CN112626144B - 一种替诺福韦中间体(r)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的生物合成方法 - Google Patents

一种替诺福韦中间体(r)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的生物合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程与酶工程技术领域，尤其是一种替诺福韦中间体(R)‑9‑(2‑羟丙基)腺嘌呤的生物合成方法，以重组的羰基还原酶为催化剂，所述羰基还原酶基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，在NADP+、辅酶循环酶、缓冲液存在的条件下，催化化合物II还原成目的产物化合物I(R)‑9‑(2‑羟丙基)腺嘌呤，合成路线如下：

Description

一种替诺福韦中间体(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的生物合成 方法
技术领域
本发明涉及基因工程与酶工程技术领域，具体领域为(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的生物合成方法。
背景技术
替诺福韦酯(商品名：韦瑞德)是吉利德公司非常成功的明星产品，(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤是生产替诺福韦酯的关键中间体。替诺福韦酯，全称替诺福韦二吡呋酯富马酸盐，属于新型核苷酸类逆转录酶抑制剂，由吉利德(Gilead)公司开发并于2001年在美国上市，国内市场由葛兰素史克独家销售，主要用于治疗艾滋病(HIV)和慢性乙型肝炎(HBV)。
Figure GDA0002951496950000011
以下为替诺福韦酯(商品名：韦瑞德)的分子结构式：
Figure GDA0002951496950000012
目前，(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的制备主要为化学法制备。如：
CN101574356公开了以R-乳酸乙酯为原料，五步反应制备(R)-(+)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤，其路线如下：
Figure GDA0002951496950000021
该路线较长，且中间体需过柱纯化，收率低，不利于工业化生产。
CN103374038A公开了以腺嘌呤与(R)-环氧丙烷为原料，碱催化下制备(R)-(+)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤，其路线如下：
Figure GDA0002951496950000022
该路线中原料(R)-环氧丙烷价格昂贵，反应收率较低，只有69％。
CN101279987A公开了以(R)-1,2-丙二醇和三光气为起始原料制备(R)-碳酸-1,2-丙二酯，再与腺嘌呤反应得(R)-(+)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤，其路线如下：
Figure GDA0002951496950000023
该法收率较低，总收率35％，且剧毒三光气，不安全，不利于工业化生产。
可以看出，上述化学法制备手性中间体条件苛刻，有机溶剂使用量大，对环境不友好。
Nelo R.Rivera等人(Tetrahedron Letters.2016,57,1090–1092)报道了以Ketone 5为原料，利用羰基还原酶KRED选择性还原，制备(R)-(+)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤，其路线如下：
Figure GDA0002951496950000031
该路线有较好的立体选择性，但底物Ketone 5水溶解度差，加助溶剂效果也不佳，导致溶剂用量大，产能低，也不利于工业化生产。
因此，找到一种适用于工业化生产、对环境友好的(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤生产方法成为了该领域亟需解决的问题之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种替诺福韦中间体(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的生物合成方法，该方法通过羰基还原酶的异源表达，作为生物催化剂用于催化化合物I还原，制备替诺福韦重要的手性中间体(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种替诺福韦中间体(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的生物合成方法，以重组的羰基还原酶为催化剂，所述羰基还原酶基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，在NADP+、辅酶循环酶、缓冲液存在的条件下，催化化合物II还原成目的产物化合物I(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤，合成路线如下：
Figure GDA0002951496950000032
其中，所述辅酶循环酶为异丙醇脱氢酶；所述缓冲液为0.1M pH6.0-7.0PB缓冲体系。
其中，化合物II与羰基还原酶冻干粉质量比为1：1-10；化合物II与辅酶循环酶质量比为1：0.5-10；化合物II与NADP+质量比为1：0.0001-0.01；化合物II与PB缓冲液的比例为1g：10-100mL。
其中，反应温度为25-35℃，反应时长为20-72h，反应摇床转速为200-280rpm。
其中，所述羰基还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
其中，所述羰基还原酶的生产方法具体为，将羰基还原酶重组菌株种子液按照1-5％的接种量转接于LB培养基中，37℃培养至OD600＝0.6时，加入50μl 0.5mol/L的IPTG，18℃过夜诱导，即获得羰基还原酶发酵液。
其中，所述羰基还原酶重组菌株以pET-28a质粒为载体，表达羰基还原酶基因；所述羰基还原酶基因编号为TAA。
即，所述羰基还原酶基因连接到pET-28a质粒的EcoR I和Hind III位点，然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。
其中，所述羰基还原酶重组菌株的构建方法具体为，设计羰基还原酶基因TAA的上下游引物F、引物R，如SEQ ID NO：3-4所示；
以pUC57-TAA为模板，PCR扩增含有EcoR I和Hind III酶切位点的TAA基因；PCR条件为：98℃3min，98℃30s，56℃90s、72℃90s，30个循环；PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，灭菌的双蒸水20.5μL，PrimerSTAR Mix 25μL；
采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度；EcoRI，Hind III酶切胶回收产物及pET-28a质粒，胶回收试剂盒对酶切后的胶回收产物进行纯化和回收，胶回收试剂盒对酶切后质粒进行纯化回收，电泳检验回收产物的浓度；目的基因TAA与载体pET-28a连接，连接体系：目的基因4μL，载体pET-28a 2μL，Buffer 2μL，连接酶1μL，16℃过夜连接；将构建好的载体通过化转技术导入E.coli BL21(DE3)中，涂布在含卡那霉素的LB平板中，放入37℃培养箱中过夜，将长出来的单菌落进行质粒提取和测序，最终获得含该羰基还原酶基因的重组工程菌。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过基因工程技术构建了羰基还原酶重组菌株，并实现了异源表达，生产的羰基还原酶可以用于(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤生物催化合成。
本发明的合成路线获得了高ee值的产物获得，ee值大于99％，其底物转化率>90％，催化效率为1；可以替代现有的化学法进行(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的高效清洁生产。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1羰基还原酶重组菌株的构建
设计羰基还原酶基因(TAA)的上下游引物F、R(如表1所示)，以全基因合成构建的pUC57-TAA为模板，通过PCR的方式扩增含有EcoR I和Hind III酶切位点的TAA基因。PCR条件为：98℃3min，98℃30s，55℃90s、72℃90s，30个循环。PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，灭菌的双蒸水20.5μL，PrimerSTAR Mix 25μL。采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。EcoR I，Hind III酶切胶回收产物(目的基因TAA)及pET-28a质粒(表达载体)，胶回收试剂盒对酶切后的胶回收产物进行纯化和回收，胶回收试剂盒对酶切后质粒进行纯化回收，电泳检验回收产物的浓度。目的基因TAA与载体pET-28a连接，连接体系：目的基因4μL，载体pET-28a 2μL，Buffer 2μL，连接酶1μL，16℃过夜连接。将构建好的载体通过化转技术导入E.coli BL21(DE3)中，涂布在含卡那霉素的LB平板中，放入37℃培养箱中过夜，将长出来的单菌落进行质粒提取和测序，最终获得含该羰基还原酶基因的重组工程菌。
其中，羰基还原酶基因的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，羰基还原酶基因的核苷酸序列是SEQ ID NO：2。
LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L，pH 7.0。
表1引物
引物名称 序列 编号
F GG<u>AATTC</u>ATGGTCGGCACTACTAC SEQ ID NO：3
R CCC<u>AAGCTT</u>CTACTTGATCTTCACGGCGTTC SEQ ID NO：4
实施例2重组菌发酵生产(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤
(1)制备羰基还原酶冻干粉制备
将实施例1构建的重组菌接种于5mL的LB培养基中，37℃震荡培养过夜，次日按照1％的接种量转接于LB培养基中，37℃培养至OD600＝0.6时，加入50μl 0.5mol/L的IPTG，18℃诱导14h，离心收集菌体，生理盐水洗涤后，冻干获得羰基还原酶冻干粉。
(2)重组菌发酵生产(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤：
A.磷酸缓冲盐配置，依据配方称取磷酸盐如下(g/100mL)：Na2HPO4·12H2O 0.88，NaH2PO4·2H2O 2.74；
B.配制100mg/mL NADP+辅酶母液：称取100mg NADP+，采用纯净水溶解并定容至1mL，-20℃储存待用；
C.菌液前处理：取5g上述冻干酶粉，3g异丙醇脱氢酶粉加入A中制备的磷酸盐缓冲液50mL，再加入30mL甘油；
D.称取底物：称取5g底物化合物II，投反应前待用。
反应步骤：将C和D所准备好的含甘油菌液和5g底物化合物II加入250mL规格三角瓶，摇匀。随后，加入200μL 100mg/mL NADP+辅酶母液(反应体系终浓度0.2mg/mL)和3mLIPA(异丙醇)。最后，用纯净水使反应体系定容至100mL，摇匀。将该100mL反应体系置于35℃、200rpm摇床反应。
Figure GDA0002951496950000071
反应过程监测与补加IPA，每隔12h补加1mL IPA(底物0.5倍当量)，同时，取样监测反应，取10μL反应液，加入200μL乙酸乙酯萃取、离心，取上清进行TLC检测，TLC展板条件为二氯甲烷：甲醇：冰乙酸＝10:1:0.1。在反应72h后，TLC检测发现底物点消失后，乙酸乙酯萃取产物进行HPLC分析鉴定，经分析底物转化率为90.3％，ee值99.7％，催化率为1，得到产物化合物I 4.5g。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 江苏阿尔法药业有限公司
<120> 一种替诺福韦中间体(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的生物合成方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 323
<212> PRT
<213> 羰基还原酶氨基酸序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Val Gly Thr Thr Thr Leu Asn Thr Gly Ala Ser Leu Glu Leu Val
1 5 10 15
Gly Tyr Gly Thr Trp Gln Ala Ala Pro Gly Glu Val Gly Gln Gly Val
20 25 30
Lys Val Ala Ile Glu Thr Gly Tyr Arg His Leu Asp Leu Ala Lys Val
35 40 45
Tyr Ser Asn Gln Pro Glu Val Gly Ala Ala Ile Lys Glu Ala Gly Val
50 55 60
Lys Arg Glu Asp Leu Phe Ile Thr Ser Lys Leu Trp Asn Asn Ser His
65 70 75 80
Arg Pro Glu Gln Val Glu Pro Ala Leu Asp Asp Thr Leu Lys Glu Leu
85 90 95
Gly Leu Glu Tyr Leu Asp Leu Tyr Leu Ile His Trp Pro Val Ala Phe
100 105 110
Pro Pro Glu Gly Asp Ile Thr Gln Asn Leu Phe Pro Lys Ala Asn Asp
115 120 125
Lys Glu Val Lys Leu Asp Leu Glu Val Ser Leu Val Asp Thr Trp Lys
130 135 140
Ala Met Val Lys Leu Leu Asp Thr Gly Lys Val Lys Ala Ile Gly Val
145 150 155 160
Ser Asn Phe Asp Ala Lys Met Val Asp Ala Ile Ile Glu Ala Thr Gly
165 170 175
Val Thr Pro Ser Val Asn Gln Ile Glu Arg His Pro Leu Leu Leu Gln
180 185 190
Pro Glu Leu Ile Ala His His Lys Ala Lys Asn Ile His Ile Thr Ala
195 200 205
Tyr Ser Pro Leu Gly Asn Asn Thr Val Gly Ala Pro Leu Leu Val Gln
210 215 220
His Pro Glu Ile Lys Arg Ile Ala Glu Lys Asn Gly Cys Thr Pro Ala
225 230 235 240
Gln Val Leu Ile Ala Trp Ala Ile Val Gly Gly His Ser Val Ile Pro
245 250 255
Lys Ser Val Thr Pro Ser Arg Ile Gly Glu Asn Phe Lys Gln Val Ser
260 265 270
Leu Ser Gln Glu Asp Val Asp Ala Val Ser Lys Leu Gly Glu Gly Ser
275 280 285
Gly Arg Arg Arg Tyr Asn Ile Pro Cys Thr Tyr Ser Pro Lys Trp Asp
290 295 300
Ile Asn Val Phe Gly Glu Glu Asp Glu Lys Ser Cys Lys Asn Ala Val
305 310 315 320
Lys Ile Lys
<210> 2
<211> 972
<212> DNA
<213> 羰基还原酶核苷酸序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggtcggca ctactaccct caacactggc gcttccctcg agctcgtcgg ctacggcacg 60
tggcaggcag caccgggcga ggtgggccag ggcgtcaagg tcgccatcga gactggatac 120
cgtcacctcg accttgccaa ggtctactcg aaccaacctg aggttggtgc cgccatcaag 180
gaggctggcg tcaagcgcga ggacctcttc atcacctcga agctctggaa caactcgcac 240
cgcccggagc aggtcgagcc tgcccttgac gacaccctca aggagctcgg cctcgagtac 300
ctcgaccttt acctcattca ctggcccgtc gcgttcccgc ccgagggcga catcacccag 360
aacctcttcc cgaaggccaa cgacaaggag gtcaagctcg acctggaggt cagcctcgtc 420
gacacgtgga aggcgatggt caagcttctc gacactggca aggtcaaggc gatcggcgtt 480
tccaacttcg acgcgaagat ggtcgacgcc atcatcgagg ctaccggcgt gaccccctcc 540
gtcaaccaga tcgagcgtca ccctctcctt ctccagcccg agctcatcgc ccaccacaag 600
gccaagaaca ttcacattac cgcatactct cctctcggta acaacaccgt cggcgcgcct 660
cttcttgtcc agcacccgga gatcaagcgc atcgccgaga agaacggctg cacgcccgct 720
caggtcctca ttgcctgggc catcgttggc ggccactcgg ttatccccaa gtcggtcacc 780
ccctcccgca ttggcgagaa cttcaagcag gtctcgctct cgcaggagga cgtcgatgcc 840
gtcagcaagc tcggcgaggg ttcgggccgc aggcgctaca acatcccctg cacgtactcg 900
cccaagtggg acatcaacgt ctttggcgag gaggacgaga agtcgtgcaa gaacgccgtg 960
aagatcaagt ag 972
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物F(Artificial Sequence)
<400> 3
ggaattcatg gtcggcacta ctac 24
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 引物R(Artificial Sequence)
<400> 4
cccaagcttc tacttgatct tcacggcgtt c 31

Claims (6)

1.一种替诺福韦中间体(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的生物合成方法，其特征在于：以重组的羰基还原酶为催化剂，所述羰基还原酶基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，在NADP+、辅酶循环酶、缓冲液存在的条件下，催化化合物II还原成目的产物化合物I(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤，合成路线如下：
Figure FDA0003902107280000011
所述辅酶循环酶为异丙醇脱氢酶；所述缓冲液为0.1M pH6.0-7.0PB缓冲体系；
反应温度为25-35℃，反应时长为20-72h，反应摇床转速为200-280rpm；
化合物II与羰基还原酶冻干粉质量比为1：1-10；化合物II与辅酶循环酶质量比为1：0.5-10；化合物II与NADP+质量比为1：0.0001-0.01；化合物II与PB缓冲液的比例为1g：10-100mL。
2.根据权利要求1所述的替诺福韦中间体(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的生物合成方法，其特征在于：所述羰基还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.根据权利要求2所述的替诺福韦中间体(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的生物合成方法，其特征在于：所述羰基还原酶的生产方法具体为，将羰基还原酶重组菌株种子液按照1-5％的接种量转接于LB培养基中，37℃培养至OD600＝0.6时，加入50μl 0.5mol/L的IPTG，18℃过夜诱导，即获得羰基还原酶发酵液。
4.根据权利要求3所述的替诺福韦中间体(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的生物合成方法，其特征在于：所述羰基还原酶重组菌株以pET-28a质粒为载体，表达羰基还原酶基因；所述羰基还原酶基因编号为TAA。
5.根据权利要求4所述的替诺福韦中间体(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的生物合成方法，其特征在于：所述羰基还原酶基因连接到pET-28a质粒的EcoR I和Hind III位点，然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。
6.根据权利要求5所述的替诺福韦中间体(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的生物合成方法，其特征在于：所述羰基还原酶重组菌株的构建方法具体为，设计羰基还原酶基因TAA的上下游引物F、引物R，如SEQ ID NO：3-4所示；
以pUC57-TAA为模板，PCR扩增含有EcoR I和Hind III酶切位点的TAA基因；PCR条件为：98℃3min，98℃30s，56℃90s、72℃90s，30个循环；PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，灭菌的双蒸水20.5μL，PrimerSTAR Mix 25μL；
采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度；EcoR I，Hind III酶切胶回收产物及pET-28a质粒，胶回收试剂盒对酶切后的胶回收产物进行纯化和回收，胶回收试剂盒对酶切后质粒进行纯化回收，电泳检验回收产物的浓度；目的基因TAA与载体pET-28a连接，连接体系：目的基因4μL，载体pET-28a 2μL，Buffer 2μL，连接酶1μL，16℃过夜连接；将构建好的载体通过化转技术导入E.coliBL21(DE3)中，涂布在含卡那霉素的LB平板中，放入37℃培养箱中过夜，将长出来的单菌落进行质粒提取和测序，最终获得含该羰基还原酶基因的重组工程菌。
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