CN112645952B - 一种(r)-(+)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程与酶工程技术领域，尤其是一种(R)‑(+)‑9‑(2‑羟丙基)腺嘌呤的合成方法，其合成路线如下：

Description

一种(R)-(+)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的合成方法

技术领域

本发明涉及基因工程与酶工程技术领域，具体领域为一种(R)-(+)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的合成方法。

背景技术

目前，合成(R)-(+)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的方法有化学法和酶法路线，该化合物是合成抗病毒药物替诺福韦酯的关键中间体。

具体方法主要为以下几种：

CN101574356公开了以R-乳酸乙酯为原料，五步反应制备(R)-(+)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤，其路线如下：

该路线较长，且中间体需过柱纯化，收率低，不利于工业化生产。

CN103374038A公开了以腺嘌呤与(R)-环氧丙烷为原料，碱催化下制备(R)-(+)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤，其路线如下：

该路线中原料(R)-环氧丙烷价格昂贵，反应收率较低，只有69％。

CN101279987A公开了以(R)-1,2-丙二醇和三光气为起始原料制备(R)-碳酸-1,2-丙二酯，再与腺嘌呤反应得(R)-(+)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤，其路线如下：

该法收率较低，总收率35％，且剧毒三光气，不安全，不利于工业化生产。

Nelo R.Rivera等人(Tetrahedron Letters.2016,57,1090–1092)报道了以Ketone 5为原料，利用羰基还原酶KRED选择性还原，制备(R)-(+)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤，其路线如下：

该路线有较好的立体选择性，但底物Ketone 5水溶解度差，加助溶剂效果也不佳，导致溶剂用量大，产能低，也不利于工业化生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种(R)-(+)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的合成方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种(R)-(+)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的合成方法，其合成路线如下：

由于化合物Ⅳ不溶于水，添加乙醇、甲醇、DMSO等助溶剂也不能很好的进行溶解；经大量实验发现，将羰基还原酶应用于化合物Ⅳ还原时发现，ee值＞99％，适用于该底物酶催化反应，但由于化合物Ⅳ难溶解，催化效率较低，需要额外在体系中添加甘油，延长酶催化反应时间。在此基础上，本发明对化合物Ⅳ先进行成盐，增加其溶解性，然后进行酶催化反应，再解离盐获得中间体化合物I。

具体为，化合物Ⅳ中加入X来成盐，所述X为盐酸、硫酸、磷酸或柠檬酸；然后以化合物Ⅲ为底物，在pH 6.0的PB缓冲溶液中，在辅酶和辅酶循环酶的存在下，以羰基还原酶为催化剂，不对称还原Ⅲ，获得化合物Ⅱ；然后加入碱获得化合物Ⅰ；

其中，所述羰基还原酶基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

其中，化合物Ⅳ制备化合物Ⅲ时，所用溶剂为甲醇或乙醇。

其中，所述辅酶为NADP+。

其中，所述辅酶循环酶为葡糖脱氢酶或异丙醇脱氢酶或甲酸脱氢酶。

其中，所述羰基还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

其中，所述羰基还原酶的生产方法具体为，将羰基还原酶重组菌株种子液按照1-5％的接种量转接于LB培养基中，37℃培养至OD600＝0.6时，加入50μl0.5mol/L的IPTG，18℃过夜诱导，即获得羰基还原酶发酵液。

其中，所述羰基还原酶重组菌株的构建方法具体为，设计羰基还原酶基因TAA的上下游引物F、引物R，如SEQ ID NO：3-4所示；

以pUC57-TAA为模板，PCR扩增含有EcoR I和Hind III酶切位点的TAA基因；PCR条件为：98℃3min，98℃30s，56℃90s、72℃90s，30个循环；PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，灭菌的双蒸水20.5μL，PrimerSTAR Mix 25μL；

采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度；EcoRI，Hind III酶切胶回收产物及pET-28a质粒，胶回收试剂盒对酶切后的胶回收产物进行纯化和回收，胶回收试剂盒对酶切后质粒进行纯化回收，电泳检验回收产物的浓度；目的基因TAA与载体pET-28a连接，连接体系：目的基因4μL，载体pET-28a 2μL，Buffer 2μL，连接酶1μL，16℃过夜连接；将构建好的载体通过化转技术导入E.coli BL21(DE3)中，涂布在含卡那霉素的LB平板中，放入37℃培养箱中过夜，将长出来的单菌落进行质粒提取和测序，最终获得含该羰基还原酶基因的重组工程菌。

进一步的，所述辅酶循环酶为辅酶循环酶GDH，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；

所述辅酶循环酶GDH的生产方法为：将GDH表达菌株接种到含有卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃培养16h，得到种子培养液。将种子培养液接种到含卡那霉素抗性的TB液体培养基中，接种量为含卡那霉素抗性的TB液体培养基体积的1％。然后置于37℃下培养至OD600值为0.8，加入终浓度为0.01mmol/L的IPTG，置于30℃继续培养16h后，4000rmp，4℃下离心收集菌体，采用pH值为7.5的100mmol/L的PB缓冲液将收集后菌株进行洗涤并重悬，通过超声波破碎仪进行破碎，超声破碎功率为150W，运行5S，间隔5S，共运行3min，获得辅酶循环酶GDH粗酶液，冻干后获得冻干粉。

其中，所述GDH表达菌株的构建方法为，将GDH序列质粒的E.coli DH5α菌株活化，接种于含有卡那的LB培养基中，37℃，220rpm振荡培养过夜，收集菌株于EP管中，于12000r/min，离心2-5min，收集细胞，通过天根质粒小提试剂盒，按照标准方法收集质粒；并以引物F0、R0为模板进行PCR扩增，引物F0、R0如SEQ ID NO：9-10所示；并经过跑胶验证后，通过天根切胶回收试剂盒，按照标准方法回收PCR产物，送检测序；

平板上挑选阳性克隆菌株，收集质粒，通过引物F1、R1进行PCR扩增，引物F1、R1如SEQ ID NO：7-8所示；表达质粒采用pET-30a，按照ddH₂O 31μL、缓冲液5μL、质粒DNA10μL、内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ各2μL顺序，加入到axygen PCR小管中，进行酶切反应10-20min后终止酶切反应，跑胶验证结果，并切胶回收；

将质粒与DNA连接，反应体系：目的基因4.4μL，pET-30a 3.6μL,T4连接酶1μL，10×buffer 1μL，16℃10-18h，获得重组质粒，并将重组质粒导入E.coliBL21(DE3)中，获得重组表达细胞。

其中，制备化合物Ⅰ所用碱为碳酸氢钾或碳酸氢钠。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1)本发明以羰基还原酶作为催化剂，对环境友好，无污染；

2)由于底物的溶解度较差，导致酶活较低，本发明方法通过将化合物IV制备成盐酸盐，提高了该化合物的水溶性，大幅度提高了酶催化率，更有利于工业化生产。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

(1)底物Ⅲ的制备

向甲醇(3.5L)中加化合物Ⅳ(100g)，回流溶清，滴加20％盐酸甲醇溶液(100.3g)，约0.5h加完，缓慢降温至15-20℃，析晶。

抽滤，收集滤饼，真空干燥(40℃/-0.1MPa)，获得黄色粉末状固体化合物Ⅲ：111.1g，收率93.5％，HPLC纯度99.3％。

(2)化合物Ⅱ制备中所需辅酶循环酶GDH序列的获得

将包含有突变的GDH序列质粒的E.coli DH5α菌株活化(辅酶循环酶GDH的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示)，接种于含有卡那的LB培养基中，37℃，220rpm振荡培养过夜，收集菌株于EP管中，于12000r/min，离心2-5min，收集细胞，通过天根质粒小提试剂盒，按照标准方法收集质粒；并以引物F0、R0为模板进行PCR扩增，引物F0、R0如SEQ ID NO：9-10所示；并经过跑胶验证后，通过天根切胶回收试剂盒，按照标准方法回收PCR产物，送检测序。

(3)GDH表达菌株的构建

平板上挑选阳性克隆菌株，收集质粒，通过引物F1、R1(如SEQ ID NO：7-8所示)PCR扩增；表达质粒以pET-30a为例，按照ddH₂O 31μL、缓冲液5μL、质粒DNA10μL、Fast digest(EcoRⅠ和BamHⅠ各2μL)顺序，加入到axygen PCR小管中，进行酶切反应10-20min后终止酶切反应，跑胶验证结果，并切胶回收；

将质粒与DNA连接，反应体系：目的基因4.4μL，pET-30a 3.6μL，T4连接酶1μL，10×buffer 1μL，16℃10-18h，获得重组质粒，并将重组质粒导入E.coliBL21(DE3)中，获得重组表达细胞。

(4)辅酶循环酶GDH的获得

将GDH表达菌株接种到含有卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃培养16h，得到种子培养液。将种子培养液接种到含卡那霉素抗性的TB液体培养基中，接种量为含卡那霉素抗性的TB液体培养基体积的1％。然后置于37℃下培养至OD600值为0.8，加入终浓度为0.01mmol/L的IPTG，置于30℃继续培养16h后，4000rmp，4℃下离心收集菌体，采用pH值为7.5的100mmol/L的PB缓冲液将收集后菌株进行洗涤并重悬，通过超声波破碎仪进行破碎，超声破碎功率为150W，运行5S，间隔5S，共运行3min，获得辅酶循环酶GDH粗酶液，冻干后获得辅酶循环酶GDH冻干粉。

(5)羰基还原酶重组菌株的构建

设计羰基还原酶基因(TAA)的上下游引物F、R(如表1所示)，以全基因合成构建的pUC57-TAA为模板，通过PCR的方式扩增含有EcoR I和Hind III酶切位点的TAA基因。PCR条件为：98℃3min，98℃30s，55℃90s、72℃90s，30个循环。PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，灭菌的双蒸水20.5μL，PrimerSTAR Mix 25μL。采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。EcoR I，Hind III酶切胶回收产物(目的基因TAA)及pET-28a质粒(表达载体)，胶回收试剂盒对酶切后的胶回收产物进行纯化和回收，胶回收试剂盒对酶切后质粒进行纯化回收，电泳检验回收产物的浓度。目的基因TAA与载体pET-28a连接，连接体系：目的基因4μL，载体pET-28a 2μL，Buffer 2μL，连接酶1μL，16℃过夜连接。将构建好的载体通过化转技术导入E.coli BL21(DE3)中，涂布在含卡那霉素的LB平板中，放入37℃培养箱中过夜，将长出来的单菌落进行质粒提取和测序，最终获得含该羰基还原酶基因的重组工程菌。

其中，羰基还原酶基因的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，羰基还原酶基因的核苷酸序列是SEQ ID NO：2。

LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L，pH 7.0。

表1引物

引物名称	序列	编号
			F	GG<u>AATTC</u>ATGGTCGGCACTACTAC	SEQ ID NO：3
R	CCC<u>AAGCTT</u>CTACTTGATCTTCACGGCGTTC	SEQ ID NO：4

(6)制备羰基还原酶冻干粉

将步骤(6)构建的重组菌接种于5mL的LB培养基中，37℃震荡培养过夜，次日按照1％的接种量转接于LB培养基中，37℃培养至OD600＝0.6时，加入50μl0.5mol/L的IPTG，18℃诱导14h，离心收集菌体，生理盐水洗涤后，冻干获得羰基还原酶冻干粉。

(7)酶催化制备化合物Ⅱ

1)磷酸缓冲液配备

100mL反应体系需0.1M pH6.0 PB缓冲体系，依据配方称取磷酸盐如下(g/100mL)：Na₂HPO₄·12H₂O 0.88，NaH₂PO₄·2H₂O 2.74，ddH₂O补齐至100mL。

2)配制100mg/mL NADP+辅酶母液

称取100mg NADP+，采用纯净水溶解并定容至1mL，-20℃储存待用。

3)酶液混液配备

取1g羰基还原酶冻干粉，5ml GDH粗酶液，加入1)中称取的磷酸缓冲盐充分搅拌混匀。

4)反应

将步骤3)准备好的酶液和5g化合物Ⅲ加入250mL规格三角瓶，摇匀。随后，加入步骤2)配备的NADP+200μL和1g葡萄糖，混匀。最后，用步骤1)配置的磷酸盐缓冲液使反应体系定容至100mL，摇匀。将该100mL反应体系置于35℃、200rpm摇床反应，反应中通过0.1％氢氧化钠溶液调节pH控制在6.5-7.5。

反应约48h，向体系中加入乙酸乙酯100ml*2次萃取，分液；合并有机相，减压浓缩(10KPa，35-40℃)，蒸至冷凝管无溶剂滴出至无溶剂蒸出，得黄色固体化合物Ⅱ。经液相检测发现ee值99.9％，转化率97％，收率：90.6％。

(8)化合物I制备

向二氯甲烷(400ml)加入化合物Ⅱ(100g)，碳酸氢钾(145g)，体系为固液两相，控制温度19-25℃，快速搅拌。

反应10-14h，过滤，滤饼用二氯甲烷(200ml)洗，合并滤液。滤液中加入无水硫酸钠干燥，控制水分<0.05％，抽滤，收集滤液，减压浓缩(10KPa)，温度35-40℃，蒸至冷凝管无溶剂滴出至无溶剂蒸出，得白色固体化合物I：77.9g，收率：92.5％，HPLC纯度：99.6％。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 江苏阿尔法药业有限公司

<120> 一种(R)-(+)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的合成方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 323

<212> PRT

<213> 羰基还原酶氨基酸序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Val Gly Thr Thr Thr Leu Asn Thr Gly Ala Ser Leu Glu Leu Val

1 5 10 15

Gly Tyr Gly Thr Trp Gln Ala Ala Pro Gly Glu Val Gly Gln Gly Val

20 25 30

Lys Val Ala Ile Glu Thr Gly Tyr Arg His Leu Asp Leu Ala Lys Val

35 40 45

Tyr Ser Asn Gln Pro Glu Val Gly Ala Ala Ile Lys Glu Ala Gly Val

50 55 60

Lys Arg Glu Asp Leu Phe Ile Thr Ser Lys Leu Trp Asn Asn Ser His

65 70 75 80

Arg Pro Glu Gln Val Glu Pro Ala Leu Asp Asp Thr Leu Lys Glu Leu

85 90 95

Gly Leu Glu Tyr Leu Asp Leu Tyr Leu Ile His Trp Pro Val Ala Phe

100 105 110

Pro Pro Glu Gly Asp Ile Thr Gln Asn Leu Phe Pro Lys Ala Asn Asp

115 120 125

Lys Glu Val Lys Leu Asp Leu Glu Val Ser Leu Val Asp Thr Trp Lys

130 135 140

Ala Met Val Lys Leu Leu Asp Thr Gly Lys Val Lys Ala Ile Gly Val

145 150 155 160

Ser Asn Phe Asp Ala Lys Met Val Asp Ala Ile Ile Glu Ala Thr Gly

165 170 175

Val Thr Pro Ser Val Asn Gln Ile Glu Arg His Pro Leu Leu Leu Gln

180 185 190

Pro Glu Leu Ile Ala His His Lys Ala Lys Asn Ile His Ile Thr Ala

195 200 205

Tyr Ser Pro Leu Gly Asn Asn Thr Val Gly Ala Pro Leu Leu Val Gln

210 215 220

His Pro Glu Ile Lys Arg Ile Ala Glu Lys Asn Gly Cys Thr Pro Ala

225 230 235 240

Gln Val Leu Ile Ala Trp Ala Ile Val Gly Gly His Ser Val Ile Pro

245 250 255

Lys Ser Val Thr Pro Ser Arg Ile Gly Glu Asn Phe Lys Gln Val Ser

260 265 270

Leu Ser Gln Glu Asp Val Asp Ala Val Ser Lys Leu Gly Glu Gly Ser

275 280 285

Gly Arg Arg Arg Tyr Asn Ile Pro Cys Thr Tyr Ser Pro Lys Trp Asp

290 295 300

Ile Asn Val Phe Gly Glu Glu Asp Glu Lys Ser Cys Lys Asn Ala Val

305 310 315 320

Lys Ile Lys

<210> 2

<211> 972

<212> DNA

<213> 羰基还原酶核苷酸序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggtcggca ctactaccct caacactggc gcttccctcg agctcgtcgg ctacggcacg 60

tggcaggcag caccgggcga ggtgggccag ggcgtcaagg tcgccatcga gactggatac 120

cgtcacctcg accttgccaa ggtctactcg aaccaacctg aggttggtgc cgccatcaag 180

gaggctggcg tcaagcgcga ggacctcttc atcacctcga agctctggaa caactcgcac 240

cgcccggagc aggtcgagcc tgcccttgac gacaccctca aggagctcgg cctcgagtac 300

ctcgaccttt acctcattca ctggcccgtc gcgttcccgc ccgagggcga catcacccag 360

aacctcttcc cgaaggccaa cgacaaggag gtcaagctcg acctggaggt cagcctcgtc 420

gacacgtgga aggcgatggt caagcttctc gacactggca aggtcaaggc gatcggcgtt 480

tccaacttcg acgcgaagat ggtcgacgcc atcatcgagg ctaccggcgt gaccccctcc 540

gtcaaccaga tcgagcgtca ccctctcctt ctccagcccg agctcatcgc ccaccacaag 600

gccaagaaca ttcacattac cgcatactct cctctcggta acaacaccgt cggcgcgcct 660

cttcttgtcc agcacccgga gatcaagcgc atcgccgaga agaacggctg cacgcccgct 720

caggtcctca ttgcctgggc catcgttggc ggccactcgg ttatccccaa gtcggtcacc 780

ccctcccgca ttggcgagaa cttcaagcag gtctcgctct cgcaggagga cgtcgatgcc 840

gtcagcaagc tcggcgaggg ttcgggccgc aggcgctaca acatcccctg cacgtactcg 900

cccaagtggg acatcaacgt ctttggcgag gaggacgaga agtcgtgcaa gaacgccgtg 960

aagatcaagt ag 972

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物F(Artificial Sequence)

<400> 3

ggaattcatg gtcggcacta ctac 24

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 引物R(Artificial Sequence)

<400> 4

cccaagcttc tacttgatct tcacggcgtt c 31

<210> 5

<211> 263

<212> PRT

<213> GDH序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Asp Met Tyr Pro Asp Leu Tyr Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr

1 5 10 15

Gly Ala Ala Thr Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Lys

20 25 30

Glu Gln Ala Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Lys Gln Asp Pro

35 40 45

Asn Glu Val Lys Glu Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val Val

50 55 60

Val Gln Gly Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile Val Gln

65 70 75 80

Thr Ala Ile Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Ile Met Ile Asn Asn Ala

85 90 95

Gly Leu Glu Asn Pro Val Pro Ser His Glu Met Pro Leu Lys Asp Trp

100 105 110

Asp Lys Val Ile Gly Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg

115 120 125

Glu Ala Ile Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile

130 135 140

Asn Met Ser Ser Val His Glu Val Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His

145 150 155 160

Tyr Ala Ala Ser Lys Gly Gly Ile Lys Lys Met Thr Glu Thr Leu Ala

165 170 175

Leu Glu Tyr Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly

180 185 190

Ala Ile Asn Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Lys Gln

195 200 205

Lys Ala Asp Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro

210 215 220

Glu Glu Ile Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Glu Ser Lys Glu Ala Ser

225 230 235 240

Tyr Val Thr Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Leu Met Thr Gln Tyr

245 250 255

Pro Ser Phe Gln Ala Gly Arg

260

<210> 6

<211> 792

<212> DNA

<213> GDH序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggacatgt atccggattt atataaagga aaagtcgtcg ctattacagg agctgctaca 60

gggctcggaa aggcgatggc cattcgcttc ggcaaggagc aggcaaaagt ggttatcaac 120

tattatagta ataaacaaga tccgaacgag gtaaaagaag aggtcatcaa ggcgggcggt 180

gaagctgttg tcgtccaagg agatgtcacg aaagaggaag atgtaaaaaa tatcgtgcaa 240

acggcaatta aggagttcgg cacactcgat attatgatta ataatgccgg tcttgaaaat 300

cctgtgccat ctcacgaaat gccgctcaag gattgggata aagtcatcgg cacgaactta 360

acgggtgcct ttttaggaag ccgtgaagcg attaaatatt tcgtagaaaa cgatatcaag 420

ggaaatgtca ttaacatgtc cagtgtgcac gaagtgattc cttggccgtt atttgtccac 480

tatgcggcaa gtaaaggcgg gataaagaaa atgacagaaa cattagcgtt ggaatacgcg 540

ccgaagggca ttcgcgtcaa taatattggg ccaggtgcga tcaacacgcc aatcaatgct 600

gaaaaattcg ctgaccctaa acagaaagct gatgtagaaa gcatgattcc aatgggatat 660

atcggcgaac cggaggagat cgccgcagta gcagcctggc ttgagtcgaa ggaagccagc 720

tacgtcacag gcatcacgtt attcgcggac ggcttaatga cacaatatcc ttcattccag 780

gcaggccgct aa 792

<210> 7

<211> 37

<212> DNA

<213> 引物F1(Artificial Sequence)

<400> 7

cgcggatcca tggacatgta tccggattta tataaag 37

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物R1(Artificial Sequence)

<400> 8

ccggaattct tagcggcctg cctg 24

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物F0(Artificial Sequence)

<400> 9

taatacgact cactatagg 19

<210> 10

<211> 48

<212> DNA

<213> 引物R0(Artificial Sequence)

<400> 10

caaaaaaccc ctcaagaccc gtttagaggc cccaaggggt tatgctag 48

Claims (10)

1.一种(R)-(+)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的合成方法，其特征在于：其合成路线如下：

具体为，化合物Ⅳ中加入X来成盐，所述X为盐酸、硫酸、磷酸或柠檬酸；然后以化合物Ⅲ为底物，在pH 6.0的PB缓冲溶液中，在辅酶和辅酶循环酶的存在下，以羰基还原酶为催化剂，不对称还原Ⅲ，获得化合物Ⅱ；然后加入碱获得化合物Ⅰ；

其中，所述羰基还原酶基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的(R)-(+)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的合成方法，其特征在于：化合物Ⅳ制备化合物Ⅲ时，所用溶剂为甲醇或乙醇。

3.根据权利要求1所述的(R)-(+)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的合成方法，其特征在于：所述辅酶为NADP+。

4.根据权利要求1所述的(R)-(+)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的合成方法，其特征在于：所述辅酶循环酶为葡糖脱氢酶或异丙醇脱氢酶或甲酸脱氢酶。

5.根据权利要求1所述的(R)-(+)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的合成方法，其特征在于：所述羰基还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

6.根据权利要求1所述的(R)-(+)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的合成方法，其特征在于：所述羰基还原酶的生产方法具体为，将羰基还原酶重组菌株种子液按照1-5％的接种量转接于LB培养基中，37℃培养至OD600＝0.6时，加入50μl 0.5mol/L的IPTG，18℃过夜诱导，即获得羰基还原酶发酵液。

7.根据权利要求6所述的(R)-(+)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的合成方法，其特征在于：所述羰基还原酶重组菌株的构建方法具体为，设计羰基还原酶基因TAA的上下游引物F、引物R，如SEQ ID NO：3-4所示；

以pUC57-TAA为模板，PCR扩增含有EcoR I和Hind III酶切位点的TAA基因；PCR条件为：98℃3min，98℃30s，56℃90s、72℃90s，30个循环；PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，灭菌的双蒸水20.5μL，PrimerSTAR Mix 25μL；

采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度；EcoR I，Hind III酶切胶回收产物及pET-28a质粒，胶回收试剂盒对酶切后的胶回收产物进行纯化和回收，胶回收试剂盒对酶切后质粒进行纯化回收，电泳检验回收产物的浓度；目的基因TAA与载体pET-28a连接，连接体系：目的基因4μL，载体pET-28a 2μL，Buffer 2μL，连接酶1μL，16℃过夜连接；将构建好的载体通过化转技术导入E.coliBL21(DE3)中，涂布在含卡那霉素的LB平板中，放入37℃培养箱中过夜，将长出来的单菌落进行质粒提取和测序，最终获得含该羰基还原酶基因的重组工程菌。

8.根据权利要求1所述的(R)-(+)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的合成方法，其特征在于：所述辅酶循环酶为辅酶循环酶GDH，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示；

所述辅酶循环酶GDH的生产方法为：将GDH表达菌株接种到含有卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃培养16h，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素抗性的TB液体培养基中，接种量为含卡那霉素抗性的TB液体培养基体积的1％；然后置于37℃下培养至OD600值为0.8，加入终浓度为0.01mmol/L的IPTG，置于30℃继续培养16h后，4000rmp，4℃下离心收集菌体，采用pH值为7.5的100mmol/L的PB缓冲液将收集后菌株进行洗涤并重悬，通过超声波破碎仪进行破碎，超声破碎功率为150W，运行5S，间隔5S，共运行3min，获得辅酶循环酶GDH粗酶液，冻干后获得冻干粉。

9.根据权利要求8所述的(R)-(+)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的合成方法，其特征在于：所述GDH表达菌株的构建方法为，将含GDH序列质粒的E.coli DH5α菌株活化，接种于含有卡那的LB培养基中，37℃，220rpm振荡培养过夜，收集菌株于EP管中，于12000r/min，离心2-5min，收集细胞，通过天根质粒小提试剂盒，收集质粒；并以引物F0、R0为模板进行PCR扩增，引物F0、R0如SEQ ID NO：9-10所示；并经过跑胶验证后，通过天根切胶回收试剂盒，回收PCR产物，送检测序；

平板上挑选阳性克隆菌株，收集质粒，通过引物F1、R1进行PCR扩增，引物F1、R1如SEQID NO：7-8所示；表达质粒采用pET-30a，按照ddH₂O 31μL、缓冲液5μL、质粒DNA10μL、内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ各2μL的顺序，加入到axygen PCR小管中，进行酶切反应10-20min后终止酶切反应，跑胶验证结果，并切胶回收；

将质粒与DNA连接，反应体系：目的基因4.4μL，pET-30a 3.6μL，T4连接酶1μL，10×buffer 1μL，16℃10-18h，获得重组质粒，并将重组质粒导入E.coliBL21(DE3)中，获得重组表达细胞。

10.根据权利要求1所述的(R)-(+)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的合成方法，其特征在于：制备化合物Ⅰ所用碱为碳酸氢钾或碳酸氢钠。