ES2338118T3

ES2338118T3 - Mutante de cefalosporina c acilasa y su utilizacion para preparar 7-aca.

Info

Publication number: ES2338118T3
Application number: ES04748527T
Authority: ES
Inventors: Yong Chul Shin; John Yj Jeon; Kyung Hwa Jung; Mi Ran Park; Youngsoo Kim
Original assignee: Sandoz AG
Current assignee: Sandoz AG
Priority date: 2003-08-11
Filing date: 2004-08-10
Publication date: 2010-05-04
Anticipated expiration: 2024-08-10
Also published as: EP1656450B1; KR100530299B1; SI1656450T2; CN1836044B; PL1656450T5; CN1836044A; PL1656450T3; WO2005014821A1; EP1656450A1; JP2007502108A; KR20050017832A; ATE452186T1; EP1656450A4; US20070207519A1; ES2338118T5; DE602004024686D1; US7592168B2; EP1656450B2; SI1656450T1

Abstract

Un mutante de una CPC acilasa compuesto de una subunidad α de acuerdo con la SEQ ID NO: 4 y una subunidad β de acuerdo la SEQ ID NO: 5, o un derivado del mismo de CPC acilasa funcionalmente equivalente, caracterizado porque al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Val121α, Gly139α y Phe169α de la subunidad α de CPC acilasa de la SEQ ID NO: 4 y Phe58β, His70β, Ile75β, Ile176β y Ser471β de la subunidad β de CPC acilasa de la SEQ ID NO: 5 es reemplazado por otro aminoácido, en donde el mutante de CPC acilasa o el derivado del mismo de CPC acilasa funcionalmente equivalente cataliza la conversión de un compuesto de Fórmula I hasta un compuesto de Fórmula II: **(Ver fórmula)** en donde, R es acetoxi (-OCOCH3), hidroxi (-OH), hidrógeno (-H) o una sal del mismo.

Description

Mutante de cefalosporina C acilasa y su utilización para preparar 7-ACA.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con un polipéptido mutante de cefalosporina C (CPC) acilasa derivado de Pseudomonas sp. SE83; con un gen que codifica dicho polipéptido; con un vector de expresión que contiene dicho gen; con un microorganismo transformado con dicho vector de expresión; con un método para preparar dicho mutante de CPC acilasa; y con un método para preparar 7-ACA utilizando dicho mutante de CPC acilasa.

Antecedentes de la invención

La cefalosporina C (de ahora en adelante denominada como "CPC") es uno de los antibióticos de la familia de la \beta-lactama producido por hongos filamentosos tales como Acremonium chrysogenum. La CPC muestra actividad antibiótica contra bacterias Gram negativas obstaculizando la síntesis de la pared celular, pero no es lo suficientemente activa contra el crecimiento de bacterias Gram negativas. Por lo tanto, la CPC ha sido utilizada principalmente para preparar intermediarios para la producción de antibióticos semisintéticos de cefalosporina. En particular, se ha utilizado al ácido 7-aminoacefalosporánico (de ahora en adelante denominado como "7-ACA") preparado por remoción de la cadena lateral de D-\alpha-aminoadipoilo de la CPC para la producción de la mayoría de los antibióticos semisintéticos de cefalosporina que representa más del 40% del mercado mundial de antibióticos.

Existen dos métodos conocidos para preparar 7-ACA a partir de CPC, el método químico y el método enzimático. El método químico para sintetizar 7-ACA a partir de CPC utiliza grupos de protección sililo tanto para grupos amina como carboxilo y produce un rendimiento superior al 90%. Sin embargo, este método es complicado, costoso y ambientalmente desfavorable. Por lo tanto, el método químico ha sido reemplazado por un método enzimático para la preparación de 7-ACA el cual es considerado como un método ambientalmente aceptable.

Un método enzimático de dos etapas ampliamente utilizado comercialmente hoy en día comprende las dos etapas de convertir la CPC en ácido glutaril-7-aminocefalosporánico (de ahora en adelante denominado como "GL-7-ACA") por medio de la D-amino ácido oxidasa (de ahora en adelante denominada como "DAO") (la primera etapa) y GL-7-ACA en 7-ACA por medio de la GL-7-ACA acilasa (la segunda etapa) (ver la Fig. 1). Sin embargo, este método produce un rendimiento más bajo de 7-ACAque el método químico, debido a la gran cantidad de subproductos generados por la reacción del peróxido de hidrógeno producido en la primera etapa con el sustrato DAO o el producto de la reacción. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar un método enzimático eficiente en una etapa para convertir directamente CPC en 7-ACA utilizando una CPC acilasa modificada que es capaz de romper un enlace amida en la séptima posición de la CPC y remover la cadena lateral de aminoadipoilo.

La CPC acilasa (también llamada CPC amidasa o CPC amidohidrolasa) activa con respecto a la CPC ha sido encontrada en varios microorganismos, tales como Pseudomonas sp., Bacillus megaterium, Aeromonas sp., Arthrobacter viscous etc., y se han clonado y secuenciado algunos genes para la CPC acilasa: gen acyII derivado de Pseudomonas sp. SE83 (Matsuda y colaboradores, J. Bacteriol. 169: 5821 -5829, 1987); gen para la CPC acilasa derivado de Pseudomonas sp. N176 (patente estadounidense No. 5.192.678); gen para la CPC acilasa derivado de Pseudomonas sp. V22 (Aramori y colaboradores, J. Ferment. Bioeng. 72: 232 - 243, 1991); gen para la CPC amidohidrolasa derivado de Pseudomonas vesicularis B965 (patente estadounidense No. 6.297.032); gen para la CPC amidasa derivado de Bacillus megaterium (patente estadounidense No. 5.229.274); y gen para la CPC acilasa derivado de Pseudomonas sp. 130 (Li y colaboradores, Eur. J. Biochem. 262: 713 - 719, 1999). Sin embargo, estas CPC acilasas no son hidrolíticamente suficientemente activas para escindir el enlace amida en la séptima posición de la CPC, y por lo tanto, no son adecuadas para el proceso enzimático en una etapa para preparar 7-ACA a partir de CPC.

Varios estudios a través de ingeniería genética han intentado incrementar la actividad de la enzima de la CPC acilasa con respecto a la CPC. Por ejemplo, Fujisawa Pharmaceutical Co. (Japón) desarrolló un mutante de CPC acilasa derivada de Pseudomonas sp. N176 que muestra aproximadamente 2,5 veces mayor actividad específica con respecto a la CPC que aquella de tipo silvestre (patente estadounidense No. 5.804.429; patente estadounidense No. 5.336.613, Publicación de Patente Japonesa No. 1995-222587; Publicación de Patente Japonesa No. 1996-098686; y Publicación de Patente Japonesa No. 1996-205864). Sin embargo, tal mutante aún tiene una actividad específica insuficiente con respecto a la CPC para producir directamente 7-ACA a partir de CPC y exhibe inhibición del producto final por 7-ACA. Por lo tanto, no puede ser utilizado en forma práctica en la conversión directa de la CPC en 7-ACA.

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Con el propósito de desarrollar un mutante de CPC acilasa aplicable a un método enzimático en una etapa para preparar 7-ACA, se ha investigado la estructura terciaria de la GL-7-ACA acilasa por parte de los presentes inventores, quienes han identificado por primera vez las estructuras terciarias de apoenzima (Kim, y colaboradores, Structure 8: 1059 - 1068, 2000) y el complejo CAD- GL-7-ACA (Kim, y colaboradores, Chem. Biol. 8: 1253 - 1264, 2001; Kim, y colaboradores, J. Biol. Chem. 276: 48376 - 48381, 2001) asociados con la GL-7-ACA acilasa derivada de Pseudomonas sp. KAC-1 (Kim, y colaboradores, Biotech. Lett. 23: 1067 - 1071, 2001; de ahora en adelante denominada como "CAD") (ver la Fig. 2). Las estructuras de los dos complejos binarios CAD sugieren que las interacciones más grandes entre la GL-7-ACA acilasa y un sustrato tuvieron lugar en la fracción glutarilo de GL-7-ACA. Por lo tanto, se sugiere que las interacciones hidrofílicas e hidrofóbicas entre la cadena lateral del sustrato y su bolsillo de unión son los factores dominantes en el reconocimiento del sustrato en GL-7-ACA acilasa. Cuando las estructuras químicas de la CPC tienen afinidad de enlazamiento con el sustrato extremadamente baja y se comparan GL-7-ACA, sus estructuras de \beta-lactama son iguales, pero existen algunas diferencias en la cadena lateral (ver la Fig. 3). Es decir, a diferencia de la cadena lateral de GL-7-ACA que está compuesta de ácido glutárico, aquella de la CPC es un ácido D-\alpha-aminoadípico. Por lo tanto, la modelación de la estructura del complejo CAD-CPC sugiere que la cadena lateral de ácido glutárico de GL-7-ACA y los residuos clave relacionados con el enlazamiento de CAD están estéricamente apiñados con respecto a los grupos carboxilo y amino de forma D en el extremo terminal de la cadena lateral del ácido D-\alpha-aminoadípico (ver la Fig. 4). De este modo, si se puede garantizar suficiente espacio para acomodar la cadena lateral de CPC (que contiene un esqueleto carbonado mayor que aquel de la cadena lateral de GL-7-ACA y el grupo D-amino) en el sitio de enlazamiento del sustrato de CAD, se considera que se puede incrementar la actividad específica de GL-7-ACA para la CPC. Por lo tanto, el análisis estructural del complejo "enzima-sustrato" de CAD puede proporcionar información importante para desarrollar un mutante de CPC acilasa que tiene una mayor actividad específica con respecto a CPC por medio de la introducción de las mutaciones en el sitio activo de la GL-7-ACA acilasa derivada de Pseudomonas sp. que muestra relativamente baja afinidad de enlazamiento con el sustrato.

WO 02/072806A2 describe la conversión directa de cefalosporina C en 7-ACA por medio del uso de glutaril amidasa mutada.

Ishii, Y. y colaboradores, Eur. J. Biochem. 230, 773 - 778 (1995) describen el uso de una CPC acilasa mutada de la cepa N176 de Pseudomonas para la conversión de cefalosporina C en 7-ACA.

Los presentes inventores se han esforzado por lo tanto para desarrollar un mutante de CPC acilasa que tiene una reactividad mejorada con respecto a CPC que puede ser utilizada en un método enzimático de una etapa para preparar 7-ACA a partir de CPC.

Resumen de la invención

Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es la de proporcionar un mutante de CPC acilasa que tiene reactividad mejorada con respecto a CPC que puede ser convenientemente utilizada para convertir CPC en 7-ACA y una CPC acilasa funcionalmente equivalente derivada de la misma.

Otro objetivo de la presente invención es la de proporcionar una secuencia de nucleótidos que codifique un mutante de CPC acilasa y un derivado funcionalmente equivalente de la misma, como se reivindica.

Un objetivo adicional de la presente invención es el de proporcionar un vector de expresión que contenga dicha secuencia de nucleótidos y un microorganismo transformado con dicha secuencia de nucleótidos o dicho vector de expresión, como se reivindica.

Un objetivo adicional de la presente invención es el de proporcionar un método para preparar un mutante de CPC acilasa utilizando dicho microorganismo transformado, como se reivindica.

Un objetivo adicional de la presente invención es el de proporcionar un método para preparar 7-ACA o una sal de la misma a partir de CPC utilizando dicho mutante de CPC acilasa, una composición que contenga dicho mutante de CPC acilasa o el mutante procesado de CPC acilasa, como se reivindica.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un mutante de CPC acilasa o un derivado del mismo funcionalmente equivalente a la CPC acilasa, caracterizado porque al menos uno de los aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de Val121\alpha, Gly139\alpha y Phe169\alpha de la subunidad \alpha de CPC acilasa de SEQ ID NO: 4 y Phe58\beta, His70\beta, Ile75\beta, Ile176\beta y Ser471\beta de la subunidad \beta de CPC acilasa de SEQ ID NO: 5 es reemplazado por otro aminoácido.

Entre los mutantes de CPC acilasa de la presente invención, se prefieren aquellos, en donde:

Val121\alpha es reemplazado por alanina;

Gly139\alpha es reemplazado por serina;

Phe169\alpha es reemplazado por tirosina;

Met31\beta es reemplazado por leucina;

Phe58\beta es reemplazado por alanina, metionina, leucina, valina, cisteína o asparagina;

His70\beta es reemplazado por serina o leucina;

Ile75\beta es reemplazado por treonina;

Ile176\beta es reemplazado por valina; o

Ser471\beta es reemplazado por cisteína.

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Breve descripción de los dibujos

Los anteriores y otros objetivos y características de la presente invención serán claros a partir de la siguiente descripción de la invención, cuando se los toma junto con los dibujos acompañantes que muestran respectivamente;

Fig. 1: procedimientos esquemáticos de métodos enzimáticos de una y dos etapas para la preparación de 7-ACA a partir de CPC;

Fig. 2: la estructura del complejo CAD-GL-7-ACA derivado de Pseudomonas sp. KAC-1 (A) y un esquema general para los residuos de enlazamiento adyacentes a su sitio activo (B);

Fig. 3: el patrón de enlazamiento de CAD derivado de Pseudomonas sp. KAC-1 con GL-7-ACA;

Fig. 4: modelamiento del complejo CAD-CPC derivado de Pseudomonas sp. KAC-1;

Fig. 5: una representación esquemática del procedimiento para preparar los mutantes de la CPC acilasa de la invención;

Fig. 6: comparación de la inhibición del producto final por 7-ACA observada para la CPC acilasa de tipo silvestre (-\bullet-, Sem), cuatro veces mutante F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/I176\betaV de CPC acilasa (H70) y cinco veces mutante F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/H70\betaS/I176\betaV de CPC acilasa (-\circ-, mI176);

Fig. 7: comparación de las reactividades con respecto a CPC del cuatro veces mutante F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/
I176\betaV de CPC acilasa (-\lozenge-, H70), cinco veces mutante V121\alphaA/F169\betaY/M31\betaL/F58\betaM/I176\betaV de CPC acilasa
(-\circ-, #213), cinco veces mutante G139\alphaS/F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/I176\betaV de CPC acilasa (-\sqbullet-, #120) y seis veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/I176\betaV de CPC acilasa (-\bullet-, TnS5);

Fig. 8: comparación de las reactividades con respecto a CPC del cinco veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F169\alphaY/
F58\betaN/I176\betaV de CPC acilasa (-\nabla-, mF58), cinco veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F169\alphaY/F58\betaC/I176\betaV de CPC acilasa (-\sqbullet-), seis veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaN/I176\betaV de CPC acilasa (-\circ-, TnS5\alpha\beta), seis veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaC/I176\betaV de CPC acilasa (-\ding{116}-) y seis veces mutante
V121\alphaA/G139\alphaS/F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/I176\betaV de CPC acilasa (-\bullet-, TnS5);

Fig. 9: comparación de las reactividades con respecto a CPC del cuatro veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F58\betaN/
I176\betaV de CPC acilasa (-\ding{116}-, F169), cinco veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F58\betaN/I75\betaT/I176\betaV de CPC acilasa (-\nabla-, #59), cinco veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F58\betaN/I176\betaV/S471\betaC de CPC acilasa (-\sqbullet-, #76), cinco veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F169\alphaY/F58\betaN/I176\betaV de CPC acilasa (-\circ-, mF58) y seis veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/
F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaN/I176\betaV de CPC acilasa (-\bullet-, TnS5\alpha\beta);

Fig. 10a y 10b: comparación de las reactividades con CPC (A) y la inhibición del producto final por 7-ACA (B) observada para el seis veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F58\betaN/I75\betaT/I176\betaV/S471\betaC de CPC acilasa (-\ding{116}-, S12) con aquellas observadas para el seis veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaN/I176\betaV de CPC acilasa
(-\bullet-, TnS5\alpha\beta) y seis veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F58\betaN/I176\betaV/S471\betaC de CPC acilasa (-\circ-, #76);

Figs. 11a a 11c: el peso molecular de la CPC acilasa tipo silvestre derivada de Pseudomonas sp. SE83;

11a: SDS-PAGE (M: marcador de tamaño; 1: extracto libre de células; 2: la enzima purificada)

11b: PAGE no desnaturalizante (M: marcador de tamaño; 1: la enzima purificada)

11c: espectrometría de masas MALDI-TOF

Fig. 12: los resultados de electroforesis en gel y coloración azul de Coomassie de una enzima cruda aislada de la solución del cultivo de E. coli BL21 (DE3) que contiene al plásmido pET29-TnS5;

M: marcador de tamaño estándar, 1: 0% de lactosa, 48 horas de cultivo

2: 0,02% de lactosa, 48 horas de cultivo, 3: 0,2% de lactosa, 48 horas de cultivo

4: 2% de lactosa, 48 horas de cultivo, 5: 2% de lactosa, 72 horas de cultivo

Fig. 13: comparación de las tasas de conversión de CPC en 7-ACA observada para la CPC acilasa de tipo silvestre, mutantes de CPC acilasa TnS5 y S12;

Fig. 14: el resultado del análisis por HPLC para determinar la 7-ACA producida a partir de CPC por medio de la acción de la mutante de CPC acilasa S12 de la invención.

Descripción detallada de la invención

Como se lo utiliza allí, el término "incremento en la reactividad con respecto a CPC" significa mayor actividad específica con respecto a CPC y/o menor inhibición del producto final por 7-ACA.

El término "derivado funcionalmente equivalente" como se lo utiliza aquí significa un derivado de CPC acilasa que retiene la misma propiedad funcional que el mutante de CPC acilasa de la invención. Es decir, el derivado de funcionalidad equivalente incluye todas las posibles variantes tal como un polipéptido sintético o recombinante nativo que puede ser modificado, es decir, por mutación, supresión, inserción, sustitución, inversión de la secuencia de uno o diferentes nucleótidos y una combinación de los mismos, capaces de funcionar como un mutante de CPC acilasa.

El término "mutante procesado de la CPC acilasa" como se lo utiliza aquí significa mutante de la CPC acilasa en un estado inmovilizado pero no en estado libre. Se puede inmovilizar un mutante de la CPC acilasa con un portador convencional generalmente empleado en el arte por medio de un método convencional tal como un enlace covalente, enlace iónico, enlace hidrofílico, enlace físico, microencapsulación y así sucesivamente. Además, se puede preparar un mutante procesado de CPC acilasa por medio de un método de inmovilización total de la célula que inmoviliza un microorganismo que produce al mutante de la CPC acilasa como tal sin purificación adicional.

El término "GL-7-ACA acilasa" como se lo utiliza aquí generalmente significa una enzima que es capaz de convertir GL-7-ACA en 7-ACA. El término "CPC acilasa" como se lo utiliza aquí significa una enzima que tiene actividad específica con respecto a CPC entre GL-7-ACA acilasas, que produce directamente 7-ACA a partir de CPC por escisión del enlace amida en la séptima posición de CPC para remover la cadena lateral de aminoadipoilo. El término "CAD" como se lo utiliza aquí significa GL-7-ACA acilasa derivada de Pseudomonas sp. KAC-1.

La presente invención proporciona una secuencia de aminoácidos de un mutante de CPC acilasa que tiene una reactividad mejorada con CPC que se deriva de Pseudomonas sp. SE83 y un derivado de CPC acilasa funcionalmente equivalente del mismo; una secuencia de nucleótidos que codifica a dicho mutante de CPC acilasa y a un derivado de CPC acilasa funcionalmente equivalente del mismo.

El gen para la CPC acilasa ("gen acyII") derivado de Pseudomonas sp. SE83 ha sido utilizado como un gen de partida para el desarrollo de un mutante de CPC acilasa en la presente invención, en donde el gen acyII es nuevamente sintetizado utilizando un sintetizador de ADN con base en la secuencia de nucleótidos de la CPC acilasa identificada por Matsuda y colaboradores (J. Bacteriol. 169: 5821 - 5826, 1987; GenBank M18278). Para incrementar la eficiencia de la síntesis de proteína utilizando E. coli, se modifica la secuencia de aminoácidos previamente conocida de AcyII de tal manera que sea compatible con los codones preferidos utilizados en la síntesis de proteína mediada por E. coli. Por ejemplo, en la secuencia de aminoácidos previamente conocida codificada por el gen acyII, el único codón para fenilalanina es TTC y un codón para arginina es predominantemente CGC o CGG, y por lo tanto, la secuencia de aminoácidos codificada por el gen acyII sintetizado en la presente invención se realiza utilizando los codones TTT y CGT para fenilalanina y arginina, respectivamente. El gen acyII sintetizado en la presente invención consiste de 2.325 pares de bases que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. En la SEQ ID NO: 1, el marco de lectura abierta correspondiente a los números de las bases 1 a 2.322 (2.323 - 2.325: codón de terminación) es una región de codificación de la proteína completa y la secuencia predicha de aminoácidos derivada de allí es mostrada en la SEQ ID NO: 2 que consiste de 774 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 codificada por el gen acyII sintetizado en la presente invención es idéntica a aquella de la CPC acilasa previamente conocida, pero 18% de los pares de bases en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 es diferente de aquella del gen existente para la CPC acilasa.

Las secuencias de aminoácidos deducidas de la mayoría de los genes para la GL-7-ACA acilasa (o CPC acilasa) están compuestas de una subunidad \alpha, un péptido espaciador, y una subunidad \beta, en ese orden. La CPC acilasa de tipo silvestre derivada de las Pseudomonas sp. SE83 es generada en la forma de una cadena sencilla inactiva de polipéptidos que tiene aproximadamente 84 kDa en tamaño después de sufrir transcripción y traducción en una célula huésped. Después de eso, ocurren autodigestiones dos veces entre el doscientos treintavo y el doscientos treintaiunavo aminoácidos, y el doscientos treintainueveavo y el doscientos cuarentavo aminoácidos en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, que resulta en la remoción del péptido espaciador que consiste de 9 aminoácidos, y que se separa en una subunidad \alpha de 25 kDa y en una subunidad \beta de aproximadamente 58 kDa. La subunidad \alpha separada anteriormente se acopla con una de las subunidades \beta a través de interacciones hidrófobas, para formar un dímero de aproximadamente 83 kDa que tiene actividad de acilasa. Como es generalmente conocido, el primer aminoácido, el codón de metionina necesario para la iniciación de la traducción durante una síntesis de proteína en un procariota, es removido después de la traducción. En consecuencia, una forma activa de la CPC acilasa de tipo silvestre utilizada en la presente invención está compuesta de una subunidad \alpha que consiste de 229 aminoácidos (SEQ ID NO: 4) y una subunidad \beta que consiste de 535 aminoácidos (SEQ ID NO: 5).

Si no ocurre una autodigestión adecuada en una célula huésped después de la transcripción y de la traducción de un gen correspondiente, se genera GL-7-ACA acilasa (o CPC acilasa) en la forma de un polipéptido inactivo. Por lo tanto, la eficiencia de la autodigestión en una célula huésped juega un papel importante en la obtención de una proteína activa. También se ha reportado que la eficiencia de la autodigestión puede verse disminuida por varias causas tales como sobreproducción de acilasa en una célula huésped o una mutación de un aminoácido específico en un péptido espaciador o una proteína madura, resultando en la producción de una proteína inactiva (Li, y colaboradores, Eur. J. Biochem. 262: 713 - 719, 1999; Kim, y colaboradores, J. Biol. Chem. 276: 48376 - 48381, 2001). Por lo tanto, cuando se pretende la mejora de las propiedades de reacción de la acilasa, la cuestión de si una mutación que se introducirá en un aminoácido específico para incrementar la reactividad de la enzima puede afectar la eficiencia de la autodigestión deberá ser tenida en cuenta. Es decir, ya que el cambio de la eficiencia de la autodigestión de un polipéptido inactivo generado en una célula huésped después de la transcripción/traducción de un gen para CPC acilasa gene está directamente relacionado con la productividad de una CPC acilasa activa, es difícil seleccionar un mutante de CPC acilasa que tenga una reactividad mejorada con respecto a CPC sin conocer las características de reactividad del mutante activo de CPC acilasa purificada. Para resolver tales problemas, los presentes inventores han ideado un gen para CPC acilasa que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3 basada en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, que es capaz de generar una CPC acilasa activa sin la etapa de autodigestión por medio de la síntesis individual de subunidades \alpha y \beta durante la traducción. La secuencia de aminoácidos codificada por el gen para la CPC acilasa de la SEQ ID NO: 3 es idéntica a aquella de la SEQ ID NO: 2 codificada por el gen acyII para la CPC acilasa, excepto porque la secuencia de nucleótidos que codifica al péptido espaciador correspondiente a la región desde el doscientos treintaiunavo hasta el doscientos treintainueveavo de la SEQ ID NO: 2 está modificada. Es decir, se inserta un codón de detención de la traducción detrás del codón de glicina que codifica al último aminoácido de la subunidad \alpha; y se inserta una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia aleatoria de nucleótidos que incluye un sitio de una enzima de restricción, una secuencia de nucleótidos que codifica un sitio de enlazamiento del ribosoma representado como -AGGA-, otra secuencia aleatoria de nucleótidos, y un codón de iniciación de la traducción (metionina), dispuestos en una forma consecutiva, en frente del codón de serina que codifica al primer aminoácido de la subunidad \beta. Los presentes inventores han ideado formar el gen para la CPC acilasa en una estructura de operón haciendo que cada una de las secuencias de nucleótidos que codifica a la subunidad \alpha y a la subunidad \beta mantengan individualmente su propio gen estructural. El gen para la CPC acilasa que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3 y que expresa individualmente a la subunidad \alpha y a la subunidad \beta es denominado sem. Por lo tanto, se puede esperar que si el gen sem para la CPC acilasa de la invención es insertado dentro de un vector apropiado de expresión y transformado en una célula huésped, la subunidad \alpha y la subunidad \beta serían individualmente sintetizadas y acopladas entre sí dentro de una célula huésped, para obtener la forma dimérica de la CPC acilasa activa. La comparación de los rasgos característicos de la CPC acilasa purificada a partir del transformante de E. coli que contiene al gen sem de la SEQ ID NO: 3 con aquel purificado a partir del transformante de E. coli que contiene al gen acyII de la SEQ ID NO: 1 muestra realmente que los rasgos característicos de la CPC acilasa derivada de sem, por ejemplo, el peso molecular, la actividad específica, la especificidad del sustrato, la temperatura óptima de reacción y el pH, son idénticos a aquellos de la CPC acilasa derivada de acyII. Por lo tanto, la expresión separada de la subunidad \alpha y de la subunidad \beta puede remover la causa responsable de la eficiencia de la autodigestión del polipéptido inactivo, haciendo fácil detectar el cambio en los rasgos característicos inducidos por una mutación introducida en un residuo aminoácido específico. De este modo, en la presente invención el gen acyII de la SEQ ID NO: 3 es empleado como ADN de partida para desarrollar un mutante de CPC acilasa.

La nomenclatura de la literatura de la secuencia de aminoácidos de la CPC acilasa derivada de Pseudomonas sp. SE83 (AcyII, SEQ ID NO: 2) empleada en la presente invención ha adoptado un sistema consecutivo de numeración partiendo del codón de metionina en el extremo N-terminal de la subunidad \alpha como el primero, hasta el codón de alanina en el extremo C-terminal de la subunidad \beta como el último. Sin embargo, ya que el primer aminoácido, metionina, y el péptido espaciador son removidos en una célula huésped después de transcripción y traducción de un gen para CPC acilasa, ellos no existen en la secuencia de aminoácidos de una proteína madura. Es decir, la secuencia de aminoácidos de una proteína activa consiste de la secuencia de aminoácidos de la subunidad \alpha y la secuencia de aminoácidos de la subunidad \beta. Por lo tanto, el sistema de numeración empleado en la presente invención es para numerar consecutivamente cada una de las subunidades \alpha y \beta que existen en la forma activa de la CPC acilasa madura. El nombramiento de un residuo específico de la secuencia de aminoácidos de la CPC acilasa se lleva a cabo por medio de la nomenclatura convencional de la siguiente manera: la treonina, el primer residuo de la subunidad \alpha en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, es denominado Thr1\alpha; y la serina, el primer residuo de la subunidad \beta en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, Ser1\beta. Por lo tanto, Thr1\alpha y Ser1\beta significa el segundo residuo de treonina y el residuo doscientos cuarentavo de serina en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, respectivamente.

El nombramiento de un residuo específico introducido con una mutación entre la secuencia de aminoácidos de CPC acilasa se lleva a cabo también siguiendo la nomenclatura convencional de la siguiente manera: el residuo mutado que reemplaza al residuo ciento sesentainueveavo de fenilalanina de la subunidad \alpha por una tirosina está representado por F169\alphaY y el residuo mutado que reemplaza al residuo ciento setentaiseisavo de isoleucina de la subunidad \beta por una valina, I176\betaV.

El mutante de la CPC acilasa de la presente invención ha sido preparado utilizando al gen sem para la CPC acilasa de la SEQ ID NO: 3 como ADN de partida utilizando métodos convencionales puntuales de mutación y técnicas de ingeniería genética de la siguiente manera (ver la Fig. 5).

Primero, con el propósito de incrementar la actividad específica del mutante de CPC acilasa con respecto a CPC, se ha seleccionado el residuo aminoácido que va a ser mutado de la secuencia de aminoácidos de AcyII, con base en el resultado de mutagénesis virtual en el modelamiento estructural terciario del complejo CAD-CPC utilizando un programa de computador. Un oligonucleótido artificial que incluye una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia mutada de aminoácidos seleccionada anteriormente ha sido sintetizada y sometida a PCR para inducir una mutagénesis dirigida al sitio en el gen para CPC acilasa. El gen mutado ha sido transformado dentro de un microorganismo y se cultivó el transformante bajo una condición adecuada para producir la CPC acilasa. Luego, se ha medido la actividad de la enzima de las CPC acilasas así producidas para seleccionar un mutante de CPC acilasa que tiene una reactividad mejorada con respecto a CPC. La secuencia de nucleótidos del gen que codifica al mutante seleccionado de CPC acilasa ha sido analizada. Como resultado, se ha encontrado que la mutación introducida en uno o más de los residuos aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de Phe169\alpha, Met31\beta, Phe58\beta, His70\beta e Ile176\beta en la secuencia de aminoácidos de AcyII de las SEQ ID Nos: 4 y 5 mejora la reactividad de la CPC acilasa con respecto a CPC.

Para incrementar adicionalmente la reactividad del mutante de CPC acilasa con respecto a CPC, se ha sometido el gen seleccionado del mutante de la CPC acilasa a PCR propenso a errores para inducir una mutación puntual en un sitio aleatorio. El gen mutado ha sido transformado con una célula huésped para construir una biblioteca de mutantes y se ha seleccionado la célula huésped que contiene al mutante de CPC acilasa que tiene mayor reactividad con respecto a CPC a partir de la biblioteca de mutantes. La enzima activa de los mutantes de CPC acilasa así producida ha sido medida para seleccionar un mutante de CPC acilasa que tenga una reactividad mejorada de CPC acilasa y se ha analizado la secuencia de nucleótidos del gen que codifica al mutante de CPC acilasa seleccionado anteriormente. Como resultado, se ha encontrado que la mutación introducida en uno o más de los residuos aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de Val121\alpha, Gly139\alpha, Ile75\beta, y Ser471\beta en la secuencia de aminoácidos de AcyII de las SEQ ID Nos: 4 y 5 incrementa la eficiencia de la CPC acilasa que convierte CPC en 7-ACA.

Por lo tanto, el mutante de CPC acilasa de la presente invención tiene preferiblemente una secuencia de aminoácidos que se caracteriza porque al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Val121\alpha, Gly139\alpha y Phe169\alpha de la subunidad \alpha de CPC acilasa de la SEQ ID NO: 4 y Met31\beta, Phe58\beta, His70\beta, Ile75\beta, Ile176\beta y Ser471\beta de la subunidad \beta de CPC acilasa de la SEQ ID NO: 5 es reemplazado por otro aminoácido.

En la anterior sustitución de aminoácidos para incrementar la reactividad de CPC acilasa con relación a CPC, es preferible reemplazar el residuo aminoácido especificado con otro aminoácido seleccionado del grupo que consiste de glicina, alanina, valina, leucina, serina, treonina, cisteína, isoleucina, metionina, prolina, fenilalanina, tirosina, triptófano, ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina, histidina, lisina y arginina. Más preferiblemente, Val121\alpha es reemplazado por alanina; Gly139\alpha, por serina; Phe169\alpha, por tirosina; Met31\beta, por leucina; Phe58\beta, por asparagina, metionina, alanina, leucina, valina o cisteína; His70\beta, por serina o leucina; Ile75\beta, por treonina; Ile176\beta, por valina; y Ser471\beta, por cisteína.

En una modalidad preferida de la presente invención, se ha preparado un gen mutante para CPC acilasa denominado S12 que tiene Val121\alpha reemplazado por alanina; Gly139\alpha, por serina; Phe58\beta, por asparagina; Ile75\beta, por treonina; Ile176\beta, por valina; y Ser471\beta, por cisteína. El gen mutante S12 tiene una mayor actividad específica con respecto a CPC pero muestra menor inhibición del producto final por 7-ACA. El gen mutante S12 tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 6 y el mutante activo de CPC acilasa codificado por el gen mutante S12 consiste de la subunidad \alpha de la SEQ ID NO: 7 y la subunidad \beta de la SEQ ID NO: 8.

La presente invención también incluye un derivado funcionalmente equivalente del mutante de CPC acilasa. Un derivado funcionalmente equivalente en la presente invención significa un derivado de CPC acilasa que retiene la característica general del mutante de CPC acilasa de la invención. Es decir, el derivado funcionalmente equivalente incluye todas las posibles variantes tales como polipéptidos nativos, sintéticos o recombinantes modificados por mutación, supresión, inserción, sustitución, inversión de la secuencia de uno o varios nucleótidos y una combinación de los mismos, que son capaces de funcionar como un mutante de CPC acilasa.

Además, la presente invención incluye al polinucleótido que codifica a dicho mutante de CPC acilasa que tiene una reactividad mejorada con respecto a CPC o un derivado de CPC acilasa funcionalmente equivalente del mismo. Preferiblemente, el polinucleótido tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 6. El derivado funcionalmente equivalente en la presente invención significa un polinucleótido y su derivado retiene la propiedad funcional crucial de los polinucleótido(s) que codifican la subunidad \alpha y/o la subunidad \beta del mutante de la CPC acilasa. Por lo tanto, la presente invención incluye dentro de su alcance no solamente al polinucleótido que codifica al mutante de la CPC acilasa que incluye la subunidad \alpha enlazada con la subunidad \beta con un péptido espaciador específico pero también un polinucleótido que codifica tanto a las subunidades \alpha como \beta del mutante de CPC acilasa sin un péptido espaciador. Además, un polinucleótido que codifica únicamente a la subunidad \alpha del mutante de CPC acilasa y un polinucleótido que codifica únicamente a la subunidad \beta de CPC acilasa también cae dentro del alcance de la presente
invención.

La presente invención también incluye, en su ámbito de aplicación, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos del gen mutante para la CPC acilasa de la invención o una secuencia de nucleótidos deducida de la secuencia de aminoácidos del mutante de CPC acilasa así como una secuencia de nucleótidos generada a través de la degeneración del codón del código genético en la secuencia de nucleótidos del gen mutante de CPC acilasa de la invención.

Además, la presente invención incluye un vector de expresión recombinante que comprende al gen que codifica para el mutante de CPC acilasa de la invención. Dicho vector de expresión recombinante se puede preparar insertando un fragmento de ADN que contiene al gen mutante para la CPC acilasa y una secuencia reguladora adecuada de transcripción/traducción dentro de un vector apropiado de expresión de acuerdo con un método convencional (Sambrook, y colaboradores, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Cualquier vector de expresión capaz de expresar un gen foráneo en una célula huésped puede ser empleado en la presente invención. Por ejemplo, los vectores de expresión preferidos incluyen, pero no se limitan a, un plásmido, un vector fago y un vector de integración.

El vector de expresión recombinante preparado anteriormente se puede introducir en una célula huésped adecuada de acuerdo con un método convencional de transformación (Sambrook, y colaboradores, ver más arriba). Se pueden emplear bacterias, actinomices, levadura, hongos, una célula animal, una célula de insecto o una célula de planta como célula huésped adecuada para la expresión de un ADN recombinante. Entre estas células huésped, se prefieren bacterias tales como E. coli o Bacillus sp.; actinomices tales como Streptomyces sp.; levaduras tales como Saccharomyces sp., Humicola sp. o Pichia sp.; hongos tales como Aspergillus sp. o Trichoderma sp.; y un microorgnismo que produce CPC tal como Cephalosporium sp. o Acremonium sp.

En una modalidad preferida de la presente invención, E. coli BL21(DE3) es transformada con el vector de expresión recombinante que comprende al gen mutante S12 (SEQ ID NO: 6) para CPC acilasa de la invención para obtener transformante de E. coli denominado E. coli BL21(DE3)/pET-S12 que fue depositado el 30 de julio, 2003 en la Korean Collection for Type Cultures (KCTC) (Dirección: Korea Research Institute of Bioscience y Biotechnology (KRIBB), #52, Oun-dong, Yusongku, Taejon, 305 - 333, República de Corea) bajo el número de acceso KCTC 10503BP, de acuerdo con los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para el Propósito del Procedimiento de Patente.

El mutante de CPC acilasa se puede preparar cultivando dicho microorganismo transformado con el vector de expresión que comprende al gen que codifica al mutante de CPC acilasa o derivado de CPC acilasa funcionalmente equivalente del mismo en un medio adecuado bajo condiciones apropiadas.

Además, el mutante de CPC acilasa se puede preparar también cultivando un microorganismo transformado con el vector de expresión que comprende únicamente un gen que codifica a la subunidad \alpha del mutante de CPC acilasa o un derivado de CPC acilasa funcionalmente equivalente del mismo y un microorganismo transformado con el vector de expresión que comprende únicamente un gen que codifica una subunidad \beta del mutante de CPC acilasa o un derivado de CPC acilasa funcionalmente equivalente del mismo en un medio adecuado bajo una condición apropiada, produciendo separadamente la proteína de la subunidad \alpha y la proteína de la subunidad \beta en microorganismos transformados respectivos y mezclando las dos proteínas de la subunidad purificadas allí dentro in vitro.

Es posible utilizar al mutante de CPC acilasa así preparado como está o en una forma purificada para producir el producto deseado, 7-ACA, en un método enzimático de una etapa. Se puede purificar al mutante de CPC acilasa por medio de un método convencional de purificación de proteína utilizando diferentes técnicas cromatográficas en columna con base en las características de la CPC acilasa, con o sin modificaciones menores de acuerdo con propósitos específicos. Además, también es posible purificar al mutante de CPC acilasa por medio de cromatografía de afinidad, aprovechando la afinidad de enlazamiento tal como la afinidad de enlazamiento de un péptido de histidina con una columna de níquel o la afinidad de enlazamiento de un dominio de enlazamiento de celulosa (CBD) con una
celulosa.

Se puede utilizar también al mutante de CPC acilasa de la invención en una forma inmovilizada. La inmovilización del mutante de CPC acilasa se puede llevar a cabo por medio de un método convencional utilizando un portador, por ejemplo, un polímero natural tal como celulosa, almidón, dextrano y agarosa; un polímero sintético tal como poliacrilamida, poliacrilato, polimetacrilato y Eupergit C; o un mineral tal como sílice, bentonita y metal. El mutante de CPC acilasa se puede acoplar con dicho portador por medio de un método convencional de inmovilización tal como un enlace covalente, un enlace iónico, un enlace hidrofílico, absorción física o microencapsulación. Además, también es posible inmovilizar al mutante de CPC acilasa formando un enlace covalente entre el portador y la enzima a través de la acción de glutaraldehído o bromuro de cianógeno. Preferiblemente, se puede inmovilizar la célula del microorganismo que produce al mutante de CPC acilasa como está por medio de un método de inmovilización total de la célula sin purificación del mutante de CPC acilasa. Con el propósito de incrementar la reactividad del mutante de CPC acilasa producido por un microorganismo, también es posible hacer un agujero en la pared celular o aplicar además una técnica de expresión en la superficie de la célula.

Además, la presente invención proporciona un método para preparar 7-ACA de fórmula II o una sal del mismo a partir de CPC de fórmula I utilizando dicho mutante de CPC acilasa.

En la siguiente fórmula, R es acetoxi (-OCOCH_{3}), hidroxi (-OH), hidrógeno (-H) o una sal del mismo. Preferiblemente, R es acetoxi (-OCHCH_{3}) y una sal es una sal de metal alcalino tal como una sal de sodio, potasio o litio.

1

7-ACA (II) puede ser producida poniendo en contacto a CPC (I) con el mutante de CPC acilasa, en donde la CPC acilasa puede ser utilizada en la forma de una solución de cultivo de la cepa que produce al mutante de CPC acilasa, o en la forma de una composición que comprende al mutante de CPC acilasa, la misma enzima purificada libre o una forma inmovilizada de la enzima. Preferiblemente, la reacción de contacto del mutante de CPC acilasa con CPC (I) se puede llevar a cabo en una solución acuosa. La concentración preferible de CPC (I) está en el rango entre 1 y 500 mM; la cantidad añadida de mutante de CPC acilasa, entre 0,1 y 100 U/ml; el pH de la mezcla de la reacción, entre 7 y 10; el tiempo de reacción, entre 0,1 y 24 h; y la temperatura de reacción, entre 4 y 40ºC. 7-ACA (II) preparada por medio de la reacción enzimática anterior puede sr aislada y purificada a partir de la mezcla de la reacción por medio de métodos convencionales.

Además, es posible producir 7-ACA (II) poniendo en contacto al mutante de CPC acilasa de la invención con CPC (I) in vivo. En particular, 7-ACA (II) puede ser producida por medio de las etapas de introducir al gen que codifica al mutante de CPC acilasa o un equivalente funcional derivado de CPC acilasa en un microorganismo que tiene una actividad biosintética de C tal como Acremonium crysozenum; cultivando al transformante en un medio adecuado bajo una condición apropiada; y poniendo en contacto espontáneamente al mutante de CPC acilasa con la CPC (I) biosintetizada en dicho transformante.

La presente invención es definida adicionalmente en los siguientes Ejemplos. Debe entenderse que estos Ejemplos, aunque indican modalidades preferidas de la invención, se presentan únicamente a manera de ilustración. A partir de la descripción anterior y de estos Ejemplos, alguien capacitado en el arte puede determinar las características esenciales de esta invención, y sin apartarse del espíritu y alcance de la misma, puede hacer diferentes cambios y modificaciones de la invención para adaptarla diferentes usos y condiciones.

Ejemplo 1

Preparación del mutante de CPC acilasa que tiene reactividad mejorada con respecto a CPC <1-1> Preparación del mutante de CPC acilasa con base en la información estructural <1-1-1> Selección del residuo aminoácido de AcyII que va a ser mutado con base en la información estructural

Se ha determinado recientemente la estructura terciaria del complejo CAD-GL-7-ACA (Kim, y colaboradores, Chem. Biol. 8: 1253 - 1264, 2001; Kim, y colaboradores, J. Biol. Chem. 276: 48376 - 48381, 2001). Como se ilustra en la Fig. 3, Arg57\beta, Tyr33\beta, Tyr149\alpha y Arg155\alpha que existen en el sitio de enlazamiento del sustrato de CAD forman directamente enlaces de hidrógeno con GL-7-ACA, y Phe177\beta, Leu24\beta y Val70\beta se enlaza con GL-7-ACA a través de interacciones hidrófobas. Además, aunque Gln50\beta no interactúa directamente con GL-7-ACA, forma enlaces de hidrógeno con Arg57\beta y Tyr149\alpha para disponer estos residuos en posiciones adecuadas para una reacción catalítica. Mientras tanto, en el acoplamiento de CAD y GL-7-ACA, un núcleo de beta lactama de GL-7-ACA que comprende un grupo acetoxi, un anillo de seis miembros y un anillo de beta lactama de cuatro miembros no afecta significativamente el enlazamiento con residuos activos del sitio. Si acaso, una región de ácido glutárico como una cadena lateral de GL-7-ACA tiene el mayor efecto sobre el enlazamiento del sustrato por medio de acoplamiento preciso con Arg57\beta, Tyr33\beta, Tyr149\alpha y Phe177\beta (Figs. 2 y 3). Además, se ha presumido que Leu24\beta y Val70\beta juegan un papel en la estimulación de una reacción catalítica de Ser1\beta haciendo que un sustrato ocupe una posición adecuada.

Mientras tanto, como resultado de la superposición de la estructura terciaria del complejo CAD-GL-7-ACA con aquella del complejo CAD-CPC, residuos claves de CAD tales como Arg57\beta, Tyr33\beta, Phe177\beta y Tyr149\alpha involucrados en el acoplamiento con una cadena lateral de ácido glutárico de GL-7-ACA chocan con el grupo carboxilo y el grupo de forma D en la región terminal de la cadena lateral de ácido D-\alpha-aminoadípico de CPC (Fig. 4). A partir de estos resultados de modelamiento, si se puede garantizar suficiente espacio para acomodar la cadena lateral de CPC (es decir, dicha columna vertebral de carbono y un grupo D-amino que ya existía en la cadena lateral de CPC comparada con la cadena lateral de GL-7-ACA) dentro de un sitio de enlazamiento del sustrato de CAD, se puede esperar que se incremente la actividad específica de la GL-7-ACA acilasa para CPC.

Mientras tanto, se ha presumido a través de los resultados de estructuras de comparación de CAD, penicilina G acilasa y GL-7-ACA acilasa derivada de Pseudomonas sp. que la GL-7-ACA acilasa derivada de Pseudomonas sp. muestra patrones de enlazamiento y de reacción similares del sustrato con el resto (Kim, y colaboradores, Chem. Biol. 8: 1253 - 1264, 2001; Fritz-Wolf, y colaboradores, Protein Sci. 11: 92 - 103, 2002). Además, se ha reportado que aunque CAD no tiene actividad con CPC, la GL-7-ACA acilasa derivada de Pseudomonas sp. (AcyII) muestra aproximadamente 5% del nivel de actividad de la acilasa con respecto a CPC comparado con GL-7-ACA (Matsuda, y colaboradores, J. Bacteriol. 169: 5815 - 5820, 1987). Por lo tanto, existe una ventaja en el desarrollo de un mutante de CPC acilasa con base en AcyII que tiene un nivel constante de actividad enzimática con respecto a CPC en lugar de basarse en CAD que no tiene actividad enzimática con respecto a CPC. Por lo tanto, la presente invención ha empleado el gen para la CPC acilasa derivado de Pseudomonas sp. SE83 (acyII) como gen fundamental para desarrollar un mutante de CPC acilasa.

La presente invención pretende preparar un mutante de CPC acilasa que tiene una mejor actividad específica para CPC que la AcyII de tipo silvestre seleccionando un sitio activo de AcyII con base en la estructura terciaria del complejo CAD-CPC y una información de mutagénesis virtual, y luego, llevar a cabo una mutagénesis dirigida al sitio con residuos de AcyII que están involucrados en la interferencia con un enlazamiento de CPC entre el sitio activo seleccionado. La Tabla 1 muestra residuos de AcyII que corresponden a residuos del sitio activo de CAD sometidos a mutagénesis dirigida al sito.

TABLA 1

2

Con base en los resultados del modelamiento estructural terciario del complejo CAD-CPC, se llevó a cabo una mutagénesis dirigida al sitio con residuos de Phe58\beta, Met31\beta, Ile176\beta y Phe169\alpha de AcyII correspondientes a residuos de Phe58\beta, Tyr33\beta, Phe177\beta y Tyr149\alpha de CAD que se presume que inhiben seriamente el enlazamiento de la cadena lateral de CPC, y del residuo de His70\beta de AcyII correspondiente al residuo de Val70\beta de CAD que estimula la reacción catalítica del sitio activo de Ser1\beta (Fig. 5).

<1-1-2> Preparación de los plásmidos pBCPC y pBSEM

Se construyó el plásmido pBCPC insertando el fragmento de ADN del gen estructural acyII de la SEQ ID NO: 1 dentro de los sitios XhoI/XbaI del vector pBC KS(+) (Stratagene, EUA)de la siguiente forma. Primero, se sintetizó el gen estructural acyII utilizando un sintetizador de ADN con base en la secuencia de nucleótidos del ADN del gen (acyII) para la CPC acilasa derivado de Pseudomonas sp. SE83 y la secuencia de aminoácidos de la proteína AcyII codificada a partir de allí (Acceso al GenBank No. M18278). En este momento, se identificó que la secuencia de aminoácidos codificada por el gen acyII era idéntica a aquella publicada en la literatura, pero se ha sintetizado su secuencia de nucleótidos para hacer algunas modificaciones para que el gen acyII pueda incluir uno o más codones preferidos en E. coli.

Se llevó a cabo una PCR para introducir un sitio de reconocimiento de una enzima de restricción y un sitio de enlazamiento de ribosoma dentro del gen estructural acyII. La solución de la reacción PCR (100 \mul) contenía 10 ng del ADN sintetizado del gen acyII, 50 pmol de cada uno de los iniciadores CPC-F (SEQ ID NO: 13) y CPC-R (SEQ ID NO: 14), mezcla de dNTP 0,2 mM, solución amortiguadora Taq (KCl 5 mM, Tris-HCl 5 mM, (pH 8,3), MgCl_{2} 1,5 mM), y 2,5 unidades de ExTaq polimerasa (Takara, Japón). Se iniciaron las reacciones por medio de desnaturalización previa durante 5 min a 95ºC en a termociclador programable (Peltier Thermal Cycler PTC-200; MJ Research, EUA). Las condiciones de la PCR consistieron de 25 ciclos de 1 min a 95ºC (desnaturalización), 30 s a 58ºC (hibridación), y 1 min 30 s a 72ºC (polimerización), con un alargamiento final de 10 min a 72ºC (post-polimerización). Después de la amplificación por PCR, se digirieron aproximadamente 2,5 kb de producto PCR con XbaI/XhoI y se purificó con un kit para purificación (QIAEX II Gel Extraction Kit; Qiagen, Alemania), para obtener un inserto de ADN. Además, se digirió el ADN vector pBC KS(+) con XbaI/XhoI y se lo sometió a desfosforilación con CIP, para obtener ADN vector. El ADN inserto y el ADN vector fueron sometidos a ligación utilizando T4 ADN ligasa (Roche, Alemania) a 16ºC durante 12 a 16 h y se los transformó con la cepa MC1061 de E. coli MC1061 por medio de electroporación. Se esparció la cepa de E. coli sobre una placa de agar LB que contenía 25 \mug/ml of cloranfenicol y se la cultivó a 30ºC en una incubadora durante la noche para seleccionar un transformante. Se purificó el plásmido del transformante seleccionado y se analizó la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN. A parte de esto, se preparó el plásmido pBCPC que contenía el gen estructural acyII de la SEQ ID NO: 1 y se designó al transformante de E. coli que contenía al plásmido pBCPC, MC 1061 de E. coli (pBCPC).

Se construyó el plásmido pBSEM insertando el fragmento de ADN del gen estructural sem de la SEQ ID NO: 3 dentro de los sitios XhoI/XbaI del vector pBCKS (+) (Stratagene, EUA). Se llevaron a cabo una serie de amplificaciones por PCR de la siguiente manera: el plásmido pBCPC como molde y el iniciador M 13-R (SEQ ID NO: 11) y el iniciador \alphaORF-R (SEQ ID NO: 15) para obtener 0,8 kb de producto PCR; el plásmido pBCPC como molde y el iniciador \betaORF-F (SEQ ID NO: 16) y el iniciador HindIII-R (SEQ ID NO: 18) para obtener aproximadamente 0,96 kb del producto PCR; y el plásmido pBCPC como molde y el iniciador HindIII-F (SEQ ID NO: 17) y el iniciador M 13-F (SEQ ID NO: 12) para obtener 0,75 kb del producto PCR. Se mezclaron 0,8 kb, 0,96 kb y 0,75 kb de los productos PCR obtenidos anteriormente y sometidos a PCR bajo las mismas condiciones de la PCR descritas anteriormente excepto porque no se añadieron los iniciadores, para obtener aproximadamente 2,5 kb del producto PCR que liga tres productos PCR en uno. Después de eso, se sometieron aproximadamente 2,5 kb de producto PCR a PCR utilizando un iniciador T3 (SEQ ID NO: 9) e iniciador T7 (SEQ ID NO: 10) para amplificar el fragmento de ADN del gen sem aproximadamente hasta un tamaño de 2,5 kb. Después de la amplificación por PCR, se digirieron aproximadamente 2,5 kb del producto PCR con XbaI/XhoI y s purificó con kit para purificación (QIAEX II Gel Extraction Kit; Qiagen, Alemania), para obtener un inserto de ADN. Además, se digirió ADN vector pBCKS (+) con XbaI/XhoI y se lo sometió a desfosforilación con CIP para obtener ADN vector. El ADN inserto y el ADN vector fueron sometidos a ligación utilizando T4 ADN ligasa (Roche, Alemania) a 16ºC durante 16 h y transformados en una cepa MC1061 de E. coli por electroporación. Se esparció la cepa de E. coli sobre una placa de agar LB que contenía 25 \mug/ml of cloranfenicol y se la cultivó a 30ºC en una incubadora durante la noche para seleccionar un transformante. Se purificó el plásmido del transformante seleccionado y se analizó la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN. Como resultado, se preparó el plásmido pBSEM que contenía el gen estructural sem de la SEQ ID NO: 3 y se designó al transformante de E. coli que contenía al plásmido pBSEM, MC 1061 de E. coli (pBSEM).

Para comparar la productividad de la CPC acilasa del transformante de E. coli derivado del plásmido pBCPC con aquella del transformante E. coli derivado del plásmido pBSEM, se preparó una solución de enzima cruda CPC acilasa obtenida de cada transformante de E. coli de la siguiente manera. Se inoculó cada transformante de E. coli en 3 ml de un medio LB (Bacto-Triptona al 1%, Extracto de Levadura al 0,5%, NaCl al 0,5%) que contenía 25 \mug/ml de cloranfenicol y se cultivó a 30ºC, 200 rpm durante 16 h con agitación vigorosa. Se transformaron 50 \mul de la solución del cultivo con 50 ml de un nuevo medio LB que contenían 25 \mug/ml de cloranfenicol y se los cultivó adicionalmente a 25ºC, 200 rpm durante 48 h con agitación vigorosa. Se sometió la solución del cultivo a centrifugación a 4ºC, 8.000 rpm durante 10 min para separar un precipitado y se lavó el precipitado dos veces con solución amortiguadora Tris-HCl 0,1 M (pH 8,0). Se suspendió este precipitado en 5 ml de la misma solución amortiguadora y se lo sometió a ultrasonicación a 4ºC durante 10 min. Y luego, se sometió la suspensión a centrifugación a 4ºC, 15.000 rpm durante 20 min, para separar un sobrenadante que puede ser utilizado como una solución enzimática cruda de CPC acilasa.

Se midió la actividad enzimática del mutante de CPC acilasa con respecto a CPC de acuerdo con el método descrito por Park y colaboradores con modificaciones menores de la siguiente manera (Park, y colaboradores, Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 23: 559 - 564, 1995). Se preparó una solución de sustrato disolviendo CPC (pureza del 74,2%; CJ Corp., Corea) en solución amortiguadora Tris-HCl 0,1 M (pH 8,0) en una concentración de 20 mg/ml y ajustando el pH en 8 con NaOH 1 N. Se mezclaron 20 \mul de la solución de CPC con 20 \mul de la solución de enzima cruda preparada anteriormente y se incubó la mezcla de reacción a 37ºC durante 5 min. Después de la reacción, se añadió la mezcla de (200 \mul) de NaOH 50 mM y ácido acético glacial al 20% (1:2) para detener la reacción. Se mezclaron 200 \mul del sobrenadante recuperado de la mezcla de reacción por centrifugación con 40 \mul de PDAB (p-dimetilaminobenzaldehído; Sigma, EUA) al 0,5% (p/v) disueltos en metanol y se incubó la mezcla de reacción a 37ºC durante 10 min. Después de la reacción, se midió la absorbancia de la mezcla de reacción a 415 nm y se cuantificó por comparación con una curva de calibración de material estándar. En ese momento, se ha definido 1 unidad como la cantidad de enzima capaz de producir 1 mmol de 7-ACA de CPC por minuto. Mientras tanto, se determinó la actividad específica del mutante de CPC acilasa para CPC midiendo la cantidad de proteína que queda en la solución de la enzima de acuerdo con el método descrito por Bradford (Bradford, M., Anal. Biochem. 72: 248 - 254, 1976) y representándola como una unidad activa correspondiente a 1 mg de proteína. La reactividad del mutante de CPC acilasa con respecto a CPC se determinó por medio de las siguientes etapas de adición de la misma cantidad de proteína a una mezcla de reacción, llevando a cabo una reacción enzimática durante un tiempo establecido, midiendo la cantidad de 7-ACA producida en la mezcla de reacción, y representándola como un valor relativo. Se determinó la inhibición del producto final por 7-ACA añadiendo una proteína correspondiente a la misma unidad activa a una mezcla de reacción, llevando a cabo una reacción enzimática durante un tiempo fijo; midiendo la cantidad de 7-ACA producida en la mezcla de reacción, y representándolo como un valor relativo.

Como resultado de medir la actividad enzimática para CPC, mientras que la productividad de CPC acilasa producida por el transformante MC1061 (pBCPC) de E. coli era aproximadamente de 97 unidades/lH, aquella para el transformante MC1061 (pBSEM) de E. coli fue únicamente aproximadamente de 11 unidades/lH.

<1-1-3> Preparación del mutante doble Met31\beta/Phe58\beta

Para desarrollar un mutante de CPC acilasa que tenga una reactividad mejorada con respecto a CPC, se preparó el mutante doble Met31\beta/Phe58\beta de la siguiente manera. Como se muestra en la modulación estructural terciaria del complejo CAD-CPC, ya que la cadena lateral de CPC adicionalmente contiene una columna vertebral carbonada y un grupo D-amino comparado con la cadena lateral de GL-7-ACA, CAD necesita un espacio mayor para enlazarse con CPC que GL-7-ACA. Para garantizar el espacio suficiente para enlazarse con CPC, se sometieron dos residuos dentro del sitio de enlazamiento del sustrato de AcyII a una mutación simultánea. Con la fijación de His57\beta de AcyII correspondiente a Arg57\beta de CAD como el residuo más importante para el enlazamiento de la cadena lateral de CPC, se reemplazó Met31\beta de AcyII que se considera que choca con un grupo carboxilo y un grupo D-amino en el extremo terminal de la cadena lateral de CPC por leucina. Al mismo tiempo, para garantizar adicionalmente el espacio para el enlazamiento de la cadena lateral de CPC induciendo un cambio de rotación de la torsión en la cadena lateral de His57\beta de AcyII, se reemplazó Phe58\beta de AcyII por otro residuo aminoácido que tiene una cadena lateral relativamente pequeña tal como alanina, valina, leucina, metionina, cisteína o asparagina. Como resultado, se prepararon mutantes dobles de M31\betaL/F58\betaM, M31\betaL/F58\betaC, M31\betaL/F58\betaL, M31\betaL/F58\betaA, M31\betaL/F58\betaV y M31\betaL/F58\betaN por medio de PCR de superposición (Ho, y colaboradores, Gene 15: 51 - 59, 1989). El procedimiento para preparar estos mutantes dobles se expone en detalle de la siguiente manera.

La solución de la reacción PCR (100 \mul) para la mutagénesis dirigida al sitio contenía 10 ng of ADN molde, 50 pmol cada uno de los iniciadores hacia adelante e inverso, mezcla dNTP 0,2 mM, solución amortiguadora Taq (KCI 5 mM, Tris-HCl 5 mM, (pH 8,3), MgCl_{2} 1,5 mM), y 2,5 unidades de ExTaq polimerasa (Takara, Japón). Se iniciaron las reacciones por desnaturalización durante 5 min a 95ºC en un termociclador programable (Peltier Thermal Cycler PTC-200; MJ Research, EUA). Las condiciones de la PCR consistieron de 25 ciclos de 1 min a 95ºC, 30 s a 58ºC, y 60 a 90 s a 72ºC, con un alargamiento final de 10 min a 72ºC.

En particular, se llevaron a cabo una serie de amplificaciones por PCR para la preparación del mutante doble M31\betaL/F58\betaM utilizando el siguiente molde e iniciadores: plásmido pBSEM como molde y el iniciador M 13-R (SEQ ID NO: 11) y el iniciador M31\betaL-R (SEQ ID NO: 19) para obtener 1,0 kb del producto PCR; y el plásmido pBSEM como molde y el iniciador F58\betaM-F (SEQ ID NO: 20) y el iniciador M13-F (SEQ ID NO: 12) para obtener 1,6 kb del producto PCR.

Se mezclaron 1,0 kb y 1,6 kb de los productos PCR obtenidos anteriormente y se los sometió a PCR bajo las mismas condiciones excepto porque no se añadieron los iniciadores, para obtener aproximadamente 2,5 kb del producto PCR que se forma en uno por conexión de dos de los productos PCR entre sí. Después de eso, se sometieron aproximadamente 2,5 kb del producto PCR a PCR utilizando el iniciador T3 (SEQ ID NO: 9) y el iniciador T7 (SEQ ID NO: 10) para amplificar el fragmento de ADN del mutante doble de aproximadamente 2,5 kb de tamaño. Después de la amplificación por PCR, se digirieron aproximadamente 2,5 kb del producto PCR con XbaI/XhoI y se purificó con un kit para purificación (QIAEX II Gel Extraction Kit; Qiagen, Alemania), para obtener un ADN inserto. Además, se digirió el ADN vector pBC KS(+) con XbaI/XhoI y se lo sometió a desfosforilación con CIP, para obtener un ADN vector. Se sometieron el ADN inserto y el ADN vector a ligación utilizando T4 ADN ligasa (Roche, Alemania) a 16ºC durante 16 h y se los transformó con la cepa MC1061 de E. coli por electroporación. Se esparció la cepa de E. coli sobre una placa de agar LB que contenía 25 \mug/ml de cloranfenicol y se cultivó a 30ºC en una incubadora para seleccionar durante la noche un transformante que contenga el gen del mutante doble. Se purificó el plásmido del trans-
formante seleccionado y se analizó la secuencia del nucleótido del ADN inserto para confirmar el residuo mutado.

Se prepararon los mutantes dobles M31\betaL/F58\betaC, M31\betaL/F58\betaL, M31\betaL/F58\betaA, M31\betaL/F58\betaV y M31\betaL/
F58\betaN de acuerdo con el mismo método descrito anteriormente. En este momento, se emplearon para M31\betaL/F58\betaC, el iniciador M13-R (SEQ ID NO: 11) y el iniciador M31\betaL-R (SEQ ID NO: 19), y el iniciador F58\betaC-F (SEQ ID NO: 21) y el iniciador M13-F (SEQ ID NO: 12) para la amplificación del PCR de superposición; para M31\betaL/F58\betaL, el iniciador M13-R (SEQ ID NO: 11) y el iniciador M31\betaL-R (SEQ ID NO: 19), y el iniciador F58\betaL-F (SEQ ID NO: 24) y el iniciador M13-F (SEQ ID NO: 12); para M31\betaL/F58\betaA, el iniciador M13-R (SEQ ID NO: 11) y el iniciador M31\betaL-R (SEQ ID NO: 19), y el iniciador F58\betaA-F (SEQ ID NO: 22) y el iniciador M13-F (SEQ ID NO: 12); para M31\betaL/F58\betaV, el iniciador M 13-R (SEQ ID NO: 11) y el iniciador M31\betaL-R (SEQ ID NO: 19), y el iniciador F58\betaV-F (SEQ ID NO: 23) y el iniciador M13-F (SEQ ID NO: 12); y para M31\betaL/F58\betaN, el iniciador M 13-R (SEQ ID NO: 11) y el iniciador M31\betaL-R (SEQ ID NO: 19), y el iniciador F58\betaN-F (SEQ ID NO: 25) y el iniciador M13-F (SEQ ID NO: 12).

Se midió la actividad específica de los mutantes dobles obtenida anteriormente para CPC utilizando la solución de enzima cruda de cada mutante de CPC acilasa de acuerdo con el mismo método descrito en el Ejemplo <1-1-2>. Como resultado, se ha confirmado que la actividad específica de los mutantes dobles M31\betaL/F58\betaM, M31\betaL/F58\betaC, M31\betaL/F58\betaN, M31\betaL/F58\betaL, M31\betaL/F58\betaA y M31\betaL/F58\betaV muestra que es 2,4, 2,3, 2,0, 1,8, 1,6 y 1,6 veces más alta que aquella del AcyII de tipo silvestre, respectivamente.

<1-1-4> Preparación del mutante triple Met31\beta/Phe58\beta/His70\beta

Para incrementar adicionalmente la actividad específica de M31\betaL/F58\betaM que muestra la actividad específica más alta entre 6 mutantes dobles, se reemplazó His70\beta de AcyII correspondiente a Val70\beta de CAD que estimula una reacción catalítica del sitio activo S1\beta por serina o leucina para preparar un mutante triple.

Se preparó el mutante triple M31\betaL/F58\betaM/H70\betaS utilizando un kit para mutagénesis dirigida al sitio
QuickChange^{TM} (Stratagene, EUA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La solución de la reacción PCR (50 \mul) contenía 40 ng de ADN del mutante doble M31\betaL/F58\betaM, 100 pmol cada uno de los iniciadores H70\betaS-F (SEQ ID NO: 26) y H70\betaS-R (SEQ ID NO: 27), 1 \mul de la mezcla de dNTP, 5 \mul de la solución amortiguadora (KCl 100 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 100 mM, Tris-HCl 200 mM, (pH 8,8), MgSO_{4} 20 mM, Triton X-100 al 1% y 1 mg/ml de BSA), y 2,5 unidades de ADN polimerasa pfuTurbo^{TM} (Stratagene, EUA). Se iniciaron las reacciones por desnaturalización durante 30 s a 95ºC en un termociclador programable (Peltier Thermal Cycler PTC-200; MJ Research, EUA). Las condiciones para la PCR consistieron de 16 ciclos de 30 s a 95ºC, 1 min a 55ºC, y 12 min a 68ºC. Después de la amplificación por PCR, se añadieron 10 unidades de la enzima de restricción DpnI a la solución de la reacción PCR y se incubó a 37ºC durante 1 h para remover el ADN del molde en donde no se produce cualquier mutación. Se purificó el ADN del mutante con un kit para purificación (QIAEX II Gel Extraction Kit; Qiagen, Alemania) y se transformó en la cepa MC1061 de E. coli por electroporación. Se esparció la cepa de E. coli sobre una placa de agar LB que contenía 25 \mug/ml de cloranfenicol y se cultivó a 30ºC en una incubadora durante la noche para seleccionar un transformante. Se purificó el plásmido del transformante seleccionado y se analizó la secuencia de nucleótidos del ADN inserto para confirmar el residuo mutado.

Se preparó el mutante triple M31\betaL/F58\betaM/H70\betaL utilizando un kit para mutagénesis dirigida al sitio
QuickChange^{TM} (Stratagene, EUA) de acuerdo con el mismo método descrito anteriormente excepto porque se emplearon el iniciador H70\betaL-F (SEQ ID NO: 28) y el iniciador H70\betaL-R (SEQ ID NO: 29).

Se midió la actividad específica del mutante triple para CPC utilizando la solución de enzima cruda de cada mutante de CPC acilasa de acuerdo con el mismo método como el descrito en el Ejemplo <1-1-2>. Como resultado, la actividad específica de los mutantes triples M31\betaL/F58\betaM/H70\betaS y M31\betaL/F58\betaM/H70\betaL mostró que era 3,2 y 2,4 veces más alta que aquella del mutante doble M31\betaL/F58\betaM, respectivamente.

<1-1-5> Preparación del cuatro veces mutante Phe169\alpha/Met31\beta/Phe58\beta/His70\beta

Para incrementar adicionalmente la actividad específica de M31\betaL/F58\betaM/H70\betaS que muestra la actividad específica más incrementada entre dos mutantes triples, se reemplazó Phe169\alpha de AcyII correspondiente a Tyr149\alpha de CAD que ayuda a localizar a CPC en una posición adecuada para una reacción catalítica eficiente del sitio activo S1\beta por tirosina para preparar un cuatro veces mutante, F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/H70\betaS. Ya que una cadena lateral de tirosina tiene adicionalmente un grupo hidroxilo (-OH) comparado con una cadena lateral de fenilalanina, puede estimular una reacción catalítica de S1\beta por formación de un enlace de hidrógeno con una cadena lateral de CPC y/o residuos adyacentes del mismo.

Se preparó un cuatro veces mutante F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/H70\betaS utilizando un kit para mutagénesis dirigida al sitio QuickChange^{TM} (Stratagene, EUA) de acuerdo con el mismo método descrito en el Ejemplo <1-1-4> excepto porque se empleó al mutante triple M31\betaL/F58\betaM/H70\betaS como molde y al iniciador F169\alphaY-F (SEQ ID NO: 30) y al iniciador F169\alphaY-R (SEQ ID NO: 31).

Se midió la actividad específica del cuatro veces mutante F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/H70\betaS para CPC utilizando la solución de enzima cruda de acuerdo con el mismo método descrito en el Ejemplo <1-1-2>. Como resultado, se incrementó la actividad específica del cuatro veces mutante F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/H70\betaS 2,1 veces más que aquella del mutante triple M31\betaL/F58\betaM/H70\betaS.

<1-1-6> Preparación del cinco veces mutante Phe169\alpha/Met31\beta/Phe58\beta/His70\beta/Ile176\beta

Para incrementar adicionalmente la actividad específica del cuatro veces mutante F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/H70\betaS con respecto a CPC, se reemplazó Ile176\beta de AcyII correspondiente a Phe177\beta de CAD que puede estar involucrado en interferir con el enlazamiento de una cadena lateral de CPC por valina para preparar un cinco veces mutante, F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/H70\betaS/Ile176\betaV. En el Ejemplo <1-1-3>, se reemplazó Phe58\beta de AcyII por metionina. Mientras tanto, Ile176\beta de AcyII está localizado muy cerca de Phe58\beta de AcyII así como se supone que interfiere con el enlazamiento de CPC. Por lo tanto, para el enlazamiento más eficiente de la cadena lateral del sustrato de CPC, se remplazó Ile176\beta por valina que tiene una cadena lateral con una estructura similar pero tamaño más pequeño que la isoleucina.

Se preparó el cinco veces mutante F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/H70\betaS/I176\betaV utilizando un kit para mutagénesis dirigida al sitio QuickChange^{TM} (Stratagene, EUA) de acuerdo con el mismo método descrito en el Ejemplo <1-1-4> excepto porque se empleó el cuatro veces mutante F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/H70\betaS como molde y el iniciador Ile176\betaV-F (SEQ ID NO: 32) y el iniciador Ile176\betaV-R (SEQ ID NO: 33).

La actividad específica del cinco veces mutante F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/H70\betaS/I176\betaV para CPC fue medida utilizando la solución de enzima cruda del cinco veces mutante de acuerdo con el mismo método como el descrito en el Ejemplo <1-1-2>. Como resultado, la actividad específica del cinco veces mutante F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/H70\betaS/
I176\betaV se incrementó 2,4 veces más que el cuatro veces mutante F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/H70\betaS.

<1-2> Preparación del mutante de CPC acilasa que tiene una reactividad mejorada con respecto a CPC <1-2-1> Preparación del cuatro veces mutante Phe169\alpha/Met31\beta/Phe58\beta/Ile176\beta

La razón por la cual es difícil aplicar una CPC acilasa existente a un método enzimático en una etapa para producir 7-ACA a gran escala es que la eficiencia de la conversión de CPC en 7-ACA es muy baja debido a la inhibición del producto final por 7-ACA así como porque la CPC acilasa muestra una actividad específica baja por CPC. Mientras tanto, se puede conocer a partir de una serie de mutagénesis dirigida al sitio para incrementar la actividad específica del mutante de CPC acilasa en el Ejemplo <1-1> que la mutación de His70\beta incrementa significativamente la actividad específica del mutante de CPC acilasa para CPC pero incrementa severamente el nivel de inhibición del producto final por 7-ACA. Por lo tanto, se sometió al cinco veces mutante F169\alphaY/M431\betaL/F58\betaM/H70\betaS/I176\betaV del Ejemplo <1-1-6> a una mutagénesis inversa de H70\betaS en un residuo tipo silvestre, histidina, para preparar al cuatro veces mutante F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/I176\betaV (Fig. 5). Se preparó el cuatro veces mutante F 169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/I176\betaV de acuerdo con el mismo método descrito en el Ejemplo <1-1-4> excepto porque se emplearon al cinco veces mutante F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/H70\betaS/I176\betaV como molde y el iniciador H70\beta-F (SEQ ID NO: 34) y el iniciador H70\beta-R (SEQ ID NO: 35).

Se midió la inhibición del producto final utilizando una solución enzimática correspondiente a la misma unidad activa después de la preparación de cada solución de enzima cruda de tipo silvestre, cinco veces mutante F169\alphaY/
M31\betaL/F58\betaM/H70\betaS/I176\betaV y cuatro veces mutante F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/I176\betaV por medio del mismo método descrito en el Ejemplo <1-1-2>. Como resultado, se ha confirmado que la mutación inversa del cinco veces mutante H70\betaS en F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/H70\betaS/I176\betaV en un residuo de tipo silvestre, histidina, disminuye la inhibición del producto final por 7-ACA hasta el nivel similar de enzima tipo silvestre (Fig. 6).

<1-2-2> Preparación de cinco veces mutantes Gly139\alpha/Phe169\alpha/Met31\beta/Phe58\beta/Ile176\beta y Val121\alpha/Phe169\alpha/ Met31\beta/Phe58\beta/Ile176\beta

Para incrementar adicionalmente la reactividad del cuatro veces mutante F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/I176\betaV con respecto a CPC, se sometió el ADN del cuatro veces mutante a una PCR propensa a error para construir una biblioteca de mutantes que tiene una mutación puntal en un sitio aleatorio. En este momento, se ajustó una tasa de error en dicha PCR propensa a error para que ocurriera una sustitución en un residuo aminoácido para un gen cuatro veces mutante en promedio. El procedimiento particular de construcción de una biblioteca de mutantes fue el siguiente.

La solución de la reacción PCR (100 \mul) para la PCR propensa a error contenía 5 ng de ADN del cuatro veces mutante F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/I176\betaV, 50 pmol cada uno de iniciador T3 (SEQ ID NO: 9) y de iniciador T7 (SEQ ID NO: 10), 0,2 mM cada uno de dATP y dGTP, 1,0 mM cada uno de dCTP y dTTP, KCl 5 mM, Tris-HCl 5 mM, (pH 8,3), MgCl_{2} 3,5 mM, MnCl_{2} 0,025 mM y 5 unidades de rTaq ADN polimerasa (Takara, Japón). Se iniciaron las reacciones por desnaturalización durante 3 min a 95ºC en un termociclador programable (Peltier Thermal Cycler PTC-200; MJ Research, EUA). Las condiciones de la PCR consistieron de 20 ciclos de 1 min a 95ºC, 30 s a 58ºC, y 90 s a 72ºC, con un alargamiento final de 10 min a 72ºC. Después de la amplificación por PCR propensa a error, se digirieron aproximadamente 2,5 kb del producto PCR con XbaI/XhoI y se purificó con un kit para purificación (QIAEX II Gel Extraction Kit; Qiagen, Alemania), para obtener un ADN inserto. Además, se digirió el ADN del plásmido pBSEM con XbaI/XhoI para obtener 3,4 kb del fragmento de ADN utilizado como ADN vector. Se sometieron el ADN inserto y ADN vector a ligación utilizando T4 ADN ligasa (Roche, Alemania) a 16ºC durante 16 h y se los transformó en una cepa MC1061 de E. coli por electroporación. Se esparció la cepa de E. coli sobre una placa de agar LB que contenía 25 \mug/ml de cloranfenicol y se cultivó a 30ºC en una incubadora durante la noche para construir una biblioteca de mutantes.

Se seleccionó el mutante de CPC acilasa que tiene una reactividad mejorada con respecto a CPC a partir de la biblioteca de mutantes obtenida anteriormente de la siguiente manera.

Se inoculó el transformante MC1061 de E. coli que contenía el gen mutante para CPC acilasa que introdujo una mutación puntual en un sitio aleatorio por medio de PCR propenso a error en una placa de 96 pozos llenando 200 \mul de medio LB que contenía 25 \mug/ml de cloranfenicol y se cultivó a 30ºC, 180 rpm durante 60 a 70 h con agitación vigorosa. Se transfirieron 100 \mul de cada solución de cultivo tomada de la placa de pozos a una nueva placa de 96 pozos. Se añadieron 100 \mul de una solución de lisis celular (solución amortiguadora Tris-HCl 0,1 M (pH 8,0) que contenía 2 \mug/ml de lisozima, EDTA 4 mM, Triton X-100 al 0,4%) y se la dejó a 30ºC durante 2 h. Luego de eso, se añadieron 50 \mul de la mezcla de solución d CPC al 2.5% (p/v) CPC disueltos en solución amortiguadora Tris-HCl 0,1 M (pH 8,0) y se añadió 7-ACA 5 mM a cada pozo y se mantuvo la placa de pozos a 28ºC durante 14 a 16 h para inducir una reacción de hidrólisis de CPC. En ese momento, la razón por la cual se añadió 7-ACA a la solución de CPC es para facilitar la selección del mutante de CPC acilasa que muestra una actividad específica mejorada por CPC y/o la menor inhibición del producto final por 7-ACA. Después de la reacción de hidrólisis de CPC, se sometió la mezcla de la reacción a centrifugación a 4.200 rpm durante 20 min para separar un sobrenadante y se transfirieron 50 \mul del sobrenadante a una nueva placa de 96 pozos. Después de añadir 160 \mul de una solución de detención (ácido acético : NaOH 250 mM, 2:1) a cada pozo para detener la reacción enzimática, se añadieron 40 \mul de un agente desarrollador (solución de PDAB al 0,5% (p/v) disuelta en metanol) y se dejó la placa de pozos a temperatura ambiente durante 10 min. Se montó luego la placa de pozos sobre un lector de microplacas para medir una absorbancia a 415 nm y se seleccionó al mutante de
CPC acilasa que tiene una actividad específica mejorada para CPC por comparación del valor de absorbancia medido.

Como resultado de seleccionar aleatoriamente aproximadamente 25.000 colonias de dicha biblioteca aleatoria de mutantes, se seleccionaron 2 mutantes (#120 y #213) que muestran un valor más alto de absorbancia que aquel del cuatro veces mutante F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/I176\betaV utilizado como molde para una mutagénesis aleatoria. Se ha confirmado por medio de un análisis de secuencia que el mutante #120 tiene la sustitución de Gly139\alpha por serina (cinco veces mutante G139\alphaS/F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/I176\betaV) y el mutante #213, la sustitución de Val121\alpha por alanina (cinco veces mutante V121\alphaA/F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/I176\betaV) (Fig. 5).

Además, se midió la reactividad de los mutantes #120 y #213 con respecto a CPC utilizando la solución de enzima cruda de cada mutante de acuerdo con el mismo método descrito en el Ejemplo <1-1-2>. Como resultado, se ha confirmado que los mutantes #120 y #213 muestran un aumento mayor de la reactividad con respecto a CPC que el cuatro veces mutante F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/I176\betaV del Ejemplo <1-2-1> (Fig. 7).

<1-2-3> Preparación del seis veces mutante Val121\alpha/Gly139\alpha/Phe169\alpha/Met31\beta/Phe58\beta/Ile176\beta

Se ha confirmado a partir de los resultados del Ejemplo <1-2-2> que la incorporación de la mutación V121\alphaA o G 139aS en el cuatro veces mutante F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/I176\betaV incrementa la reactividad del mutante CPC acilasa con respecto a CPC. Por lo tanto, con el propósito de incrementar adicionalmente la reactividad con respecto a CPC, se preparó el seis veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/I176\betaV por medio de la incorporación de la mutación G139\alphaS del mutante #120 en el mutante #213 (Fig. 5). Se preparó el seis veces mutante de la invención de acuerdo con el mismo método descrito en el Ejemplo <1-1-4> excepto porque se empleó el ADN del mutante #213 como molde y el iniciador G139\alphaS-F (SEQ ID NO: 36) y el iniciador G139\alphaS-R (SEQ ID NO: 37) para la PCR. La presente invención ha denominado al gen del mutante de CPC acilasa que codifica al seis veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/I176\betaV como TnS5.

Se midió la reactividad del seis veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/I176\betaV con respecto a CPC utilizando la solución de la enzima cruda del seis veces mutante de acuerdo con el mismo método descrito en el Ejemplo <1-1-2>. Como resultado, se ha confirmado que la reactividad del seis veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/
F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/I176\betaV (TnS5) con respecto a CPC se incrementa en lugar de aquellos mutantes #213 y #120 (Fig. 7).

<1-3> Preparación del plásmido pBC-TnS5\alpha\beta

El gen TnS5 que codifica al seis veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/ I176\betaV es el gen para el mutante de CPC acilasa que se diseña para expresar la subunidad \alpha y la subunidad \beta separadamente en una célula huésped y generar la forma activa de la CPC acilasa a través de un contacto espontáneo de estas dos subunidades tal como el gen sem gene.

Para inducir la formación del mutante activo de CPC acilasa a partir del gen TnS5 que consiste de cada una de las subunidades \alpha y \beta obtenidas a través de un proceso de autodigestión después de la transcripción y traducción del gen del mutante de CPC acilasa en una célula huésped tal como el gen para la acilasa de tipo silvestre (acyII), la presente invención preparó un gen TnS5\alpha\beta que codifica al seis veces mutante de CPC acilasa en donde se insertó el péptido espaciador de la CPC acilasa de tipo silvestre (AcyII) entre la subunidad \alpha y la subunidad \beta del seis veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/I176\betaV (Fig. 5). A continuación se detalla el método para preparar el gen TnS5\alpha\beta.

Se insertó el gen TnS5 en los sitios XhoI/XbaI del vector pBC-KS(+) para preparar el plásmido pBC-TnS5. Se llevaron a cabo dos amplificaciones PCR utilizando el plásmido pBC-TnS5 como molde y el iniciador M13-R (SEQ ID NO: 11) y el iniciador \alphaCPC-R (SEQ ID NO: 38) para obtener 0,8 kb del producto PCR y el plásmido pBC-TnS5 como molde y el iniciador \betaCPC-F (SEQ ID NO: 39) y el iniciador M13-F (SEQ ID NO: 12) para obtener 1,7 kb del producto PCR. Se mezclaron 0,8 kb y 1,7 kb de los productos PCR obtenidos anteriormente y sometidos a PCR bajo las mismas condiciones excepto porque no se añadieron los iniciadores, para obtener aproximadamente 2,5 kb del producto PCR que se forma en uno conectando dos productos PCR con cada uno de los otros. Después de eso, se sometieron 2,5 kb del producto PCR a PCR utilizando el iniciador T3 (SEQ ID NO: 9) y el iniciador T7 (SEQ ID NO: 10) para amplificar el fragmento de ADN que contiene al gen TnS5\alpha\beta. Después de la amplificación PCR, se digirieron aproximadamente 2,5 kb del producto PCR con XbaI/XhoI y se purificó con el kit de purificación (QIAEX II Gel Extraction Kit; Qiagen, Alemania), para obtener ADN inserto. Además, se digirió el ADN vector pBC KS(+) con XbaI/XhoI y se lo sometió a desfosforilación con CIP, para obtener ADN vector. Se sometieron el ADN inserto y el ADN vector a ligación utilizando T4 ADN ligasa (Roche, Alemania) a 16ºC durante 16 h y transformados con la cepa MC1061 de E. coli por medio de electroporación. Se esparció la cepa de E. coli sobre una placa de agar LB que contenía 25 \mug/ml de cloranfenicol y se cultivó a 30ºC en una incubadora durante la noche para seleccionar un transformante. Se purificó el plásmido a partir del transformante seleccionado y se analizó la secuencia de nucleótidos del ADN inserto. Fuera de esto, se preparó el plásmido pBC-TnS5\alpha\beta que contenía el gen TnS5\alpha\beta.

Con el propósito de examinar la productividad del mutante de CPC acilasa por medio del gen TnS5\alpha\beta, se insertó cada uno de los genes TnS5 y TnS5\alpha\beta que codifican al seis veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/
I176\betaV en un vector pBC-KS(+) para preparar los plásmidos recombinantes pBC-TnS5 y pBC-TnS5\alpha\beta, respectivamente, y se transformó cada plásmido recombinante con MC1061 de E. coli para obtener el transformante MC1061 (pBC-TnS5) de E. coli y MC1061 (pBC-TnS5\alpha\beta). Se cultivó cada transformante de E. coli en 50 ml de un caldo LB que contiene 25 \mug/ml de cloranfenicol a 25ºC, 200 rpm durante 48 h con agitación vigorosa y se midió la actividad de la enzima con respecto a CPC utilizando la solución de enzima cruda preparada a partir de la solución de cultivo de transformante de acuerdo con el mismo método descrito en el Ejemplo <1-1-2>. Como resultado, la productividad de la CPC acilasa producida por cada transformante MC1061 (pBC-TnS5) y MC1061 (pBC-TnS5\alpha\beta) de E. coli fue aproximadamente de 78 unidades/l y 162 unidades/l, respectivamente. A partir de estos resultados, se ha confirmado que el seis veces mutante de CPC acilasa formado por medio de un proceso de autodigestión después de la transcripción y traducción del gen para el mutante de CPC acilasa en una célula huésped tal como TnS5\alpha\beta muestra aproximadamente una productividad 2 veces mayor que el seis veces mutante de CPC acilasa formado por medio de un contacto espontáneo de la subunidad \alpha y la subunidad \beta expresada separadamente en una célula huésped tal como TnS5.

Además, se sometió la solución de encima cruda preparada a partir de la solución de cultivo del transformante MC1061 (pBCTnS5\alpha\beta) de E. coli a electroforesis desnaturalizante en gel de poliacrilamida (12% SDS-PAGE) para examinar el patrón de expresión de la proteína. Como resultado, no hubo una banda precursora inactiva de aproximadamente 83 kDa de tamaño, lo cual significa que la mayor parte de la forma precursora inactiva se convierte en la forma inactiva del mutante de CPC acilasa por medio de una autodigestión eficiente después de la transcripción y traducción del gen TnS5\alpha\beta bajo las condiciones de cultivo de la presente invención (Fig. 7). Por lo tanto, se ha empleado el gen TnS5\alpha\beta como ADN molde para desarrollar un mutante de CPC acilasa a continuación.

<1-4> Preparación del mutante de CPC acilasa que tiene una reactividad adicionalmente incrementada con respecto a CPC <1-4-1> Preparación del cinco veces mutante Val121\alpha/Gly139\alpha/Phe169\alpha/Phe58\beta/Ile176\beta

La presente invención preparó los genes TnS5 y TnS5\alpha\beta para el mutante de CPC acilasa que codifican al seis veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/I176\betaV que tiene una reactividad mejorada con respecto a CPC por medio de una serie de mutagénesis dirigida al sitio y una mutagénesis aleatoria en los Ejemplos <1-1> a <1-3>. En estos procedimientos de mutagénesis para preparar al seis veces mutante TnS5\alpha\beta, Met31\beta que se supone que se encuentra con un grupo carboxilo y un grupo D-amino en el extremo terminal de la cadena lateral de CPC fue reemplazado por leucina y Phe58\beta fue reemplazado por metionina, cisteína o asparagina al mismo tiempo para garantizar que el espacio sea suficiente para el enlazamiento eficiente de la cadena lateral de CPC cambiando una rotación de torsión en la cadena lateral de His57\beta. Por lo tanto, la presente invención optimizó residuos de Met31\beta y Phe58\beta en el seis veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/I176\betaV para incrementar adicionalmente la reactividad con respecto a CPC de la siguiente manera.

La presente invención llevó a cabo una mutagénesis inversa de M31\betaL en un residuo de tipo silvestre, metionina y una sustitución de F58\betaM por asparagina o cisteína utilizando el ADN del seis veces mutante TnS5\alpha\beta como molde para preparar 4 mutantes (V121\alphaA/G139\alphaS/F169\alphaY/F58\betaN/ I176\betaV, V121\alphaA/G139\alphaS/F169\alphaY/F58\betaC/I176\betaV, V121\alphaA/G139\alphaS/F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaN/ I176\betaV, V121\alphaA/G139\alphaS/F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaC/I176\betaV). Estos mutantes fueron preparados de acuerdo al mismo método para preparar al mutante doble M31\betaL/F58\betaM como se describe en el Ejemplo <1-1-3>. En este momento, se llevó a cabo la PCR de superposición utilizando los siguientes iniciadores: para V121\alphaA/G139aS/F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaC/I176\betaV, el iniciador M 13-R (SEQ ID NO: 11) y el iniciador M31\betaL-R (SEQ ID NO: 19), y el iniciador F58\betaC-F (SEQ ID NO: 21) y el iniciador M13-F (SEQ ID NO: 12); para V121\alphaA/G139\alphaS/F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaN/I176\betaV, el iniciador M13-R (SEQ ID NO: 11) y el iniciador M31\betaL-R (SEQ ID NO: 19), el iniciador F58\betaN-F (SEQ ID NO: 25) y el iniciador M 13-F (SEQ ID NO: 12); para V121\alphaA/G139\alphaS/F169\alphaY/F58\betaC/I176\betaV, el iniciador M13-R (SEQ ID NO: 11) y el iniciador M31\beta-R (SEQ ID NO: 42), y el iniciador F58\betaC-F (SEQ ID NO: 21) y el iniciador M13-F (SEQ ID NO: 12); para V121\alphaA/G139\alphaS/F169\alphaY/F58\betaN/I176\betaV, el iniciador M13-R (SEQ ID NO: 11) y el iniciador M31\beta-R (SEQ ID NO: 42), y el iniciador F58\betaN-F (SEQ ID NO: 25) y el iniciador M13-F (SEQ ID NO: 12).

Se midió la reactividad de la enzima con respecto a CPC utilizando la solución de enzima cruda de cada mutante de acuerdo con el mismo método descrito en el Ejemplo <1-1-2>. Como resultado, se ha confirmado que el mutante que tiene una sustitución de F58\betaM por asparagina en el seis veces mutante TnS5\alpha\beta muestra una reactividad considerablemente mayor con respecto a CPC y el mutante que tiene una mutación inversa de M31\betaL en la metionina en el seis veces mutante TnS5\alpha\beta produce más eficientemente 7-ACA a partir de CPC aunque su actividad específica disminuye algo (Fig. 8). A partir de estos resultados, la presente invención ha seleccionado al cinco veces mutante

V121\alphaA/G139\alphaS/F169\alphaY/F58\betaN/I176\betaV (mF58) que tiene una mayor reactividad adicional con respecto a CPC que el seis veces mutante TnS5\alpha\beta (Fig. 5).

<1-4-2> Preparación del cuatro veces mutante Val121\alpha/Gly139\alpha/Phe58\beta/Ile176\beta

La presente invención ha reemplazado Phe169\alpha por tirosina en el mutante triple M31\betaL/F58\betaM/H70\betaS para incrementar adicionalmente la reactividad específica del mutante de CPC acilasa para CPC en el Ejemplo <1-1-5>. Mientras tanto, se sometió el residuo H70\betaS en el cinco veces mutante F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/H70\betaS/I176\betaV a una mutagénesis inversa en histidina en el Ejemplo <1-2-1> para reducir la inhibición del producto final por 7-ACA, y el residuo M31\betaL en el seis veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/I176\betaV también fue sometido a mutagénesis inversa en un residuo de tipo silvestre, metionina en el Ejemplo <1-4-1>. Además, el residuo mutado F58\betaM y el residuo I176\beta en el cinco veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/ F169\alphaY/F58\betaM/I176\betaV fueron reemplazados por asparagina y valina, respectivamente. Por lo tanto, el cuatro veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F58\betaN/I176\betaV (F169) fue preparado por mutagénesis inversa del residuo mutado F169\alphaYen un residuo de tipo silvestre, fenilalanina (Fig. 5).

Se preparó el cuatro veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F58\betaN/I176\betaV por medio del mismo método para preparar el ADN del mutante triple M31\betaL/F58\betaM/H70\betaS como se describe en el Ejemplo <1-1-4> excepto porque se emplearon el ADN del cinco veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F169\alphaY/F58\betaN/I176\betaV como molde y el iniciador F169\alpha-F (SEQ ID NO: 45) y el iniciador F169\alpha-R (SEQ ID NO: 46) para la PCR.

Se midió la reactividad del cuatro veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F58\betaN/I176\betaV con respecto a CPC utilizando la solución de enzima cruda de la enzima mutante de acuerdo con el mismo método descrito en el Ejemplo <1-1-2>. Como resultado, se ha confirmado que la mutación inversa de F169\alphaYen un residuo de tipo silvestre, fenilalanina en el cinco veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F169\alphaY/F58\betaN/I176\betaV incrementa adicionalmente la reactividad del mutante de CPC acilasa con respecto a CPC (Fig. 9).

<1-4-3> Preparación de los cinco veces mutantes Val121\alpha/Gly139\alpha/Phe58\beta/Ile75\beta/Ile176\beta y Val121\alpha/Gly139\alpha/ Phe58\beta/Ile176\beta/Ser471\beta

Para incrementar adicionalmente la reactividad del cuatro veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F58\betaN/I176\betaV con respecto a CPC, se sometió el cuatro veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F58\betaN/I176\betaV a una PCR propensa a error para construir una biblioteca de mutantes. Se seleccionó un mutante que muestra mayor reactividad adicional con respecto a CPC que el cuatro veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F58\betaN/I176\betaV de la biblioteca aleatoria de mutantes construida anteriormente. En este momento, la condición de la reacción de la PCR propensa a error, los métodos para preparar dicha biblioteca de mutantes y la selección de allí del mutante fueron las mimas que las descritas en el Ejemplo <1-2-2> excepto porque cuando se seleccionó el mutante muestra una mayor reactividad adicional con respecto a CPC a partir de la biblioteca de mutantes, se añadió 7-ACA 5 mM (concentración final) a la mezcla de la reacción.

Como resultado de la selección de aproximadamente 15.000 colonias de dicha biblioteca aleatoria de mutantes, se seleccionaron 2 mutantes (#59 y #76) que muestran el valor más alto de absorbancia que el cuatro veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F58\betaN/I176\betaV utilizado como molde para una mutagénesis aleatoria. Se ha confirmado a partir de los resultados del análisis de secuencia que el mutante #59 tiene la sustitución de Ile75\beta por treonina (cinco veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F58\betaN/I75\betaT/H76\betaV) y el mutante #76, la sustitución de Ser471\beta por cisteína (cinco veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F58\betaN/I176\betaV/S471\betaC) (Fig. 5).

Además, se midió la reactividad de los mutantes #59 y #76 con respecto a CPC utilizando la solución de enzima cruda de cada mutante de acuerdo con el mismo método descrito en el Ejemplo <1-1-2>. Como resultado, se ha confirmado que la reactividad de los mutantes #59 y #76 con respecto a CPC es más alta que aquella del cuatro veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F58\betaN/I176\betaV (F169) (Fig. 9).

<1-4-4> Preparación del seis veces mutante Val121\alpha/Gly139\alpha/Phe58\beta/Ile75\beta/Ile176\beta/Ser471\beta

Se ha confirmado más arriba que la reactividad con respecto a CPC se incrementa por la introducción de la mutación Ile75\betaT o S471\betaC en el cuatro veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F58\betaN/I176\betaV. Por lo tanto, para incrementar adicionalmente la reactividad con respecto a CPC, la presente invención preparó al seis veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F58\betaN/I75\betaT/I176\betaV/S471\betaC por introducción de la mutación Ile75\betaT del mutante #59 en el mutante #76 (Fig. 5). El seis veces mutante de la presente invención fue preparado por medio del mismo método descrito en el Ejemplo <1-1-4> excepto porque se empleó el ADN del mutante #76 como molde y al iniciador I75\betaT-F (SEQ ID NO: 43) y al iniciador I75\betaT-R (SEQ ID NO: 44) para la amplificación. La presente invención ha designado al gen para el mutante de CPC acilasa que codifica al seis veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F58\betaN/I75\betaT/I176\betaV/S471\betaC como S 12.

Se midió la reactividad del seis veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F58\betaN/I75\betaT/I176\betaV/ S471\betaC con respecto a CPC utilizando la solución de enzima cruda del seis veces mutante de acuerdo con el mismo método descrito en el Ejemplo <1-1-2>. Como resultado, se ha confirmado que la reactividad del seis veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/
F58\betaN/I75\betaT/I176\betaV/S471\betaC (S12) con respecto a CPC es más alta que aquella del mutante #76 (cinco veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/ F58\betaN/I176\betaV/S471\betaC) (Fig. 10).

Ejemplo 2 Purificación del mutante de CPC acilasa y análisis de sus propiedades de reacción <2-1> Purificación del mutante de CPC acilasa que tiene una mayor actividad específica con respecto a CPC

Se cultivó el transformante MC1061 de E. coli que contiene al plásmido recombinante introducido con el gen de tipo silvestre para el mutante de CPC acilasa de la invención en 1 l de un excelente caldo (Bacto-Triptona al 1,2%, Extracto de Levadura al 2,4%, glicerol al 0,4%, KH_{2}PO_{4 }0,17 M, K_{2}HPO_{4} 0,72 M) que contenía 25 \mug/ml de cloranfenicol a 30ºC durante 16 h para obtener una solución de precultivo. Se inocularon 10 ml de la solución de precultivo en el mismo medio, y luego, se cultivó a 25ºC, 200 rpm durante 48 h con agitación vigorosa. Se sometió la solución del cultivo a centrifugación a 4ºC, 8.000 rpm durante 10 min para separar un precipitado, y luego se lo lavó dos veces con solución amortiguadora Tris-HCl 20mM (pH 8,0). Se suspendió el precipitado en 100 ml de la misma solución amortiguadora. Se sometió esta suspensión a ultra sonicación a 4ºC durante 20 min para destruir una pared celular y centrifugación a 4ºC, 15.000 rpm durante 20 min para remover los materiales insolubles y los residuos celulares, lo cual resulta en la obtención de un sobrenadante utilizado como solución de enzima cruda a conti-
nuación.

Se añadió sulfato de amonio a la solución de enzima cruda para ajustar su tasa final de saturación al 30% y se agitó la mezcla de reacción a 4ºC durante 1 h hasta saturación. Luego de eso, se sometió la mezcla de reacción a centrifugación a 4ºC, 12.000 rpm durante 15 min para remover el precipitado y se añadió sulfato de amonio al sobrenadante para ajustar la tasa final de saturación al 60%. Se agitó la mezcla de reacción a 4ºC durante 1 h hasta saturación y se la sometió a centrifugación a 4ºC, 12.000 rpm durante 15 min para recuperar el precipitado. Se suspendió el precipitado en solución amortiguadora Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) y se sometió a diálisis con solución amortiguadora Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 50 mM durante la noche.

Se sometió la solución de proteína obtenida por diálisis a cromatografía de intercambio aniónico en columna de Sefarosa - DEAE (5 x 18,5 cm) equilibrada con solución amortiguadora Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 50 mM y se lavó la columna con un volumen triple de la misma solución amortiguadora para remover moléculas de proteína que no absorben la misma. Se eluyó la proteína absorbida incrementando gradualmente la concentración de NaCl en el rango desde 50 hasta 200 mM. Se recolectó la fracción que muestra una actividad de CPC acilasa y se la concentró con polietilén glicol (P. M. 20.000) en una bolsa de diálisis. Se sometió la proteína concentrada a diálisis con solución amortiguadora Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) que contenía sulfato de amonio al 25%.

El difusato obtenido arriba fue sometido a cromatografía en columna de Fenil-Toyoperl (2,5 x 6 cm) equilibrada con una solución amortiguadora Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) que contenía sulfato de amonio al 25% para absorber la proteína en la columna, y se eluyó la proteína absorbida disminuyendo gradualmente la concentración de sulfato de amonio en el rango desde 25 hasta 0%. Después de confirmar la actividad de la CPC acilasa de cada fracción, se recuperó la fracción que tenía la actividad de la enzima, se la concentró con polietilén glicol y se la sometió a diálisis con solución amortiguadora Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), para purificar al mutante de CPC acilasa de tipo silvestre y al de la invención.

Se midió la actividad de la enzima por medio del mismo método descrito en el Ejemplo <1-1-2>.

<2-2> Análisis de las propiedades físicas y las características de reacción de la CPC acilasa de tipo silvestre

Se purificó la CPC acilasa de tipo Silvestre del transformante de E. coli que contenía al plásmido pBCPC o pBSEM preparado en el Ejemplo <1-1-2> de acuerdo con el mismo método descrito en el Ejemplo <2-1>. Como resultado del análisis de las propiedades físicas y de las características de reacción de la CPC acilasa de tipo silvestre (AcyII) derivada del plásmido pBCPC y de la CPC acilasa de tipo silvestre (Sem) derivada del plásmido pBSEM, respectivamente, ellas mostraron las mismas propiedades físicas (por ejemplo, peso molecular) y características de reacción (por ejemplo, actividad específica, temperatura óptima, pH óptimo).

Además, la fracción activa de la CPC acilasa de tipo silvestre obtenida en el Ejemplo <2-1> fue sometida a PAGE no desnaturalizante y coloración con azul de Coomassie. Como resultado, se detectó una única banda en una posición correspondiente al peso molecular de aproximadamente 83 kDa, lo cual significa que la CPC acilasa de tipo silvestre fue purificada en forma pura (Figs. 11a a 11c). Junto con el resultado de PAGE no desnaturalizante, el análisis por espectrometría de masas MALDI-TOF confirmó que el peso molecular de la enzima purificada (esto es, la CPC acilasa activa) es aproximadamente de 83 kDa. Además, aproximadamente 25 kDa de la banda correspondiente a la subunidad \alpha y aproximadamente 58 kDa de la banda correspondiente a la subunidad \beta fueron detectados por SDS-PAGE desnaturalizante. A partir de estos resultados, se ha confirmado que el mutante de CPC acilasa de la invención es un dímero que consiste una por una aproximadamente de 25 kDa de la subunidad \alpha y aproximadamente 58 kDa de la subunidad \beta.

Se purificaron las subunidades \alpha y \beta a partir del gel de SDS-PAGE desnaturalizante, respectivamente, y se midió el peso molecular de cada fragmento de subunidad por medio de análisis de espectrometría de masas MALDI-TOF. Como resultado, se ha supuesto que la CPC acilasa (AcyII) de tipo Silvestre derivada del plásmido pBCPC se separa aproximadamente en 25 kDa de la subunidad \alpha y aproximadamente 58 kDa de la subunidad \beta por remoción de un péptido espaciador que consiste de 9 aminoácidos a través de una autodigestión ocurrida en dos posiciones entre el doscientos treintavo y el doscientos treintaiunavo aminoácidos, y el doscientos treintainueveavo y el doscientos cuarentavo aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, respectivamente.

Como resultado del examen de la actividad específica de la CPC acilasa de tipo silvestre, la CPC acilasa de tipo silvestre mostró aproximadamente 23,1 unidades/mg de proteína de la actividad específica con respecto a GL-7-ACA y aproximadamente 0,33 unidades/mg proteína de la actividad específica con respecto a CPC. Por lo tanto, se sabe que la AcyII derivada de Pseudomonas sp. SE83 muestra la actividad específica con respecto a CPC correspondiente únicamente aproximadamente a 1,4% de aquella con respecto a GL-7-ACA.

Después de llevar a cabo la reacción de la enzima de acuerdo con el mismo método descrito en el Ejemplo <1-1-2>, se determinó un parámetro cinético de la enzima purificada por medio del método de la representación gráfica de Lineweaver-Burk. Como resultado, Km, Kcat y una eficiencia catalítica (esto es, Kcat/Km) de la CPC acilasa AcyII de tipo silvestre fueron 50 mM, 0,9/s y 0,02/s/mM, respectivamente.

Además, como resultado del examen de la temperatura óptima de reacción y el pH de la CPC acilasa AcyII de tipo silvestre, la temperatura óptima de reacción y el pH con respecto a CPC fueron 40ºC y 9,0, respectivamente.

<2-3> Análisis de las características de reacción del mutante de CPC acilasa que tiene una mayor actividad específica

Se purificó cada mutante de CPC acilasa a partir del E. coli recombinante transformado con el plásmido cada uno conteniendo al gen para el mutante de CPC acilasa que codifica al mutante doble M31\betaL/F58\betaM, al mutante triple M31\betaL/F58\betaM/H70\betaS, al cuatro veces mutante F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/H70\betaS y al cinco veces mutante F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/H70\betaS/I176\betaV, respectivamente, de acuerdo con el mismo método descrito en el Ejemplo <2-1>.

Como resultado del análisis de las características de reacción de cada enzima mutante purificada, sus características de reacción (por ejemplo, temperatura óptima y pH) y propiedades físicas (por ejemplo, peso molecular) fueron las mismas que las de la CPC acilasa de tipo silvestre. Sin embargo, como resultado del examen de la actividad específica de cada enzima mutante, la actividad específica de cada mutante con respecto a CPC se incrementó gradualmente a medida que la mutagénesis progresa continuamente (Tabla 2). A partir de estas mutagénesis sucesivas, se obtuvo el cinco veces mutante de CPC acilasa F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/H70\betaS/I176\betaV que muestra la mayor actividad específica aproximadamente 11,2 veces superior que la CPC acilasa de tipo silvestre con respecto a CPC.

TABLA 2

3

Después de llevar a cabo la reacción de la enzima de acuerdo con el mismo método descrito en el Ejemplo <1-1-2>, se determinó un parámetro cinético de la enzima cinco veces mutante F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/H70\betaS/I176\betaV por medio del método de la gráfica de Lineweaver-Burk. Como resultado, Km, Kcat y Kcat/Km fueron 8 mM, 2,4/s y 0,30/s/mM, respectivamente. La cinco veces mutante F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/H70\betaS/I176\betaV mostró aproximadamente un valor de Km 6,3 veces menor y una eficiencia de reacción aproximadamente 15 mayor con respecto a CPC comparado con la enzima de tipo silvestre. A partir de estos resultados, se ha confirmado que el mutante de CPC acilasa de la invención obtenido por medio de una serie de mutagénesis dirigida al sitio con base en la información estructural terciaria de CAD tiene una mayor afinidad de enlazamiento y actividad específica con respecto a CPC.

<2-4> Purificación del mutante de CPC acilasa que tiene una mayor reactividad con respecto a CPC y análisis de las características de reacción de la misma

Cada seis veces mutante de CPC acilasa fue purificada a partir de la E. coli recombinante transformada con el plásmido que contenía al gen para el mutante de CPC acilasa (TnS5\alpha\beta) que codifica al seis veces mutante V121\alphaA/
G139\alphaS/F169\alphaY/M31\betaL/F58\betaM/I176\betaV del Ejemplo <1-3> o al gen para el mutante de CPC acilasa (S12) que codifica al seis veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F58\betaN/I75\betaT/I176\betaV/S471\betaC del Ejemplo <1-4-4> de acuerdo con el mismo método descrito en el Ejemplo <2-1>.

Como resultado del análisis de las características de reacción de cada enzima mutante purificada TnS5\alpha\beta y S12, sus características de reacción (por ejemplo, temperatura óptima y pH) y propiedades físicas (por ejemplo, peso molecular) fueron las mismas que la CPC acilasa de tipo silvestre.

Para examinar la actividad específica con respecto a CPC y la inhibición del producto final por 7-ACA de cada mutante de CPC acilasa, se llevó a cabo la reacción de la enzima de acuerdo con el mismo método descrito en el Ejemplo <1-1-2> excepto porque el pH de la mezcla de la reacción se ajustó en 8.5. Como resultado, la actividad específica de las enzimas mutantes TnS5\alpha\beta y S12 con respecto a CPC fueron 1,5 unidades/mg de proteína y 5,8 unidades/mg de proteína, respectivamente, que corresponden a 2,3 y 8,5 veces superior a aquella de la CPC acilasa de tipo silvestre. Además, como resultado de la medición de la constante de inhibición (Ki) por 7-ACA de la enzima mutante S12, aunque el valor de Ki de la enzima de tipo silvestre fue de 0,4 mM, el valor de Ki de la enzima mutante S12, 1,9 mM, lo cual significa que la inhibición del producto final por 7-ACA de la enzima mutante S12 disminuyó significativamente comparada con aquella de la enzima de tipo silvestre. A partir de estos resultados, se ha conformado que la enzima mutante S12 de la invención (seis veces mutante V121\alphaA/G139\alphaS/F58\betaN/I75\betaT/I176\betaV/S471\betaC) muestra la mayor actividad específica con respecto a CPC pero una menor inhibición del producto final por 7-ACA.

Ejemplo 3 Producción del mutante de CPC acilasa en E. coli <3-1> Producción de mutante de CPC acilasa utilizando el vector pBC KS(+)

Los genes TnS y TnS5\alpha\beta que codifican al seis veces mutante de CPC acilasa V121\alphaA/G139\alphaS/F169\alphaY/M31\betaL/
F58\betaM/I176\betaV, y el gen S12 que codifica al seis veces mutante de CPC acilasa V121\alphaA/G139\alphaS/F58\betaN/I75\betaT/
I176\betaV/S471\betaC fueron insertados en el vector pBC KS(+) para obtener los plásmidos recombinantes pBC-TnS5, pBC-TnS5\alpha\beta y pBC-S12, respectivamente, y se transformó MC1061 de E. coli con cada plásmido recombinante resultante.

Cada transformante de E. coli fue cultivado en 50 ml de un caldo LB que contenía 25 \mug/ml de cloranfenicol a 25ºC, 200 rpm durante 48 h con agitación vigorosa y se midió la productividad de CPC acilasa utilizando la solución de enzima cruda preparada a partir de la solución de cultivo de acuerdo con el mismo método descrito en el Ejemplo <1-1-2>. En este momento, se utilizaron los plásmidos recombinantes pBSEM y pBCPC que contienen los genes acyII y sem que codifican para la acilasa de tipo silvestre, respectivamente, como control. Como resultado, el transformante de E. coli que contiene al plásmido pBC-S12 mostró la máxima productividad de CPC acilasa en un nivel de 712 unidades/l.

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TABLA 3

4

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<3-2> Producción del mutante de CPC acilasa utilizando el vector pET29-a(+) <3-2-1> Preparación de plásmidos pET29-TnS5\alpha\beta y pET29-S12

Se sometieron los plásmidos recombinantes pBC-TnS5\alpha\beta y pBC-S12 a amplificación PCR utilizando el iniciador pET29-F (SEQ ID NO: 40) y el iniciador pET29-R (SEQ ID NO: 41), respectivamente, para obtener 2,5 kb cada uno de producto PCR. Después de la amplificación PCR, se digirió el producto PCR con XbaI/XhoI y se purificó con un kit de purificación (QIAEX II Gel Extraction Kit; Qiagen, Alemania), para obtener un ADN inserto. Además, se digirió ADN vector de pET29-a(+) (Novagen, EUA) con XbaI/XhoI y se lo sometió a desfosforilación con CIP, para obtener un ADN vector. Se sometieron el ADN inserto y el ADN vector a ligación utilizando T4 ADN ligasa (Roche, Alemania) a 16ºC durante 16 h y se los transformó en la cepa MC1061 de E. coli por electroporación. Se esparció la cepa de E. coli sobre una placa de agar LB que contenía 20 \mug/ml de kanamicina y se cultivó a 30ºC en una incubadora durante la noche para seleccionar un transformante que contiene el gen del mutante. Se purificó el plásmido del transformante seleccionado y se analizó la secuencia de nucleótidos del ADN inserto, para obtener los plásmidos pET29-TnS5\alpha\beta y pET29-S12.

<3-2-2> Producción del mutante de CPC acilasa por medio del transformante de E. coli que contiene al plásmido pET29-TnS5\alpha\beta o pET29-S12

Se transformó cada uno de los plásmidos pET29-TnS5\alpha\beta y pET29-S12 dentro de BL21(DE3) de E. coli por electroporación para preparar al E. coli recombinante que contiene al plásmido pET29-TnS5\alpha\beta y pET29-S12, respectivamente, y se midió la productividad del seis veces mutante de CPC acilasa en cada E. coli recombinante. Se transcribió el gen TnS5\alpha\beta y S12 para el mutante de CPC acilasa en estos plásmidos recombinantes por medio de la acción del promotor T7 que está bajo el control del operador LacI que existe en el vector pET29-a(+).

Se inoculó el E. coli recombinante que contiene el plásmido pET-TnS5\alpha\beta en 3 ml de un caldo LB que contenía 20 \mug/ml de kanamicina y se cultivó a 30ºC, 200 rpm durante 16 h con agitación vigorosa. Se transfirieron 50 ml de la solución de cultivo a 50 ml de un nuevo caldo LB que contenía 20 \mug/ml de kanamicina y lactosa al 0,02, 0,2 y 2% cada vez y se cultivó a 25ºC, 200 rpm durante 80 h con agitación vigorosa. En ese momento, para medir la productividad del mutante de CPC acilasa de acuerdo con la evolución del cultivo, se tomaron 5 ml de caldo de cultivo del recipiente para cultivo a 24, 36, 48, 72 y 80 h durante el cultivo, respectivamente. Se sometió cada solución de cultivo a centrifugación a 4ºC, 8.000 rpm durante 10 min para separar un precipitado y se lavó el precipitado dos veces con solución amortiguadora Tris-HCl 0,1 M (pH 8,0). Después de que el precipitado fue suspendido en 500 ml de la misma solución amortiguadora, fue sometido a ultrasonicación a 4ºC durante 1 min y centrifugación a 4ºC, 15.000 rpm durante 20 min para separar un sobrenadante, que puede ser utilizado como una solución de enzima cruda del seis veces mutante de CPC acilasa. La actividad del seis veces mutante de CPC acilasa con respecto a CPC fue medida utilizando dicha solución de enzima cruda de acuerdo al mismo método descrito en el Ejemplo <1-1-2>.

Ya que IPTG que es generalmente utilizado como inductor para alta expresión de un gen foráneo en un sistema de expresión del vector pET29 y de E. coli BL21(DE3) es muy costoso, es difícil aplicar IPTG a escala industrial de cultivo. Por lo tanto, la presente invención ha empleado un inductor de bajo costo, lactosa (DIFCO, EUA) en vez de IPTG para la producción en masa del mutante de CPC acilasa. Además, generalmente se ha sabido en el arte que el sistema de expresión del pET29 y de BL21(DE3) de E. coli expresa en forma alta al gen foráneo dentro de un corto período cultivando un transformante durante un período fijo de tiempo sin un inductor en la primera etapa del cultivo para propagarlo y además cultivarlo con la adición de inductor en un punto fijo. Sin embargo, ya que se confirmó que el método inducible de expresión para producir la CPC acilasa descrita más arriba generó una gran cantidad de polipéptido inactivo como subproducto, la presente invención cultivó al transformante de E. coli con la adición de lactosa en la primera etapa del cultivo para inducir una expresión constitutiva. Como resultado, en caso de cultivar con lactosa al 2%, la productividad de CPC acilasa se incrementó por acción de la lactosa como inductor de acuerdo con la evolución temporal del cultivo (Tabla 4).

Además, se preparó cada solución de enzima cruda a partir de tres caldos de cultivo que contenían diferente concentración de lactosa (0,02, 0,2 y 2%) tomada 48 h después del cultivo y sometida a SDS-PAGE desnaturalizante (SDS - gel de poliacrilamida al 12%) para examinar el patrón de expresión de una proteína. Como resultado, se produjo el mutante de CPC acilasa en gran cantidad en caso de cultivar con lactosa al 2% (Fig. 12). Además, no hubo banda de precursor inactivo correspondiente al peso molecular de aproximadamente 83 kDa, lo cual confirma que la mayor parte de la forma inactiva del precursor se convierte en la forma activa de CPC acilasa por medio de una autodigestión eficiente.

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TABLA 4

5

TABLA 4 (continuación)

6

Además, se midió la productividad de CPC acilasa por medio de la enzima mutante S 12 en el transformante BL21 (DE3) de E. coli que contiene al plásmido recombinante pET29-S12 de acuerdo con el mismo método descrito anteriormente excepto porque se emplearon 50 ml de caldo LB que contenía 20 \mug/ml de kanamicina y lactosa al 2% para un cultivo principal y se cultivó el transformante de E. coli a 25ºC, 200 rpm durante 72 h con agitación vigorosa. Como resultado, la productividad del seis veces mutante de CPC acilasa V121\alphaA/G139\alphaS/F58\betaN/I75\betaT/I176\betaV/S471\betaC (S12) fue de 1.207 unidades/l.

BL21(DE3) de E. coli transformado con el plásmido pET29-S12 que contenía al gen S 12 para el seis veces mutante de CPC acilasa V121\alphaA/G139\alphaS/F58\betaN/I75\betaT/I176\betaV/S471\betaC de la invención ha sido denominado BL21(DE3)/pET-S12 de E. coli que fue depositado el 30 de julio de 2003 en la Korean Collection for Type Cultures (KCTC) (Dirección: Korea Research Institute of Bioscience y Biotechnology (KRIBB), #52, Oun-dong, Yusong-ku, Taejon, 305 - 333, República de Corea) bajo el número de acceso KCTC 10503BP, de acuerdo con los términos de Tratado de Budapest para el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los fines del Procedimiento en Materia de Patentes.

Ejemplo 4 Conversión en una etapa de CPC en 7-ACA utilizando mutante de CPC acilasa

Se cultivó el transformante BL21(DE3) de E. coli que contenía cada uno de los plásmidos pET29-TnS5\alpha\beta y pET29-S12 del Ejemplo <3-2> en 5 l de un caldo LB que contenía 20 \mug/ml de kanamicina y lactosa al 2% a 25ºC, 200 rpm durante 72 h con agitación vigorosa. Además, MC1061(pBCPC) de E. coli que contenía al gen para CPC acilasa de tipo silvestre fue también cultivado en 10 l de un caldo LB que contenía 25 \mug/ml de cloranfenicol a 25ºC, 200 rpm durante 48 h con agitación vigorosa. Luego de eso, se purificaron la CPC acilasa de tipo silvestre, los mutantes de CPC acilasa TnS5\alpha\beta y S12 de cada caldo de cultivo de acuerdo con el mismo método descrito en el Ejemplo <2-1>, respectivamente. La proteína purificada obtenida más arriba fue sometida a diálisis con solución amortiguadora de fosfato 50 mM (pH 8,5), y el difusato obtenido por diálisis fue utilizado para una reacción de conversión de CPC.

Después de que CPC fue disuelto en solución amortiguadora de fosfato 50 mM (pH 8,5) a una concentración final de 50 mM, se añadió la solución de enzima purificada disuelta en la misma solución amortiguadora a la solución de CPC obtenida más arriba hasta una concentración final de 5 unidades/ml para preparar 50 ml de la mezcla de reacción. Se agitó la mezcla de reacción a 25ºC durante 1 h para inducir una reacción de conversión de CPC. En ese momento, con el propósito de evitar la caída del pH de la mezcla de reacción durante la reacción de conversión, cuando el pH de la mezcla de reacción alcanzó 8,4, se inyectó automáticamente solución de NaOH 0,2 N a la mezcla de reacción por medio de un regulador de pH para mantener constante el pH de la mezcla de reacción en 8,5. Se tomaron 100 ml de la mezcla de reacción en un momento específico durante la reacción de conversión e inmediatamente se los sometió a un análisis por HPLC para cuantificar la cantidad de CPC y de 7-ACA en la mezcla de reacción. Para el análisis por HPLC, se emplearon una columna Symmetry C18 (Waters, EUA) y la mezcla (90:10) de solución amortiguadora de acetato de amonio 20 mM (pH 5,0) y acetonitrilocomo fase móvil. Además, la velocidad de flujo de la fase móvil fue de 0,6 ml/min, se preparó la muestra (20 ml) que iba a ser inyectada diluyendo apropiadamente la mezcla e reacción con solución amortiguadora de fosfato 50 mM (pH 8,5), y se detectó su absorbancia en una longitud de onda UV de 250 nm.

Como resultado, mientras que la CPC acilasa de tipo silvestre mostró un nivel del 60% de tasa de conversión de CPC bajo las condiciones de reacción descritas más arriba, los mutantes de CPC acilasa TnS5\alpha\beta y S12 de la presente invención, un nivel de 86% y 98% de tasa de conversión de CPC, respectivamente (Fig. 13). En particular, el mutante S12 de CPC acilasa convirtió eficientemente CPC en 7-ACA con un nivel alto de rendimiento de 7-ACA (90% o más) (Figs. 13 y 14).

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Referencias citadas en la descripción

Este listado de referencias citado por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patente citados en la descripción

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<110> AMICOGEN, INC.

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<120> MUTANTE DE CEFALOSPORINA C ACILASA Y SU UTILIZACIÓN PARA PREPARAR 7-ACA

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<130> PCA30855/AMI

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<160> 44

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<170> KopatentIn 1.71

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<210> 1

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<211> 2325

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<212> ADN

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<213> gen acyII para CPC acilasa de tipo silvestre

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<400> 1

7

8

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<210> 2

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<211> 774

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<212> PRT

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<213> proteína AcyII de CPC acilasa de tipo silvestre

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<400> 2

9

10

11

12

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<210>3

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<211> 2334

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> gen sem para CPC acilasa de tipo silvestre

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

13

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 229

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> subunidad alfa de proteína AcyII de CPC acilasa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

15

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 535

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> subunidad beta de proteína AcyII de CPC acilasa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

17

18

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2325

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> gen S12 para CPC acilasa mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

20

21

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 229

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> subunidad alfa de proteína S12 de CPC acilasa mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

23

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210>8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 535

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> subunidad beta de proteína S12 de CPC acilasa mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

25

26

27

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador T3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattaaccct cactaaaggg a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador T7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taatacgact cactataggg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador M13-R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaaacagct atgaccatg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador M13-F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtaaaacgac ggccagt

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador CPC-F

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ataccgctcg aggtcctaga aaaaaccaag gaggtaataa ataatgacca tggcggcg

\hfill

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador CPC-R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctagctctag agatcctcat tacgccggca ccagttc

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador alfa ORF-R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttattacctc cttgaattca ctagtcatta gccgcccatc gctttc

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador beta ORF-F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctagtgaatt caaggaggta ataaataatg agcaacaact gggcgg

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador HindIII-F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgtgcgcgt ctggaagctt tgggcatcca gggc

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador HindIII-R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccctggatg cccaaagctt ccagacgcgc acgc

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador M31beta L-R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador F58beta M-F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador F58beta C-F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador F58beta A-F

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador F58beta V-F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador F58beta L-F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador F58beta N-F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador H70beta S-F

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcgtattgc gtgaccagcg cgtttatgga tatcc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador H70 beta S-R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggatatccat aaacgcgctg gtcacgcaat acgcc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador H70beta L-F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcgtattgc gtgaccctgg cgtttatgga tatcc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador H70beta L-R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggatatccat aaacgccagg gtcacgcaat acgcc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador F169alfa Y-F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgggcagc gtgtggtata aactgtggcg tatg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador F169alfa Y-R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catacgccac agtttatacc acacgctgcc catc

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador I 176beta V-F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtggctggg gcctggttga tcataacctg gtg

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador I 176beta V-R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caccaggtta tgatcaacca ggccccagcc acg

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador H70beta-F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcgtattgc gtgacccatg cgtttatgga tatcc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador H70beta-R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggatatccat aaacgcatgg gtcacgcaat acgcc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador G139alfa S-F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgctgccgat cgaatatagc ctgctgggcg cggaac

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador G139alfa S-R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttccgcgcc cagcaggcta tattcgatcg gcagcg

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador alfa CPC-R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctgccgccg cccgccgcat cgctcgcatc gccgcccatc gctttcagc

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador beta CPC-F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgatgcgag cgatgcggcg ggcggcggca gcaacaactg ggcggtg

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador pET29-F

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador pET29-R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtggtgctcg agtcattacg ccggcaccag ttc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador M31beta-R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador I75betaT-F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtgacccat gcgtttatgg atacccatga tctgtatctg gaacagtttg

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador I75betaT-R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caaactgttc cagatacaga tcatgggtat ccataaacgc atgggtcacg

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador F169alfa-F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgggcagc gtgtggttta aactgtggcg tatg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador F169alfa-R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catacgccac agtttaaacc acacgctgcc catc

\hfill

34

Claims

1. Un mutante de una CPC acilasa compuesto de una subunidad \alpha de acuerdo con la SEQ ID NO: 4 y una subunidad \beta de acuerdo la SEQ ID NO: 5, o un derivado del mismo de CPC acilasa funcionalmente equivalente, caracterizado porque al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de Val121\alpha, Gly139\alpha y Phe169\alpha de la subunidad \alpha de CPC acilasa de la SEQ ID NO: 4 y Phe58\beta, His70\beta, Ile75\beta, Ile176\beta y Ser471\beta de la subunidad \beta de CPC acilasa de la SEQ ID NO: 5 es reemplazado por otro aminoácido, en donde el mutante de CPC acilasa o el derivado del mismo de CPC acilasa funcionalmente equivalente cataliza la conversión de un compuesto de Fórmula I hasta un compuesto de Fórmula II:

38

en donde, R es acetoxi (-OCOCH_{3}), hidroxi (-OH), hidrógeno (-H) o una sal del mismo.

\vskip1.000000\baselineskip

2. El mutante de CPC acilasa o un derivado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el mutante de CPC acilasa o el derivado del mismo de CPC acilasa funcionalmente equivalente cataliza la conversión de CPC en 7-ACA.

3. El mutante de CPC acilasa o un derivado de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde:

: Val121\alpha es reemplazado por alanina;

: Gly139\alpha es reemplazado por serina;

: Phe169\alpha es reemplazado por tirosina;

: Phe58\beta es reemplazado por alanina, metionina, leucina, valina, cisteína o asparagina;

: His70\beta es reemplazado por serina o leucina;

: Ile75\beta es reemplazado por treonina;

: Ile176\beta es reemplazado por valina; o

: Ser471\beta es reemplazado por cisteína.

\vskip1.000000\baselineskip

4. El mutante de CPC acilasa o un derivado de acuerdo con la reivindicación 3, en donde Phe58\beta es reemplazado por alanina, metionina, leucina, valina, cisteína o asparagina, y además Met31\beta es reemplazado por leucina.

5. El mutante de CPC acilasa o un derivado de acuerdo con la reivindicación 4, en donde His70\beta es reemplazado adicionalmente por serina o leucina.

6. El mutante de CPC acilasa o un derivado de acuerdo con la reivindicación 5, en donde Phe169\alpha es reemplazado adicionalmente por tirosina.

7. El mutante de CPC acilasa o un derivado de acuerdo con la reivindicación 6, en donde Ile176\beta es reemplazado adicionalmente por valina.

8. El mutante de CPC acilasa o un derivado de acuerdo con la reivindicación 4, en donde Phe169\alpha es reemplazado adicionalmente por tirosina e Ile176\beta es reemplazado adicionalmente por valina.

9. El mutante de CPC acilasa o un derivado de acuerdo con la reivindicación 8, en donde Val121\alpha es reemplazado adicionalmente por alanina.

10. El mutante de CPC acilasa o un derivado de acuerdo con la reivindicación 8, en donde Gly139\alpha es reemplazado adicionalmente por serina.

11. El mutante de CPC acilasa o un derivado de acuerdo con la reivindicación 8, en donde Val121\alpha es reemplazado adicionalmente por alanina y Gly139\alpha es reemplazado adicionalmente por serina.

12. El mutante de CPC acilasa o un derivado de acuerdo con la reivindicación 3, en donde Val121\alpha es reemplazado por alanina; Gly139\alpha es reemplazado por serina; Phe58\beta es reemplazado por alanina, metionina, leucina, valina, cisteína o asparagina; e Ile176\beta es reemplazado por valina.

13. El mutante de CPC acilasa o un derivado de acuerdo con la reivindicación 12, en donde Phe169\alpha es reemplazado adicionalmente por tirosina.

14. El mutante de CPC acilasa o un derivado de acuerdo con la reivindicación 12, en donde Ile75\beta es reemplazado adicionalmente por treonina.

15. El mutante de CPC acilasa o un derivado de acuerdo con la reivindicación 12, en donde Ser471\beta es reemplazado adicionalmente por cisteína.

16. El mutante de CPC acilasa o un derivado de acuerdo con la reivindicación 12, en donde Ile75\beta es reemplazado adicionalmente por treonina y Ser471\beta es reemplazado adicionalmente por cisteína.

17. El mutante de CPC acilasa o un derivado de acuerdo con la reivindicación 16, el cual tiene una secuencia de aminoácidos que comprende una subunidad \alpha de CPC acilasa de la SEQ ID NO: 7 y una subunidad \beta de CPC acilasa de la SEQ ID NO: 8.

18. Un gen que codifica al mutante de CPC acilasa o un derivado de CPC acilasa funcionalmente equivalente del mismo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.

19. El gen de acuerdo con la reivindicación 18, que tiene la secuencia de nucleótidos descrita por la SEQ ID NO: 6.

20. El gen de acuerdo con la reivindicación 18, en donde el gen codifica

(a): la subunidad \alpha y la subunidad \beta, enlazadas con un péptido espaciador específico; o

(b): la subunidad \alpha y la subunidad \beta, no enlazadas con un péptido espaciador; o

(c): únicamente la subunidad \alpha; o

(d): únicamente la subunidad \beta.

21. Un vector de expresión recombinante que contiene al gen de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20.

22. El vector de expresión recombinante de acuerdo con la reivindicación 21, que es pET29-S12.

23. Un microorganismo transformado con el vector de expresión recombinante de la reivindicación 21.

24. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 23, que es BL21(DE3) de E. coli (pET29-S12) (Acceso No: KCTC 10503BP).

25. Un método para preparar el mutante de CPC acilasa o un derivado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, que comprende las etapas de cultivar el microorganismo de las

reivindicaciones 23 ó 24 bajo una condición adecuada y recuperar al mutante de CPC acilasa o un derivado a partir de caldo de cultivo.

26. El método de acuerdo con la reivindicación 25, que comprende además la etapa de añadir lactosa al caldo de cultivo como un inductor en la primera etapa del cultivo.

27. El uso de una composición que comprende al mutante de CPC acilasa o un derivado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para preparar 7-ACA por medio de un método enzimático en una etapa.

28. Un método para preparar el compuesto de Fórmula II, que comprende la etapa de poner en contacto un compuesto de Fórmula I con el mutante de CPC acilasa o un derivado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17:

39

en donde, R es acetoxi (-OCOCH_{3}), hidroxi (-OH), hidrógeno (-H), o una sal del mismo.

29. El método de acuerdo a la reivindicación 28, en donde el mutante de CPC acilasa o un derivado es utilizado en la forma de un caldo de cultivo del microorganismo de la reivindicación 23 ó 24, una composición que comprende al mutante de CPC acilasa o al derivado de las reivindicaciones 1 a 17, una forma libre del mutante de CPC acilasa o derivado purificado a partir de la solución del cultivo, o una forma inmovilizada del mutante de CPC acilasa o derivado.

30. El método de acuerdo a la reivindicación 28, en donde la reacción de contacto del compuesto de Fórmula I con el mutante de CPC acilasa o derivado se lleva a cabo en una solución acuosa.

31. El método de acuerdo a la reivindicación 28, en donde la concentración de compuesto de Fórmula I está en el rango entre 1 y 500 mM y la cantidad añadida del mutante de CPC acilasa o derivado está en el rango entre 0,1 y
100 U/Ml.

32. El método de acuerdo a la reivindicación 28, en donde la reacción de contacto del compuesto de Fórmula I con el mutante de CPC acilasa o derivado se lleva a cabo a pH de 7 a 10, 4 a 40ºC durante 0,1 a 24 h.