CN116731988B - 全合成酮还原酶及应用该酮还原酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及合成技术领域，特别是涉及基因工程与酶工程合成技术领域，具体而言，涉及全合成酮还原酶及应用该还原酶的制备方法。通过全合成的方法获得了一种新的酮还原酶，该酮还原酶能够稳定异源功能性表达，同时该酮还原酶能够在替格瑞洛合成关键中间体化合物(S)‑2‑氯‑1‑(3,4‑二氟苯基)乙醇的制备中和富马酸丙酚替诺福韦关键中间体化合物(R)‑9‑(2‑羟丙基)腺嘌呤的制备中均表现出高效地催化活性，具有巨大的工业化应用潜力，有望成为催化不同手性构型的通用酮还原酶。
Description
技术领域
本发明涉及合成技术领域，特别是涉及基因工程与酶工程合成技术领域，具体而言，涉及全合成酮还原酶及应用该还原酶的制备方法。
背景技术
手性醇化合物作为天然产物和手性药物合成中的重要中间体化合物，其合成一直是本领域技术人员研究的热点。手性化合物合成中手性中心的构建是合成中的关键环节，不同的手性化合物其药理活性、代谢及毒性都有着重大差异。对于手性药物，通常一组对映体中，一个是活性有效的，而另一个是无效，甚至是有毒的。
譬如，替格瑞洛合成中的关键中间体化合物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇和富马酸丙酚替诺福韦合成中的关键中间体化合物(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤都是手性中间体，其光学纯度在目标药物化合物的制备中起着至关重要的作用。
还原酶作为生物催化剂在生物法合成中具有重要作用。但是在还原酶的应用中，能否异源表达，表达效果好坏，以及能否有效、高效催化底物转化为目标光学手性化合物，都需要具体问题具体分析。在现有技术中，还原酶往往只能单一作用在某一底物转化合成中，针对不同的手性化合物的需要，必须要构建不同的催化酶。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种全合成酮还原酶，并利用该全合成酮还原酶作为生物催化剂，提供一种新的合成替格瑞洛合成关键中间体化合物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇和合成富马酸丙酚替诺福韦关键中间体化合物(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的方法，进而不仅得到高光学纯度的目标化合物，同时能够实现一酶两用。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种酮还原酶，所述酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
同时，本发明还公开了该酮还原酶的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQID NO：2所示。
同时，本发明还公开了一种连接有上述编码基因的重组质粒。优选地，该重组质粒为pET-28a(+)。
进一步地，在本发明中还公开了重组质粒的构建方法，分别设计如SEQ ID NO：3所示的上游引物P1和如SEQ ID NO：4所示的下游引物P2，将pET-28a(+)质粒BamH I和XhoI双酶切处理后，将经PCR扩增的含有BamH I和XhoI酶切位点含有如SEQ ID NO：2所示的编码基因的目的基因与载体pET-28a(+)连接，所用连接体系为目的基因4μL，载体pET-28a(+)2μL，Buffer 2μL，连接酶1μL，16℃过夜。
进一步地，本发明还公开了PCR扩增的条件为：98℃3min，98℃30s，55℃90s、72℃90s，35个循环；PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，灭菌的双蒸水20.5μL，PrimerSTARMix25μL；其中模板为pUC57。
同时，本发明还公开了含有上述重组质粒的宿主细胞。优选地，该宿主细胞为大肠杆菌。
另一方面，本发明还公开了应用该酮还原酶的制备化合物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的方法，将重组工程菌培养、破碎后添加至含有底物化合物Ⅱ、NADP+、异丙醇和异丙醇还原酶酶粉的反应体系中，经反应形成化合物Ⅰ，所述重组工程菌是以E.coliBL21(DE3)为宿主，pET-28a(+)为载体，表达如SEQ ID NO：1所示的酮还原酶的大肠杆菌，
在另一个发明，本发明还公开了应用该酮还原酶制备化合物(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的方法，将重组工程菌培养、破碎后添加至含有底物化合物Ⅳ、NADP+、异丙醇和异丙醇还原酶酶粉的反应体系中，经反应形成化合物Ⅲ，所述重组工程菌是以E.coliBL21(DE3)为宿主，pET-28a(+)为载体，表达如SEQ ID NO：1所示的酮还原酶，
进一步优选地，所述重组工程菌培养方法如下：将重组菌接种于培养基中，37℃震荡培养过夜，按照2％的接种量转接于LB培养基中，37℃培养至OD600＝0.6时，加入50μl0.5mol/L的诱导剂，16～25℃诱导16h，离心收集菌体。
进一步优选地，所述重组工程菌采用超声波破碎的方式，超声功率为260W，超声程序为运行3s，间隔5s，总时长3min。
进一步优选地，所述酮还原酶在反应体系中的浓度为0.04g/mL。
本发明通过全合成的方法获得了一种新的酮还原酶，该酮还原酶能够稳定异源功能性表达，同时该酮还原酶能够在替格瑞洛合成关键中间体化合物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的制备中和富马酸丙酚替诺福韦关键中间体化合物(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的制备中均表现出高效地催化活性，具有巨大的工业化应用潜力，有望成为催化不同手性构型的通用酮还原酶。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面我们结合具体的实施例对本发明进行进一步的阐述。
实施例1酮还原酶的构建
设计酮还原酶的上下游引物F、R(如表1所示)，以全基因合成构建的pUC57-D_001为模板，通过PCR的方式扩增含有BamH I和XhoI酶切位点的D-001基因。
PCR条件为：98℃3min，98℃30s，55℃90s、72℃90s，35个循环。
PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，灭菌的双蒸水20.5μL，PrimerSTARMix 25μL。
采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。BamH I和XhoI酶酶切胶回收产物及pET-28a(+)质粒(表达载体)，胶回收试剂盒对酶切后的胶回收产物进行纯化和回收，胶回收试剂盒对酶切后质粒进行纯化回收，电泳检验回收产物的浓度。
目的基因D_001与载体pET-28a(+)连接，连接体系：目的基因4μL，载体pET-28a2μL，Buffer 2μL，连接酶1μL，16℃过夜连接。
将构建好的载体通过化转技术导入E.coli BL21(DE3)中，涂布在含卡那霉素的LB平板中，放入37℃培养箱中过夜，将长出来的单菌落进行质粒提取和测序，最终获得含该酮还原酶基因的重组工程菌。
其中，酮还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，酮还原酶的核苷酸序列是SEQ IDNO：2。
LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L，pH 7.0。
表1引物
| 引物名称 | 序列 | 编号 |
| F | GCGGGATCCATGGCTTCTGACAACTC | SEQ ID NO：3 |
| R | CCGCTCGAGTTAGTTGGAGTTTTTTTCCGC | SEQ ID NO：4 |
实施例2重组菌发酵产酶制备(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇
(1)制备酮还原酶发酵液
将实施例1构建的重组工程菌接种于10mL的LB培养基中，37℃震荡培养过夜，按照2％的接种量转接于LB培养基中，37℃培养至OD600＝0.6时，加入50μl 0.5mol/L的IPTG，18℃诱导16h，离心收集菌体，磷酸盐缓冲液(0.1M)洗后重悬，进行超声波破碎，功率260W运行3s，间隔5s，总时长3min，获得粗酶液。
(2)酶催化制备(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇
将实施例2步骤(1)中制备的含有1g酮还原酶湿菌体破碎获得的酮还原酶粗酶液10mL和1g底物化合物II加入250mL规格三角瓶，摇匀。随后，加入300μL 0.2mg/mL NADP+和2.5mL异丙醇，1g异丙醇酮还原酶酶粉，最后，用0.1M pH 6.0PB buffer使反应体系定容至25mL，摇匀。将该反应体系置于35℃、220rpm摇床反应3h，加入等体积乙酸乙酯萃取2次，取上层乙酸乙酯相，经检测手性纯度100％，化学纯度：91.8％，转化率：98.7％。
实施例3重组菌发酵产酶制备(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤
(1)制备酮还原酶发酵液
将实施例1构建的重组菌接种于10mL的LB培养基中，37℃震荡培养过夜，按照2％的接种量转接于LB培养基中，37℃培养至OD600＝0.6时，加入50μl 0.5mol/L的IPTG，18℃诱导16h，离心收集菌体，磷酸盐缓冲液(0.1M)洗后重悬，进行超声波破碎，功率260W运行3s，间隔5s，总时长3min，获得粗酶液。
(2)酶催化制备(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤
将实施例3步骤(1)中制备的含有1g酮还原酶湿菌体破碎获得的酮还原酶粗酶液10mL和1g底物化合物IV加入250mL规格三角瓶，摇匀。随后，加入300μL 0.2mg/mL NADP+和5mL异丙醇，1g异丙醇酮还原酶酶粉。最后，用0.1M pH 6.0PB buffer使反应体系定容至100mL，摇匀。将该反应体系置于35℃、220rpm摇床反应16h。加入等体积乙酸乙酯萃取2次，取上层乙酸乙酯相，经检测手性纯度93％，化学纯度：87.8％，转化率：95.3％。
以上所述是本发明的具体实施方式。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1. 应用酮还原酶制备化合物(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的方法，其特征是：将重组工程菌培养、破碎后添加至含有底物化合物Ⅳ、NADP+、异丙醇和异丙醇还原酶酶粉的反应体系中，经反应形成化合物Ⅲ，所述重组工程菌是以E.coliBL21(DE3)为宿主，pET-28a（+）为载体，表达如SEQ ID NO：1所示的酮还原酶，
。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述重组工程菌培养方法如下：将重组菌接种于培养基中，37℃震荡培养过夜，按照2%的接种量转接于LB培养基中，37℃培养至OD600=0.6时，加入50μl0.5mol/L的诱导剂，16~25℃诱导16h，离心收集菌体。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述重组工程菌采用超声波破碎的方式，超声功率为260W，超声程序为运行3s，间隔5s，总时长3min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述酮还原酶在反应体系中的浓度为0.04g/mL。。
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