JPH04104792A

JPH04104792A - 新規アクレモニウム・クリソゲナム

Info

Publication number: JPH04104792A
Application number: JP2219032A
Authority: JP
Inventors: Akio Matsuda; 昭生松田; Kenichi Komatsu; 小松　謙一
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1990-08-22
Filing date: 1990-08-22
Publication date: 1992-04-07

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、アクレモニウム・クリソゲナム内でセファロ
スポリンＣ・アシラーゼ遺伝子を発現させるため、構築
された組換え体ＤＮＡおよび該ＤＮＡで形質転換され、
７−アミノセファロスポラン酸を生成する能力を獲得し
た新規アクレモニウム・クリソゲナムに関する。

（従来の技術）糸状菌アクレモニウム・クリソゲナム等を用いた発酵生
産によって得られるセファロスポリンＣは、７位アミノ
基に結合したアシル基を除去する反応（以下、脱アシル
化と略す）により、７−アミノセファロスポラン酸（以
下、７−ＡＣＡと略す）に誘導され、これを出発原料と
して種々のセファロスポリン系抗生物質が合成され、医
薬品として実用に供されている。

セファロスポリンＣの脱アシル方法としては、化学的方
法および酵素的方法がある。化学的脱アシル化法（例え
ば、特公昭４１−１３８６２号および特公昭４５−４０
８８９号の方法）は反応工程が多く、反応に用いる試薬
のコストが高いこと、反応の副産物として大量の化合物
が排出されることなど、工業的に欠点が多いことが知ら
れている。

酵素的脱アシル化法としては、セファロスポリンＣの７
位側鎖７β−（Ｄ−５−アミノ−５−カルボキシペンタ
ンアミド）基のＤ−５−アミノ基にグリオキシル酸を作
用させ、化学的に脱アミノ反応を行う特公昭５５−１２
９１０の方法、あるいは微生物酵素を作用させて脱アミ
ノ反応を行う特公昭５０−７１５８の方法などにより、
セファロスポリンＣを７β−（５−カルボキシ−５−オ
キソペンタンアミド）−セファロスポラン酸に誘導し、
ついで過酸化水素を作用させることにより脱炭酸反応を
行わせて、７β−（４−カルボキシブタンアミド）−セ
ファロスポラン酸に誘導しておき、さらに、シュードモ
ナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属）細菌の生産する酵
素（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　４５巻、１５６１頁、１９
８１年）を作用させることにより脱アシル化を行わせ、
７−ＡＣＡへ誘導する方法がある。この方法は、上記化
学的脱アシル化法の問題点の多くを解決できるが、多段
の反応工程を必要とするため、よりすぐれた方法として
酵素的な一段反応の開発が望まれてきた。このような理
由から、セファロスポリンＣを直接脱アシル化して７−
ＡＣＡを生成させる酵素、すなわち、セファロスポリン
Ｃ・アシラーゼの探索が精力的に行われて、種々の微生
物〔例えば、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌａｓ
属〕、アルタナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ属）の真
菌、〈特開昭５２−１４３２８９＞；シュードモナス属
の新種に属する細菌５Ｅ−８３株〈特開昭６１−２１０
９７＞、５Ｅ−４９５株〈特開昭６２−４８３８０＞；
バチラス・メガテリウム（ＡＴＣＣ５３６６７）＜特開
平２−２３９５〉）が該酵素活性を有していることが見
いだされてきた。さらに、上記シュードモナス属の新種
に属する細菌５Ｅ８３株（以下、５Ｅ−８３株と略記す
ることがある）が所有するセファロスポリンＣ・アシラ
ーゼに関しては、その遺伝子が単離され、該酵素を大量
に供給するために利用されている〈特開昭６１−１５２
２８６＞。しかしながら、現在までこれらの酵素を工業
的に利用することに成功した例は知られていない。

（発明が解決しようとする課題）一方、７−ＡＣＡを直接生産する微生物が得られれば、
工業的に極めて有利な７−ＡＣＡ製造法の開発が期待で
きる。しかしながら、このような微生物の存在は全く知
られていなかった。

（課題を解決するための手段）本発明者らは、先に５Ｅ−８３株よりセファロスポリン
Ｃ・アシラーゼをコードする遺伝子を単離し、該遺伝子
を大腸菌で大量に発現させることに成功した。（Ｍａｔ
ｓｕｄａ　ｅｔ　ａｌ、　：　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＢ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　（１９８７）　１６９．５８
１５−５８２０３また、アクレモニウム・クリソゲナム
より、プロモーター活性を有する３種のＤＮＡ断片を単
離し、該断片がアクレモニウム・クリソゲナムを宿主と
した発現ベクターの重要な構成要素として利用できるこ
とを証明した〔特願平２−１６６５６６（平成２年６月
２７日出願１発明の名称「アクレモニウム・クリソゲナ
ムのプロモーター」）］。

本発明者らは、上記の発明に基づいて、アクレモニウム
・クリソゲナム内でセファロスポリンＣ・アシラーゼ遺
伝子を発現させるべく引き続き鋭意研究を行った。その
結果、セファロスポリンＣ・アシラーゼを効率良く産生
ずる新規アクレモニウム・クリソゲナムを創製すること
に成功した。

さらに、該菌の培養液中に７−ＡＣＡが存在することを
見いだし、本発明を完成するに至った。すなわち、本発
明は、（１）アクレモニウム・クリソゲナム内で作用す
るプロモーター、セファロスポリンＣ・アシラーゼ遺伝
子、アクレモニウム・クリソゲナム内で作用するターミ
ネータ−が発現に好適な配置で連結したセファロスポリ
ンＣ・アシラーゼ発現単位、（２）（１）記載のセファ
ロスポリンＣ・アシラーゼ発現単位が少なくとも１個、
ベクターに挿入された組換え体ＤＮＡ、（３）（２）記
載の組換え体ＤＮＡで形質転換された新規アクレモニウ
ム・クリソゲナム、（４）　（３）記載の新規アクレモ
ニウム・クリソゲナムを培養し、７−アミノセファロス
ポラン酸を直接発酵せしめ、培養液からこれを採取する
ことを特徴とする７−アミノセファロスポラン酸の新規
製造方法に関する。

本発明者らは、セファロスポリンＣ・アシラーゼを高生
産する新規アクレモニウム・クリソゲナムを育種する過
程において、最近、所望の遺伝子産物を動物細胞に量産
させるための技術として開発されたマルクス法（所望の
遺伝子発現単位を同一方向に多数連結させた状態でコス
ミドベクターにクローン化し、得られた組換え体ＤＮＡ
を動物細胞に導入することにより、高生産株を得る方法
〔例えばイケダらの文献１ＧＥＮＥ　（１９８８）　７
Ｌ　１９−２７〕）を適用することを試みた。その結果
、後述の実施例に示すとおり、該方法が、糸状菌の一種
であるアクレモニウム・クリソゲナムを宿主とした場合
においても極めて有効であることを見いだした。本発明
に係る組換え体ＤＮＡおよび組換え体微生物は、大略以
下の工程にしたがって調製することができる。

（１）セファロスポリンＣ・アシラーゼを産生ずる微生
物より、該酵素をコードする遺伝子をクローン化する。

（２）アクレモニウム・クリソゲナム内で作用するプロ
モーター断片およびターミネータ−断片を単離する。

（３）上記（１）、（２）で得たＤＮＡ断片をプロモー
ターセファロスポリンＣ・アシラーゼ遺伝子、ターミネ
ータ−の順で連結し、セファロスポリンＣ・アシラーゼ
発現単位を構築する。

（４）アクレモニウム・クリソゲナム内で作用する選択
マーカー遺伝子を含有するベクターを利用して、上記発
現単位をアクレモニウム・クリソゲナムに導入する。

上記の工程中でＤＮＡ、組換え体宿主としての大腸菌等
の取り扱いに必要な一般的な操作は、当業者間で通常行
われているものであり、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓらの
実験操作書（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　　Ａ　　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ、　　ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１９
８２．１９８９　）にしたがえば、容易に実施できる。

使用される酵素、試薬類もすべて市販の製品を用いるこ
とができ、特に断らない限り、製品で指定されている使
用条件にしたがえば、完全にそれらの目的を達成するこ
とができる。

上記工程（１）において、セファロスポリンＣ・アシラ
ーゼを産生ずる微生物としては、例えば、シュウトモナ
ス属の新種に属する細菌５Ｅ−８３株（微工研菌寄第７
６４９号）が挙げられる。該菌に由来するセファロスポ
リンＣ・アシラーゼ遺伝子およびその遺伝子を含む組換
え体ＤＮＡは、例えば、特開昭６１−１５２２８６に記
載されている方法により得ることができる。また、既に
明らかにされている該遺伝子の塩基配列［Ｍａｔｓｕｄ
ａら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ　（１９８７）　１６９．５８２１−５８２６］に基
づきＤＮＡオリゴマーを合成し、該オリゴマーをプロー
ブとしたハイブリダイゼーション法により、５Ｅ−８３
株の染色体ＤＮＡライブラリーから得ることも可能であ
る。

上記工程（２）において、アクレモニウム・クリソゲナ
ム内で作用するプロモーターおよびターミネータ−とし
ては、例えば、アクレモニウム・クリソゲナム由来ホス
ホグリセレートキナーゼ遺伝子（ＰＧＫ遺伝子）、グリ
セルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＧＡ
ＰＤ遺伝子）、アクチン遺伝子等のプロモーターならび
にターミネータ−が挙げられる。

これらのプロモーターならびにターミネータ−を含むＤ
ＮＡ断片は、例えば、特願平１−１６６５６６に記載さ
れている方法にしたがってアクレモニウム・クリソゲナ
ムの遺伝子ライブラリーから取得できる。

上記工程（４）において、選択マーカー遺伝子を有する
アクレモニウム・クリソゲナム形質転換用ベクターとし
ては、例えば、ｐＰＧＫＭ５．ｐＡＣＴＨＹ８３．ｐＥ
ＧＡＰ８３．ｐＢＳＦＡＨＹ８３、ｐＢｓＦＰＫＭ５等
が挙げられる。これらのベクターを利用したアクレモニ
ウム・クリソゲナムの形質転換は、例えば、Ｑｕｅｅｎ
ｅｒらの方法〔Ｑｕｅｅｎｅｒ　ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ　　１９８５．　　ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉ
ｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　（１９８
５）　ｐｐ４６８−４７２　）に準じて行うことができ
る。また、宿主として用いるアクレモニウム・クリソゲ
ナムは、セファロスポリンＣ産生能を有するものであれ
ば如何なる株でも使用できるが、より好適には、セファ
ロスポリンＣを高生産する株、例えば、アクレモニウム
・クリソゲナムｌ５−５　（微工研菌寄第１１２３２号
）等を使用することが望ましい。なお、上記のベクター
ｐＰＧＫＭ５．ｐＡＣＴＨＹ８３゜ｐＥＧＡＰ８３は、
特願平２−１６６５６６に記載された方法により得るこ
とができる。また、ＰＢＳＦＰＫＭ５．ｐＢｓＦＡＨＹ
８３はｐＰＧＫＭ５．ｐＡＣＴＨＹ８３から誘導された
コスミドベクターであり、これらの作成法および利用法
に関しては、本実施例において詳述する。

（実施例）以下、実施例により本発明を詳述するが、本発明は、該
実施例によって限定されるものではない。

実施例に記載の略称ないし略号は、以下のとおりのもの
である。

マニアティスの実験書：　　（Ｔ９Ｍａｎｉａｔｉｓ　
ｅｔ　ａｌ、。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｉｇ
　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１９８２　）
Ｎ−３シード培地：コーンスティーブリ力−４０ｇ／ビ
ート２０ｇ／酢酸アンモニウム２ｇ／スイトース４０ｇ
を水１！に熔解したもの。

メイン培地：ビート３０ｇ／脱脂大豆４０ｇ／コーンス
テイープリカー１０ｇ／酢酸アンモニウム５ｇ／ｌＵ酸
アンモニウム７ｇ／硫酸カルシウム８ｇ／炭酸カルシウ
ム１５ｇ／スイトース６０ｇ／メチルオレイト４１．５
ｇを水１１に含むもの。

ＣＭＧ培地培地ニゲルコース２０リ／リン酸二水素カリ
ウム０ｇ／リン酸水酸水素ジカリウム０．５塩化カリウ
ム０．５ｇ／硫酸マグネシウム（７水塩）０．５ｇ／硫
酸鉄（ＩＩ）（７水塩）０゜０１　ｇ／硝酸ナトリウム
３ｇ／イーストエキストラクｚｇ／ペプトン１０ｇを水
１！に溶解したもの。

ＣＭ培地：ショ糖２０ｇ／リン酸二水素カリウム０．５
ｇ／リン酸水酸水素ジカリウム０．５塩化カリウム０．
５ｇ／硫酸マグネシウム（７水塩）０．５ｇ／硫酸鉄（
ＩＩ）（７水塩）０．０１ｇ／硝酸ナトリウム３ｇ／イ
ーストエキストラクト４ｇ／ペプトン１０ｇを水１！に
溶解したもの。

ＣＭ固形培地：１．５％の寒天を含有するＣＭ培地。

ＧＡＧ培地：グリセロール４０ｇ／アスパラギン４ｇ／
塩化カルシウム０．１ｇ／塩化ナトリウム０．１ｇ／微
量金属溶液〔硫酸マグネシウム（７水塩）４ｇ／硫酸鉄
（ｎ）（７水塩）０．４ｇ／硫酸マンガン（４水塩）０
．１６ｇ／硫酸亜鉛（７水塩）０．４ｇ／無水硫酸ｆＪ
ｉｉＯ，０４ｇを水１１に溶解したもの）２５１ｉ１０
．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７，０）３０戚を水１！
に含有する培地。

Ｐ−バッファー：０．６Ｍ塩化カリウム１０゜０１Ｍ塩
化マグネシウム１０．０２５Ｍ塩化カルシウム。

ＰＥＧ？容液：２５％ポリエチレングリコール（約４０
００）１０．０１Ｍトリス（ｐＨ８゜０）１０．０５Ｍ
塩化カルシウム１０．６Ｍ塩化カリウム。

実施例１ｐＰＧＡＣＹ２の構築第１図に示される工程にしたがって、５Ｅ−８３株由来
のセファロスポリンＣ・アシラーゼ遺伝子をアクレモニ
ウム・クリソゲナム由来のＰＧＫプロモーター支配下に
発現させるためのプラスミドｐＰ（：、ＡＣＹ２を構築
した。以下に各工程を説明する。

（１）ＡＣＹリンカ−の作成セファロスポリンＣ・アシラーゼ遺伝子の開始コドンを
アクレモニウム・クリソゲナムＰＧＫ遺伝子の開始コド
ンの位置に正確に一致させるため、第１図中に示す配列
を有するＡＣＹリンカ−を作成した。

作成の詳細は以下のとおりである。まず、次の配列を有
する４種類のオリゴヌクレオチド：■　ＣＧＣＧＴＣＧ
ＡＴＴＣＡＣＡＧＴＣＡＡＡＡＴＧＡＣＧＡＴ■　ＧＧ
ＣＧＧＣＣＡＡＧＡＣＣＧＡＴＣＧＣＧＡＧＧＣＣＣＴ
ＧＣＡ■　　ＧＣＣＧＣＣＡＴＣＧＴＣＡＴＴＴＴＧＡ
ＣＴＧＴＧＡＡＴＣＧＡ■　ＧＧＧＣＣＴＣＧＣＧＡＴ
ＣＧＧＴＣＴＴＧを自動ＤＮＡ合成機（アプライド・バ
イオシステム社のＤＮＡシンセサイザー・モデル３８０
Ａ）を用いて、常法どおり合成した。次いで、上記オリ
ゴヌクレオチド■および■の５′末端をＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼによりリン酸化した後、オリゴヌクレオ
チド■および■と混合しアニーリングせしめ、Ｔ４リガ
ーゼで連結することによりＡＣＹリンカ−を得た。

（２）　　ｐ　Ｐ　Ｇ　Ａ　ＣＹ　２の作製まず、ｐＡ
ＭＫ３をＳｍａ　Ｉで消化し、線状化した。そして、こ
れにＢａｍＨＩリンカ−をＴ４リガーゼにより連結した
後、ＰｓｔｌとＢａｍＨＩで同時に切断し、Ｎ端コード
域の一部を欠いた５Ｅ−８３株由来のセファロスポリン
Ｃ・アシラーゼ遺伝子を含有するＰｓ　ｔ　Ｉ−Ｂａｍ
ＨＩ断片（２，３Ｋｂ）を分離、精製した。一方、ｐＧ
Ｋｃｓ’をＭｌｕｌ、ＢｇｌＩＩで切断し、約４．８Ｋ
ｂのＤＮＡ断片を分離、精製した。ついで、これら２種
の断片と上記（Ｉ）により得たＡＣＹリンカ−とを、Ｔ
４リガーゼを用いて連結することにより、ｐＰＧＡＣＹ
２を得た。なお、本実施例で５Ｅ−８３由来のセファロ
スポリンＣ・アシラーゼ遺伝子の供給源として使用した
プラスミドｐＡＭＫ３の造成方法は、特開昭６１−１５
２２８６およびマツダらの文献（Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏ
ｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９８７）、　１６９．
５８１５−５８２０　）に記載されている。また、アク
レモニウム・クリソゲナム由来のＰＧＫプロモーターな
らびにターミネータ−の供給源として用いたプラスミド
ｐ　ＧＫＣ３°は、アクレモニウム・クリソゲナム由来
のＰＧＫプロモーターＰＧＫターミネータ−を含む断片
がユニーク制限酵素部位を介して発現に好適な配置でつ
ながった構造を有するプラスミドであり、その造成方法
は、特願平１−１６６５６６に記載されている。

上記実施例において制限酵素消化により生ずるＤＮＡ断
片の分離は、すべて１％アガロースゲル電気泳動により
行い、アガロースゲルからのＤＮＡ断片の単離精製は、
シーンクリーン（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ　７Ｍ、フナコシ
社販）を用いて、その添付プロトコールにしたがって行
った。また、ＤＮＡ断片の結合反応、該反応により生ず
るプラスミドを用いた大腸菌の形質転換、得られた形質
転換体からのプラスミドの調製およびその解析等の基本
操作は、すべてマニアティスの実験書に記載された方法
に準じて行った。

実施例２ｐＰＧＡＣＹ２によるアクレモニウム・クリソゲナムの
形質転換ｐＡＣＴＨＹ８３との同時形質転換により、ｐＰＧＡＣ
Ｙ２によるアクレモニウム・クリソゲナムの形質転換体
（セファロスポリンＣ・アシラーゼ産生能を獲得した新
規アクレモニウム・クリソゲナム）を取得した。以下に
その詳細を説明する。

なお、本実施例で使用したｐＡＣＴＨＹ８３は、アクレ
モニウム・クリソゲナム内で機能しうるハイグロマイシ
ンＢホスホトランスフェラーゼ発現単位（アクレモニウ
ム・クリソゲナム由来アクチン遺伝子のプロモーターお
よびターミネータ−ｔａｉ由来のハイグロマイシンＢホ
スホトランスフェラーゼ遺伝子が発現に好適な配置で結
合した発現単位）を有するアクレモニウム・クリソゲナ
ム形質転換用ベクターであり、その造成法は、特願平２
−１６６５６６に記載されている。

（１）　　プロトプラストの調製ＣＭ固形培地上で３０°Ｃ５日間生育させたアクレモニ
ウム・クリソゲナムｌ５−５の菌糸体を０Ｍ培地５０ｄ
に接種し、回転式振とう機（２５０ｒ、ｐ、ｍ）上、３
０°Ｃで３日間培養した。さらに、該菌液１ｄを５０−
の〇ＡＧ培地に接種して、３０°Ｃで２０時間培養した
。得られた培養液５０〆を３５０　Ｏｒ、ｐ、ｍで１０
分間遠心し、菌糸体を沈澱させた後、０．９％のＮａＣ
Ｉｌ溶液で洗浄し、０゜０１Ｍジチオスレイトールを含
んだマクイルベイン緩衝液（０，１Ｍクエン酸、０．２
Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７，３）２０ｄに懸濁し、３
０℃で１時間、おだやかに振とうした。次いで、菌糸体
を３２０　Ｏｒ、ｐ、ｗ　１０分間の遠心で沈澱させ、
Ｐ−バッファーで洗浄した後、ノポザイム（ＮｏｖＯ社
）を１０■／ｄの濃度で含有するＰ−バッファー１０ｄ
に懸濁し、３０℃で１時間おだやかに振とうした。該反
応液を８００ｒ、ｐ、ｍで３０秒間遠心して得た上清を
、濾紙（ＴＯＹＯＦＩＬＴＥＲＰＡＰＥＲ５Ａ）を用い
て濾過することにより、菌糸体とプロトプラストを分離
した。次いで、該濾液を３０ＱＱｒ、ｐ、Ｉｌｌで５分
間遠心し、プロトプラストを沈澱させた後、Ｐ−バッフ
ァーで１回洗浄し、プロトプラストが３Ｘ１０８個／蔽
の濃度となるようにＰ−バッファーに懸濁した。

（２）　　ｐ　ＰＧＡＣＹ２．ｐＡＣＴＨＹ８３による
プロトプラスト形質転換上記（１）で得たプロトプラスト懸濁液０．ｌｄにｐＰ
ＧＡＣＹ２とｐＡＣＴＨＹＢ３を５μｇずつ含む溶液１
０μｉを加えた後、０．０５ｄのＰＥＧ溶液を加え、か
るく混合した。該混合液を氷上に２５分間静置した後、
同上のＰＥＧ溶液をＩＭｉ加えて、室温でさらに３０分
間静置した。かくして得られた形質転換プロトプラスト
懸濁液を０゜２ｄずつ、プロトプラスト再生培地〔文献
（イソガイら：　Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ
、　１９８７．５１．２３２１−２３２９）に記載され
ているＢＲＭ培地〕を２５−含有するプレート上に広げ
、１５°Ｃで２０時間培養した。次いで、該プレートに
４．５■のハイグロマイシンＢを含み、５０°Ｃに保温
した同上のＢＲＭ培地５Ｉ１１を重層した後、２８℃で
１４日間培養した。その結果、ハイグロマイシンＢに耐
性となった形質転換体（以下、ＨＹＢ形質転換体と略す
）が７０株出現した。

（３）セファロスポリンＣ・アシラーゼ活性の検出上記（２）で得たＨＹＢ形質転換体より７株をランダム
に選択し、その各々をＣＭ培地５０ｄに接種し、３０″
Ｃで４日間振とう培養した（２２Ｏｒ、ｐ、層）。該培
養液１０ｍ１を遠心分離により集菌し、１耐のリン酸緩
衝液（ｐＨ８，Ｏ）に懸濁した後、超音波破砕機により
細胞を破砕した。該破砕液を遠心分離して得られる上清
を細胞粗抽出液とした。

該抽出１０．１ｍとセファロスポリンＣ３０ｍＭを含む
０．１ＭＩＪ７酸緩衝液（ｐＨ８，０）０゜１−を混合
し、３７゛Ｃで２０分間反応させた後、６７％酢酸水溶
液（ｐＨ２，０）０．０４戚を加えて反応を停止した。

該反応液を遠心分離して得られる上清を高速液体クロマ
トグラフィーに供し、反応生成物である７−ＡＣＡの検
出を行った。なお、高速液体クロマトグラフィー〇カラ
ムは、ユニシールパック（ｔｌＮＩｓＩＬ　ＰＡＣＫ）
　５　Ｃ１８−１０ＯＡ（ガスクロ工業社）を用い、移
動相としては５％酢酸アンモニウムと０．８％アセトニ
トリルからなる溶液を用いて、流速はｌｄ／分、さらに
、検出波長は２８０ｎｍで行った。その結果、調べた７
株中２株のＨＹＢ形質転換体に由来する細胞粗抽出液を
用いた反応液中に７−ＡＣＡが検出された。すなわち、
これら２株は、セファロスポリンＣ・アシラーゼ産生能
を獲得していることが明らかとなった。

実施例３ｐＭＡＣＹ２の構築第２．３．４図に示される工程にしたがって、アクレモ
ニウム・クリソゲナム由来ＰＧＫプロモーター、セファ
ロスポリンＣ・アシラーゼ遺伝子、アクレモニウム・ク
リソゲナム由来ＰＧＫターミネータ−からなるセファロ
スポリンＣ・アシラーゼ発現単位（以下、セファロスポ
リンＣ・アシラーゼ発現単位と略記する）が同一方向に
複数個挿入されたコスミドｐＭＡＣＹ２を構築した。以
下に、各工程を説明する。

（１）　　ｐ　Ｓ　Ｆ　Ｉ　−２の構築（第２図）まず
、ｐＵｃｌＢ（宝酒造社）をＥｃｏＲＩで切断し、生じ
た粘着末端をＤＮＡポリメラーゼクレノウ断片と４種の
デオキシヌクレオチド３リン酸を用いて平滑末端に変換
した。ついで、該断片と下記の配列からなるＳＦリンカ
−（ＤＮＡ合成機を用いて、常法どおり２本の一本鎖Ｄ
ＮＡとして合成した）とをＴ４リガーゼにより連結し、
ＰＳＦＩ−１を得た。

５”ＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＡＧＡＴＣＴＣＣＡ
ＴＧＧ３”３’　ＡＣＣＧＧＣＴＣＣＧＣＣＧＧＴＣＴ
ＡＧＡＧＧＴＡＣＣ５’なお、ｐｓＦＩ−１のマルチク
ローニング部位の塩基配列を常法にしたがって決定し、
上記ＳＦリンカ−の配列およびｐｓＦＩ−１における該
リンカ−の挿入方向が第２図に示すとおりであることな
どを確認した。かくして得たｐＳＦＩ−１のＨｉｎｃＩ
［部位に、同上のＳＦリンカ−を第２図に示す方向で挿
入することにより、ｐｓＦＩ−２を得た。挿入方向の確
認はｐｓＦＩ−１の場合と同様に行った。ｐＳＦＩ−２
は第２図に示すとおり同一の５ｆｉｌ部位の間に多数の
クローニング部位を有する構造をしており、同一方向に
のみ連結可能な断片を調製するのに有用なベクターであ
る。

（２）　　ｐ　Ｂ　Ｓ　Ｆ　Ａ　ＨＹ　８３およびｐＢ
ｓＦＰＫＭ５の構築（第３図）ダラム陰性細菌の広域宿主用コスミドベクターであるＰ
ＬＡＦＲ１（ＡＴＣＣ３７１６７）をＢｇｌＩＩで切断
し、ＣＯＳ部位を有する１、６Ｋｂの断片を分離精製し
た。該断片とＢｇｌｌＩで切断し、アルカリフォスファ
ターゼ処理を施したｐＳＦｌ−１＜上記（１）参照〉と
をＴ４リガーゼで連結することにより、ｐＢｓＦｌを得
た。次いで、ｐＡＣＴＨＹ８３をＨｉｎｄｌｌｌ、５ａ
ｃＩで切断し、３．５ＫｂのＨＹＢ発現単位断片（実施
例２参照）を分離精製し、該断片を上記ｐＢｓＦ１のＨ
ｉｎｄｌ［［−３ａ　ｃ　Ｉ間に挿入することにより、
ｐＢＳＦＡＨＹ８３を得た。また、ｐＰＧＫＭ５をＸｂ
ａｌ、５ａｃＩで切断し、３．８Ｋｂのネオマイシンホ
スホトランスフェラーゼ発現単位（アクレモニウム・ク
リソゲナム由来ＰＧＫ遺伝子のプロモーターおよびター
ミネータ−１細菌由来のネオマイシンホスホトランスフ
ェラーゼ遺伝子が発現に好適な配置で結合した発現単位
）断片を分離精製し、該断片をｐＢｓＦｌのＸｂａｌ−
３ａｃＩ間に挿入することにより、ｐＢＳＦＰＫＭ５を
得た。ｐＢＳＦＡＨＹ８３およびｐＢＳＦＰＫＭ５は、
上記ｐＳＦＩ−２を利用して調製される５ｆｉｌ断片を
同一方向に多数連結した状態でクローン化し、アクレモ
ニウム・クリソゲナム内に導入するのに適したコスミド
ベクターである。なお、本工程で使用したｐＰＧＫＭ５
の造成法は、特願平２−１６６５６６に開示されている
。上記工程において、制限酵素消化により生ずるＤＮＡ
断片の分離精製、ＤＮＡ断片間の結合反応、該反応によ
り生ずるプラスミドによる大腸菌の形質転換、得られた
形質転換体からのプラスミドの調製およびその解析等の
基本操作は、実施例１ならびにマニアティスの実験書に
記載された方法に準じて行った。

（３）　　ｐ　Ｍ　Ａ　ＣＹ　２およびｐＳＡＣＹ２の
構築（第４図）実施例１−（２）で得たｐＰＧＡＣＹ２を５ａｃｌ、Ｘ
ｂａ　Ｉで切断し、アガロースゲル電気泳動を行った後
、シーンクリーンを使用して４，８Ｋｂのセファロスポ
リンＣ・アシラーゼ発現単位断片を分離精製した。該断
片を上記（１）で得たｐＳＦ　Ｉ２の５ａｃｌ−Ｘｂａ
ｌ間に挿入することにより、ｐＰＧＡｃＹｓＦｌを得た
。次いで、該プラスミドｐ　ＰＧＡＣＹＳＦ　１を５ｆ
ｉｌで切断後、１％アガロースゲル電気泳動に供し、４
．８ＫｂのセファロスポリンＣ・アシラーゼ発現単位断
片を電気溶出法（マニアティスの実験書）により分離精
製した。一方、ベクターとして用いるｐＢＳＦＡＨＹ８
３は５ｆｉｌで切断した後、アルカリホスファターゼ処
理を施した。次いで、両者を高濃度でＴ４リガーゼにて
連結せしめ、λ−ファージ粒子内へ封入し、Ｅｃｏｌｉ
、ＨＢ　１０１　（ＡＴＣＣ３３６９４）に感染させた
。かくして得られた菌液を適当に希釈した後、アンピシ
リン（１００μｇ／ｄ）を含有するし一ブロス寒天培地
上に広げ、３７°Ｃで一夜培養し、コロニーを形成させ
た。ついで、該コロニーからランダムに１０個を選択し
、その各々より組換え体コスミドＤＮＡを抽出し、Ｐｓ
ｔｌならびにＢｓ’ｔＥＩＩ（Ｐｓｔ１部位はベクター
およびセファロスポリンＣ・アシラーゼ発現単位断片内
にそれぞれ一箇所ずつ存在し、ＢｓｔＥＩ［部位はベク
ターのみに一箇所存在している）で切断した後、アガロ
ースゲル電気泳動による解析を行った。その結果より、
ベクター１分子に多数のセファロスポリンＣ・アシラー
ゼ発現単位が挿入された組換え体コスミドを１個選択し
、これをｐＭＡＣＹ２と命名し、大量に精製した。

なお、上記の解析結果から、ｐＭＡＣＹ２には少なくと
も６コピ一以上のセファロスポリンＣ・アシラーゼ発現
単位が含まれていることが推定された。上記工程におい
て、コスミドベクターと供与体ＤＮＡの連結反応、該反
応により得られるＤＮＡのλ−ファージ粒子への封入お
よび大腸菌への感染、組換え体コスミドＤＮＡの調製、
解析等の基本操作は、サイトウらが記載した条件および
方法に準じて行った〔文献：実験医学（１９８９）　７
．８１８５〕。また、上記ベクターとセファロスポリン
Ｃ・アシラーゼ発現単位を通常の条件でＴ４リガーゼに
より連結し、該発現単位が一個挿入されたプラスミドｐ
ＳＡＣＹ２を得た。該プラスミドがセファロスポリンＣ
・アシラーゼ発現単位を１コピーしか所有していないこ
とは、ｐＭＡＣＹ２の場合と同様に、Ｐｓｔｌならびに
ＢｓｔＥＩＩによる消化で生ずる断片をアガロースゲル
電気泳動で解析することにより確認された。

実施例４ｐＭＡＣＹ２およびｐｓＡｃＹ２によるアクレモニウム
・クリソゲナムｌ５−５の形質転換（１）　　ｐ　Ｍ　
Ａ　ＣＹ　２およびｐ　５ＡＣＹ２の導入実施例２（１
）、（２）に記載の方法により、ｐＭＡＣＹ２をアクレ
モニウム・クリソゲナムＩ　Ｓ−５由来のプロトプラス
トに導入し、２２株のＨＹＢ形質転換体を得た。また、
ｐＳＡＣＹ２を用いて同上の操作を行い、５２株のＨＹ
Ｂ形質転換体を得た。

（２）セファロスポリンＣ・アシラーゼ活性の検出上記（１）で得たｐＭＡＣＹ２によるＨＹＢ形質転換体
より３株（Ｍｌ、Ｍ２．Ｍ３）、ｐＳＡＣＹ２によるＨ
ＹＢ形質転換体より２株（Ｓｌ、Ｓ２）を培養し、その
各々から細胞粗抽出液を調製した。また、親株であるア
クレモニウム・クリソゲナムｌ　Ｓ−５からも同様に細
胞抽出液を調製した。次いで、該抽出液とセファロスポ
リンＣを反応させ、生成する’１−ＡＣＡを高速液体ク
ロマトグラフィーにて定量することにより、セファロス
ポリンＣ・アシラーゼ活性を求めた。その結果、第１表
に示すとおり、ｐＭＡＣＹ２．ｐＳＡＣＹ２によるすべ
てのＨＹＢ形質転換体にセファロスポリンＣ・アシラー
ゼ活性が認められた。これに対して、非転換株であるア
クレモニウム・クリソゲナムｌ５−５には、まったく該
活性が検出されなかった。また、ｐＭＡＣＹ２によるＨ
ＹＢ形質転換体は、ｐＳＡＣＹ２による転換体の３〜６
倍高いセファロスポリンＣ・アシラーゼ活性を示した。

この結果は、動物細胞の系で開発されたマルコス法が、
糸状菌の１種であるアクレモニウム・クリソゲナムで所
望の遺伝子を高発現させる際にも有効な手段となるうる
ことを示唆している。なお、反応１分間にｌ　ｎｍｏｌ
ｅの７−ＡＣＡを生成する酵素量を１単位と定め、粗抽
出液中のタンパク１■当たりの単位数をセファロスポリ
ンＣ・アシラーゼ活性として第１表に表示した。

第　　１　　表上記工程において、菌の培養、細胞粗抽出液の調製、セ
ファロスポリンＣとの反応、高速液体クロマトグラフィ
ーによる反応生成物の分析等の操作は、実施例２−（３
）に記載した条件および方法に準して行った。

（３）　　７−Ａ　ＣＡの検出上記（１）、（２）により得たセファロスポリンＣ・ア
シラーゼ高生産株Ｍ３、ならびにその親株であるアクレ
モニウム・クリソゲナムｌ５−５をＮ３シード培地５０
Ｍ１に植菌し、２５°Ｃで３日間振とう培養した。得ら
れた培養液ＩＩＩＩｌをメイン培地３０戚を含む５００
ｄのフラスコに移し、２５°Ｃで６日間振とう培養した
。かくして得られた培養液を遠心分離して得た上清を２
０倍希釈した後、高速液体クロマトグラフィーに供し、
７−ＡＣＡの検出を行った。なお、高速液体クロマトグ
ラフィーは、実施例２−（３）と同様の条件で行った。

その結果、第５図（Ａ）に示すとおり、Ｍ３株の培養上
滑中に７−ＡＣＡが検出された。これに対してアクレモ
ニウム・クリソゲナムＩ　Ｓ−５の培養上清には、７−
ＡＣＡのピークは全（認められなかった。く第５図（Ｂ
）〉（発明の効果）実施例に開示したとおり、本発明のセファロスポリンＣ
・アシラーゼ発現単位を利用することにより、セファロ
スポリン系抗生物質の主要な中間原料である７−ＡＣＡ
を直接生産しうる新規微生物を創製することが初めて可
能となった。該新規微生物を使用することによって、工
業的に極めて有利な７−ＡＣＡ製造プロセスの開発が期
待できる。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＰＧＡｃＹ２の作製過程を示す工
程図、第２図はｐｓＦＩ−１およびｐｓＦｌ−２の作製
過程を示す工程図、第３図はアクレモニウム・クリソゲ
ナム導入用コスミドｐＢＳＦＡＨＹ８３およびｐＢＳＦ
ＰＫＭ５の作製過程を示す工程図、第４図はＰＳＡＣＹ
２およびｐＭＡＣＹ２の作製過程を示す工程図である。なお、これらのプラスミド上に存在するセファロスポリ
ンＣ・アシラーゼ発現単位は、　唖　　で示した。第１図〜第４図中で使用した略号は以下のとおりのもの
である。Ｂ、Ｂ：ＢａｍＨＩとＢｇｌＩ［の連結部位／Ｃｍ：ク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子
／Ａｍｐ：β−ラクタマーゼ遺伝子／ａｃｙｌＩ：５Ｅ
−８３由来のセファロスポリンＣ・アシラーゼ遺伝子／
ＰＧＫＰ　：アクレモニウム・クリソゲナム由来ＰＧＫ
遺伝子のプロモーター／Ｐ（１，ＫＴ：アクレモニウム
・クリソゲナム由来ＰＧＫ遺伝子のターミネータ−／Ａ
ＣＴＰ：アクレモニウム・クリソゲナム由来アクチン遺
伝子のプロモーター／ＡＣＴＴ：アクレモニウム・クリ
ソゲナム由来アクチン遺伝子のターミネータ−／Ｋｍ：
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子／ＨＹＢ
：ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子第５図（Ａ）は本発明により得られた新規アクレモニウ
ム・クリソゲナムの１種Ｍ３株の培養液の高速液体クロ
マトグラフィーによる分析のクロマトグラムを示す。第
５図（Ｂ）はアクレモニウム・クリソゲナムＩ　Ｓ−５
の培養液の同クロマトグラムを示す。（Ａ）禁５図

Claims

【特許請求の範囲】

（１）アクレモニウム・クリソゲナム内で作用するプロ
モーター、セファロスポリンＣ・アシラーゼ遺伝子、ア
クレモニウム・クリソゲナム内で作用するターミネータ
ーが発現に好適な配置で連結したセファロスポリンＣ・
アシラーゼ発現単位。
（２）請求項１記載のセファロスポリンＣ・アシラーゼ
発現単位が少なくとも１個、ベクターに挿入された組換
え体ＤＮＡ。
（３）請求項２記載の組換え体ＤＮＡで形質転換された
アクレモニウム・クリソゲナム。
（４）請求項３記載の新規アクレモニウム・クリソゲナ
ムを培養し、７−アミノセファロスポラン酸を直接発酵
せしめ、培養液からこれを採取することを特徴とする７
−アミノセファロスポラン酸の製造方法。