CN112410276B - 一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株及构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程与酶工程技术领域,尤其是一种2‑氯‑1‑(3,4‑二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株及构建方法和应用,所述重组菌株以pET‑30a质粒为载体,表达2‑氯‑1‑(3,4‑二氟苯基)乙酮还原酶基因;所述2‑氯‑1‑(3,4‑二氟苯基)乙酮还原酶基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明在大肠杆菌中实现了重组表达,手性选择ee值可达100%,可以替代现有的化学法进行(S)‑2‑氯‑1‑(3,4‑二氟苯基)乙醇的高效清洁生产。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程与酶工程技术领域,具体领域为一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株的构建及其应用。
背景技术
替格瑞洛是一种由英国的阿斯利康公司所研发的新型的具有选择性的小分子抗凝血药,它是属于环戊基三唑嘧啶类口服抗血小板药物,是一种选择性二磷酸腺苷受体拮抗剂,作用于P2Y12ADP受体来抑制ADP介导的血小板活化和聚集,该药于2011年7月被美国FDA批准上市,2012年11月获准在中国上市。其中,(1R,2S)-2-(3,4二氟苯基)环丙胺是制备替格瑞洛的关键中间体。
目前文献报道的(1R,2S)-2-(3,4二氟苯基)环丙胺的主要合成方法如下:
WO2008018822A公开了以邻二氟苯和氯乙酰氯为原料经傅克反应、不对称还原、环化、环丙烷化,氨解和霍夫曼降解得到(1R,2S)-2-(3,4_二氟苯基)环丙胺,其合成路线如下:
在上述合成路线中,化合物VII制备化合物VI采用化学方法进行不对称还原,存在手性选择性差、光学纯度差、操作繁琐、生产成本高且污染严重等问题。
CN107686447A和CN106906249A均提及了一种替格瑞洛中间体(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的酶催化制备方法,但酶活较低,有机溶剂使用量大。且CN107686447的酶催化反应需要葡糖的添加,增加了废水处理量,且真菌发酵产酶的生产成本要高于常规的E.coli菌株。
因此,目前仍亟需一种经济有效的(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的生物制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株及构建方法和应用,通过基因工程技术筛选高效催化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原的还原酶基因并实现异源功能性表达,获得高效催化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮生成重要的药物中间体(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的生物催化剂。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株,以pET-30a质粒为载体,表达2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因;所述2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
将2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因连接到pET-30a质粒的BamH I和XhoI位点,然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。
一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株的构建方法:
全合成2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因TGC DNA序列,保存于pUC57质粒中,设计2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因的上下游引物P1(GCGGGATCCATGGCTAAAAACTTCTCTAACGTTGA)、P2(CCGCTCGAGTTACGGCAGGGTGTAACCA),如SEQ ID NO:3-4所示;以pUC57为模板,PCR扩增含有BamH I和XhoI酶切位点的TGC基因;PCR条件为:98℃3min,98℃30s,55℃90s、72℃90s,35个循环;PCR扩增体系:模板1.5μL,上下游引物各1.5μL,灭菌的双蒸水20.5μL,PrimerSTAR Mix 25μL;
采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收,电泳检验回收产物的浓度;BamH I和XhoI酶切胶回收产物及pET-30a质粒,胶回收试剂盒对酶切后的胶回收产物进行纯化和回收,胶回收试剂盒对酶切后质粒进行纯化回收,电泳检验回收产物的浓度;目的基因与载体pET-30a连接,连接体系:目的基因4μL,载体pET-30a 2μL,Buffer 2μL,连接酶1μL,16℃过夜连接;将构建好的载体通过化转技术导入E.coli BL21(DE3)中,涂布在含卡那霉素的LB平板中,放入37℃培养箱中过夜,将长出来的单菌落进行质粒提取和测序,最终获得含该羰基还原酶基因的重组工程菌。
采用本发明所述的2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株发酵生产2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶:将2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株种子液按照2%的接种量转接于LB培养基中,37℃培养至OD600=0.6时,加入50μl 0.5mol/L的IPTG,18℃诱导14h,即2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶发酵液。
本发明所述2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株及其生产得到的2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶在催化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮生成(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇中的应用。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:本发明通过基因工程技术,制备了一种全新的2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶并构建了2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株,并实现了异源表达,手性选择ee值可达100%,可以替代现有的化学法进行(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的高效清洁生产。并且,同现有的羰基还原酶催化方法相比,本发明方法切实有效,酶催化活性高,对环境友好。
附图说明
图1为pET30a-TGC-K01质粒结构图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1 2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株的构建
设计2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因的上下游引物P1、P2(如表1所示),以全基因合成构建的pUC57-TGC为模板,通过PCR的方式扩增含有BamH I和XhoI酶切位点的TGC基因。PCR条件为:98℃3min,98℃30s,55℃90s、72℃90s,35个循环。PCR扩增体系:模板1.5μL,上下游引物各1.5μL,灭菌的双蒸水20.5μL,PrimerSTAR Mix25μL。采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收,电泳检验回收产物的浓度。BamHI和XhoI酶酶切胶回收产物及pET-30a质粒(表达载体),胶回收试剂盒对酶切后的胶回收产物进行纯化和回收,胶回收试剂盒对酶切后质粒进行纯化回收,电泳检验回收产物的浓度。目的基因TGC与载体pET-30a连接,连接体系:目的基因4μL,载体pET-28a 2μL,Buffer 2μL,连接酶1μL,16℃过夜连接。如图1所示。将构建好的载体通过化转技术导入E.coli BL21(DE3)中,涂布在含卡那霉素的LB平板中,放入37℃培养箱中过夜,将长出来的单菌落进行质粒提取和测序,最终获得含该羰基还原酶基因的重组工程菌。
其中,2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因的氨基酸序列为SEQ ID NO:1,2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因的核苷酸序列是SEQ ID NO:2。
LB培养基:胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10 g/L,pH 7.0。
表1引物
引物名称 | 序列 | 编号 |
P1 | <u>GCGGGATCC</u>ATGGCTAAAAACTTCTCTAACGTTGA | SEQ ID NO:3 |
P2 | <u>CCGCTCGAG</u>TTACGGCAGGGTGTAACCA | SEQ ID NO:4 |
实施例2重组菌发酵产酶制备(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇
(1)制备2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶发酵液
将实施例1构建的重组菌接种于10mL的LB培养基中,37℃震荡培养过夜,按照2%的接种量转接于LB培养基中,37℃培养至OD600=0.6时,加入50μl0.5mol/L的IPTG,18℃诱导16h,离心收集菌体,磷酸盐缓冲液(0.1M)洗后重悬,进行超声波破碎,功率260W运行3s,间隔5s,总时长3min,获得粗酶液。
(2)酶催化制备(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇
分别称取0.219g的NaH2PO4·2H2O和0.786g的Na2HPO4·12H2O于250mL三角瓶中,加入18mL水溶解,再加入0.26g的吐温80,混匀。再分别加入10mL的步骤(1)制备的粗酶液和10mL的异丙醇脱氢酶,以及10mg的NADP+,混匀。另称取1g的化合物于5mL离心管中,加入4mL的异丙醇溶解后再缓慢加入三角瓶中,30℃,220rpm,摇床催化反应。
反应3h,底物完全转化。催化率约为2.5。加入等体积乙酸乙酯萃取2次,取上层乙酸乙酯相。30℃减压浓缩后称重1.15g,手性纯度100%,化学纯度:92.08%,转化率:96%。
表2物料表
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,对于本领域的普通技术人员而言,可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 江苏阿尔法药业有限公司
<120> 一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株及构建方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 283
<212> PRT
<213> 2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Lys Asn Phe Ser Asn Val Glu Tyr Pro Ala Pro Pro Pro Ala
1 5 10 15
His Thr Lys Asn Glu Ser Leu Gln Val Leu Asp Leu Phe Lys Leu Asn
20 25 30
Gly Lys Val Ala Ser Ile Thr Gly Ser Ser Ser Gly Tyr Gly Tyr Ala
35 40 45
Leu Ala Glu Ala Phe Ala Gln Val Gly Ala Asp Val Ala Ile Trp Tyr
50 55 60
Asn Ser His Asp Ala Thr Gly Lys Ala Glu Ala Leu Ala Lys Lys Tyr
65 70 75 80
Gly Val Lys Val Lys Ala Tyr Lys Ala Asn Val Ser Ser Ser Asp Ala
85 90 95
Val Lys Gln Thr Ile Glu Gln Gln Ile Lys Asp Phe Gly His Leu Asp
100 105 110
Ile Val Val Ala Asn Ala Gly Ile Pro Trp Thr Lys Gly Ala Tyr Ile
115 120 125
Asp Gln Asp Asp Asp Lys His Phe Asp Gln Val Val Asp Val Asp Leu
130 135 140
Lys Gly Val Gly Tyr Val Ala Lys His Ala Gly Arg His Phe Arg Glu
145 150 155 160
Arg Phe Glu Lys Glu Gly Lys Lys Gly Ala Leu Val Phe Met Ala Thr
165 170 175
Met Ser Gly His Ile Val Asn Val Pro Gln Phe Gln Ala Thr Tyr Asn
180 185 190
Ala Ala Lys Ala Gly Val Arg His Phe Ala Lys Ser Leu Ala Val Glu
195 200 205
Phe Ala Pro Phe Ala Arg Val Asn Ser Val Ser Met Gly Tyr Ile Asn
210 215 220
Thr Glu Ile Ser Asp Phe Val Pro Gln Glu Thr Gln Asn Lys Trp Trp
225 230 235 240
Ser Leu Val Pro Leu Gly Arg Gly Gly Glu Thr Ala Glu Leu Val Gly
245 250 255
Ala Tyr Leu Phe Leu Ala Ser Asp Ala Gly Ser Tyr Ala Thr Gly Thr
260 265 270
Asp Ile Ile Val Asp Gly Gly Tyr Thr Leu Pro
275 280
<210> 2
<211> 852
<212> DNA
<213> 2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶(Artificial Sequence)
<400> 2
atggctaaaa acttctctaa cgttgaatac ccggctccgc cgccggctca caccaaaaac 60
gaatctctgc aggttctgga cctgttcaaa ctgaacggta aagttgcttc tatcaccggt 120
tcttcttctg gttacggtta cgctctggct gaagcgttcg ctcaggttgg tgctgacgtt 180
gctatctggt acaactctca cgacgctacc ggtaaagctg aagctctggc taaaaaatac 240
ggtgttaaag ttaaagcgta caaagctaac gtttcttctt ctgacgctgt taaacagacc 300
atcgaacagc agatcaaaga cttcggtcac ctggacatcg ttgttgctaa cgctggtatc 360
ccgtggacca aaggtgctta catcgaccag gacgacgaca aacacttcga ccaggttgtt 420
gacgttgacc tgaaaggtgt tggttacgtt gctaaacacg ctggtcgtca cttccgtgag 480
aggttcgaaa aagaaggcaa aaaaggtgct ctggttttca tggctaccat gtctggtcac 540
atcgttaacg ttccgcagtt ccaggctacc tacaacgctg ctaaagctgg tgttcgtcac 600
ttcgctaaat ctctggctgt tgaatttgct ccgttcgctc gtgttaactc tgtttctatg 660
ggctacatca acaccgaaat ctctgacttc gttccgcagg aaacccagaa caaatggtgg 720
tctctggttc cgctgggtcg tggtggtgaa accgctgaac tggttggtgc ttacctgttc 780
ctggcttctg acgctggttc ttacgctacc ggtaccgaca tcatcgttga cggtggttac 840
accctgccgt aa 852
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> P1(Artificial Sequence)
<400> 3
gcgggatcca tggctaaaaa cttctctaac gttga 35
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> P2(Artificial Sequence)
<400> 4
ccgctcgagt tacggcaggg tgtaacca 28
Claims (5)
1.一种2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株,其特征在于:所述重组菌株以pET-30a质粒为载体,表达2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因;所述2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示;所述2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因连接到pET-30a质粒的BamH I和XhoI位点,然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。
2.根据权利要求1所述的2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株,其特征在于:所述2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.权利要求1或2所述的2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株的构建方法,其特征在于:设计2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因的上下游引物P1、P2,如SEQ IDNO:3-4所示;将pET-30a质粒BamH I和XhoI双酶切处理后,电泳检验回收;将目的基因与载体pET-30a连接,连接体系:目的基因4 μL,载体pET-30a 2 μL,Buffer 2 μL,连接酶1 μL,16℃过夜连接;将构建好的载体通过转化技术导入E. coli BL21(DE3)中,涂布在含卡那霉素的LB平板中,放入37 ℃培养箱中过夜,将长出来的单菌落进行质粒提取和测序,最终获得含2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶基因的重组工程菌。
4.采用权利要求1或2所述的2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株发酵生产2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶的方法。
5.根据权利要求4所述的生产2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶的方法,其特征在于:将2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶重组菌株种子液按照2%的接种量转接于LB培养基中,37℃培养至OD600=0.6时,加入50 μl 0.5 mol/L的IPTG,18 ℃诱导14 h,得到2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮还原酶发酵液。
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