법으로 조효소액을 제조하여 CPC 기질에 대한 활성을 측정한 결과, 재조합 E. coli MC1061(pBCPC) 균주에 의한 CPC 아실라제의 생산성은 약 97 단위/ℓ이었고, 재조합 E. coli MC1061(pBSEM) 균주에 의한 CPC 아실라제의 생산성은 약 11 단위/ℓ이었다.

<1-1-3> Met31β/Phe58β 2중 변이체의 제조

우선, CPC 기질에 대한 반응성이 증가된 변이 CPC 아실라제를 제조하기 위하여 Met31β/Phe58β 2중 변이체를 제조하였다. 상기 CAD 효소-CPC 기질 결합체의 3차 구조 모델링 결과와 같이, CPC 기질의 곁가지는 GL-7-ACA 곁가지에 1개의 탄소 골격뿐만 아니라 D-아미노기가 추가적으로 존재한다. 따라서, CPC 기질이 결합할 수 있는 공간을 확보하기 위해서는 AcyⅡ 기질결합 부위 내의 잔기를 1개만 변이시키는 것보다 2가지 잔기의 동시 변이가 더욱 효과적일 것으로 판단되었다. CAD의 3차 구조정보를 바탕으로 가상돌연변이를 수행한 결과, CPC 기질 곁가지의 결합에 가장 중요한 역할을 담당할 것으로 추정되는 CAD의 Arg57β에 해당하는 AcyⅡ의 His57β잔기를 고정한 상태에서, CPC 기질 곁가지 말단부위의 카르복실기와 D-아미노기가 가장 많이 충돌할 것으로 여겨지는 AcyⅡ의 Met31β 잔기를 루이신으로 치환하였다. 이와 동시에 AcyⅡ의 His57β 잔기 곁가지의 비틀림 회전 (torsion rotation)의 변화를 유도하여 CPC 기질 곁가지가 결합할 수 있는 공간을 더 확보하기 위하여, AcyⅡ의 Phe58β 잔기를 각각 알라닌, 발린, 루이신, 메티오닌, 시스테인 및 아스파라긴과 같이 곁가지의 크기가 비교적 작은 아미노산으로 치환하면 CPC 기질의 곁가지가 효과적으로 결합할 수 있을 것으로 추정하였다. 이에, 중첩 PCR (overlapping PCR) 방법 (Ho 등, Gene 15: 51-59, 1989)을 사용하여 M31βL/F58βM, M31βL/F58βC, M31βL/F58βL, M31βL/F58βA, M31βL/F58βV, M31βL/F58βN의 2중 변이 아실라제 6종을 각각 제조하였다. 구체적인 2중 변이체 제조과정은 하기와 같다.

부위특이 돌연변이를 위한 PCR 반응액의 조성은 10 ng 주형 DNA, 각 50 pmol의 정방향 프라이머와 역방향 프라이머, Taq 완충용액 (5 mM KCl, 5 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1.5 mM MgCl₂), 0.2 mM dNTP 혼합액, 2.5 단위 ExTaq 중합효소 (Takara사, Japan)로 구성되어 있고, 최종 부피는 100 ㎕로 조정하였다. PCR은 펠티어 열 순환기 (Peltier Thermal Cycler PTC-200; MJ Research사)를 사용하였고, 반응조건은 반응 혼합액을 95℃에서 5분 동안 전-변성시키고, 변성을 95℃에서 1분, 어닐링을 58℃에서 30초 및 중합을 72℃에서 60∼90초 동안 수행하는 반응을 25회 반복한 후 72℃에서 10분 동안 후-변성시켰다.

구체적으로, M31βL/F58βM 2중 변이체를 제조하기 위하여, pBSEM 플라스미드를 주형으로 하고 M13-R 프라이머 (서열번호: 11)와 M31βL-R 프라이머 (서열번호: 19)를 사용하는 PCR을 수행하여 1 kb 크기의 PCR 산물을 회수하였고, 또한 pBSEM 플라스미드를 주형으로 하고 F58βM-F 프라이머 (서열번호: 20)와 M13-F 프라이머 (서열번호: 12)를 사용하는 PCR을 수행하여 1.6 kb 크기의 PCR 산물을 회수하였다. 상기 1 kb의 PCR 산물과 1.6 kb의 PCR 산물을 혼합하여 프라이머를 첨가하지 않고 상기의 방법으로 PCR을 수행하여 두 PCR 산물이 하나로 연결된 약 2.5 kb 크기의 PCR 산물을 회수하였다. 이로부터 얻은 2.5 kb의 PCR 산물을 주형으로 하고 T3 프라이머 (서열번호: 9)와 T7 프라이머 (서열번호: 10)를 사용한 PCR을 수행하여 약 2.5 kb 크기의 2중 변이체 DNA 단편을 증폭하였다.

상기 PCR을 통해 얻은 변이 유전자 즉, 2.5 kb의 PCR 산물을 제한효소 XhoI과 XbaI으로 절단한 후 정제 키트 (QIAEX Ⅱ Gel Extraction Kit)로 정제하여 삽입 DNA로 사용하였고, pBC KS(+) 벡터 DNA를 제한효소 XhoI과 XbaI으로 절단하고 CIP로 탈인산화시킨 DNA 단편을 벡터 DNA로 사용하였다. 상기의 삽입 DNA와 벡터 DNA를 T4 DNA 리가아제를 이용하여 16℃에서 16시간 동안 접합시킨 후 상기 접합액을 이용하여 전기천공법에 의한 E. coli MC1061 균주의 형질전환을 수행하였다. 상기 균주를 25 ㎍/㎖ 농도의 클로르암페니콜 항생제를 함유한 LB 한천배지에 도말하여 30℃에서 하룻밤 정치배양함으로써 변이 유전자를 함유한 형질전환체들을 선별하였다. 이 형질전환체로부터 플라스미드를 분리하여 CPC 아실라제 유전자의 염기서열을 결정함으로써 변이부위를 확인하였다.

상기와 동일한 방법으로 M31βL/F58βC, M31βL/F58βL, M31βL/F58βA, M31βL/F58βV 및 M31βL/F58βN의 2중 변이체를 제조하였다. 이때, M31βL/F58βC 제조를 위해서는 M13-R 프라이머 (서열번호: 11)와 M31βL-R 프라이머 (서열번호: 19), 또한 F58βC-F 프라이머 (서열번호: 21)와 M13-F 프라이머 (서열번호: 12)를 사용하였고, M31βL/F58βL 제조를 위해서는 M13-R 프라이머 (서열번호: 11)와 M31βL-R 프라이머 (서열번호: 19), 또한 F58βL-F 프라이머 (서열번호: 24)와 M13-F 프라이머 (서열번호: 12)를 사용하였고, M31βL/F58βA 제조를 위해서는 M13-R 프라이머 (서열번호: 11)와 M31βL-R 프라이머 (서열번호: 19), 또한 F58βA-F 프라이머 (서열번호: 22)와 M13-F 프라이머 (서열번호: 12)를 사용하였고, M31βL/F58βV 제조를 위해서는 M13-R 프라이머 (서열번호: 11)와 M31βL-R 프라이머 (서열번호: 19), 또한 F58βV-F 프라이머 (서열번호: 23)와 M13-F 프라이머 (서열번호: 12)를 사용하였고, M31βL/F58βN 제조를 위해서는 M13-R 프라이머 (서열번호: 11)와 M31βL-R 프라이머 (서열번호: 19), 또한 F58βN-F 프라이머 (서열번호: 25)와 M13-F 프라이머 (서열번호: 12)를 사용하여 중첩 PCR을 수행하였다.

상기 2중 변이체 효소들의 CPC 기질에 대한 비활성 정도를 측정하기 위해서 상기 실시예 <1-1-2>의 방법과 동일하게 변이 CPC 아실라제 조효소액을 제조하고 CPC 기질에 대한 비활성 정도를 측정하였다. 그 결과, M31βL/F58βM, M31βL/F58βC, M31βL/F58βN, M31βL/F58βL, M31βL/F58βA 및 M31βL/F58βV 2중 변이체 조효소의 CPC 기질에 대한 비활성은 야생형 AcyⅡ의 비활성에 비하여 각각 2.4배, 2.3배, 2.0배, 1.8배, 1.6배 및 1.6배 증가한 것을 확인하였다.

<1-1-4> Met31β/Phe58β/His70β 3중 변이체의 제조

상기 2중 변이체 중에서 비활성이 가장 크게 증가된 M31βL/F58βM 2중 변이체의 비활성을 부가적으로 증대시키기 위해서 활성잔기 S1β의 촉매작용을 도와주는 CAD의 Val70β에 해당하는 AcyⅡ의 His70β 잔기를 세린 또는 루이신으로 치환한 3중 변이체 효소를 제조하였다.

M31βL/F58βM/H70βS 3중 변이체 DNA의 제조는 부위특이 돌연변이 키트 (QuickChange^TM Site-Directed Mutagenesis Kit; Stratagene사, USA)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다. 50 ㎕의 PCR 반응 혼합액에는 주형 DNA로서 40 ng의 M31βL/F58βM 2중 변이체 DNA, 100 pmol의 H70βS-F 프라이머 (서열번호: 26), 100 pmol의 H70βS-R 프라이머 (서열번호: 27), 1 ㎕의 dNTP 혼합액, 5 ㎕의 반응 완충용액 (100 mM KCl, 100 mM (NH₄)₂SO₄, 200 mM Tris-HCl (pH 8.8), 20 mM MgSO₄, 1% Triton X-100, 1 ㎎/㎖ BSA), 2.5 단위의 pfuTurbo^TM DNA 중합효소가 들어있다. 이 반응 혼합액을 사용한 PCR은 펠티어 열 순환기를 사용하였으며, 반응조건은 반응 혼합액을 95℃에서 30초간 전-변성시켰고, 변성을 95℃에서 30초, 어닐링을 55℃에서 1분, 중합을 68℃에서 12분 동안 수행하는 반응을 16회 반복하였다. PCR을 수행한 후 돌연변이가 일어나지 않은 주형 DNA를 제거하기 위해서 PCR 반응액에 10 단위의 DpnI 제한효소를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후에 정제 키트 (QIAEX Ⅱ Gel Extraction Kit)로 정제한 변이 DNA를 이용하여 E. coli MC1061를 형질전환시킨 후 25 ㎍/㎖의 클로르암페니콜이 함유된 LB 한천배지에 도말하여 배양함으로써 형질전환체들을 선별하였다. 그 후 형질전환체로부터 플라스미드를 분리하여 변이 CPC 아실라제 유전자의 염기서열을 결정함으로써 변이부위를 확인하였다.

M31βL/F58βM/H70βL 3중 변이체 DNA의 제조과정은 부위특이 돌연변이 키트 (QuickChange^TM Site-Directed Mutagenesis Kit)를 사용한 상기 M31βL/F58βM/H70βS 3중 변이체 DNA의 제조과정과 PCR 수행에 사용한 프라이머 종류만 다르고 나머지는 모두 동일하다. 이때 PCR에 사용한 프라이머는 H70βL-F 프라이머 (서열번호: 28)와 H70βL-R 프라이머 (서열번호: 29)이다.

상기 실시예 <1-1-2>에서 설명한 방법과 동일하게 3중 변이체 조효소액을 제조하여 CPC 기질에 대한 비활성을 측정하였다. 그 결과, M31βL/F58βM/H70βS 3중 변이체 효소와 M31βL/F58βM/H70βL 3중 변이체 효소는 M31βL/F58βM 2중 변이체 효소에 비하여 비활성이 각각 3.2배 및 2.4배 증가하였다.

<1-1-5> Phe169α/Met31β/Phe58β/His70β 4중 변이체의 제조

상기 3중 변이체 중에서 비활성이 가장 크게 증가된 M31βL/F58βM/H70βS 3중 변이체 효소의 비활성을 부가적으로 증대시키기 위해서, CAD-CPC 기질 결합체의 3차구조 모델링 결과로부터 S1β 잔기의 효율적인 촉매작용을 위해서 CPC 기질이 적절한 위치로 자리잡을 수 있도록 도와주는 역할을 할 것으로 추정되는 CAD의 Tyr149α 잔기에 해당하는 AcyⅡ의 Phe169α 잔기가 티로신으로 치환된 F169αY/M31βL/F58βM/H70βS 4중 변이체를 제조하였다. 티로신의 곁가지는 페닐알라닌의 곁가지에 -OH기를 추가로 가지고 있어 CPC 기질의 곁가지 사슬 및/또는 주위 잔기와의 수소결합을 통하여 S1β 잔기의 촉매작용을 도와줄 수 있을 것으로 기대되었다.

F169αY/M31βL/F58βM/H70βS 4중 변이체 DNA의 제조과정은 부위특이 돌연변이 키트 (QuickChange^TM Site-Directed Mutagenesis Kit)를 사용한 상기 삼중 변이체 DNA의 제조과정과 동일하다. 다만, 이때 PCR에 사용한 프라이머는 F169αY-F 프라이머 (서열번호: 30)와 F169αY-R 프라이머 (서열번호: 31)이고, 주형 DNA로서는 M31βL/F58βM/H70βS 3중 변이체 DNA를 사용하였다. 또한, 상기 실시예 <1-1-2>에서 설명한 방법과 동일하게 F169αY/M31βL/F58βM/H70βS 4중 변이체 조효소액을 제조하고 CPC 기질에 대한 비활성을 측정하였다. 그 결과, F169αY/M31βL/F58βM/H70βS 4중 변이체 효소의 비활성은 M31βL/F58βM/H70βS 3중 변이체 효소의 비활성에 비하여 2.1배 증가하였다.

<1-1-6> Phe169α/Met31β/Phe58β/His70β/Ile176β 5중 변이체의 제조

상기 F169αY/M31βL/F58βM/H70βS 4중 변이체 효소의 비활성을 부가적으로 증대시키기 위해서, CAD 효소-CPC 기질 결합체의 3차 구조 모델링 결과로부터 CPC 기질 곁가지의 결합에 방해가 될 것으로 추정되는 CAD의 Phe177β 잔기에 해당하는 AcyⅡ의 Ile176β 잔기가 발린으로 치환된 F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV 5중 변이체 효소를 제조하였다. 상기 실시예 <1-1-3>에서는, CPC 기질 곁가지의 결합에 가장 중요한 역할을 할 것으로 추정되는 AcyⅡ의 His57β 잔기 곁가지의 비틀림 회전의 변화를 유도하여 CPC 기질 곁가지가 결합할 수 있는 공간을 더 확보하기 위하여 AcyⅡ의 Phe58β 잔기를 메티오닌 잔기로 치환한 바 있다. 그런데, AcyⅡ Ile176β 잔기는 CPC 기질 곁가지의 결합에 방해가 될 것으로 추정될 뿐만 아니라 AcyⅡ Phe58β 잔기와 가장 근접한 위치에 있는 잔기 중의 하나이다. 이에, CPC 곁가지 사슬이 더욱 효과적으로 결합될 수 있도록 Ile176β 잔기를 곁가지의 구조는 유사하지만 크기가 더 작은 발린 잔기로 치환하였다.

F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV 5중 변이체 DNA의 제조과정은 부위특이 돌연변이 키트 (QuickChange^TM Site-Directed Mutagenesis Kit)를 사용한 상기 3중 변이체 DNA의 제조과정과 동일하다. 다만, 이때 PCR에 사용한 프라이머는 I176βV-F 프라이머 (서열번호: 32)와 I176βV-R 프라이머 (서열번호: 33)이고, 주형 DNA로는 F169αY/M31βL/F58βM/H70βS 4중 변이체 DNA를 사용하였다. 또한, 상기 실시예 <1-1-2>에서 설명한 방법과 동일하게 F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV 5중 변이체 조효소액을 제조하고 CPC 기질에 대한 비활성을 측정하였다. 그 결과, F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV 5중 변이체 효소의 비활성은 F169αY/M31βL/F58βM/H70βS 4중 변이체 효소의 비활성에 비하여 2.4배 증가하였다.

<1-2> CPC 기질에 대한 반응성이 증대된 변이 CPC 아실라제의 제조

<1-2-1> Phe169α/Met31β/Phe58β/Ile176β 4중 변이체의 제조

산업적 생산규모에서 7-ACA 제조를 위한 1단계 효소공법에 공지의 CPC 아실라제를 적용하기 어려운 이유는 CPC 아실라제의 CPC 기질에 대한 낮은 비활성에도 원인이 있지만, 반응산물인 7-ACA에 의한 효소활성 저해현상 때문에 CPC로부터 7-ACA로 전환되는 효율이 매우 낮은 데에도 그 원인이 있다. 그런데, 상기 실시예 <1-1>의 비활성 증진을 위한 일련의 부위특이 돌연변이에서 His70β 잔기의 돌연변이는 야생형 효소의 CPC 기질에 대한 비활성을 크게 증가시킨 반면에 7-ACA 반응산물에 의한 효소활성 저해 현상이 심화되는 것을 확인할 수 있었다. 이에, 상기 실시예 <1-1-6>의 비활성 증진 F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV 5중 변이체 효소에서 H70βS 잔기를 야생형의 히스티딘 잔기로 역 돌연변이시킨 F169αY/M31βL/F58βM/I176βV 4중 변이체 효소를 제조하였다 (도 5). F169αY/M31βL/F58βM/I176βV 4중 변이체 DNA의 제조과정은 상기 실시예 <1-1-4>의 변이체 DNA 제조과정과 동일하다. 다만, 이때 PCR에 사용한 프라이머는 H70β-F 프라이머 (서열번호: 34)와 H70β-R 프라이머 (서열번호: 35)이고, 주형 DNA로는 F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV 5중 변이체 DNA를 사용하였다.

상기 실시예 <1-1-2>에서 설명한 방법과 동일하게 야생형 효소 및 F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV 5중 변이체, F169αY/M31βL/F58βM/I176βV 4중 변이체의 조효소액을 제조한 후에 동일 활성단위에 해당하는 효소액을 사용하여 반응산물에 의한 효소활성 저해정도를 측정하였다. 그 결과, 상기 실시예 <1-1-6>의 비활성 증진 F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV 5중 변이체 효소에서 H70βS 잔기를 야생형의 히스티딘 잔기로 역 돌연변이시킴으로써 반응산물 저해정도가 야생형 효소와 비슷해지는 것을 확인하였다 (도 6).

<1-2-2> 무작위 돌연변이에 의한 Gly139α/Phe169α/Met31β/Phe58β/Ile176β 및 Val121α/Phe169α/Met31β/Phe58β/Ile176β 5중 변이체의 제조

상기 실시예 <1-2-1>의 F169αY/M31βL/F58βM/I176βV 4중 변이체의 CPC에 대한 반응성을 부가적으로 증대시키기 위해서 F169αY/M31βL/F58βM/I176βV 4중 변이체 DNA를 주형 DNA로 사용하여 에러 유발성 중합효소 연쇄반응을 수행함으로써 무작위 위치에서 점 돌연변이를 유발시킨 돌연변이 라이브러리를 제조하였다. 이때, 에러 유발성 중합효소 연쇄반응에서 에러 유발 정도는 F169αY/M31βL/F58βM/I176βV 4중 변이 아실라제 유전자 하나에 평균 하나의 아미노산 잔기가 치환되는 조건을 사용하였다. 구체적인 돌연변이 라이브러리의 제조과정은 하기에 설명한 바와 같다.

에러 유발성 중합효소 연쇄반응을 위한 PCR 반응액의 조성은 주형 DNA로서 5 ng의 F169αY/M31βL/F58βM/I176βV 4중 변이체 DNA, 각 50 pmol의 T3 프라이머 (서열번호: 9)와 T7 프라이머 (서열번호: 10), 5 mM KCl, 5 mM Tris-HCl (pH 8.3), 3.5 mM MgCl₂, 0.025 mM MnCl₂, 각 0.2 mM의 dATP와 dGTP, 각 1 mM의 dCTP와 dTTP, 5 단위의 rTaq 중합효소 (Takara사, Japan)로 구성되어 있고, 최종 부피는 100 ㎕로 조정하였다. PCR은 펠티어 열 순환기를 사용하였고, 반응조건은 반응 혼합액을 95℃에서 3분 동안 전-변성시키고 변성을 95℃에서 1분, 어닐링을 58℃에서 30초 및 중합을 72℃에서 90초 동안 수행하는 반응을 20회 반복한 후 72℃에서 10분 동안 후-중합시켰다. 상기 조건의 에러 유발성 중합효소 연쇄반응을 통해 얻은 변이 유전자, 즉, 2.5 kb 크기의 PCR 산물을 제한효소 XhoI과 XbaI으로 절단한 후 정제 키트 (QIAEX Ⅱ Gel Extraction Kit)로 정제하여 삽입 DNA로 사용하였고, pBSEM 플라스미드를 제한효소 XhoI과 XbaI으로 절단하여 회수한 3.4 kb 크기의 DNA 단편을 벡터 DNA로 사용하였다. 상기의 삽입 DNA와 벡터 DNA를 T4 DNA 리가아제를 이용하여 16℃에서 16시간 동안 접합시킨 후 상기 접합액을 이용하여 전기천공법에 의한 E. coli MC1061 균주의 형질전환을 수행하였다. 상기 균주를 25 ㎍/㎖ 농도의 클로르암페니콜 항생제를 함유한 LB 한천배지에 도말하여 30℃에서 하룻밤 정치배양함으로써 무작위 돌연변이 라이브러리를 제조하였다.

상기 무작위 돌연변이 라이브러리로부터 CPC 기질에 대한 반응성이 증가된 변이 CPC 아실라제를 하기와 같은 방법으로 스크리닝하였다.

에러 유발성 중합효소 연쇄반응에 의해 무작위 위치에서 점 돌연변이가 유발된 변이 CPC 아실라제 유전자를 함유한 E. coli MC1061 형질전환체를 클로르암페니콜 항생제가 함유된 LB 액체배지가 200 ㎕씩 분주된 96-웰 플레이트에 접종한 후, 30℃, 180 rpm 조건으로 60∼70시간 동안 진탕배양하였다. 그 후 상기 웰 플레이트에서 100 ㎕씩의 배양액을 취하여 이를 새로운 96-웰 플레이트로 옮겼다. 상기 배양액을 100 ㎕의 세포 분해용액 (0.67 ㎎/㎖ 리소자임 (lysozyme), 1.3 mM EDTA, 0.13% Triton X-100을 포함한 0.1 M Tris-Cl (pH 8.0) 완충용액)과 혼합하여 30℃에서 2시간 동안 방치하였다. 그 후에 0.1 M Tris-Cl (pH 8.0) 완충용액에 용해시킨 2.5%(w/v) CPC 기질과 1 mM 7-ACA의 혼합용액 50 ㎕를 첨가하고 28℃에서 14∼16시간 동안 CPC 기질의 가수분해 반응을 수행하였다. 이때, CPC 기질용액 내에 7-ACA를 첨가하는 이유는 본 발명의 야생형 및 변이 CPC 아실라제가 CPC의 가수분해에 의해서 생성되는 7-ACA 반응산물에 의해서 효소활성 저해가 크게 나타났기 때문에, 7-ACA가 첨가된 CPC 기질용액을 사용한 효소반응을 통해서 7-ACA 반응산물에 의해 효소활성 저하가 감소된 및/또는 CPC 기질에 대한 비활성이 증가된 변이 CPC 아실라제를 스크리닝하기 위해서이다. CPC 기질의 가수분해를 수행한 후에 반응액을 4,200 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 얻은 상등액 50 ㎕를 새로운 96-웰 플레이트로 옮겼다. 여기에 반응 정지액 (acetic acid: 250 mM NaOH, 2:1) 160 ㎕를 첨가하여 효소반응을 정지시킨 후 발색시약 (메탄올에 용해된 0.5% (w/v) PDAB 용액) 40 ㎕를 첨가하고 실온에서 10분간 방치하였다. 그 후에 96-웰 플레이트 판독기를 사용하여 415 ㎚에서 흡광도를 측정함으로써 CPC 기질에 대한 반응성이 증가된 변이체를 스크리닝하였다.

상기와 같은 방법으로 약 25,000종의 변이체를 스크리닝한 결과, 무작위 돌연변이 주형으로 사용한 F169αY/M31βL/F58βM/I176βV 4중 변이효소에 의한 흡광도 값보다 큰 흡광도 값을 나타내는 변이체 2종 (#120과 #213)을 선발하였다. 이들 변이체를 암호화하는 유전자의 염기서열 결정을 통하여 #120 변이효소는 Gly139α 잔기가 세린으로 치환되어 있었고, #213 변이효소는 Val121α 잔기가 알라닌으로 치환되어 있음을 확인하였다 (도 5).

또한, 상기 실시예 <1-1-2>에서 설명한 방법과 동일하게 #120 변이효소 (G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV 5중 변이체)와 #213 변이효소 (V121αA/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV 5중 변이체)의 조효소액을 제조하여 CPC 기질에 대한 반응성을 측정한 결과, 도 7에 도시된 바와 같이 #120 변이효소와 #213 변이효소가 상기 실시예 <1-2-1>의 F169αY/M31βL/F58βM/I176βV 4중 변이 아실라제보다 CPC 기질에 대한 반응성이 증가한 것을 확인하였다.

<1-2-3> Val121α/Gly139α/Phe169α/Met31β/Phe58β/Ile176β 6중 변이체의 제조

상기의 결과에서 F169αY/M31βL/F58βM/I176βV 4중 변이체 효소에 V121αA 또는 G139αS의 돌연변이가 도입된 경우에 CPC 기질에 대한 반응성이 증가하는 것을 확인하였다. 따라서, 부가적인 CPC 기질에 대한 반응성 증대를 위해서 무작위 돌연변이 라이브러리로부터 선발된 #213 변이효소 (V121αA/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV 5중 변이체)에 #120 변이효소의 변이부위인 G139αS 돌연변이를 도입함으로써 V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV 6중 변이효소를 제조하였다 (도 5). 6중 변이체 DNA의 제조과정은 상기 실시예 <1-1-4>의 3중 변이체 DNA의 제조과정과 동일하다. 다만, 이때 PCR에 사용한 프라이머는 G139αS-F 프라이머 (서열번호: 36)와 G139αS-R 프라이머 (서열번호: 37)이고, 주형 DNA로는 #213 변이체 DNA를 사용하였다. 이로부터 제조된 V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV 6중 변이체 효소를 암호화하는 변이 CPC 아실라제 유전자를 TnS5로 명명하였다.

상기 실시예 <1-1-2>에서 설명한 방법과 동일하게 V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV 6중 변이체의 조효소액을 제조하여 CPC 기질에 대한 반응성을 측정한 결과, 도 7에 도시된 바와 같이 V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV 6중 변이효소 (TnS5)는 #213 변이효소 및 #120 변이효소보다 CPC 기질에 대한 반응성이 더욱 증가한 것을 확인하였다.

<1-3> pBC-TnS5αβ 플라스미드의 제조

상기 실시예 <1-2-3>에서 제조되고 TnS5로 명명된 상기 V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV 6중 변이 CPC 아실라제를 암호화하는 아실라제 유전자는 sem 유전자처럼 변이효소 중의 알파-서브유닛과 베타-서브유닛이 숙주세포 내에서 개별적으로 생성된 후 이들 서브유닛간의 자연스러운 접촉을 통해 활성형의 CPC 아실라제가 형성되도록 제조된 6중 변이 CPC 아실라제 유전자이다.

TnS5 유전자로부터 서열번호: 1의 야생형 아실라제 유전자 (acyⅡ)처럼 숙주세포 내에서 변이 CPC 아실라제 유전자의 전사 및 번역 후 자체적인 절단과정을 거쳐 알파-서브유닛과 베타-서브유닛 각각 1개로 이루어진 활성형 변이 CPC 아실라제가 생성되도록 유도하기 위해서 6중 변이효소의 알파-서브유닛과 베타-서브유닛 사이에 야생형 CPC 아실라제 (AcyⅡ)의 스페이서 펩티드가 도입된 6중 변이 CPC 아실라제를 암호화하는 TnS5αβ 유전자를 제조하였다 (도 5). TnS5αβ 유전자의 구체적인 제조방법은 하기에 설명한 바와 같다.

TnS5 유전자를 pBC KS(+) 벡터의 XhoI/XbaI 제한효소 인식부위에 삽입시켜 제조한 pBC-TnS5 플라스미드를 주형으로 하고 M13-R 프라이머 (서열번호: 11)와 αCPC-R 프라이머 (서열번호: 38)를 사용한 PCR을 수행하여 0.8 kb 크기의 PCR 산물을 회수하였고, pBC-TnS5 플라스미드를 주형으로 하고 βCPC-F 프라이머 (서열번호: 39)와 M13-F 프라이머 (서열번호: 12)를 사용한 PCR을 수행하여 1.7 kb 크기의 PCR 산물을 회수하였다. 상기 0.8 kb의 PCR 산물과 1.7 kb의 PCR 산물을 혼합하여 프라이머를 첨가하지 않고 PCR을 수행하여 두 PCR 산물이 하나로 연결된 약 2.5 kb 크기의 PCR 산물을 회수하였다. 그 후에 2.5 kb의 PCR 산물을 주형으로 하고 T3 프라이머 (서열번호: 9)와 T7 프라이머 (서열번호: 10)를 사용한 PCR을 수행하여 약 2.5 kb 크기의 DNA 단편을 증폭함으로써 TnS5αβ 유전자를 제조하였다. 상기 PCR을 통해 얻은 2.5 kb의 PCR 산물을 제한효소 XhoI과 XbaI으로 절단한 후 정제 키트 (QIAEX Ⅱ Gel Extraction Kit)로 정제하여 삽입 DNA로 사용하였다. 또한, pBC KS(+) 벡터 DNA를 제한효소 XhoI과 XbaI으로 절단하고 CIP로 탈인산화시킨 DNA 단편을 벡터 DNA로 사용하였다. 상기 삽입 DNA와 벡터 DNA를 T4 DNA 리가아제를 이용하여 16℃에서 16시간 동안 접합시킨 후 상기 접합액을 이용하여 전기천공법에 의한 E. coli MC1061 균주의 형질전환을 수행하였다. 상기 균주를 25 ㎍/㎖ 농도의 클로르암페니콜 항생제를 함유한 LB 한천배지에 도말하여 30℃에서 하룻밤 정치배양함으로써 형질전환체들을 선별하였다. 이 형질전환체로부터 플라스미드를 분리하여 삽입 DNA의 염기서열을 결정함으로써 TnS5αβ 유전자가 삽입된 pBC-TnS5αβ 플라스미드를 제조하였다.

TnS5αβ 유전자의 변이 CPC 아실라제 생산성을 조사하기 위하여 pBC KS(+) 벡터에 V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV 6중 변이 CPC 아실라제를 암호화하는 유전자 TnS5 및 TnS5αβ가 각각 삽입된 재조합 플라스미드 pBC-TnS5 및 pBC-TnS5αβ를 제조한 후 이들 각각을 E. coli MC1061에 형질전환시켜 재조합 E. coli MC1061(pBC-TnS5) 및 E. coli MC1061(pBC-TnS5αβ)를 제조하였다. 상기 실시예 <1-1-2>에서 설명한 방법과 동일하게 각각의 재조합 대장균을 배양한 후 조효소액을 제조하고 CPC 기질에 대한 활성을 측정하였다. 이때, 본 배양에 사용한 배지는 25 ㎍/㎖ 클로르암페니콜이 함유된 50 ㎖의 LB 브로쓰이고 배양조건은 25℃에서 48시간 동안 200 rpm으로 진탕배양하였다. 그 결과, 재조합 E. coli MC1061(pBC-TnS5) 균주에 의한 CPC 아실라제의 생산성은 약 78 단위/ℓ이었고, 재조합 E. coli MC1061(pBC-TnS5αβ) 균주에 의한 CPC 아실라제의 생산성은 약 162 단위/ℓ이었다. 이와 같이 TnS5αβ 6중 변이 CPC 아실라제를 숙주세포 내에서 변이 유전자의 전사 및 번역 후 자체적인 절단과정을 거쳐 활성형의 변이 CPC 아실라제가 생성되도록 유도한 경우가 숙주세포 내에서 알파-서브유닛과 베타-서브유닛이 개별적으로 생성된 후 활성형의 변이 CPC 아실라제가 형성되도록 유도한 경우 (TnS5)보다 변이 CPC 아실라제 생산성이 약 2배가 높았다. 또한 E. coli MC1061(pBC-TnS5αβ) 배양액으로부터 제조된 조효소액을 변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 (12% SDS-PAGE)을 수행하여 단백질 양상을 조사한 결과, 약 83 kDa 크기의 불활성 폴리펩티드 밴드가 보이지 않는 것으로 보아 본 발명의 배양조건에서 TnS-5αβ 유전자의 전사 및 번역 후에 자체절단이 효율적으로 일어나 대부분의 불활성 폴리펩티드가 활성형의 변이 CPC 아실라제로 전환된 것으로 추정된다. 따라서, 하기에서는 변이 CPC 아실라제 개발을 위한 주형 DNA로서 TnS5αβ 유전자 DNA를 사용하였다.

<1-4> CPC 기질에 대한 반응성이 부가적으로 증대된 변이 CPC 아실라제의 제조

<1-4-1> Val121α/Gly139α/Phe169α/Phe58β/Ile176β 5중 변이체의 제조

상기 실시예 <1-1>과 <1-2>에서 CAD 효소-CPC 기질 결합체의 3차 구조 모델링 결과에 근거한 일련의 부위특이 돌연변이 및 무작위 돌연변이를 수행하여 야생형 효소에 비해 CPC 기질에 대한 반응성이 증대된 V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV 6중 변이 CPC 아실라제를 암호화하는 유전자 (TnS5 및 TnS5αβ)를 제조하였다. 그런데, TnS5αβ 6중 변이체를 제조하기 위한 일련의 돌연변이 과정 중에서 첫 번째 돌연변이로서 상기 실시예 <1-1-3>에서 설명한 바와 같이 CPC 기질 곁가지 말단부위의 카르복실기와 D-아미노기가 가장 많이 충돌할 것으로 여겨지는 Met31β 잔기를 루이신으로 치환하고, 이와 동시에 His57β 잔기 곁가지의 비틀림 회전의 변화를 유도하여 CPC 기질 곁가지가 결합할 수 있는 공간을 더 확보할 수 있도록 하기 위하여 Phe58β 잔기를 메티오닌, 시스테인 및 아스파라긴 잔기 등으로 치환한 바가 있다. 이에 본 발명자들은 TnS5αβ 6중 변이체의 CPC 기질에 대한 반응성을 부가적으로 증대시키기 위하여 V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV 6중 변이체 내에서 Met31β 잔기 및 Phe58β 잔기의 최적화를 수행하였다.

이를 위해서 TnS5αβ 6중 변이체 DNA를 주형 DNA로 사용하여 M31βL 변이잔기의 야생형 메티오닌 잔기로의 역 돌연변이 및 F58βM 변이 잔기의 아스파라긴 또는 시스테인 잔기로의 치환을 수행하여 4종의 변이체 (V121αA/G139αS/F169αY/F58βN/I176βV, V121αA/G139αS/F169αY/F58βC/I176βV, V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βN/I176βV 및 V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βC/I176βV)를 제조하였다. 이들 변이체 DNA의 제조과정은 상기 실시예 <1-1-3>의 M31βL/F58βM 2중 변이체 DNA의 제조과정과 동일하다. 다만, PCR 반응을 위한 프라이머로서 V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βC/I176βV 변이체 제조를 위해서는 M13-R 프라이머 (서열번호: 11)와 M31βL-R 프라이머 (서열번호: 19), 또한 F58βC-F 프라이머 (서열번호: 21)와 M13-F 프라이머 (서열번호: 12)를 사용하였고, V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βN/I176βV 변이체 제조를 위해서는 M13-R 프라이머 (서열번호: 11)와 M31βL-R 프라이머 (서열번호: 19), 또한 F58βN-F 프라이머 (서열번호: 25)와 M13-F 프라이머 (서열번호: 12)를 사용하였고, V121αA/G139αS/F169αY/F58βC/I176βV 변이체 제조를 위해서는 M13-R 프라이머 (서열번호: 11)와 M31β-R 프라이머 (서열번호: 42), 또한 F58βC-F 프라이머 (서열번호: 21)와 M13-F 프라이머 (서열번호: 12)를 사용하였고, V121αA/G139αS/F169αY/F58βN/I176βV 변이체 제조를 위해서는 M13-R 프라이머 (서열번호: 11)와 M31β-R 프라이머 (서열번호: 42), 또한 F58βN-F 프라이머 (서열번호: 25)와 M13-F 프라이머 (서열번호: 12)를 사용하여 중첩 PCR을 수행하였다.

상기 실시예 <1-1-2>의 방법과 동일하게 조효소액을 제조하고 상기 변이체 효소들의 CPC 기질에 대한 반응성 정도를 측정하였다. 그 결과, 도 8에 도시된 바와 같이 TnS5αβ 6중 변이체에서 F58βM 잔기가 아스파라긴 잔기로 치환된 경우에 CPC 기질에 대한 반응성이 크게 증가하는 것을 확인하였고, TnS5αβ 6중 변이체에서 M31βL 잔기가 야생형 잔기인 메티오닌으로 역 돌연변이된 경우에는 비활성은 조금 낮아졌지만 CPC 기질로부터 7-ACA 산물을 더 효율적으로 생성하는 것을 확인하였다. 결국, TnS5αβ 6중 변이체 내에서 Met31β 잔기 및 Phe58β 잔기의 최적화를 수행하여 TnS5αβ 6중 변이체보다 CPC에 대한 반응성이 부가적으로 증대된 V121αA/G139αS/F169αY/F58βN/I176βV 5중 변이체 (mF58)를 선발하였다 (도 5).

<1-4-2> Val121α/Gly139α/Phe58β/Ile176β 4중 변이체의 제조

CAD 효소-CPC 기질 결합체의 3차 구조 모델링 결과로부터 야생형 AcyII 효소에서 Phe169α 잔기는 S1β 잔기의 효율적인 촉매작용을 위해서 CPC 기질이 적절한 위치로 자리잡을 수 있도록 도와주는 역할을 할 것으로 추정하였다. 또한, 야생형 AcyII 효소에서 Phe169α, Met31β 및 Ile176β 잔기가 CPC 기질의 D-α-아미노아디픽산 곁가지 말단부위와 가장 많이 충돌할 것으로 추정하였다. 그리고, 야생형 AcyII 효소에서 Phe169α 잔기는 Phe58β 잔기와 가장 근접한 잔기 중의 하나로 추정하였다. 따라서, 상기 실시예 <1-1-5>에서 M31βL/F58βM/H70βS 3중 변이체의 비활성을 증진시키기 위해서 Phe169α 잔기를 티로신으로 치환한 바가 있다. 그런데, 상기 실시예 <1-4-1>에서 제조한 V121αA/G139αS/F169αY/F58βN/I176βV 5중 변이체에서는 활성잔기 S1β의 촉매작용을 도와주는 것으로 추정되는 H70βS 변이 잔기가 반응산물에 의한 활성저해 현상 때문에 야생형 잔기인 히스티딘으로 역 돌연변이되었을 뿐만 아니라 M31βL 변이 잔기 또한 야생형 메티오닌 잔기로 역 돌연변이되었다. 또한 F58βM 변이 잔기가 아스파라긴으로 치환되었고 Ile176β 잔기는 발린으로 치환되었다. 이에, V121αA/G139αS/F169αY/F58βN/I176βV 5중 변이체에서 F169αY 변이잔기의 적합성을 검토하기 위해서 F169αY 변이잔기를 야생형 페닐알라닌 잔기로 역 돌연변이시킨 V121αA/G139αS/F58βN/I176βV 4중 변이체 (F169)를 제조하였다 (도 5).

V121αA/G139αS/F58βN/I176βV 4중 변이체 DNA의 제조과정은 상기 실시예 <1-1-4>의 M31βL/F58βM/H70βS 3중 변이체 DNA의 제조과정과 동일하다. 다만, 주형 DNA로서 V121αA/G139αS/F169αY/F58βN/I176βV 5중 변이체 DNA를 사용하였고, PCR 반응을 위한 프라이머로서 F169α-F 프라이머 (서열번호: 45)와 F169α-R 프라이머 (서열번호: 46)를 사용하였다.

상기 실시예 <1-1-2>의 방법과 동일하게 조효소액을 제조하고 V121αA/G139αS/F58βN/I176βV 4중 변이체 효소의 CPC 기질에 대한 반응성 정도를 측정한 결과, 도 9에 도시된 바와 같이 V121αA/G139αS/F169αY/F58βN/I176βV 5중 변이체에서 F169αY 변이잔기를 야생형 티로신 잔기로 역 돌연변이시킨 경우에 CPC 기질에 대한 반응성이 부가적으로 증대된 것을 확인하였다.

<1-4-3> 무작위 돌연변이에 의한 Val121α/Gly139α/Phe58β/Ile75β/Ile176β 및 Val121α/Gly139α/Phe58β/Ile176β/Ser471β 5중 변이체의 제조

상기 실시예 <1-4-2>의 V121αA/G139αS/F58βN/I176βV 4중 변이체의 CPC 기질에 대한 반응성을 부가적으로 증대시키기 위해서 V121αA/G139αS/F58βN/I176βV 4중 변이체 DNA를 주형 DNA로 사용하여 에러 유발성 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 그 후에 무작위 돌연변이 라이브러리를 제조하고 상기 라이브러리로부터 V121αA/G139αS/F58βN/I176βV 4중 변이체에 비해 CPC 기질에 대한 반응성이 증가된 돌연변이체를 스크리닝하였다. 이때 에러 유발성 중합효소 연쇄반응 조건과 돌연변이 라이브러리의 제조과정 및 스크리닝 과정은 상기 실시예 <1-2-2>에 설명한 바와 같다. 다만, 무작위 돌연변이 라이브러리로부터 CPC 기질에 대한 반응성이 증가된 돌연변이체를 스크리닝할 때 반응액 내에 5 mM 7-ACA를 첨가하였다.

무작위 돌연변이 라이브러리로부터 약 15,000종의 변이체를 스크리닝한 결과, 무작위 돌연변이 주형으로 사용한 V121αA/G139αS/F58βN/I176βV 4중 변이효소에 의한 흡광도 값보다 큰 흡광도 값을 나타내는 변이체 2종 (#59과 #76)을 선발하였다. 이들 변이체를 암호화하는 유전자의 염기서열 결정을 통하여 #59 변이효소는 Ile75β 잔기가 쓰레오닌으로 치환되어 있었고, #76 변이효소는 Ser471β 잔기가 시스테인으로 치환되어 있음을 확인하였다 (도 5).

또한, 상기 실시예 <1-1-2>에서 설명한 방법과 동일하게 #59 변이효소 (V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV 5중 변이체)와 #76 변이효소 (V121αA/G139αS/F58βN/I176βV/S471βC 5중 변이체)의 조효소액을 제조하여 CPC 기질에 대한 반응성을 측정한 결과, 도 9에 도시된 바와 같이 #59 변이효소와 #76 변이효소가 V121αA/G139αS/F58βN/I176βV 4중 변이 아실라제 (F169)보다 CPC 기질에 대한 반응성이 증가한 것을 확인하였다.

<1-4-4> Val121α/Gly139α/Phe58β/Ile75β/Ile176β/Ser471β 6중 변이체의 제조

상기의 결과에서 V121αA/G139αS/F58βN/I176βV 4중 변이체 효소에 I75βT 또는 S471βC의 돌연변이가 도입된 경우에 CPC 기질에 대한 반응성이 증가하는 것을 확인하였다. 따라서, 부가적인 CPC 기질에 대한 반응성 증대를 위해서 무작위 돌연변이 라이브러리로부터 선발된 #76 변이효소 (V121αA/G139αS/F58βN/I176βV/S471βC 5중 변이체)에 #59 변이효소의 변이부위인 I75βT 돌연변이를 도입함으로써 V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV/S471βC 6중 변이효소를 제조하였다 (도 5). 6중 변이체 DNA의 제조과정은 상기 실시예 <1-1-4>의 3중 변이체 DNA의 제조과정과 동일하다. 다만, 이때 PCR에 사용한 프라이머는 I75βT-F 프라이머 (서열번호: 43)와 I75βT-R 프라이머 (서열번호: 44)이고, 주형 DNA로는 #76 변이체 DNA를 사용하였다. 이로부터 제조된 V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV/S471βC 6중 변이체 효소를 암호화하는 변이 CPC 아실라제 유전자를 S12로 명명하였다.

상기 실시예 <1-1-2>에서 설명한 방법과 동일하게 S12 변이체의 조효소액을 제조하여 CPC 기질에 대한 반응성을 측정한 결과, 도 10에 도시된 바와 같이 S12 변이효소 (V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV/S471βC 6중 변이체)는 #76 변이효소 (V121αA/G139αS/F58βN/I176βV/S471βC 5중 변이체)보다 CPC 기질에 대한 반응성이 부가적으로 증가한 것을 확인하였다.

<실시예 2> 변이 CPC 아실라제의 정제 및 반응특성 분석

<2-1> 야생형 CPC 아실라제 및 비활성 증진 변이 CPC 아실라제의 정제

야생형 및 변이 CPC 아실라제 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드를 함유한 E. coli MC1061 형질전환체를 25 ㎍/㎖의 클로르암페니콜이 함유된 테리픽 브로쓰 (terrific broth; 1.2% Bacto-tryptone, 2.4% Yeast Extract, 0.4% glycerol, 0.17 M KH₂PO₄, 0.72 M K₂HPO₄) 1 ℓ에 30℃에서 16시간 동안 배양하여 얻은 전배양액 10 ㎖을 접종하여 25℃, 200 rpm 조건으로 48시간 동안 진탕배양하였다. 그 후에 원심분리 (8,000 rpm, 10분, 4℃)하여 균체를 회수한 후 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) 완충용액으로 2회 세척하였다. 상기 균체를 100 ㎖의 동일 완충용액에 현탁하였다. 이 현탁액을 4℃에서 초음파 분쇄기로 20분 동안 파쇄하고 불용성 물질과 세포 단편들을 제거하기 위해 원심분리 (4℃, 15,000 rpm, 20분)하여 상등액을 취하였다.

상기 조효소액에 황산암모늄 (ammonium sulfate)을 최종 30% 포화가 되도록 첨가하고 4℃에서 1시간 동안 교반하여 포화시킨 후 원심분리 (12,000 rpm, 15분, 4℃)를 통해 침전물을 제거하고, 상등액에 다시 황산암모늄을 최종 60% 포화가 되도록 첨가하였다. 4℃에서 1시간 동안 교반하여 포화시킨 후 원심분리 (12,000 rpm, 15분, 4℃)를 통해 침전물을 회수하여 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) 완충용액 100 ㎖에 용해시키고, 50 mM NaCl을 함유된 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) 완충용액으로 하룻밤 동안 투석하였다.

투석하여 얻은 상기 단백질 용액을 50 mM NaCl을 포함한 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) 완충용액으로 평형화시킨 DEAE-세파로스 음이온 교환수지 컬럼 (5×18.5 ㎝)에 흡착시키고 3배의 동일한 완충용액으로 결합되지 않는 단백질을 세척하였다. 흡착된 단백질은 NaCl 농도를 50~200 mM까지 단계적으로 증가시키면서 용출하였다. CPC 아실라제 활성을 보이는 분획을 회수하여 투석막에 넣고 폴리에틸렌 글리콜 (분자량 20,000)을 이용하여 농축한 후, 농축된 단백질을 25% 황산암모늄을 포함한 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) 완충용액으로 투석하였다.

상기 투석액을 25% 황산암모늄을 함유한 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) 완충용액으로 평형화시킨 페닐-토요펄 컬럼 (Phenyl-Toyopearl column, 2.5×6 ㎝)에 흡착시키고, 흡착된 단백질은 황산암모늄 농도를 25∼0%로 단계적으로 감소시키면서 용출하였다. 각 분획의 CPC 아실라제 활성을 확인한 후, 활성을 보이는 분획을 회수하였고, 상기 활성분획을 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 농축하고 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0) 완충용액으로 투석함으로써 야생형 및 변이 CPC 아실라제를 순수하게 정제하였다.

효소활성은 상기 실시예 <1-1-2>의 방법과 동일하게 측정하였다.

<2-2> 야생형 CPC 아실라제의 물리적 성질 및 반응특성 분석

상기 실시예 <1-1-2>의 pBCPC 플라스미드와 pBSEM 플라스미드를 함유한 재조합 대장균으로부터 상기 실시예 <2-1>에서 설명한 방법으로 야생형 CPC 아실라제를 정제하였다. 그 후에 pBCPC 플라스미드 유래의 야생형 CPC 아실라제 (AcyⅡ)와 pBSEM 플라스미드 유래의 야생형 CPC 아실라제 (즉, 알파-서브유닛과 베타-서브유닛이 개별적으로 생성된 후에 형성된 본 발명의 활성형 CPC 아실라제; Sem)의 물리적 성질 및 반응특성을 조사한 결과, pBCPC 플라스미드 유래의 CPC 아실라제와 pBSEM 플라스미드 유래의 CPC 아실라제는 물리적 특성 (분자량 등) 및 반응특성 (즉, 비활성, 최적 온도, 최적 pH 등)이 모두 동일하였다.

상기 실시예 <2-1>의 과정에 의해 수득된 야생형 CPC 아실라제 활성분획 시료를 비변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 (non-denaturating PAGE)을 수행하여 코마시 블루로 염색한 결과, 도 11에서 보는 바와 같이 약 83 kDa 위치에서 단일 밴드를 보여 야생형 CPC 아실라제가 순수하게 정제되었음을 알 수 있었다. 또한, 상기 비변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 (non-denaturating PAGE) 결과와 더불어 말디-토프 질량분석법 (MALDI-TOF mass spectrophotometry)을 통하여 정제효소 (즉, 활성형 CPC 아실라제)의 분자량이 약 83 kDa임을 확인하였다. 또한, 정제효소를 변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 (denaturating SDS-PAGE)을 수행한 결과, 알파-서브유닛에 해당하는 약 25 kDa 크기의 밴드와 베타-서브유닛에 해당하는 약 58 kDa 크기의 밴드를 확인하였다. 이로부터, 본 발명의 CPC 아실라제는 약 25 kDa의 알파-서브유닛 1개와 약 58 kDa의 베타-서브유닛 1개로 이루어진 이량체 (dimer)임을 확인하였다.

변성 폴리아크릴아마이드 겔 상의 알파-서브유닛과 베타-서브유닛을 각각 분리한 후 말디-토프 질량분석법을 이용하여 각 서브유닛 단편의 분자량을 측정한 결과, pBCPC 유래의 야생형 CPC 아실라제 (AcyⅡ)는 서열번호: 2로 기재되는 아미노산 서열의 230번째 아미노산과 231번째 아미노산 사이, 그리고 239번째 아미노산과 240번째 아미노산 사이에서 각각 자체적인 절단에 의해 9개의 아미노산으로 구성된 스페이서 펩티드가 떨어져 나가서 약 25 kDa의 알파-서브유닛과 약 58 kDa의 베타-서브유닛으로 분리되는 것으로 유추되었다.

야생형 CPC 아실라제의 비활성을 조사한 결과, GL-7-ACA 기질에 대해서는 약 23.1 단위/㎎ 단백질의 비활성을 나타내었고, CPC 기질에 대해서는 약 0.33 단위/㎎ 단백질의 비활성을 나타내었다. 결국, 슈도모나스 속 SE83 균주 유래 AcyⅡ의 CPC 기질에 대한 비활성은 GL-7-ACA 기질에 대한 비활성에 비하여 약 1.4% 수준의 활성을 지니고 있었다.

상기 실시예 <1-1-2>의 방법과 동일하게 효소반응을 수행한 후에 CPC 기질에 대한 정제효소의 역학 매개변수 (kinetic parameter)를 라인웨버-버크 플롯 방법 (Lineweaver-Burk plot method)으로 결정한 결과, Km은 50 mM이고 Kcat은 0.9/초, 반응효율 (catalytic efficiency; 즉, Kcat/Km)은 0.02/초/mM로 나타났다.

야생형 CPC 아실라제의 반응 최적온도와 최적 pH를 조사한 결과, CPC 기질에 대한 반응 최적온도는 40℃이고 최적 pH는 9.0으로 나타났다.

<2-3> 비활성 증진 변이 CPC 아실라제의 반응특성 분석

상기 실시예 <1-1>의 M31βL/F58βM 2중 변이효소, M31βL/F58βM/H70βS 3중 변이효소, F169αY/M31βL/F58βM/H70βS 4중 변이효소 및 F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV 5중 변이효소를 암호화하는 각각의 변이 아실라제 유전자가 삽입된 플라스미드로 형질전환된 재조합 대장균으로부터 상기 실시예 <2-1>에서 설명한 방법과 동일하게 각각의 변이 CPC 아실라제를 정제하였다.

순수하게 정제된 각 변이효소의 반응특성을 조사한 결과, 이들 변이 CPC 아실라제의 최적 온도와 최적 pH 등의 반응특성 및 분자량은 야생형 CPC 아실라제와 동일하였다. 그러나, 각 변이효소의 CPC 기질에 대한 비활성을 조사한 결과, 하기 표 2에 표시된 바와 같이 변이과정이 진행됨에 따라서 각 변이효소의 CPC 기질에 대한 비활성이 증가하였으며, 결국 상기 실시예 1에서 설명한 일련의 부위특이 돌연변이를 통해 야생형 CPC 아실라제에 비해서 CPC 기질에 대해 비활성이 약 11.2배 증가한 F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV 5중 변이 CPC 아실라제를 제조하게 되었다.

변이효소	CPC 기질에 대한 상대 활성 (배)
야생형	1.0
M31βL/F58βM	1.2
M31βL/F58βM/H70βS	5.2
F169αY/M31βL/F58βM/H70βS	7.3
F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV	11.2

상기 실시예 <1-1-2>의 방법과 동일하게 효소반응을 수행한 후에 CPC 기질에 대한 F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV 5중 변이효소의 역학 매개변수를 측정한 결과, Km은 8 mM이고 Kcat은 2.4/초, Kcat/Km은 0.30/초/mM로 나타났다. F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV 5중 변이효소는 야생형 효소에 비하여 CPC 기질에 대한 Km 값이 약 6.3배가 감소한 것이고 반응효율 (즉, Kcat/Km)은 약 15배가 증가한 것이다. 이로부터, CAD의 3차 구조 정보를 바탕으로 일련의 AcyⅡ 부위특이 돌연변이를 통해 CPC 기질에 대한 결합능력 및 비활성이 증가된 변이 CPC 아실라제가 제조되었음을 확인하였다.

<2-4> CPC 반응성 증진 변이 CPC 아실라제의 정제 및 반응특성 분석

상기 실시예 <1-3>의 V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV 6중 변이효소를 암호화하는 변이 CPC 아실라제 유전자 (TnS5αβ)와 상기 실시예 <1-4-4>의 V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV/S471βC 6중 변이효소를 암호화하는 변이 CPC 아실라제 유전자 (S12)가 삽입된 플라스미드로 형질전환된 재조합 대장균으로부터 상기 실시예 <2-1>에서 설명한 방법과 동일하게 이들 6중 변이 CPC 아실라제를 정제하였다.

순수하게 정제된 TnS5αβ 및 S12 변이효소의 반응특성을 조사한 결과, 이들 변이 CPC 아실라제의 최적 온도와 최적 pH 등의 반응특성 및 분자량은 야생형 CPC 아실라제의 반응특성 및 분자량과 동일하였다.

변이 CPC 아실라제의 CPC 기질에 대한 비활성과 7-ACA 반응산물에 의한 효소활성 저해정도를 조사하기 위해서 반응 pH를 8.5로 조정하는 것을 제외하고는 상기 실시예 <1-1-2>의 방법과 동일하게 효소반응을 수행하였다. 그 결과, TnS5αβ 및 S12 변이효소의 CPC 기질에 대한 비활성은 야생형 CPC 아실라제의 비활성에 비해 각각 2.3배 및 8.5배가 증가한 1.5 단위/㎎ 단백질 및 5.8 단위/㎎ 단백질로 나타났다. 또한, S12 변이효소의 7-ACA에 의한 저해상수 (Ki)를 측정한 결과, 야생형 효소의 Ki 값은 0.4 mM인 반면에 S12 변이효소의 Ki 값은 1.9 mM로 확인되어 S12 변이효소는 야생형 효소에 비하여 7-ACA에 의한 반응산물 저해정도가 많이 감소된 것으로 판단되었다. 이로부터, 본 발명의 S12 변이효소 (V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV/S471βC 6중 변이체)가 야생형 효소에 비하여 CPC 기질에 대한 비활성이 크게 증가되고 7-ACA 반응산물에 의한 활성저해 정도가 많이 감소되었음을 확인하였다.

<실시예 3> 대장균에서 변이 CPC 아실라제의 생산

<3-1> pBC KS(+) 벡터를 이용한 변이 CPC 아실라제의 생산

pBC KS(+) 벡터에 야생형 아실라제를 암호화하는 유전자 (acyⅡ 또는 sem)가 삽입된 재조합 플라스미드와 pBC KS(+) 벡터에 V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV 6중 변이 CPC 아실라제를 암호화하는 유전자 (TnS5 또는 TnS5αβ) 및 V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV/S471βC 6중 변이 CPC 아실라제를 암호화하는 유전자 (S12)가 삽입된 재조합 플라스미드로 형질전환된 재조합 E. coli MC1061에서의 CPC 아실라제 생산성을 조사하였다. 이때, 이들 재조합 플라스미드 상에서 야생형 또는 변이 CPC 아실라제 유전자의 전사는 pBC KS(+) 벡터 상에 존재하는 lac 프로모터에 의해서 이루어진다.

상기 실시예 <1-1-2>에서 설명한 방법과 동일하게 각각의 재조합 대장균을 배양한 후 조효소액을 제조하고 CPC 기질에 대한 활성을 측정하였다. 이때, 본 배양에 사용한 배지는 25 ㎍/㎖ 클로르암페니콜이 함유된 50 ㎖의 LB 브로쓰이고 배양조건은 25℃에서 48시간 동안 200 rpm으로 진탕배양하였다. 그 결과, 하기 표 3에서 보는 바와 같이, pBC-S12 플라스미드 함유 재조합 대장균에 의한 CPC 아실라제 생산성이 712 단위/ℓ로서 최대 생산성을 나타내었다.

CPC 아실라제생성 형태	플라스미드(CPC 아실라제)	CPC 아실라제 생산성(단위/ℓ)
각 서브유닛의 개별적인 발현	pBSEM (야생형)	11
	pBC-TnS5 (TnS5 6중 변이체)	78
자체절단	pBCPC (야생형)	97
	pBC-TnS5αβ (TnS5 6중 변이체)	162
	pBC-S12 (S12 6중 변이체)	712

<3-2> pET29-a(+) 벡터를 이용한 변이 CPC 아실라제의 생산

<3-2-1> pET29-TnS5αβ 및 pET29-S12 플라스미드의 제조

pBC-TnS5αβ 및 pBC-S12 플라스미드를 주형으로 하고 pET29-F 프라이머 (서열번호: 40)와 pET29-R 프라이머 (서열번호: 41)를 사용한 PCR을 통해 수득한 2.5 kb 크기의 DNA 단편을 제한효소 XbaI과 XhoI으로 절단한 후 정제 키트 (QIAEX Ⅱ Gel Extraction Kit)로 정제하여 삽입 DNA로 사용하였다. 또한, pET29-a(+) 벡터 (Novagen사, USA)를 제한효소 XbaI과 XhoI으로 절단하고 CIP로 탈인산화시킨 DNA 단편을 벡터 DNA로 사용하였다. 상기 삽입 DNA와 벡터 DNA를 T4 DNA 리가아제를 이용하여 16℃에서 16시간 동안 접합시킨 후 상기 접합액을 이용하여 전기천공법에 의한 E. coli MC1061 균주의 형질전환을 수행하였다. 상기 균주를 20 ㎍/㎖ 농도의 카나마이신 (kanamycin) 항생제를 함유한 LB 한천배지에 도말하여 30℃에서 하룻밤 정치배양함으로써 형질전환체들을 얻었다. 이 형질전환체로부터 플라스미드를 분리하여 삽입 DNA의 염기서열을 결정함으로써 pET29-TnS5αβ 및 pET29-S12 플라스미드를 제조하였다.

<3-2-2> pET29-TnS5αβ 및 pET29-S12 플라스미드 함유 재조합 대장균에 의한 변이 CPC 아실라제의 생산

pET29-TnS5αβ 및 pET29-S12 플라스미드를 전기천공법에 의해 E. coli BL21(DE3) 균주로 도입함으로써 pET29-TnS5αβ 및 pET29-S12 플라스미드 함유 재조합 대장균을 제조한 후 상기 재조합 대장균에서의 6중 변이 CPC 아실라제의 생산성을 조사하였다. 이때, 이들 플라스미드 상에서 TnS5αβ 및 pET29-S12 유전자의 전사는 pET29-a(+) 벡터 상에 존재하는 LacI 작용자 (operator)에 의해 조절되는 T7 프로모터에 의해서 이루어진다.

pET29-TnS5αβ 플라스미드 함유 재조합 대장균을 20 ㎍/㎖의 카나마이신이 첨가된 3 ㎖의 LB 액체배지에 접종한 후 30℃, 200 rpm 조건으로 16시간 동안 진탕배양하였다. 상기 배양액 50 ㎕를 20 ㎍/㎖의 카나마이신과 락토오스 (lactose)가 각각 0, 0.02, 0.2 및 2%씩 첨가된 50 ㎖의 새로운 LB 배지에 접종한 후 25℃, 200 rpm 조건으로 80시간 동안 진탕배양하였다. 이때, 배양시간에 따른 변이 CPC 아실라제의 생산성을 확인하기 위해서 배양시간 24, 36, 48, 72 및 80시간째의 배양액을 각각 5 ㎖씩 채취하였다. 그 후 원심분리 (4℃, 8,000 rpm, 10분 조건)하여 균체를 회수하고 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0) 완충용액으로 2회 세척하였다. 상기 균체를 500 ㎕의 동일 완충용액에 현탁한 후 4℃에서 초음파 분쇄기로 1분 동안 파쇄하고 4℃, 15,000 rpm 조건으로 20분 동안 원심분리하여 상등액을 취함으로써 6중 변이 CPC 아실라제 조효소액을 제조하였다. 상기 조효소액을 사용하여 상기 실시예 <1-1-2>에서 설명한 방법과 동일하게 CPC 기질에 대한 활성을 측정하였다.

pET29 벡터와 E. coli BL21(DE3)의 발현체계에서 외래 유전자의 고발현을 위해 유도물질 (inducer)로서 통상적으로 사용되는 IPTG는 고가의 화학물질이므로 실제 산업적 규모의 배양에서 유도물질로 사용하기에는 어려운 측면이 있다. 이에, 본 발명에서는 저가의 락토오스 (DIFCO, 미국)를 IPTG 대신 유도물질로 사용하여 변이 CPC 아실라제를 대량생산하고자 하였다. 또한, pET29 벡터와 E. coli BL21(DE3)의 발현체계에서 외래 유전자의 고발현은 배양 초기에는 유도물질을 첨가하지 않고 일정시간 동안 배양을 수행하여 균체를 증식시킨 후, 일정 시점에서 유도물질을 첨가하여 추가적으로 배양함으로써 짧은 시간 내에 외래 유전자의 고발현을 유도하는 것이 통상적인 방법이다. 그러나, CPC 아실라제의 경우 활성형의 효소를 얻기 위해서는 번역 후의 자체절단 과정이 필수적인데, 상기와 같은 유도발현 (inducible expression) 방법에 의한 CPC 아실라제의 생산은 다량의 불활성 폴리펩티드가 생성되는 것으로 확인되어 본 발명에서는 유도물질인 락토오스를 배양초기부터 첨가하여 변이 CPC 아실라제 유전자가 항시발현 (constitutive expression) 되도록 배양하였다.

그 결과, 하기 표 4에서 보는 바와 같이 LB 배지 내에 2% 락토오스가 첨가되었을 때 락토오스가 TnS5αβ 유전자의 발현을 위한 유도물질로 작용하여 배양시간이 지남에 따라서 변이 CPC 아실라제의 생산성이 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 배양시간 72시간째에 334 단위/ℓ의 최대 생산성을 나타냈다. 그리고, 각 락토오스 농도별 48시간째 배양액으로부터 제조한 상기 조효소액을 변성 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 (12% SDS-PAGE)을 수행하여 단백질 패턴을 조사한 결과, 도 12에 도시된 바와 같이 2% 락토오스를 첨가한 배양의 경우에 변이 CPC 아실라제가 대량으로 생산된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 약 83 kDa 크기의 불활성 폴리펩티드 밴드가 보이지 않는 것으로 보아 본 발명의 배양조건에서 TnS5αβ 유전자의 전사 및 번역 후에 자체절단이 효율적으로 일어나 대부분의 불활성 폴리펩티드가 활성형의 CPC 아실라제로 전환된 것으로 추정된다.

락토오스 농도	배양시간(시간)	세포 생장(OD600)	변이 CPC 아실라제 생산성(단위/ℓ)
0%	24	6.8	5
	36	6.9	6
	48	5.8	3
0.02%	24	4.7	35
	36	4.2	36
	48	3.5	32
0.2%	24	5.8	71
	36	5.2	72
	48	4.4	64
2%	24	5.7	118
	36	7.8	132
	48	9.5	168
	60	11.2	304
	72	11.5	334
	80	12.2	312

또한, pET29-S12 플라스미드 함유 재조합 E. coli BL21(DE3) 균주에서의 S12 변이효소의 생산성을 조사하였다. 상기와 동일한 방법으로 재조합 대장균을 배양한 후에 조효소액을 제조하고 CPC 기질에 대한 활성을 측정하였다. 이때, 본 배양에 사용한 배지는 20 ㎍/㎖의 카나마이신과 2% 락토오스가 첨가된 50 ㎖의 LB 브로쓰이고, 배양조건은 25℃에서 72시간 동안 200 rpm으로 진탕배양하였다. 그 결과, pET29-S12 플라스미드 함유 E. coli BL21(DE3) 균주에 의한 V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV/S471βC 6중 변이 CPC 아실라제 생산성은 1,207 단위/ℓ 수준으로 나타났다.

본 발명에 따라 제조된 CPC 기질에 대한 반응성이 증진된 V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV/S471βC 6중 변이 CPC 아실라제를 암호화하는 S12 유전자를 함유하는 pET29-S12 플라스미드로 형질전환된 E. coli BL21(DE3) 균주를 “Escherichia coli BL21(DE3)/pET-S12”라 명명하였고, 2003년 7월 30일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다 (기탁번호: KCTC 10503BP).

<실시예 4> 변이 CPC 아실라제를 이용한 CPC 기질의 7-ACA로의 전환반응

상기 실시예 <3-2>의 pET29-TnS5αβ 및 pET29-S12 플라스미드 함유 E. coli BL21(DE3) 균주를 20 ㎍/㎖의 카나마이신과 2% 락토오스가 첨가된 LB 브로쓰 5 ℓ에서 25℃, 72시간, 200 rpm 조건으로 진탕배양하였다. 또한, 야생형 CPC 아실라제 유전자가 함유된 E. coli MC1061(pBCPC) 균주를 25 ㎍/㎖ 클로르암페니콜이 첨가된 LB 브로쓰 10 ℓ에서 25℃, 48시간, 200 rpm 조건으로 진탕배양하였다. 그 후에 이들 재조합 대장균 배양체로부터 상기 실시예 <2-1>에서 설명한 방법과 동일하게 야생형 CPC 아실라제, TnS5αβ 및 S12 변이 CPC 아실라제를 정제하였다. 다만, 최종 정제된 단백질을 50 mM 인산 완충용액 (pH 8.5)으로 투석한 후에 CPC 기질의 전환반응에 사용하였다.

50 mM 인산 완충용액 (pH 8.5)에 용해된 CPC 기질을 최종 50 mM 되게 첨가하고 동일 완충용액에 용해된 상기 제조 효소액을 최종 5 단위/㎖이 되도록 첨가하여 최종 50 ㎖의 반응용액을 제조하였다. 상기 반응액을 25℃에서 60분 동안 교반하면서 CPC 전환반응을 수행하였는데, 이때 전환반응 중에 반응용액의 pH가 낮아지는 것을 방지하기 위해서 반응용액의 pH가 8.4에 도달했을 때 pH 조절기에 의해 0.2 N KOH 용액이 첨가되도록 하여 반응용액의 pH를 일정하게 8.5가 유지되도록 하였다. 전환반응 중에 일정 시간별로 100 ㎕씩을 채취한 후 즉시 HPLC 분석를 통해서 반응액 중의 CPC 기질과 7-ACA 산물의 양을 정량하였다. HPLC 분석을 위해서 Symmetry C18 컬럼 (Waters사, 미국)을 사용하였고, 전개용매 (mobile phase)는 20 mM 암모니움 아세테이트 (ammonium acetate) 완충용액 (pH 5.0)과 아세토니트릴의 혼합액 (90 : 10)을 사용하였다. 또한, 전개용매의 유속은 0.6 ㎖/분으로 하였으며, 주입한 시료양은 반응액을 50 mM 인산 완충용액 (pH 8.5)으로 적절히 희석한 후에 20 ㎕를 주입하였고, 검출은 UV 250 ㎚에서 수행하였다.

그 결과, 도 13에 도시된 바와 같이 상기 반응조건 하에서 야생형 CPC 아실라제는 60% 수준의 CPC 전환율을 나타내었지만 본 발명의 TnS5αβ 변이 CPC 아실라제와 S12 변이 CPC 아실라제에 의해서는 각각 86% 및 98% 수준의 CPC 전환율을 나타내었다. 특히, 도 13 및 도 14에 도시된 바와 같이 상기 반응조건 하에서 S12 변이 CPC 아실라제에 의해서 CPC 기질이 대부분 7-ACA로 전환되어 90% 수준 이상의 7-ACA 수율을 수득하였다.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 변이 CPC 아실라제는 CPC 기질에 대한 비활성이 증가하였을 뿐만 아니라 7-ACA 반응산물에 의한 효소활성 저해현상도 현저히 감소하여 CPC를 7-ACA로 90% 이상 전환시키므로 7-ACA 생산을 위한 1단계 효소반응법에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 CPC로부터 7-ACA를 제조하기 위한 1단계 효소반응법과 2단계 효소반응법을 도식화한 것이고,

도 2는 슈도모나스 속 KAC-1 균주 유래의 CAD 효소와 GL-7-ACA 기질 결합체의 3차원 구조 (A) 및 활성부위 주위 잔기들을 도식화 (B)한 것이고,

도 3은 슈도모나스 속 KAC-1 균주 유래의 CAD 효소와 GL-7-ACA 기질의 결합양식을 나타낸 것이고,

도 4는 슈도모나스 속 KAC-1 균주 유래의 CAD 효소와 CPC 기질의 결합양식을 모델링한 결과이고,

도 5는 본 발명에 따른 변이 CPC 아실라제의 제조과정을 도식화한 것이고,

도 6은 본 발명에 따른 야생형 CPC 아실라제 (Sem), F169αY/M31βL/F58βM/I176βV 4중 변이 CPC 아실라제 (H70) 및 F169αY/M31βL/F58βM/H70βS/I176βV 5중 변이 CPC 아실라제 (mI176)의 반응산물에 대한 효소활성 저해정도를 나타낸 것이고,

도 7은 본 발명에 따른 F169αY/M31βL/F58βM/I176βV 4중 변이 CPC 아실라제 (H70), V121αA/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV 5중 변이 CPC 아실라제 (#213), G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV 5중 변이 CPC 아실라제 (#120) 및 V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βM/I176βV 6중 변이 CPC 아실라제 (TnS5)의 CPC 기질에 대한 반응성을 나타낸 것이고,

도 8은 본 발명에 따른 V121αA/G139αS/F169αY/F58βN/I176βV 5중 변이 CPC 아실라제, V121αA/G139αS/F169αY/F58βC/I176βV 5중 변이 CPC 아실라제, V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βN/I176βV 6중 변이 CPC 아실라제 및 V121αA/G139αS/F169αY/M31βL/F58βC/I176βV 6중 변이 CPC 아실라제의 CPC 기질에 대한 반응성을 나타낸 것이고,

도 9는 본 발명에 따른 V121αA/G139αS/F58βN/I176βV 4중 변이 CPC 아실라제 (F169), V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV 5중 변이 CPC 아실라제 (#59) 및 V121αA/G139αS/F58βN/I176βV/S471βC 5중 변이 CPC 아실라제 (#76)의 CPC 기질에 대한 반응성을 나타낸 것이고,

도 10a 및 10b는 각각 본 발명에 따른 V121αA/G139αS/F58βN/I75βT/I176βV/S471βC 6중 변이 CPC 아실라제 (S12)의 CPC 기질에 대한 반응성과 반응산물 저해정도를 나타낸 것이고,

도 11은 본 발명에 따른 슈도모나스 속 SE83 균주 유래 야생형 CPC 아실라제의 분자량을 나타낸 것이고,

A: SDS-PAGE 분석 (M: 분자량 마커, 1: 무세포 추출액, 2: 정제된 효소)

B: 비-변성 PAGE (M: 분자량 마커, 1: 정제된 효소)

C: 말디-토프 질량분석

도 12는 본 발명의 pET29-TnS5αβ 플라스미드 함유 E. coli BL21(DE3) 균주의 배양체로부터 분리된 조효소를 전기영동하여 코마시 블루로 염색한 것이고,

M: 표준 크기 단백질, 1: 0% 락토오스, 48시간 배양

2: 0.02% 락토오스, 48시간 배양, 3: 0.2% 락토오스, 48시간 배양

4: 2% 락토오스, 48시간 배양, 5: 2% 락토오스, 72시간 배양

도 13은 야생형 CPC 아실라제와 본 발명의 TnS5αβ 및 S12 변이 CPC 아실라제에 의한 CPC로부터 7-ACA로의 전환을 나타낸 그래프이고,

도 14는 본 발명의 S12 변이 CPC 아실라제를 이용하여 CPC로부터 생성된 7-ACA 반응산물을 나타낸 HPLC 결과이다.

<110> AMICOGEN, INC. <120> CEPHALOSPORIN C ACYLASE MUTANT AND METHOD FOR PREPARING 7-ACA USING SAME <130> FPD/200304-0138 <160> 44 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2325 <212> DNA <213> wild-type CPC acylase acyII gene <400> 1 atgaccatgg cggcgaaaac cgatcgtgaa gcgctgcagg cggcgctgcc gccgctgagc 60 ggcagcctga gcatcccggg cctgagcgcg ccggtgcgtg tgcagcgtga tggctggggc 120 atcccgcata tcaaagcgag cggcgaagcg gatgcgtatc gtgcgttggg ctttgtgcat 180 gcgcaggatc gtctgtttca gatggaactg acccgtcgta aagcgctggg ccgtgcggcg 240 gaatggctgg gcgcggaagc ggcggaagcg gatatcctgg tgcgtcgtct gggcatggaa 300 aaagtgtgcc gtcgtgattt tgaagcgctg ggcgcggaag cgaaagatat gctgcgtgcg 360 tatgtggcgg gcgtgaacgc gtttctggcg agcggcgcgc cgctgccgat cgaatatggc 420 ctgctgggcg cggaaccgga accgtgggaa ccgtggcata gcatcgcggt gatgcgtcgt 480 ctgggcctgc tgatgggcag cgtgtggttt aaactgtggc gtatgctggc gctgccggtg 540 gtgggcgcgg cgaacgcgct gaaactgcgt tatgatgatg gcggccagga tctgctgtgc 600 atcccgccgg gcgtggaagc ggaacgtctg gaagcggatc tggcggcgct gcgtccggcg 660 gtggatgcgc tgctgaaagc gatgggcggc gatgcgagcg atgcggcggg cggcggcagc 720 aacaactggg cggtggcgcc gggccgtacc gcgaccggcc gtccgatcct ggcgggcgat 780 ccgcatcgtg tgtttgaaat cccgggcatg tatgcgcagc atcatctggc gtgcgatcgt 840 tttgatatga tcggcctgac cgtgccgggc gtgccgggct ttccgcattt tgcgcataac 900 ggcaaagtgg cgtattgcgt gacccatgcg tttatggata tccatgatct gtatctggaa 960 cagtttgcgg aagatggccg taccgcgcgt tttggcaacg aatttgaacc ggtggcgtgg 1020 cgtcgtgatc gtatcgcggt gcgtggcggc gcggatcgtg aatttgatat cgtggaaacc 1080 cgtcatggcc cggtgatcgc gggcgatccg ctggaaggcg cggcgctgac cctgcgtagc 1140 gtgcagtttg cggaaaccga tctgagcttt gattgcctga cccgtatgcc gggcgcgagc 1200 accgtggcgc agctgtatga tgcgacccgt ggctggggcc tgatcgatca taacctggtg 1260 gcgggcgatg tggcgggcag catcggccat ctggtgcgtg cgcgtgtgcc gagccgtccg 1320 cgtgaaaacg gctggctgcc ggtgccgggc tggagcggcg aacatgaatg gcgtggctgg 1380 attccgcatg aagcgatgcc gcgtgtgatc gatccgccgg gcggcctgat cgtgaccgcg 1440 aacaaccgtg tggtggcgga tgatcatccg gattatctgt gcaccgattg ccatccgccg 1500 tatcgtgcgg aacgtatcat ggaacgtctg gtggcgagcc cggcgtttgc ggtggatgat 1560 gcggcggcga tccatgcgga taccctgagc ccgcatgtgg gcctgctgcg tgcgcgtctg 1620 gaagcgctgg gcatccaggg cagcctgccg gcggaagaac tgcgtcagac cctgatcgcg 1680 tgggatggcc gtatggatgc gggcagccag gcggcgagcg cgtataacgc gtttcgtcgt 1740 gcgctgaccc gtctggtgac cgcgcgtagc ggcctggaac aggcgatcgc gcatccgttt 1800 gcggcggtgc cgccgggcgt gagcccgcag ggccaggtgt ggtgggcggt gccgaccctg 1860 ctgcgtaacg atgatgcggg catgctgaaa ggctggagct gggatgaagc gctgagcgaa 1920 gcgctgagcg tggcgaccca gaacctgacc ggccgtggct ggggcgaaga acatcgtccg 1980 cgttttaccc atccgctgag cgcgcagttt ccggcgtggg cggcgctgct gaacccggtg 2040 agccgtccga tcggcggcga tggcgatacc gtgctagcga acggcctggt gccgagcgcg 2100 ggcccggaag cgacttatgg cgcgctgagc cgttatgtgt ttgatgtggg caactgggat 2160 aacagccgtt gggtggtgtt tcatggcgcg agcggccatc cggcgagccc gcattatgcg 2220 gatcagaacg cgccgtggag cgattgcgcg atggtgccga tgctgtatag ctgggatcgt 2280 atcgcggcgg aagcggtgac cagccaggaa ctggtgccgg cgtaa 2325 <210> 2 <211> 774 <212> PRT <213> wild-type CPC acylase AcyII protein <400> 2 Met Thr Met Ala Ala Lys Thr Asp Arg Glu Ala Leu Gln Ala Ala Leu 1 5 10 15 Pro Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ser Ile Pro Gly Leu Ser Ala Pro Val 20 25 30 Arg Val Gln Arg Asp Gly Trp Gly Ile Pro His Ile Lys Ala Ser Gly 35 40 45 Glu Ala Asp Ala Tyr Arg Ala Leu Gly Phe Val His Ala Gln Asp Arg 50 55 60 Leu Phe Gln Met Glu Leu Thr Arg Arg Lys Ala Leu Gly Arg Ala Ala 65 70 75 80 Glu Trp Leu Gly Ala Glu Ala Ala Glu Ala Asp Ile Leu Val Arg Arg 85 90 95 Leu Gly Met Glu Lys Val Cys Arg Arg Asp Phe Glu Ala Leu Gly Ala 100 105 110 Glu Ala Lys Asp Met Leu Arg Ala Tyr Val Ala Gly Val Asn Ala Phe 115 120 125 Leu Ala Ser Gly Ala Pro Leu Pro Ile Glu Tyr Gly Leu Leu Gly Ala 130 135 140 Glu Pro Glu Pro Trp Glu Pro Trp His Ser Ile Ala Val Met Arg Arg 145 150 155 160 Leu Gly Leu Leu Met Gly Ser Val Trp Phe Lys Leu Trp Arg Met Leu 165 170 175 Ala Leu Pro Val Val Gly Ala Ala Asn Ala Leu Lys Leu Arg Tyr Asp 180 185 190 Asp Gly Gly Gln Asp Leu Leu Cys Ile Pro Pro Gly Val Glu Ala Glu 195 200 205 Arg Leu Glu Ala Asp Leu Ala Ala Leu Arg Pro Ala Val Asp Ala Leu 210 215 220 Leu Lys Ala Met Gly Gly Asp Ala Ser Asp Ala Ala Gly Gly Gly Ser 225 230 235 240 Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro Ile 245 250 255 Leu Ala Gly Asp Pro His Arg Val Phe Glu Ile Pro Gly Met Tyr Ala 260 265 270 Gln His His Leu Ala Cys Asp Arg Phe Asp Met Ile Gly Leu Thr Val 275 280 285 Pro Gly Val Pro Gly Phe Pro His Phe Ala His Asn Gly Lys Val Ala 290 295 300 Tyr Cys Val Thr His Ala Phe Met Asp Ile His Asp Leu Tyr Leu Glu 305 310 315 320 Gln Phe Ala Glu Asp Gly Arg Thr Ala Arg Phe Gly Asn Glu Phe Glu 325 330 335 Pro Val Ala Trp Arg Arg Asp Arg Ile Ala Val Arg Gly Gly Ala Asp 340 345 350 Arg Glu Phe Asp Ile Val Glu Thr Arg His Gly Pro Val Ile Ala Gly 355 360 365 Asp Pro Leu Glu Gly Ala Ala Leu Thr Leu Arg Ser Val Gln Phe Ala 370 375 380 Glu Thr Asp Leu Ser Phe Asp Cys Leu Thr Arg Met Pro Gly Ala Ser 385 390 395 400 Thr Val Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Thr Arg Gly Trp Gly 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cgcgtgtgcc gagccgtccg 1320 cgtgaaaacg gctggctgcc ggtgccgggc tggagcggcg aacatgaatg gcgtggctgg 1380 attccgcatg aagcgatgcc gcgtgtgatc gatccgccgg gcggcctgat cgtgaccgcg 1440 aacaaccgtg tggtggcgga tgatcatccg gattatctgt gcaccgattg ccatccgccg 1500 tatcgtgcgg aacgtatcat ggaacgtctg gtggcgagcc cggcgtttgc ggtggatgat 1560 gcggcggcga tccatgcgga taccctgagc ccgcatgtgg gcctgctgcg tgcgcgtctg 1620 gaagctttgg gcatccaggg cagcctgccg gcggaagaac tgcgtcagac cctgatcgcg 1680 tgggatggcc gtatggatgc gggcagccag gcggcgagcg cgtataacgc gtttcgtcgt 1740 gcgctgaccc gtctggtgac cgcgcgtagc ggcctggaac aggcgatcgc gcatccgttt 1800 gcggcggtgc cgccgggcgt gagcccgcag ggccaggtgt ggtgggcggt gccgaccctg 1860 ctgcgtaacg atgatgcggg catgctgaaa ggctggagct gggatgaagc gctgagcgaa 1920 gcgctgagcg tggcgaccca gaacctgacc ggccgtggct ggggcgaaga acatcgtccg 1980 cgttttaccc atccgctgag cgcgcagttt ccggcgtggg cggcgctgct gaacccggtg 2040 agccgtccga tcggcggcga tggcgatacc gtgctagcga acggcctggt gccgagcgcg 2100 ggcccggaag cgacttatgg cgcgctgtgc cgttatgtgt 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Tyr Ser Trp Asp Arg Ile Ala Ala Glu Ala Val Thr 515 520 525 Ser Gln Glu Leu Val Pro Ala 530 535 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T3 primer <400> 9 aattaaccct cactaaaggg a 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 primer <400> 10 taatacgact cactataggg 20 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13-R primer <400> 11 ggaaacagct atgaccatg 19 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13-F primer <400> 12 gtaaaacgac ggccagt 17 <210> 13 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPC-F primer <400> 13 ataccgctcg aggtcctaga aaaaaccaag gaggtaataa ataatgacca tggcggcg 58 <210> 14 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPC-R primer <400> 14 ctagctctag agatcctcat tacgccggca ccagttc 37 <210> 15 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha ORF-R primer <400> 15 ttattacctc cttgaattca ctagtcatta gccgcccatc gctttc 46 <210> 16 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta ORF-F primer <400> 16 ctagtgaatt caaggaggta ataaataatg agcaacaact gggcgg 46 <210> 17 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HindIII-F primer <400> 17 gcgtgcgcgt ctggaagctt tgggcatcca gggc 34 <210> 18 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HindIII-R primer <400> 18 gccctggatg cccaaagctt ccagacgcgc acgc 34 <210> 19 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M31beta L-R primer <400> 19 gtcaggccga tcatatcaaa acgatcgcac gccagatgat gctgcgcata aaggcccggg 60 atttc 65 <210> 20 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F58beta M-F primer <400> 20 gttttgatat gatcggcctg accgtgccgg gcgtgccggg ctttccgcat atggcgcata 60 acggc 65 <210> 21 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F58beta C-F primer <400> 21 gttttgatat gatcggcctg accgtgccgg gcgtgccggg ctttccgcat tgcgcgcata 60 acggc 65 <210> 22 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F58beta A-F primer <400> 22 gttttgatat gatcggcctg accgtgccgg gcgtgccggg ctttccgcat gcggcgcata 60 acggc 65 <210> 23 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F58beta V-F primer <400> 23 gttttgatat gatcggcctg accgtgccgg gcgtgccggg ctttccgcat gtggcgcata 60 acggc 65 <210> 24 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F58beta L-F primer <400> 24 gttttgatat gatcggcctg accgtgccgg gcgtgccggg ctttccgcat ctggcgcata 60 acggc 65 <210> 25 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F58beta N-F primer <400> 25 gttttgatat gatcggcctg accgtgccgg gcgtgccggg ctttccgcat aatgcgcata 60 acggc 65 <210> 26 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H70beta S-F primer <400> 26 ggcgtattgc gtgaccagcg cgtttatgga tatcc 35 <210> 27 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H70 beta S-R primer <400> 27 ggatatccat aaacgcgctg gtcacgcaat acgcc 35 <210> 28 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H70beta L-F primer <400> 28 ggcgtattgc gtgaccctgg cgtttatgga tatcc 35 <210> 29 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H70beta L-R primer <400> 29 ggatatccat aaacgccagg gtcacgcaat acgcc 35 <210> 30 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F169alpha Y-F primer <400> 30 gatgggcagc gtgtggtata aactgtggcg tatg 34 <210> 31 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F169alpha Y-R primer <400> 31 catacgccac agtttatacc acacgctgcc catc 34 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> I176beta V-F primer <400> 32 cgtggctggg gcctggttga tcataacctg gtg 33 <210> 33 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> I176beta V-R primer <400> 33 caccaggtta tgatcaacca ggccccagcc acg 33 <210> 34 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H70beta-F primer <400> 34 ggcgtattgc gtgacccatg cgtttatgga tatcc 35 <210> 35 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H70beta-R primer <400> 35 ggatatccat aaacgcatgg gtcacgcaat acgcc 35 <210> 36 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G139alpha S-F primer <400> 36 cgctgccgat cgaatatagc ctgctgggcg cggaac 36 <210> 37 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G139alpha S-R primer <400> 37 gttccgcgcc cagcaggcta tattcgatcg gcagcg 36 <210> 38 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha CPC-R primer <400> 38 gctgccgccg cccgccgcat cgctcgcatc gccgcccatc gctttcagc 49 <210> 39 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta CPC-F primer <400> 39 gcgatgcgag cgatgcggcg ggcggcggca gcaacaactg ggcggtg 47 <210> 40 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET29-F primer <400> 40 tcccctctag aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga tatacatatg accatggcgg 60 cgaaaactg 69 <210> 41 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET29-R primer <400> 41 gtggtgctcg agtcattacg ccggcaccag ttc 33 <210> 42 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M31beta-R primer <400> 42 gtcaggccga tcatatcaaa acgatcgcac gccagatgat gctgcgcata catgcccggg 60 atttc 65 <210> 43 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> I75betaT-F primer <400> 43 cgtgacccat gcgtttatgg atacccatga tctgtatctg gaacagtttg 50 <210> 44 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> I75betaT-R primer <400> 44 caaactgttc cagatacaga tcatgggtat ccataaacgc atgggtcacg 50 <210> 45 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F169alpha-F primer <400> 45 gatgggcagc gtgtggttta aactgtggcg tatg 34 <210> 46 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F169alpha-R primer <400> 46 catacgccac agtttaaacc acacgctgcc catc 34

Claims (30)

1. 서열번호: 4로 기재되는 알파-서브유닛과 서열번호: 5로 기재되는 베타-서브유닛으로 구성된 아미노산 서열을 갖는 CPC 아실라제 서열 중에서 Val121α, Gly139α, Phe169α, Met31β, Phe58β, His70β, Ile75β, Ile176β 및 Ser471β로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 중 적어도 하나 이상이 다른 아미노산으로 치환된 변이 CPC 아실라제.
2. 제 1항에 있어서,

   하기 아미노산 치환으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 변이 CPC 아실라제:

   Val121α가 알라닌으로 치환; Gly139α가 세린으로 치환; Phe169α가 티로신으로 치환; Met31β가 루이신으로 치환; Phe58β가 알라닌, 메티오닌, 루이신, 발린, 시스테인 또는 아스파라긴으로 치환; His70β가 세린 또는 루이신으로 치환; Ile75β가 쓰레오닌으로 치환; Ile176β가 발린으로 치환; 및 Ser471β가 시스테인으로 치환.
3. 제 2항에 있어서,

   Met31β가 루이신으로, Phe58β가 알라닌, 메티오닌, 루이신, 발린, 시스테인 또는 아스파라긴으로 각각 치환되는 것을 특징으로 하는 변이 CPC 아실라제.
4. 제 3항에 있어서,

   추가로 His70β가 세린 또는 루이신으로 치환되는 것을 특징으로 변이 CPC 아실라제.
5. 제 4항에 있어서,

   추가로 Phe169α가 티로신으로 치환되는 것을 특징으로 하는 변이 CPC 아실라제.
6. 제 5항에 있어서,

   추가로 Ile176β 잔기가 발린으로 치환되는 것을 특징으로 하는 변이 CPC 아실라제.
7. 제 3항에 있어서,

   추가로 Phe169α가 티로신으로, Ile176β 잔기가 발린으로 치환되는 것을 특징으로 하는 변이 CPC 아실라제.
8. 제 7항에 있어서,

   추가로 Val121α가 알라닌으로 치환되는 것을 특징으로 하는 변이 CPC 아실라제.
9. 제 7항에 있어서,

   추가로 Gly139α가 세린으로 치환되는 것을 특징으로 하는 변이 CPC 아실라제.
10. 제 7항에 있어서,

    추가로 Val121α가 알라닌으로, Gly139α가 세린으로 치환되는 것을 특징으로 하는 변이 CPC 아실라제.
11. 제 2항에 있어서,

    Val121α가 알라닌으로, Gly139α가 세린으로, Phe58β가 알라닌, 메티오닌, 루이신, 발린, 시스테인 또는 아스파라긴으로, Ile176β 잔기가 발린으로 치환되는 것을 특징으로 하는 변이 CPC 아실라제.
12. 제 11항에 있어서,

    추가로 Phe169α가 티로신으로 치환되는 것을 특징으로 하는 변이 CPC 아실라제.
13. 제 11항에 있어서,

    추가로 Ile75β가 쓰레오닌으로 치환되는 것을 특징으로 하는 변이 CPC 아실라제.
14. 제 11항에 있어서,

    추가로 Ser471β가 시스테인으로 치환되는 것을 특징으로 하는 변이 CPC 아실라제.
15. 제 11항에 있어서,

    추가로 Ile75β가 쓰레오닌으로, Ser471β가 시스테인으로 치환되는 것을 특징으로 하는 변이 CPC 아실라제.
16. 제 15항에 있어서,

    서열번호: 7로 기재되는 알파-서브유닛과 서열번호: 8로 기재되는 베타-서브유닛으로 구성된 아미노산 서열을 갖는 변이 CPC 아실라제.
17. 제 1항의 변이 CPC 아실라제를 암호화하는 유전자.
18. 제 17항에 있어서,

    서열번호: 6으로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 유전자.
19. 제 17항의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
20. 제 19항에 있어서,

    서열번호 6의 핵산 서열을 갖는 유전자를 포함하는 pET29-S12 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
21. 제 19항의 발현벡터에 의해 형질전환된 미생물.
22. 제 21항에 있어서,

    대장균 BL21(DE3) (pET29-S12)인 것을 특징으로 하는 미생물 (기탁번호: KCTC 10503BP).
23. 제 21항의 미생물을 적합한 배양조건 하에서 배양시키고 상기 배양액으로부터 변이 CPC 아실라제를 회수하는 단계를 포함하는, 제 1항의 변이 CPC 아실라제의 제조방법.
24. 제 23항에 있어서,

    미생물 배양의 시작부터 락토오스를 유도체로 사용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
25. 제 1항의 변이 CPC 아실라제를 포함하는 1단계 효소반응법에 의한 7-ACA 제조용 CPC 아실라제 함유 조성물.
26. 제 1항의 변이 CPC 아실라제를 하기 화학식 1의 화합물 또는 그의 염과 접촉시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 2의 화합물 또는 그의 염의 제조방법.

    <화학식 1>

    <화학식 2>

    상기 식에서, R은 아세톡시 (-OCOCH₃), 하이드록시 (-OH), 수소 (-H)이다.
27. 제 26항에 있어서,

    변이 CPC 아실라제가 제 21항의 미생물의 배양물의 형태, 제 25항의 변이 CPC 아실라제 함유 조성물의 형태, 또는 상기 배양물로부터 분리된 유리 상태 또는 고정화시킨 상태인 것을 특징으로 하는 제조방법.
28. 제 26항에 있어서,

    변이 CPC 아실라제와 화학식 1 화합물과의 접촉이 수용액 상에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
29. 제 26항에 있어서,

    화학식 1의 화합물의 농도는 1∼500 mM 범위이고, 변이 CPC 아실라제의 첨가량은 0.1∼100 U/㎖ 범위인 것을 특징으로 하는 제조방법.
30. 제 26항에 있어서,

    변이 CPC 아실라제와 화학식 1 화합물과의 접촉이 pH 7∼10, 온도 4∼40℃ 범위 내에서 0.1∼24시간 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.