CN112410276B - 一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株及构建方法和应用 - Google Patents

一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株及构建方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112410276B
CN112410276B CN202011364791.8A CN202011364791A CN112410276B CN 112410276 B CN112410276 B CN 112410276B CN 202011364791 A CN202011364791 A CN 202011364791A CN 112410276 B CN112410276 B CN 112410276B
Authority
CN
China
Prior art keywords
difluorophenyl
chloro
ethanone
reductase
recombinant strain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011364791.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112410276A (zh
Inventor
石利平
叶金星
陈本顺
何伟
徐春涛
程瑞华
孙伟振
仲召亮
张维冰
何义
尹斌
陆梦云
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Alpha Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Jiangsu Alpha Pharmaceutical Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Alpha Pharmaceutical Co ltd filed Critical Jiangsu Alpha Pharmaceutical Co ltd
Priority to CN202011364791.8A priority Critical patent/CN112410276B/zh
Publication of CN112410276A publication Critical patent/CN112410276A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112410276B publication Critical patent/CN112410276B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及基因工程与酶工程技术领域，尤其是一种2‑氯‑1‑(3,4‑二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株及构建方法和应用，所述重组菌株以pET‑30a质粒为载体，表达2‑氯‑1‑(3,4‑二氟苯基)乙酮还原酶基因；所述2‑氯‑1‑(3,4‑二氟苯基)乙酮还原酶基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明在大肠杆菌中实现了重组表达，手性选择ee值可达100％，可以替代现有的化学法进行(S)‑2‑氯‑1‑(3,4‑二氟苯基)乙醇的高效清洁生产。

Description

一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株及构建方 法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程与酶工程技术领域，具体领域为一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株的构建及其应用。
背景技术
替格瑞洛是一种由英国的阿斯利康公司所研发的新型的具有选择性的小分子抗凝血药，它是属于环戊基三唑嘧啶类口服抗血小板药物，是一种选择性二磷酸腺苷受体拮抗剂，作用于P2Y12ADP受体来抑制ADP介导的血小板活化和聚集，该药于2011年7月被美国FDA批准上市，2012年11月获准在中国上市。其中，(1R,2S)-2-(3,4二氟苯基)环丙胺是制备替格瑞洛的关键中间体。
目前文献报道的(1R，2S)-2-(3,4二氟苯基)环丙胺的主要合成方法如下：
WO2008018822A公开了以邻二氟苯和氯乙酰氯为原料经傅克反应、不对称还原、环化、环丙烷化，氨解和霍夫曼降解得到(1R，2S)-2-(3,4_二氟苯基)环丙胺，其合成路线如下：
Figure BDA0002805100970000011
在上述合成路线中，化合物VII制备化合物VI采用化学方法进行不对称还原，存在手性选择性差、光学纯度差、操作繁琐、生产成本高且污染严重等问题。
CN107686447A和CN106906249A均提及了一种替格瑞洛中间体(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的酶催化制备方法，但酶活较低，有机溶剂使用量大。且CN107686447的酶催化反应需要葡糖的添加，增加了废水处理量，且真菌发酵产酶的生产成本要高于常规的E.coli菌株。
因此，目前仍亟需一种经济有效的(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的生物制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株及构建方法和应用，通过基因工程技术筛选高效催化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原的还原酶基因并实现异源功能性表达，获得高效催化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮生成重要的药物中间体(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的生物催化剂。
Figure BDA0002805100970000021
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株，以pET-30a质粒为载体，表达2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因；所述2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
将2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因连接到pET-30a质粒的BamH I和XhoI位点，然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。
一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株的构建方法：
全合成2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因TGC DNA序列，保存于pUC57质粒中，设计2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因的上下游引物P1(GCGGGATCCATGGCTAAAAACTTCTCTAACGTTGA)、P2(CCGCTCGAGTTACGGCAGGGTGTAACCA)，如SEQ ID NO：3-4所示；以pUC57为模板，PCR扩增含有BamH I和XhoI酶切位点的TGC基因；PCR条件为：98℃3min，98℃30s，55℃90s、72℃90s，35个循环；PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，灭菌的双蒸水20.5μL，PrimerSTAR Mix 25μL；
采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度；BamH I和XhoI酶切胶回收产物及pET-30a质粒，胶回收试剂盒对酶切后的胶回收产物进行纯化和回收，胶回收试剂盒对酶切后质粒进行纯化回收，电泳检验回收产物的浓度；目的基因与载体pET-30a连接，连接体系：目的基因4μL，载体pET-30a 2μL，Buffer 2μL，连接酶1μL，16℃过夜连接；将构建好的载体通过化转技术导入E.coli BL21(DE3)中，涂布在含卡那霉素的LB平板中，放入37℃培养箱中过夜，将长出来的单菌落进行质粒提取和测序，最终获得含该羰基还原酶基因的重组工程菌。
采用本发明所述的2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株发酵生产2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶：将2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株种子液按照2％的接种量转接于LB培养基中，37℃培养至OD600＝0.6时，加入50μl 0.5mol/L的IPTG，18℃诱导14h，即2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶发酵液。
本发明所述2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株及其生产得到的2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶在催化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮生成(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过基因工程技术，制备了一种全新的2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶并构建了2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株，并实现了异源表达，手性选择ee值可达100％，可以替代现有的化学法进行(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的高效清洁生产。并且，同现有的羰基还原酶催化方法相比，本发明方法切实有效，酶催化活性高，对环境友好。
附图说明
图1为pET30a-TGC-K01质粒结构图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株的构建
设计2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因的上下游引物P1、P2(如表1所示)，以全基因合成构建的pUC57-TGC为模板，通过PCR的方式扩增含有BamH I和XhoI酶切位点的TGC基因。PCR条件为：98℃3min，98℃30s，55℃90s、72℃90s，35个循环。PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，灭菌的双蒸水20.5μL，PrimerSTAR Mix25μL。采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。BamHI和XhoI酶酶切胶回收产物及pET-30a质粒(表达载体)，胶回收试剂盒对酶切后的胶回收产物进行纯化和回收，胶回收试剂盒对酶切后质粒进行纯化回收，电泳检验回收产物的浓度。目的基因TGC与载体pET-30a连接，连接体系：目的基因4μL，载体pET-28a 2μL，Buffer 2μL，连接酶1μL，16℃过夜连接。如图1所示。将构建好的载体通过化转技术导入E.coli BL21(DE3)中，涂布在含卡那霉素的LB平板中，放入37℃培养箱中过夜，将长出来的单菌落进行质粒提取和测序，最终获得含该羰基还原酶基因的重组工程菌。
其中，2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因的核苷酸序列是SEQ ID NO：2。
LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10 g/L，pH 7.0。
表1引物
引物名称 序列 编号
P1 <u>GCGGGATCC</u>ATGGCTAAAAACTTCTCTAACGTTGA SEQ ID NO：3
P2 <u>CCGCTCGAG</u>TTACGGCAGGGTGTAACCA SEQ ID NO：4
实施例2重组菌发酵产酶制备(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇
(1)制备2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶发酵液
将实施例1构建的重组菌接种于10mL的LB培养基中，37℃震荡培养过夜，按照2％的接种量转接于LB培养基中，37℃培养至OD600＝0.6时，加入50μl0.5mol/L的IPTG，18℃诱导16h，离心收集菌体，磷酸盐缓冲液(0.1M)洗后重悬，进行超声波破碎，功率260W运行3s，间隔5s，总时长3min，获得粗酶液。
(2)酶催化制备(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇
分别称取0.219g的NaH2PO4·2H2O和0.786g的Na2HPO4·12H2O于250mL三角瓶中，加入18mL水溶解，再加入0.26g的吐温80，混匀。再分别加入10mL的步骤(1)制备的粗酶液和10mL的异丙醇脱氢酶，以及10mg的NADP+，混匀。另称取1g的化合物于5mL离心管中，加入4mL的异丙醇溶解后再缓慢加入三角瓶中，30℃，220rpm，摇床催化反应。
反应3h，底物完全转化。催化率约为2.5。加入等体积乙酸乙酯萃取2次，取上层乙酸乙酯相。30℃减压浓缩后称重1.15g，手性纯度100％，化学纯度：92.08％，转化率：96％。
表2物料表
Figure BDA0002805100970000051
Figure BDA0002805100970000061
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 江苏阿尔法药业有限公司
<120> 一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株及构建方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 283
<212> PRT
<213> 2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Lys Asn Phe Ser Asn Val Glu Tyr Pro Ala Pro Pro Pro Ala
1 5 10 15
His Thr Lys Asn Glu Ser Leu Gln Val Leu Asp Leu Phe Lys Leu Asn
20 25 30
Gly Lys Val Ala Ser Ile Thr Gly Ser Ser Ser Gly Tyr Gly Tyr Ala
35 40 45
Leu Ala Glu Ala Phe Ala Gln Val Gly Ala Asp Val Ala Ile Trp Tyr
50 55 60
Asn Ser His Asp Ala Thr Gly Lys Ala Glu Ala Leu Ala Lys Lys Tyr
65 70 75 80
Gly Val Lys Val Lys Ala Tyr Lys Ala Asn Val Ser Ser Ser Asp Ala
85 90 95
Val Lys Gln Thr Ile Glu Gln Gln Ile Lys Asp Phe Gly His Leu Asp
100 105 110
Ile Val Val Ala Asn Ala Gly Ile Pro Trp Thr Lys Gly Ala Tyr Ile
115 120 125
Asp Gln Asp Asp Asp Lys His Phe Asp Gln Val Val Asp Val Asp Leu
130 135 140
Lys Gly Val Gly Tyr Val Ala Lys His Ala Gly Arg His Phe Arg Glu
145 150 155 160
Arg Phe Glu Lys Glu Gly Lys Lys Gly Ala Leu Val Phe Met Ala Thr
165 170 175
Met Ser Gly His Ile Val Asn Val Pro Gln Phe Gln Ala Thr Tyr Asn
180 185 190
Ala Ala Lys Ala Gly Val Arg His Phe Ala Lys Ser Leu Ala Val Glu
195 200 205
Phe Ala Pro Phe Ala Arg Val Asn Ser Val Ser Met Gly Tyr Ile Asn
210 215 220
Thr Glu Ile Ser Asp Phe Val Pro Gln Glu Thr Gln Asn Lys Trp Trp
225 230 235 240
Ser Leu Val Pro Leu Gly Arg Gly Gly Glu Thr Ala Glu Leu Val Gly
245 250 255
Ala Tyr Leu Phe Leu Ala Ser Asp Ala Gly Ser Tyr Ala Thr Gly Thr
260 265 270
Asp Ile Ile Val Asp Gly Gly Tyr Thr Leu Pro
275 280
<210> 2
<211> 852
<212> DNA
<213> 2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶(Artificial Sequence)
<400> 2
atggctaaaa acttctctaa cgttgaatac ccggctccgc cgccggctca caccaaaaac 60
gaatctctgc aggttctgga cctgttcaaa ctgaacggta aagttgcttc tatcaccggt 120
tcttcttctg gttacggtta cgctctggct gaagcgttcg ctcaggttgg tgctgacgtt 180
gctatctggt acaactctca cgacgctacc ggtaaagctg aagctctggc taaaaaatac 240
ggtgttaaag ttaaagcgta caaagctaac gtttcttctt ctgacgctgt taaacagacc 300
atcgaacagc agatcaaaga cttcggtcac ctggacatcg ttgttgctaa cgctggtatc 360
ccgtggacca aaggtgctta catcgaccag gacgacgaca aacacttcga ccaggttgtt 420
gacgttgacc tgaaaggtgt tggttacgtt gctaaacacg ctggtcgtca cttccgtgag 480
aggttcgaaa aagaaggcaa aaaaggtgct ctggttttca tggctaccat gtctggtcac 540
atcgttaacg ttccgcagtt ccaggctacc tacaacgctg ctaaagctgg tgttcgtcac 600
ttcgctaaat ctctggctgt tgaatttgct ccgttcgctc gtgttaactc tgtttctatg 660
ggctacatca acaccgaaat ctctgacttc gttccgcagg aaacccagaa caaatggtgg 720
tctctggttc cgctgggtcg tggtggtgaa accgctgaac tggttggtgc ttacctgttc 780
ctggcttctg acgctggttc ttacgctacc ggtaccgaca tcatcgttga cggtggttac 840
accctgccgt aa 852
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> P1(Artificial Sequence)
<400> 3
gcgggatcca tggctaaaaa cttctctaac gttga 35
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> P2(Artificial Sequence)
<400> 4
ccgctcgagt tacggcaggg tgtaacca 28

Claims (5)

1.一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株，其特征在于：所述重组菌株以pET-30a质粒为载体，表达2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因；所述2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因连接到pET-30a质粒的BamH I和XhoI位点，然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。
2.根据权利要求1所述的2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株，其特征在于：所述2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.权利要求1或2所述的2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株的构建方法，其特征在于：设计2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因的上下游引物P1、P2，如SEQ IDNO：3-4所示；将pET-30a质粒BamH I和XhoI双酶切处理后，电泳检验回收；将目的基因与载体pET-30a连接，连接体系：目的基因4 μL，载体pET-30a 2 μL，Buffer 2 μL，连接酶1 μL，16℃过夜连接；将构建好的载体通过转化技术导入E. coli BL21(DE3)中，涂布在含卡那霉素的LB平板中，放入37 ℃培养箱中过夜，将长出来的单菌落进行质粒提取和测序，最终获得含2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因的重组工程菌。
4.采用权利要求1或2所述的2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株发酵生产2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶的方法。
5.根据权利要求4所述的生产2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶的方法，其特征在于：将2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株种子液按照2%的接种量转接于LB培养基中，37℃培养至OD600=0.6时，加入50 μl 0.5 mol/L的IPTG，18 ℃诱导14 h，得到2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶发酵液。
CN202011364791.8A 2020-11-27 2020-11-27 一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株及构建方法和应用 Active CN112410276B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011364791.8A CN112410276B (zh) 2020-11-27 2020-11-27 一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株及构建方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011364791.8A CN112410276B (zh) 2020-11-27 2020-11-27 一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株及构建方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112410276A CN112410276A (zh) 2021-02-26
CN112410276B true CN112410276B (zh) 2023-03-21

Family

ID=74842868

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011364791.8A Active CN112410276B (zh) 2020-11-27 2020-11-27 一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株及构建方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112410276B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112941115A (zh) * 2021-03-30 2021-06-11 宿迁盛基医药科技有限公司 一种替格瑞洛手性中间体的制备方法
CN113502302A (zh) * 2021-07-30 2021-10-15 江西科苑生物股份有限公司 一种（s）-2-氯-1-（3，4-二氟苯基）乙醇的生物合成方法
WO2023142153A1 (zh) * 2022-01-31 2023-08-03 山东寰酶生物制药有限公司 一种羰基还原酶及其应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005017135A1 (en) * 2003-08-11 2005-02-24 Codexis, Inc. Improved ketoreductase polypeptides and related polynucleotides
CN106520849A (zh) * 2015-09-11 2017-03-22 杭州酶易生物技术有限公司 一种制备手性2-氯-3,4-二氟苯乙醇的方法
CN109112166A (zh) * 2017-06-26 2019-01-01 上海弈柯莱生物医药科技有限公司 酶法制备替卡格雷中间体
CN109295020A (zh) * 2018-10-31 2019-02-01 安徽联创生物医药股份有限公司 酮还原酶及其在合成(1s)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇中的应用
CN109423484A (zh) * 2017-09-04 2019-03-05 尚科生物医药（上海）有限公司 一种酮还原酶及其在制备（s）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇上的应用
CN110016467A (zh) * 2016-07-18 2019-07-16 中国科学院成都生物研究所 羰基还原酶ChKRED20突变体及其用途
CN111763662A (zh) * 2019-11-29 2020-10-13 上海京新生物医药有限公司 酮还原酶及其在替格瑞洛中间体合成中的应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005017135A1 (en) * 2003-08-11 2005-02-24 Codexis, Inc. Improved ketoreductase polypeptides and related polynucleotides
CN106520849A (zh) * 2015-09-11 2017-03-22 杭州酶易生物技术有限公司 一种制备手性2-氯-3,4-二氟苯乙醇的方法
CN110016467A (zh) * 2016-07-18 2019-07-16 中国科学院成都生物研究所 羰基还原酶ChKRED20突变体及其用途
CN109112166A (zh) * 2017-06-26 2019-01-01 上海弈柯莱生物医药科技有限公司 酶法制备替卡格雷中间体
CN109423484A (zh) * 2017-09-04 2019-03-05 尚科生物医药（上海）有限公司 一种酮还原酶及其在制备（s）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇上的应用
CN109295020A (zh) * 2018-10-31 2019-02-01 安徽联创生物医药股份有限公司 酮还原酶及其在合成(1s)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇中的应用
CN111763662A (zh) * 2019-11-29 2020-10-13 上海京新生物医药有限公司 酮还原酶及其在替格瑞洛中间体合成中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112410276A (zh) 2021-02-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112410276B (zh) 一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株及构建方法和应用
CN106884025B (zh) 一种酶法水解定向制备褐藻胶寡糖的方法
CN109055292B (zh) 一种生产l-木糖的重组变形假单胞菌及其应用
CN109706191A (zh) 一种托莫西汀中间体的酶催化合成方法
CN104152506A (zh) 醛酮还原酶的重组菌粗酶体系催化合成(s)-n,n-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺的方法
CN106520715B (zh) 一种短链脱氢酶及其基因、重组表达载体、基因工程菌及其在虾青素手性中间体合成中的应用
CN110964708A (zh) 一种枯草芽孢杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体及其应用
CN110577940B (zh) 马克斯克鲁维酵母醛酮还原酶KmAKR突变体及其应用
CN108359626A (zh) 一种工程菌及其在制备（r）-3-羟基-5-己烯酸酯中的应用
CN109679978B (zh) 一种用于制备l-2-氨基丁酸的重组共表达体系及其应用
CN111378694A (zh) 一种利用羰基还原酶制备达泊西汀中间体的方法
CN101469318B (zh) (r)-羰基还原酶与甲酸脱氢酶偶联促进(r)-苯基乙二醇的合成
CN112626144B (zh) 一种替诺福韦中间体(r)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的生物合成方法
CN107828752B (zh) 一种蔗糖淀粉酶、制备方法及在生产α-熊果苷中的应用
CN104830744A (zh) 利用sd-as序列偶联(r)-羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶制备(r)-苯乙二醇的方法
CN107201375B (zh) 生产(r,r)-2,3-丁二醇基因工程菌株的构建方法及其应用
CN112645952B (zh) 一种(r)-(+)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的合成方法
CN109943542A (zh) 一种用于阿扎那韦中间体生产的醇脱氢酶
CN112143692B (zh) 一种洛伐他丁酯水解酶重组菌株及构建方法和应用
CN113355366A (zh) 一种多酶级联制备2-苯乙醇的方法
CN105671098A (zh) 一种发酵法生产l-2-氨基丁酸的方法
CN116731988B (zh) 全合成酮还原酶及应用该酮还原酶的制备方法
CN111635893A (zh) 一种酮还原酶及其在达芦那韦中间体生产中的应用
CN114410563B (zh) 大肠杆菌的高密度培养及在催化生产槲皮素中的应用
CN113897322B (zh) 一种3-甲基-4-硝基苯甲酸的工程菌及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: 223800 No.5 Yanshan Road, eco Chemical Technology Industrial Park, Suqian City, Jiangsu Province

Applicant after: Jiangsu alpha Pharmaceutical Co.,Ltd.

Address before: 223800 No.5 Yanshan Road, eco Chemical Technology Industrial Park, Suqian City, Jiangsu Province

Applicant before: JIANGSU ALPHA PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

CB02 Change of applicant information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant