CN113249348B

CN113249348B - 羰基还原酶、其基因、含有该基因的重组表达转化体及其应用

Info

Publication number: CN113249348B
Application number: CN202110544278.5A
Authority: CN
Inventors: 白云鹏; 钱源益; 张晓彦
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2021-05-19
Filing date: 2021-05-19
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2041-05-19
Also published as: CN113249348A

Abstract

本发明涉及羰基还原酶、其基因、含有该基因的重组表达转化体及其应用，具体包括来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的羰基还原酶，其基因、含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及利用该重组羰基还原酶或重组表达转化体作为催化剂催化(S)‑叔丁基(4‑氯‑3‑羰基‑1‑苯丁基‑2‑基)氨基甲酸酯的不对称还原，制备手性叔丁基((2S,3R)‑4‑氯‑3‑羟基‑1‑苯丁基‑2‑基)氨基甲酸酯的方法。与现有技术相比，本发明使用羰基还原酶催化制备手性叔丁基((2S,3R)‑4‑氯‑3‑羟基‑1‑苯丁基‑2‑基)氨基甲酸酯，具有工艺简单、产品光学纯度高和环境友好的显著优势，有很好的工业应用前景。

Description

羰基还原酶、其基因、含有该基因的重组表达转化体及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的羰基还原酶，其基因、含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及利用该重组羰基还原酶或重组表达转化体作为催化剂催化(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯的不对称还原，制备手性叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯的方法。

背景技术

阿扎那韦是蛋白酶抑制剂(PI)类的抗逆转录病毒药物，像其他抗逆转录病毒一样，它可以用于治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)的感染。该药物是国际抗病毒协会-美国专家小组推荐的用于治疗成人HIV感染的常用抗HIV药物，它被认为是一种有效的每日服用一次的药物，治疗两种不同类型的患者都有功效。其中阿扎那韦的中间体是叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯，这是一个带两个手性中心的化合物，环化后用于生产阿扎那韦。阿扎那韦的化学合成路线如图1所示。

1997年，Chen等人描述了从受保护的氨基酸酯制备α-N-BOC-环氧化物的实用方法。该方法可以容易地大规模进行并且无需使用危险试剂，并且可以制备千克级别的α-N-BOC-环氧化物。该反应步骤中，其中间产物氯醇是通过氨基酸酯的两步化学法合成的，反应条件比较苛刻，在-78℃条件下进行(Tetrahedron Lett,1997,38(18):3175-3178)。2009年，Alanvert等人介绍了一种使用羰基还原酶生物催化还原α-卤代酮为相应的α-卤代醇的方法，并且其立体选择性较高。10g规模制备叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯，反应21h，反应的转化率大于98.5％，de(2S,3R)＞98.5％(Tetrahedron-Asymmetry,2009,20(21):2462-2466)。2019年，Wu等人对来自Novosphingobiumaromaticivorans的短链脱氢酶NaSDR进行了研究，其对底物氯酮表现出优异的立体选择性，但活性相对较低。于是对NaSDR活性口袋上的位点进行迭代饱和诱变(ISM)，获得突变体muSDR(G141A/I195L)的催化效率显著提高，其对底物氯酮的k_cat增加到4.11s^-1，是WT(1.15s^-1)的3.57倍。制备实验反应总体积500mL，底物氯酮浓度为150g/L，反应20h后，成功催化还原获得产物氯醇，de(2S,3R)>99％，重结晶后产物的纯度为99.5％，产率为85.3％(获得氯醇64.6g)(Appl Microbiol Biotechnol,2019,103(11):4417-4427)。

综上所述，叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯可以通过生物催化方法获得，催化效率高，非对映选择性优异。因此，寻找一种高效的羰基还原酶对合成叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯有重要的意义。

发明内容

针对目前生物法制备光学活性手性叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯缺乏更多催化活性高、选择性强的羰基还原酶的现状，本发明提供一种来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的羰基还原酶，其基因、含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及利用该重组羰基还原酶或重组表达转化体作为催化剂催化(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯的不对称还原，制备手性叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明的技术方案之一：提供一种羰基还原酶，其是如下(a)或(b)的蛋白质：

蛋白质(a)：由SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；

蛋白质(b)：SEQ ID No.2所示氨基酸序列中经过取代、缺失或添加几个氨基酸且可以催化(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯不对称还原制备光学活性叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯的由(a)衍生的蛋白质。

进一步地，本发明所述羰基还原酶来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，记为S288C，该酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S288C保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.22135，保藏时间为2021年04月06日，保藏地点为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明还提供所述羰基还原酶的获得方法：

通过对自然界微生物以及实验室保藏微生物菌株的大规模筛选，发现酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S288C可以催化(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯还原生成相应的叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯。通过鸟枪法克隆获得了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S288C中催化相应反应的羰基还原酶，命名为羰基还原酶OdCR1，该酶是NADPH依赖型的。所述羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明中提及的鸟枪法克隆采用本领域常规的生物技术手段即可实现。

本发明所述羰基还原酶具有以下性能：可以催化(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯不对称还原制备光学活性叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯的羰基还原酶。

本发明的技术方案之二：提供一种分离的核酸，所述核酸编码所述羰基还原酶。

在本发明的一个实施方式中，提供羰基还原酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，全长为771个核苷酸碱基。其编码序列(CDS)从第1个碱基起至第771个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，无内含子。该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

本发明还提供所述羰基还原酶OdCR1的编码DNA的来源包括：通过基因克隆技术获得所述羰基还原酶OdCR1的编码DNA，或者通过人工全序列合成的方法得到所述羰基还原酶的编码DNA。

在本发明的一个实施方式中，本发明所述羰基还原酶基因来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S288C。其编码所述羰基还原酶基因的具体制备方法包括：以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S288C的基因组DNA为模板，采用本领域常规技术方法(如聚合酶链式反应，PCR)，获得编码所述羰基还原酶OdCR1的完整DNA序列。

其中涉及的合成引物，优选的如SEQ ID No.3(上游引物)和SEQ ID No.4(下游引物)所示：

上游引物：5’-CGCGAATTC ATGAACACCAGCAGCCGT-3’，下划线所示序列为限制性内切酶EcoR I的酶切位点；

下游引物：5’-CCC AAGCTT TTAGAAAACGCCTTCGCT-3’，下划线所示序列为限制性内切酶Hind III的酶切位点。

本发明的技术方案之三：提供包含所述羰基还原酶基因核酸序列的重组表达载体。所述重组表达载体可通过本领域常规方法将所述羰基还原酶基因克隆到各种表达载体上构建而成。

所述的表达载体较佳的包括本领域常规的各种质粒载体，优选的为pET28a质粒。

较佳的，可通过下述方法制得本发明所述的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的羰基还原酶OdCR1的基因序列DNA片段用限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切，同时将空载质粒pET28a用限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切，回收上述酶切后的羰基还原酶OdCR1的基因DNA片段以及pET28a质粒，利用T₄ DNA连接酶连接，构建获得包含所述羰基还原酶OdCR1基因的重组表达载体pET28a-OdCR1。

本发明的技术方案之四：提供包含所述羰基还原酶OdCR1重组表达载体的重组表达转化体。

所述重组表达转化体可通过将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。

在本发明的一些实施方式中，所述宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，并且其所携带的羰基还原酶OdCR1的基因可被有效表达即可。

在本发明的一些实施方式中，所述宿主细胞优选为大肠杆菌，更优选的为：大肠杆菌E.coli BL21(DE3)或大肠杆菌E.coli DH5α。

将所述重组表达载体转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，即可获得本发明优选的基因工程菌株。例如，将重组表达载体pET28a-OdCR1转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-OdCR1。

本发明的技术方案之五：提供一种羰基还原酶催化剂，选自以下形式中的任意一种：

(1)培养所述的重组表达转化体，分离含有所述羰基还原酶的转化体细胞；

(2)培养所述的重组表达转化体，分离含有所述羰基还原酶的转化体细胞，对含有所述羰基还原酶的转化体细胞进行破碎，获得的细胞破碎液；

(3)培养所述的重组表达转化体，分离含有所述羰基还原酶的转化体细胞，对含有所述羰基还原酶的转化体细胞进行破碎，获得的细胞破碎液，将所述羰基还原酶的细胞破碎液经冷冻干燥而得到的冻干酶粉；

(4)所述羰基还原酶OdCR1。

本发明还提供所述羰基还原酶催化剂的制备方法。

本发明所述羰基还原酶OdCR1的制备方法较佳地为：培养如上所述的重组表达转化体，分离获得重组表达的羰基还原酶OdCR1。其中所述重组表达转化体培养所用的培养基为本领域任何可使转化体生长并产生本发明的重组羰基还原酶的培养基。所述培养基优选LB培养基，其配方为：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主细胞类型和培养方法等因素的不同，按本领域常规知识进行适当的选择，只要使转化体能够生长并生产所述羰基还原酶OdCR1即可。重组表达转化体培养的具体操作可按本领域常规操作进行。优选的，将本发明所述的重组大肠杆菌，例如E.coli BL21(DE3)/pET28a-OdCR1，接种至含卡那霉素的LB培养基中，37℃培养，当培养液的光密度OD₆₀₀达到0.5～1.0(优选0.6)时，加入终浓度为0.1～1.0mmol/L(优选0.5mmol/L)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行产酶诱导，在16℃继续培养24h，即可高效表达本发明所述的羰基还原酶OdCR1。培养结束后，离心收集沉淀的菌体细胞，即为重组表达转化体的静息细胞；将收获的细胞悬浮于PBS缓冲液(100mM,pH 6.0)中，超声破碎，破碎液离心，收集上清液，即可获得所述重组羰基还原酶OdCR1的粗酶液；将离心收获的细胞沉淀冷冻干燥，可以获得冻干细胞，有利于长期存放，方便以后使用。

羰基还原酶OdCR1的活性测定：将含2mmol/L(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯和0.1mmol/L NADPH的1ml反应体系(100mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 6.0)预热至30℃，然后加入适量的羰基还原酶OdCR1，混合均匀，30℃保温反应，在分光光度计上检测340nm处NADPH的吸光度变化，记录一定时间内吸光度的变化值。

根据下式计算得到酶活力：

酶活力(U)＝EW×V×10³/(6220×l)

式中，EW为1分钟内340nm处吸光度的变化；V为反应液的体积，单位为ml；6220为NADPH的摩尔消光系数，单位为L/(mol·cm)；l为光程距离，单位为cm。1个酶活力单位(U)对应于上述条件下每分钟氧化1μmol NADPH所需的酶量。

本发明的技术方案之六：提供所述羰基还原酶催化剂在合成不对称还原(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯中的应用。

进一步地，提供所述羰基还原酶催化剂在催化(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯的不对称还原，制备手性叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯中的应用。

其中所述(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯的化学结构如下所示：

在本发明的一个实施方式中，所述(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯的不对称还原，可按下述示例性方法进行：

在pH 5.5-7.5的磷酸盐缓冲液中，在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NADP⁺的存在下，在所述羰基还原酶催化剂的作用下，催化所述(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯的不对称还原反应。

所述应用中，底物在反应液中的浓度可以为0.1～10mmol/L。

根据所采用的反应体系，所述羰基还原酶的用量可以为1～500U/L。酶促(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯不对称还原时，辅酶NADPH氧化生成NADP⁺，为了进行辅酶NADPH的循环再生，向反应体系中额外添加葡萄糖和来自巨大芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶(J Ind Microb Biotechnol,2011,38:633–641)。取决于不同的反应体系，葡萄糖脱氢酶的活力单位上载可以与所述羰基还原酶相等。葡萄糖与底物的摩尔比可以为1.0～1.5，额外添加的NADP⁺的用量可以为0～1.0mmol/L。所述缓冲液可以是本领域常规的任何缓冲液，只要其pH范围在5.0～10.0即可，比如柠檬酸钠、磷酸钠、磷酸钾、Tris-HCl或者甘氨酸-NaOH缓冲液，优选pH范围为6.0～7.0，更优选pH 6.0。磷酸盐缓冲液的浓度可以为0.05～0.2mol/L。所述的酶促不对称还原反应的温度可以是25～40℃，优选30℃。反应过程中，间歇取样测定反应转化率，反应时间以底物完全转化或反应转化率停止增长的时间为准，一般为1～24小时。

反应转化率和产物对映体过量值(ee)可采用液相色谱法进行分析，优选的，使用C18色谱柱(4.6mm×250mm)进行转化率和ee值分析，流动相为乙腈和磷酸溶液(0.1％)，比例7:3。检测器紫外波长为210nm，柱温恒定为40℃。

酶促反应结束后，反应液冷却至室温，用等量本领域常规的水不溶性有机溶剂，如乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、异丙醚、甲基叔丁基醚等进行萃取，重复萃取两次，合并萃取液，用饱和食盐水洗涤，加入无水硫酸钠干燥过夜。旋转蒸发除去溶剂，即可获得相应光学活性叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯粗产品。

与现有技术相比，本发明的积极进步效果在于：本发明提供的羰基还原酶OdCR1，可立体选择性催化(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯的不对称还原，生成相应的光学活性叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯，反应条件温和，转化率高，产品光学纯度好，ee值可高于98.3％，具有很好的工业应用前景。

附图说明

图1：阿扎那韦的化学合成路线。

具体实施方式

发明内容中所述的各反应或检测条件，可根据本领域常识进行组合或更改，并可通过实验得到验证。下面通过实施例的方式进一步说明本发明，应当理解，所列实施例虽然列举了本发明优选的实施方式，但所列具体实施例仅是为了更好地阐明本发明而给出，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之内。

下列实施例中的材料来源为：

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，记为S288C，该酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)S288C保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.22135，保藏时间为2021年04月06日，保藏地点为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

载体pUC118和限制性内切酶Sau3AI购于宝生物工程(大连)有限公司。

表达质粒pET28a购自Novagen公司。

E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)感受态细胞、2×Taq PCR MasterMix、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。

限制性内切酶EcoR I和Hind III均为New England Biolabs(NEB)公司的市售产品。

除非另有说明，下列实施例中的具体实验按照本领域常规方法和条件进行，或遵照试剂盒的商品说明书。

实施例1羰基还原酶OdCR1的基因克隆

采用高盐法获取完整的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S288C的基因组。将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S288C接种到酵母膏胨葡萄糖(YPD)琼脂培养基中，37℃培养24h，取100ml菌液，8,000rpm离心10min，收集菌体，用20ml生理盐水洗涤，重复两次，然后用20ml生理盐水重悬菌体。悬浮菌液中加入1ml溶菌酶液(50mg/ml)，37℃水浴恒温1h；加入1.6ml的十二烷基硫酸钠溶液(SDS，10％，w/v)，160μl蛋白酶K(20mg/ml)，55℃水浴保温，直到悬浮液变清。然后加入三分之一体积的饱和NaCl溶液，振荡混匀至溶液浑浊，然后高速离心10min，弃去细胞碎片。用等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)反复萃取，直到两相界面上看不到蛋白质时停止。吸取萃取之后的水相清液，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀后置于-20℃，低温析出DNA，离心弃去上清，用75％的乙醇洗涤沉淀DNA，室温干燥，最后加入20μL的TE缓冲液(100mM Tris-HCl,10mM EDTA,pH 8.0)将基因组DNA溶解。

使用限制性内切酶Sau3AI对基因组DNA进行酶切，对酶切片段进行电泳分离，收集2～6kb的DNA片段。将空载质粒pUC 118用限制性内切酶Bam HI酶切，碱性磷酸酶去磷酸化。使用T₄连接酶将回收的DNA片段与酶切的质粒pUC118片段进行连接，两者的浓度比为3:1，16℃过夜连接。将连接产物全部转化到大肠杆菌DH5α中，涂布含有100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基平板，37℃培养12h。用无菌牙签将所有的单克隆分别挑至96孔深孔板的孔洞中，每个孔洞中装有300μL含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基。37℃振荡培养12h，取50μL培养液转接至600μL含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基，37℃振荡培养3h后加入终浓度为0.2mmol/L的异丙醇硫代半乳糖苷(IPTG)，16℃诱导24h。3500×g离心10min，弃去培养基，放入-80℃冰箱冷冻2h。从冰箱中拿出深孔板，待菌液融化后，每个孔洞中加入200μL溶菌酶液(750mg溶菌酶和10mg DNA酶溶解于1L去离子水中)，振荡混匀，37℃静置1h。4℃、3500×g离心10min，分别取50μL破碎离心上清液转移到新的96孔板中，加入150μL反应液(100mM KPB，pH 7.0，含有1mM(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯以及0.2mM NADPH)，随后加入50μL酶液，30℃震荡混匀，在酶标仪上读取340nm处吸光度值的减少。对吸光度值显著下降的克隆子进行活性复筛，将其接种到4ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养2h，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG，16℃培养24h，8000×g离心10min，弃上清，加入500μl的KPB缓冲液(100mM，pH 7.0)重悬菌液，然后加入底物(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯至终浓度为10mM，葡萄糖脱氢酶1U，葡萄糖25mg，NADP⁺终浓度1mM，30℃，1,100rpm的条件下反应24h。反应结束后离心去除细胞，反应液酸化后用等体积的乙酸乙酯进行萃取。萃取液用无水硫酸钠干燥12h，GC检测有没有产物生成。有产物的克隆为阳性克隆子，委托上海桑尼生物技术有限公司进行序列测定，根据开放阅读框，获得如SEQ ID No.1所示的核酸序列，根据该核酸序列所推测的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，将该序列表达的羰基还原酶命名为OdCR1。

实施例2羰基还原酶OdCR1的基因克隆

根据羰基还原酶OdCR1的开放阅读框，设计上、下游引物，以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S288C的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。

设计的上、下游引物如下：

上游引物SEQ ID No.3：

5’-CGC GAATTC ATGAACACCAGCAGCCGT-3’；

下游引物SEQ ID No.4：

5’-CCC AAGCTT TTAGAAAACGCCTTCGCT-3’；

其中，上游引物下划线部分为限制性内切酶EcoR I的酶切位点，下游引物下划线部分为限制性内切酶Hind III的酶切位点。

PCR体系为：2×Taq PCR MasterMix 25μl，上游引物和下游引物(10ng/μl)各2.5μl，1μl酿酒酵(Saccharomyces cerevisiae)S288C的基因组DNA(100ng/μl)，以及19μl的ddH₂O。PCR扩增程序为：95℃预变性5分钟后进行32次如下循环：94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸1分钟；循环结束后，最后再72℃延伸10分钟。PCR扩增产物进行凝胶电泳纯化后，用DNA回收试剂盒回收目的片段。经过DNA测序，该序列编码的开放阅读框全长771bp，其碱基序列如SEQ ID No.1所示。

实施例3羰基还原酶OdCR1重组表达质粒和重组表达转化体的制备

将实施例2中PCR扩增所得的羰基还原酶目的DNA片段以及pET28a空质粒同时用限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切过夜，然后经琼脂糖凝胶电泳纯化、DNA试剂盒回收。将回收的酶切目的片段和空载体在T₄ DNA连接酶的作用下，于16℃连接12小时，得到重组质粒pET28a-OdCR1。

将所得重组质粒转化至E.coli DH5α，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基平板上，37℃培养8小时，对长出来的菌落进行菌落PCR验证，挑取成功扩增出长度约735bp的目的条带的阳性克隆。经测序验证后，提取相应的质粒，进一步转化至E.coli BL21(DE3)，挑取阳性克隆，即获得重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/pET28a-OdCR1。

实施例4羰基还原酶OdCR1的诱导表达

将实施例2中所得的重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/pET28a-OdCR1，接种至含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃摇床振荡培养12小时，之后按1％(v/v)的接种量接种至装有100ml的LB培养基(含50μg/ml卡那霉素)的500ml三角烧瓶中，放入摇床中，37℃、180rpm振荡培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.6时，加入IPTG至终浓度0.2mmol/L进行诱导，16℃诱导24小时后，将培养液以8000rpm转速离心，收集细胞沉淀，并用生理盐水洗涤，得到静息细胞，将其冷冻干燥，制得冻干细胞。

将0.5g如上方法所得的静息细胞悬浮于15ml的磷酸钠缓冲液(100mM，pH6.0)中，冰水浴中进行超声破碎，离心收集上清液，即为重组羰基还原酶OdCR1的粗酶液，其体积活力为1.749U/mL。所得粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，重组羰基还原酶OdCR1以可溶的形式存在。将获得的重组羰基还原酶OdCR1的粗酶液进行镍柱纯化，制得重组羰基还原酶OdCR1的纯酶，比活力为23U/mg protein。

实施例5 pH对羰基还原酶OdCR1催化活性的影响

在pH 5.5～10的范围内按标准方法测定pH对重组羰基还原酶OdCR1活性的影响。缓冲液分别为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(5.5～6.0)，磷酸钠缓冲液(6.0～8.0)，甘氨酸-NaOH缓冲液(8.5～10.0)。

在1ml上述缓冲液体系中，加入(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯和NADPH至终浓度分别为0.4mmol/L和0.1mmol/L，预热至30℃，然后加入适量的羰基还原酶，混合均匀，30℃保温反应，在分光光度计上检测340nm处NADPH的吸光度变化，测定不同pH的缓冲溶液中，羰基还原酶OdCR1的活性差异，结果如表1所示。优选酶促反应的pH范围为6.0～7.0，更优选pH 6.0。

表1 pH对OdCR1催化(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯不对称还原活性的影响

实施例6温度对羰基还原酶OdCR1催化活性的影响

在1ml磷酸钠缓冲液(100mM,pH 6.0)体系中，加入(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯和NADPH至终浓度分别为0.4mmol/L和0.1mmol/L，在25～50℃环境中预热2min，然后加入适量的羰基还原酶，混合均匀，在与预热温度相同的温度环境中保温反应，在分光光度计上检测340nm处NADPH的吸光度变化，测定不同温度条件下，羰基还原酶OdCR1的活性差异，结果如表2所示。优选酶促反应的温度范围为25～40℃。

表2温度对OdCR1不对称催化还原的影响

实施例7重组羰基还原酶OdCR1催化(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯合成手性叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯

将15mL如实施例4所述的OdCR1粗酶液和3U的葡萄糖脱氢酶冻干酶粉加入50ml磷酸钠缓冲液(100mmol/L,pH 6.0)中，加入(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯、葡萄糖和NADP⁺至终浓度分别为10mmol/L、15mmol/L和0.2mmol/L。30℃、250rpm机械搅拌反应。转化24小时，使用液相色谱测得底物转化率为>90％，ee值高于98.3％。

反应结束后，使用2倍体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取有机相使用无水硫酸钠干燥过夜，过滤，旋转蒸发去除溶剂，浓缩得到固体产物。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 羰基还原酶、其基因、含有该基因的重组表达转化体及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 771

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 1

atgaacacca gcagccgtat cacctacttc atcattggcg gtagccgtgg tatcggcttc 60

aacctggtga agattctgag cgcgagcacc ggtaacaccg ttatcaccag cattcgtggt 120

agcccgagcc tgccgaaaaa caagcaggtg gaagacctgg cgaaaatccg taagaacatt 180

cacatcgtgc agctggatct gaccaaggac gaaagcatcg gtaacatcgc ggatgagatc 240

aaaaagaccc cgtttttcct gggtatcgac attttcatcg cgtgcagcgc ggttagcgac 300

agctattaca aggttctgga gaccccgaaa agcgtttggc tgaaccacta cagcaccaac 360

gcgctgggcc cgattctggc gctgcaaaag gtgtacccgc tgctgctgct gaagaaaacc 420

cgtaagatct ttttcattag cagcgttgcg ggtagcatta acgcgttcgt tccgctgagc 480

gttagcgcgt atggtcagag caaagcggcg ctgaactacg cggttaaaac cctgagcttt 540

gagctgaaac cggagggttt taccgtggtt gcgtttcacc cgggtatggt tagcaccgac 600

atgggtcaat acggtctgga ccacttcaaa gaaaagaaca tcgacattag cggtgttaac 660

atcattaccc cggaagagag cgcgagcgcg ctgatcgacg ttttccgtaa gatcctgccg 720

gaggataacg gcaagttttt caactacgat ggtagcgaag gcgttttcta a 771

<210> 2

<211> 256

<212> PRT

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 2

Met Asn Thr Ser Ser Arg Ile Thr Tyr Phe Ile Ile Gly Gly Ser Arg

1 5 10 15

Gly Ile Gly Phe Asn Leu Val Lys Ile Leu Ser Ala Ser Thr Gly Asn

20 25 30

Thr Val Ile Thr Ser Ile Arg Gly Ser Pro Ser Leu Pro Lys Asn Lys

35 40 45

Gln Val Glu Asp Leu Ala Lys Ile Arg Lys Asn Ile His Ile Val Gln

50 55 60

Leu Asp Leu Thr Lys Asp Glu Ser Ile Gly Asn Ile Ala Asp Glu Ile

65 70 75 80

Lys Lys Thr Pro Phe Phe Leu Gly Ile Asp Ile Phe Ile Ala Cys Ser

85 90 95

Ala Val Ser Asp Ser Tyr Tyr Lys Val Leu Glu Thr Pro Lys Ser Val

100 105 110

Trp Leu Asn His Tyr Ser Thr Asn Ala Leu Gly Pro Ile Leu Ala Leu

115 120 125

Gln Lys Val Tyr Pro Leu Leu Leu Leu Lys Lys Thr Arg Lys Ile Phe

130 135 140

Phe Ile Ser Ser Val Ala Gly Ser Ile Asn Ala Phe Val Pro Leu Ser

145 150 155 160

Val Ser Ala Tyr Gly Gln Ser Lys Ala Ala Leu Asn Tyr Ala Val Lys

165 170 175

Thr Leu Ser Phe Glu Leu Lys Pro Glu Gly Phe Thr Val Val Ala Phe

180 185 190

His Pro Gly Met Val Ser Thr Asp Met Gly Gln Tyr Gly Leu Asp His

195 200 205

Phe Lys Glu Lys Asn Ile Asp Ile Ser Gly Val Asn Ile Ile Thr Pro

210 215 220

Glu Glu Ser Ala Ser Ala Leu Ile Asp Val Phe Arg Lys Ile Leu Pro

225 230 235 240

Glu Asp Asn Gly Lys Phe Phe Asn Tyr Asp Gly Ser Glu Gly Val Phe

245 250 255

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcgaattca tgaacaccag cagccgt 27

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccaagcttt tagaaaacgc cttcgct 27

Claims

1.一种来源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的羰基还原酶在催化(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯的不对称还原，制备手性叔丁基((2S,3R)-4-氯-3-羟基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯中的应用，其特征在于，所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.22135，保藏时间为2021年04月06日，保藏地点为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

所述羰基还原酶是由SEQ ID No. 2所示氨基酸序列组成的蛋白质；

在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NADP⁺的存在下，在所述羰基还原酶催化剂的作用下，催化所述(S)-叔丁基(4-氯-3-羰基-1-苯丁基-2-基)氨基甲酸酯的不对称还原反应；

反应条件为：在pH 5.5-7.5的条件下进行反应，反应温度为25~40°C，底物在反应液中的浓度为0.1~10 mmol/L，所述羰基还原酶催化剂中羰基还原酶的用量为1~500 U/L，葡萄糖与底物的摩尔比为1.0 ~ 1.5，额外添加的NADP⁺的用量为0 ~ 1.0 mmol/L。